CN113372253A - 一种胆红素的提取方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了一种胆红素的提取方法以及在尿试纸中的应用，属于医药试剂技术领域，包括以下步骤：步骤1：准备新鲜动物内脏器官；步骤2，对新鲜动物器官进行反复清洗和去杂质；步骤3：处理样本剪碎后进行细打碎；步骤4：经过盐稀进行粗提取；步骤5：冻干；步骤6：在目标胆红素中添加稳定剂保存。本发明的提取胆红素方法操作简便、成本低，得到浓度高、纯度高的胆红素，胆红素可以应用在尿试纸中。
Description
技术领域
本发明属于医药试剂技术领域，具有涉及一种高效提取胆红素的工艺及在尿试纸中的应用。
背景技术
胆红素其提取来源主要由动物的胆囊中提取，是由动物体内的血红蛋白分解代谢的还原产物，与化学方法人工合成胆红素相比，动物体内提取胆红素具有安全性高、代谢稳定等优势，但是动物天然产物的提取获得则存在不同程度的缺陷。目前，对胆红素的提取主要采用钙盐法、树脂法、快速法等提取方式。主要技术有物理吸附、超临界萃取技术等。
钙盐法，经过钙盐沉淀，在经过酸化形成游离状态，用氯仿萃取后，再经过有机溶剂进行重结晶，得到待提取物质。优点在于成本低，要求低，对于提取工艺中注意事项如下几点即可：1.提取工艺中要使酸化充分完成，加盐酸的过速度不宜过快，2.氧化剂含量不应超过原料总量1%，3.注意有机溶剂混合后静置时长。但工艺较复杂，生产周期长，提取率一般。
树脂法，采用大孔吸附树脂这一类有机高聚吸附剂，一般为白色球状颗粒。将待提取成分用碱水解成可溶性阳离子溶液，再经过大孔径树脂或阴离子交换树脂进行吸附。优点在于理化性质稳定，操作简单，但不适合长时间操作，试剂消耗大，提取成本高，不适合工业化生产。
快速法主要以超临界萃取技术为主，具有萃取效率高，自动化程度高、溶剂用量少优点。在较高温度下增加待测物的溶解度。提高压力使低沸点的溶剂在高温下保持液态，使其溶解力增加，高温时间短使得其热降解程度低，保证提取率。但具有一定局限性，会不耐高温的成分严重失活，对温度把控要求严格，不适合工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简便、成本低、浓度高、纯度高的胆红素的提取工艺及应用在尿试纸中。
本发明提供的一种胆红素的提取方法，步骤为 ：
(1)准备：准备新鲜动物胆囊器官（宰杀1-3小时以内）；
(2)预处理：将新鲜动物胆囊用0-4℃的纯化水反复冲洗5次，然后除去脂肪、外膜、血管等杂质，取出其中胆汁；
(3)处理样本：将（2）中样本反复离心，使用11000r/min离心25min，滤布过滤，放置与常温静置24-48h；
(4)粗提取：将（3）样本对其进行盐析。利用磁力搅拌器对其进行溶解，溶解8h-24h。常温放置12-24h。然后进行离心，使用11000r/min离心25min，过滤。即得到胆红素；
(5)冻干：对（4）得到样本进行冻干，冻干约40-48h；
(6)保存：向（5）中添加稳定剂。
本发明新鲜动物来源为猪、羊、牛、鸡中的一种。
本发明的盐析所用的盐为氯化钠、硫酸铵、氯化钙、氯化镁中的一种或多种组成，浓度为0.05-300g/L。
本发明的稳定剂为海藻糖、甘露醇、甘油、葡萄糖、叠氮钠、AES中的一种或两种。
本发明含有上述胆红素的尿液分析校准品，校准品包括胆红素、尿酸、醋酸钠、表面活性剂、防腐剂等。
本发明中尿酸浓度为0.01-0.1%w/v。
本发明中醋酸钠浓度为0.1-0.25%w/v。
本发明的表面活性剂为吐温系列、曲拉通系列中的一种，浓度为1-10mL/L。
本发明的防腐剂为叠氮钠、牛白蛋白、PC300中的一种，浓度为1-10ml/L。
本发明的胆红素的提取工艺具有以下优点 ：
(1) 操作简便，即可实现对来源的半机械化处理，克服了现有技术人工操作繁琐、提取成本高等问题的缺点；
(2)纯度高，利用盐析法得到的胆红素，其纯度在70-75%.克服了现有技术中，无法准确的做到目标纯度值且对浓度值无法控制的不足。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
实施例1
根据本发明提取的胆红素制备的尿液分析校准品，步骤为：
(1)准备：准备新鲜动物胆囊器官（宰杀1-3小时以内）；
(2)预处理：将新鲜动物胆囊用4℃的纯化水反复冲洗5次，然后除去脂肪、外膜、血管等杂质，取出其中胆汁；
(3)处理样本：将（2）中样本反复离心，使用11000r/min离心30min，滤布过滤，放置于常温静置48h；
(4)粗提取：上述（3）样本对其进行盐析。利用磁力搅拌器对其进行溶解，溶解10h。常温放置12h。然后进行离心，使用11000r/min离心30min，过滤；
(5)冻干：对（4）得到样本进行冻干，冻干约48h；
(6)保存：在（5）中添加稳定剂。
本发明新鲜动物来源为牛。
本发明的盐析所用的盐为氯化钠，浓度为58.44g/L。
本发明的稳定剂为叠氮钠、甘露醇两种。
本发明含有上述胆红素制备的尿液分析校准品，校准品包括胆红素、尿酸、醋酸钠、表面活性剂、防腐剂等。
本发明中尿素浓度为0.070%w/v。
本发明中醋酸钠浓度为0.90%w/v。
本发明中胆红素浓度分别为0.70w/v。
本发明的表面活性剂为曲拉通X-100，浓度为2mL/L。
本发明的防腐剂为PC300，浓度分别为0.43ml/L。
配制校准品的具体操作为：量取1L纯化水于烧杯中，分别加入0.070%w/v尿酸、0.90%w/v醋酸钠，胆红素0.70%w/v，搅拌溶解；再加入2mL曲拉通X-100、0.43ml海藻糖，搅拌混匀，即得到校准品。
校准品在尿液分析仪上的应用。
测试校准品：实施例1的尿液分析校准品、对比例1 的尿液分析校准品、试纸条（由长春迪瑞医疗科技股份有限公司生产）。
测试仪器：迪瑞H-300尿液分析仪。
具体操作为，设置参数，将校准品进行梯度稀释，使用尿液分析试纸条分别测试梯度样本中胆红素含量，以波长的大小检测，阴性、阳性的形式表现。
标准曲线的设定：分别将已知阴、阳性范围的尿试纸，即：“-”“+”“2+”“3+”放在尿液分析仪中，设置参数，得到以下数据：
[表1（实施例1）
表2（对比例1）
取30例不同尿试纸对比例平行进行检测，得到以下数据（表3）：
表3 的结果表明，本发明提取的胆红素制备的尿液分析校准品与对比例1测值一致。
校准尿液分析仪，检测同一尿液样本，反复校准10次，通过检测10次的结果观察重复性。结果见表4：
从表4数据可以看出，实施例1对同一样本的测定结果，重复性和对比例1相比，检测结果一致，说明本校准品具有很好的精确度。
实施例2
根据本发明提取的胆红素制备的尿液分析校准品，步骤为：
(1)准备：准备新鲜动物胆囊器官（宰杀1-3小时以内）；
(2)预处理：将新鲜动物胆囊用4℃的纯化水反复冲洗5次，然后除去脂肪、外膜、血管等杂质，取出其中胆汁；
(3)处理样本：将（2）中样本反复离心，使用8000r/min离心15min，滤布过滤，放置于常温静置40h；
(4)粗提取：上述（3）样本对其进行盐析。利用磁力搅拌器对其进行溶解，溶解10h。常温放置12h。然后进行离心，使用8000r/min离心15min，过滤；
(5)冻干：对（4）得到样本进行冻干，冻干约36h；
(6)保存：在（5）中添加稳定剂。
本发明新鲜动物来源为猪。
本发明的盐析所用的盐为氯化镁，浓度为43.5g/L。
本发明的稳定剂为海藻糖、甘露醇两种。
本发明含有上述胆红素制备的尿液分析校准品，校准品包括胆红素、尿酸、醋酸钠、表面活性剂、防腐剂等。
本发明中尿素浓度为0.080%w/v;
本发明中醋酸钠浓度为0.60%w/v。
本发明中胆红素浓度分别为0.50w/v。
本发明的表面活性剂为吐温80，浓度为0.05g/L。
本发明的防腐剂为叠氮钠，浓度分别为0.05g/L。
配制校准品的具体操作为：量取1L纯化水于烧杯中，分别加入0.080%w/v尿酸、0.60%w/v醋酸钠，胆红素0.50%w/v，搅拌溶解；再加入0.05g/L吐温80，0.05g/L叠氮钠，搅拌混匀，即得到校准品。
校准品在尿液分析仪上的应用
测试校准品：实施例2的尿液分析校准品、对比例2的尿液分析校准品、试纸条（由长春迪瑞医疗科技股份有限公司生产）。
测试仪器：迪瑞H-300尿液分析仪。
具体操作为，设置参数，将校准品进行梯度稀释，使用尿液分析试纸条分别测试梯度样本中胆红素含量，以波长的大小检测，阴性、阳性的形式表现。
标准曲线的设定：分别将已知阴、阳性范围的尿试纸，即：“-”“+”“2+”“3+”放在尿液分析仪中，设置参数，得到以下数据：
表5（实施例2）
表6（对比例2）
取30例不同尿试纸对比例平行进行检测，得到以下数据（表7）：
从表7数据可以看出，实施例2对同一样本的测定结果，重复性和对比例1相比，检测结果一致，说明本校准品具有很好的精确度。
校准尿液分析仪，检测同一尿液样本，反复校准10次，通过检测10次的结果观察重复性。结果见表8：
从表8数据可以看出，实施例2对同一样本的测定结果，重复性和对比例2相比，检测结果一致，说明本校准品具有很好的精确度。
实施例3
根据本发明提取的胆红素制备的尿液分析校准品，步骤为：
(1)准备：准备新鲜动物胆囊器官（宰杀1-3小时以内）；
(2)预处理：将新鲜动物胆囊用4℃的纯化水反复冲洗5次，然后除去脂肪、外膜、血管等杂质，取出其中胆汁；
(3)处理样本：将（2）中样本反复离心，使用10000r/min离心45min，滤布过滤，放置于常温静置48h；
(4)粗提取：上述（3）样本对其进行盐析。利用磁力搅拌器对其进行溶解，溶解12h。常温放置12h。然后进行离心，使用10000/min离心45,min，过滤；
(5)冻干：对（4）得到样本进行冻干，冻干约48h；
(6)保存：在（5）中添加稳定剂。
本发明新鲜动物来源为羊。
本发明的盐析所用的盐为硫酸铵，浓度226.0g/L。
本发明的稳定剂为葡萄糖、叠氮钠两种。
本发明含有上述胆红素制备的尿液分析校准品，校准品包括胆红素、尿酸、醋酸钠、表面活性剂、防腐剂等。
本发明中尿素浓度为0.1%w/v。
本发明中醋酸钠浓度为0.50%w/v。
本发明中胆红素浓度分别为0.10w/v。
本发明的表面活性剂为曲拉通X-200，浓度为5.5ml/L。
本发明的防腐剂为牛白蛋白，浓度分别为0.05g/L。
配制校准品的具体操作为：量取1L纯化水于烧杯中，分别加入0.1%w/v尿酸、0.50%w/v醋酸钠，胆红素0.10%w/v，搅拌溶解；再加入5.5ml/L曲拉通X-200，0.05g/L牛白蛋白，搅拌混匀，即得到校准品。
校准品在尿液分析仪上的应用
测试校准品：实施例3的尿液分析校准品、对比例3的尿液分析校准品、试纸条（由长春迪瑞医疗科技股份有限公司生产）。
测试仪器：迪瑞H-300尿液分析仪。
具体操作为，设置参数，将校准品进行梯度稀释，使用尿液分析试纸条分别测试梯度样本中胆红素含量，以波长的大小检测，阴性、阳性的形式表现。
标准曲线的设定：分别将已知阴、阳性范围的尿试纸，即：“-”“+”“2+”“3+”放在尿液分析仪中，设置参数，得到以下数据：
表9（实施例3）
表10（对比例3）
取30例不同尿试纸对比例平行进行检测，得到以下数据（表11）：
从表11数据可以看出，实施例3对同一样本的测定结果，重复性和对比例3相比，检测结果一致，说明本校准品具有很好的精确度。
校准尿液分析仪，检测同一尿液样本，反复校准10次，通过检测10次的结果观察重复性。结果见表12：
从表12数据可以看出，实施例3对同一样本的测定结果，重复性和对比例3相比，检测结果一致，说明本校准品具有很好的精确度。
Claims (9)
1.一种胆红素的提取方法，其特征在于，步骤为 ：
准备：准备新鲜动物胆囊器官（宰杀1-3小时以内）；
预处理：将新鲜动物胆囊用0-4℃的纯化水反复冲洗5次，然后除去脂肪、外膜、血管等杂质，取出其中胆汁；
处理样本：将（2）中样本反复离心，使用11000r/min离心25min，滤布过滤，放置与常温静置24-48h；
粗提取：将（3）样本对其进行盐析，利用磁力搅拌器对其进行溶解，溶解8h-24h；常温放置12-24h；然后进行离心，使用11000r/min离心25min，过滤，即得到胆红素；
冻干：对（4）得到样本进行冻干，冻干约40-48h；
保存：向（5）中添加稳定剂。
2.根据权利要求1 所述的一种胆红素的提取方法，其特征在于，所述的新鲜动物胆囊为猪、羊、牛中的一种。
3.根据权利要求1 所述的一种胆红素的提取方法，其特征在于，所述的盐析所用的盐为氯化钠、硫酸铵、氯化钙、氯化镁中的一种或多种组成，浓度为0.05-300g/L。
4.根据权利要求1 所述的一种胆红素的提取方法，其特征在于，所述的稳定剂为海藻糖、甘露醇、甘油、葡萄糖、叠氮钠、AES中的一种或两种。
5.含有权利要求1 所述的尿液分析校准品，其特征在于，尿液分析校准品包被胆红素、尿酸、醋酸钠、表面活性剂、防腐剂。
6.根据权利要求5所述的尿液分析校准品，其特征在于：所述的尿酸浓度为0.01-0.1%w/v。
7.根据权利要求5所述的尿液分析校准品，其特征在于，所述的醋酸钠浓度为0.1-0.25%w/v。
8.根据权利要求5所述的尿液分析校准品，其特征在于，所述的表面活性剂为吐温系列、曲拉通系列中的一种，浓度为1-10mL/L。
9.根据权利要求5所述的尿液分析校准品，其特征在于，所述的防腐剂为叠氮钠、牛白蛋白、PC300中的一种，浓度为1-10ml/L。
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