CN102226768A - 亚硝酸钠氧化法测定总胆红素试剂 - Google Patents

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本发明涉及亚硝酸钠氧化法测定总胆红素试剂，可有效解决线性范围宽、抗干扰性强、反应曲线规范、能迅速达到终点且测定的准确度和精密度高且能实际应用无污染环境的问题，方法是，其中试剂1是，由柠檬酸三钠2.25～5.26g、柠檬酸16.40～19.80g、聚乙二醇辛基苯基醚0.10～1.0ml、乙二胺四乙酸二钠0.20～0.65g，加水至1000ml混匀组成，pH值2.2～3.6；试剂2是，由亚硝酸钠0.14～0.56g、氢氧化钠0.05～0.15g、碳酸钠0.10～0.30g，加水至1000ml混匀组成，pH值11～13，本发明组份科学，易生产，成本低，性能稳定，保质期长，测试准确，无环境污染。

Description

亚硝酸钠氧化法测定总胆红素试剂
一、技术领域
本发明涉及测定血清、血浆或尿液中总胆红素的试剂，具体讲是一种亚硝酸钠氧化法测定总胆红素试剂。
二、背景技术
总胆红素(TBil)是人体内结合(直接)胆红素与非结合(间接)胆红素的总和。总胆红素增加，通常是由于胆道阻塞、肝炎、肝硬化、溶血性综合症和某些遗传性酶缺乏。近年来一些研究表明血液中胆红素低于正常值常与冠心病有关，因此，对人体的血清、血浆或尿液中总胆红素的测定，是医学检验最常规的项目之一。
测定总胆红素的试剂目前主要有以下三种：重氮法测定总胆红素的试剂、酶法测定总胆红素的试剂和化学氧化法测定总胆红素的试剂。
重氮法测定总胆红素的试剂：历史最久，在严格控制操作环境温度、时间、步骤下，采用该试剂对总胆红素水平偏高的样本检出率较高，且试剂价格低廉，所以目前仍广泛应用。但采用该试剂对总胆红素的检测操作复杂、试剂不稳定、反应不专一等问题一直是困扰医学工作者的难题，虽然100多年来人们做过无数次的改良，但至今仍无满意的结果。
酶法测定总胆红素的试剂：采用该试剂测定总胆红素具有简单、特异的特点。但由于酶催化胆红素反应速度慢，尤其是难以催化δ胆红素反应，因此实际测得为葡萄糖醛酸结合胆红素与非结合胆红素的值，而不能真实反映总胆红素。且某些特殊病人样本如光照疗法后产生的光胆红素(不属于胆红素)亦可参与反应，导致测值不准确，这些缺点大大限制了其应用。另外酶法测定总胆红素的试剂酶热稳定性差，保存时间短，价格过高，不利于推广应用。所以，目前虽然已能进入临床应用，但远非完善，还需继续研究。
化学氧化法测定总胆红素的试剂：从上世纪九十年代起，化学氧化法中的钒酸氧化法测定总胆红素的试剂开始在国外实际应用，从1998年起钒酸氧化法测定总胆红素的试剂开始进入我国。与重氮法测定总胆红素的试剂和酶法测定总胆红素的试剂相比，钒酸氧化法测定总胆红素的试剂逐步显示出测定总胆红素时其操作简单方便、试剂稳定、保存时间长(如双试剂型在室温下可以稳定一年，置于仪器的试剂仓中可以稳定一个月以上)以及价格低廉等优点。但该试剂测低值样本时，副反应较明显而影响结果，且有一定毒性，尤其是废弃物可能被还原成剧毒的偏钒酸盐而污染环境，因此测定总胆红素的试剂有待改进或创新。
三、发明内容
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明目的在于提供一种亚硝酸钠氧化法测定总胆红素试剂，可有效解决线性范围宽、抗干扰性强、反应曲线规范、能迅速达到终点且测定的准确度和精密度高且能实际应用无污染环境的问题。
本发明的技术方案是，该试剂由试剂1和试剂2组成，其中试剂1是，由柠檬酸三钠2.25～5.26g、柠檬酸16.40～19.80g、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)0.10～1.0ml、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)0.20～0.65g，加水至1000ml混匀组成，PH值2.2～3.6；试剂2是，由亚硝酸钠0.14～0.56g、氢氧化钠0.05～0.15g、碳酸钠0.10～0.30g，加水至1000ml混匀组成，PH值11～13。
在以上组分中，柠檬酸三钠与柠檬酸形成稳定的缓冲液，利于试剂中各种成分的分散稳定性。Triton X-100表面活性剂，是非水溶性间接胆红素的增溶剂，是反应的促进剂、润滑剂，它提高检测的灵敏度，促进样本中各种物质溶解，减少样本脂浊等对测定的影响，亚硝酸钠主要起氧化性的作用。
用本发明的亚硝酸钠氧化法测定总胆红素的试剂基于下列原理测定总胆红素：亚硝酸钠可以氧化直接胆红素和间接胆红素，此时吸光度的减少和血清中的胆红素成正比，测定450nm下的吸光度的减少来计算血清中总胆红素的含量，本发明组份科学，新颖独特，易生产，成本低，性能稳定，保质期长，测试准确，无环境污染。
四、具体实施方式
实施例1
本发明在具体实施中，所述的试剂1是，由柠檬酸三钠4.41g、柠檬酸17.85g、聚乙二醇辛基苯基醚0.25ml、乙二胺四乙酸二钠0.37g，加蒸馏水至1000ml，混匀组成，PH值为2.9；所述的试剂2是，由亚硝酸钠0.32g、氢氧化钠0.1g、碳酸钠0.2g，加蒸馏水至1000ml，混匀组成，PH值为12。
用本实施例的亚硝酸钠氧化法测定总胆红素的试剂基于下列原理测定总胆红素：亚硝酸钠可以氧化直接胆红素和间接胆红素，此时吸光度的减少和血清中的胆红素成正比，测定450nm下的吸光度的减少来计算血清中总胆红素的含量。
温度37℃；比色杯光径1.0cm 波长450nm
样品和标准品各10μl；所说的样品为被测品，即血清、血浆或尿液，所说的标准品为具有溯源性的定值血清，以下同
试剂1(简称R1，以下同)240μl；试剂2(简称R2，以下同)60μl
样品(标准品)加R1混匀，37℃孵育5min后读取吸光度A1；加入R2混匀，37℃孵育5mm后读取吸光度A2，ΔA＝A2-A1。
计算
Figure BSA00000453109000021
所说的ΔA样品为样品加入试剂1与加入试剂2后两次吸光度的差；ΔA标准为标准品加入试剂1与加入试剂2后两次吸光度的差(以下同)。
实施例2
本发明在具体实施中，还可以是，试剂1由柠檬酸三钠2.25g、柠檬酸19.80g、聚乙二醇辛基苯基醚0.10ml、乙二胺四乙酸二钠0.20g，加蒸馏水至1000ml，PH值为2.2；试剂2由亚硝酸钠0.14g、氢氧化钠0.05g、碳酸钠0.10g，加蒸馏水至1000ml，PH值为11。
本实施例2的试剂测定总胆红素的方法同实施例1，不再重述。
实施例3
本发明在具体实施中，还可以是，所述的试剂1由柠檬酸三钠5.26g、柠檬酸16.40g、聚乙二醇辛基苯基醚1.0ml、乙二胺四乙酸二钠0.65g，加蒸馏水至1000ml，PH值为3.6；试剂2由亚硝酸钠0.56g、氢氧化钠0.15g、碳酸钠0.30g，加蒸馏水至1000ml，PH值为13。
本实施例3的试剂测定总胆红素的方法同实施例1，不再重述。
本发明试剂进行了性能检测，并与现有的钒酸氧化法测定总胆红素的试剂进行临床样品对比试验，结果如下：
仪器：HITICH7060全自动生化分析仪
准确度试验
取RANDOX质控品正常值(批号561UN)、异常值(批号384UE)，用本发明试剂进行测试，每个浓度样品重复测试3次。
Figure BSA00000453109000031
精密度(变异系数CV)试验
取本发明三个批号的试剂，每个批号对RANDOX质控品正常值(批号561UN)T.Bili值27.2μmol/L进行10次重复测定，然后计算测定值的均数X、测定值的标准差S与测定值的变异系数CV值，其公式如下：
CV = S X ‾ × 100 %
其批内精密度(变异系数CV)为1.38％，批间精密度(变异系数CV)为1.74％。
线性试验
  理论值(μmol/L)   0   50   100   200   400   800
  本试剂测定值(μmol/L)   0   50   99   201   395   792
  现有试剂测定值(μmol/L)   0.2   51   103   189   386   675
临床对比试验
同时用本发明试剂与现有的钒酸氧化法测定总胆红素的试剂检测临床病人血清标本100例，数据和统计结果如下：
Figure BSA00000453109000051
两种试剂所测两组结果的相关性(r)＝0.9967。
综上所述，本发明亚硝酸钠氧化法测定总胆红素的试剂与现有技术(化学氧化法)的矾酸盐氧化法测定总胆红素的试剂相比，本发明的试剂既保留了现有试剂的优点：操作简便，试剂稳定，保存期长，又降低了成本，成本降低50％以上，且对环境无污染，经济和社会效益巨大，是测定总胆红素试剂上的创新。

Claims (4)

1.一种亚硝酸钠氧化法测定总胆红素试剂，其特征在于，该试剂由试剂1和试剂2组成，其中试剂1是，由柠檬酸三钠2.25～5.26g、柠檬酸16.40～19.80g、聚乙二醇辛基苯基醚0.10～1.0ml、乙二胺四乙酸二钠0.20～0.65g，加水至1000ml混匀组成，PH值2.2～3.6；试剂2是，由亚硝酸钠0.14～0.56g、氢氧化钠0.05～0.15g、碳酸钠0.10～0.30g，加水至1000ml混匀组成，PH值11～13。
2.根据权利要求1所述的亚硝酸钠氧化法测定总胆红素试剂，其特征在于，所述的试剂1是，由柠檬酸三钠4.41g、柠檬酸17.85g、聚乙二醇辛基苯基醚0.25ml、乙二胺四乙酸二钠0.37g，加蒸馏水至1000ml，混匀组成，PH值为2.9；所述的试剂2是，由亚硝酸钠0.32g、氢氧化钠0.1g、碳酸钠0.2g，加蒸馏水至1000ml，混匀组成，PH值为12。
3.根据权利要求1所述的亚硝酸钠氧化法测定总胆红素试剂，其特征在于，试剂1由柠檬酸三钠2.25g、柠檬酸19.80g、聚乙二醇辛基苯基醚0.10ml、乙二胺四乙酸二钠0.20g，加蒸馏水至1000ml，PH值为2.2；试剂2由亚硝酸钠0.14g、氢氧化钠0.05g、碳酸钠0.10g，加蒸馏水至1000ml，PH值为11。
4.根据权利要求1所述的亚硝酸钠氧化法测定总胆红素试剂，其特征在于，所述的试剂1由柠檬酸三钠5.26g、柠檬酸16.40g、聚乙二醇辛基苯基醚1.0ml、乙二胺四乙酸二钠0.65g，加蒸馏水至1000ml，PH值为3.6；试剂2由亚硝酸钠0.56g、氢氧化钠0.15g、碳酸钠0.30g，加蒸馏水至1000ml，PH值为13。
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