CN105203533A - 一种分析灵敏度高的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶检测试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分析灵敏度高的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶检测试剂。本发明试剂包括试剂R1和试剂R2，本发明以人工合成物5-（4-（3-甲基-苯乙烯）-绕丹宁-3-乙酸氨基-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷作为反应底物，提高了试剂的灵敏度；试剂使用了MES(2-(N-吗啡啉）乙磺酸)缓冲液和AMP（2-氨基-2-甲基-1-丙醇）两种缓冲液，在保证缓冲能力的同时还能够促进NAG酶的催化作用，有效提高强碱性环境，保证了显色的效率；通过合理搭配使用组分使试剂整体灵敏度、特异性和准确性均较高，有利于在市场中进一步的推广使用。

Description

一种分析灵敏度高的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶检测试剂

技术领域

本发明涉及一种分析灵敏度高的尿液N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）检测试剂。

背景技术

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（NAG）是存在于细胞溶酶体内的一种水解酶，尿中NAG主要来自肾近曲小管上皮细胞，但健康人尿中含量甚微。尿NAG活性水平的增高，是早期肾损伤和糖尿病微血管病变的敏感指标。NAG活性可用于肾小管间质性肾炎、尿路感染、糖尿病肾病综合症、高血压肾病、肾移植后的排异反应和肾病综合症的早期诊断。上述疾病时NAG活性的升高均早于其他相应指标，有利于疾病的早期发现和及时治疗。NAG活性还可用于重金属等肾毒性物质环境污染的人群筛查、职业病调查等。检测尿液NAG的方法较多，目前有连续监测法、热变性分析法、免疫分析法、终点比色法等相关方法，其中连续检测方法，对仪器要求较高，并且试剂容易发生衰减，目前需要攻克的难题还很多，使用不是很多；热变性分析法，此法是基于NAG同工酶之同热稳定性差别进行分析的。该法操作简单、快速，但重复性不好，误差大。免疫分析法，此类方法是基于同工酶免疫原性不同而建立的包括免疫沉淀法、免疫捕获法、酶联免疫吸附等相关方法，这些方法特异性较强，检测结果准确，但是大多操作比较复杂，成本较高，不便于临床大规模推广，目前临床上使用较多的大多是比色终点法，这种方法的基本原理就是NAG底物在NAG的催化作用下生成相关的产物，生成物在强碱性环境下会发生变色反应，其变化程度与样本中的NAG活性成正比，从而检测NAG的活性。其中比色法的种类比较多，较为传统的是PNP-NAG法这种方法是以对硝基苯-β-D-氨基葡萄糖苷PNP-NAG)为底物，在37℃与酶反应一段时间，尿中NAG催化底物水解释放PNP，然后用碱液终止反应并显色，在405nm波长处测定吸光度，根据工作曲线或摩尔吸光系数计算NAG活力，PNP-NAG法缺点是必设样品空白，而且操作费时，不适合于大批量自动化分析。1983年Noto提出以间甲酚磺酞-N乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(MCP-NAG)为底物称为MCP-NAG法，该法可以避免尿色原的干扰，可以不做空白，但是底物成本非常高；l961年；Leaback提出以无荧光4-甲基伞形酮-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(4MU-NAG)为底物，该法灵敏度高，与PNP法相关好，又不受尿色干扰，现已有国产试剂，但是需要荧光光度计，对仪器和操作人员的要求相对较高，仪器多需要进口仪器，因此这无疑增加了使用科室的成本。因此根据目前检测方法中存在的分析灵敏度太低，或者底物过于昂贵或者对仪器、人员要求过高等问题，特发明了一种分析灵敏度高的NAG检测试剂，该试剂选取人工合成的5-（4-（3-甲基-苯乙烯）-绕丹宁-3-乙酸氨基-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷作为底物，优化反应体系，增加激活剂和表面活性剂，来提高产品的分析灵敏度，本发明底物成本相对较低，适合全自动生化分析仪器的使用，非常有利于临床使用，甚至是普通医院的使用和推广。

发明内容

本发明的目的是提供一种分析灵敏度高的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶检测试剂（NAG）检测试剂。

本发明采用以下技术方案：

一种分析灵敏度高的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶检测试剂，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2，

所述试剂R1的组成如下：

MES缓冲液30mmol/L

底物5.3mmol/L

金属离子螯合剂5mmol/L-10mmol/L

抗坏血酸氧化酶1KU/L-5KU/L

氯化钾10g/L-20g/L

氯化锂13.5g/L-18g/L

叠氮钠2g/L-5g/L

十六烷基三甲基溴化铵1g/L-2g/L

3-磺丙基十四烷基二甲基甜菜碱5g/L-10g/L；

所述试剂R2的组成如下：

AMP缓冲液100mmol/L

曲拉通4053mL/L-5mL/L

叠氮钠2g/L-5g/L。

所述MES缓冲液为25℃，pH为4.6的MES缓冲液。

所述底物为5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯-绕丹宁)]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷。

所述金属离子螯合剂为环己二胺四乙酸。

所述AMP缓冲液为25℃，pH为9.85的AMP缓冲液。

本发明基本原理如下：

在37℃，pH4.6的条件下，NAG酶水解VRA-NAG（5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯-绕丹宁)]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷）糖苷链游离出VRA（5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯-绕丹宁)]-3-乙酸铵），VRA在强碱性环境中呈红色，在505nm上机可测出相应的吸光度变化量为酶定量。

本发明试剂的使用方法为：使用全自动生化分析仪利用终点法进行测定，检测主波长为505nm。检测时，R1试剂和R2试剂的比例为3:1。

本发明的有益效果：

1）本发明优先选择了人工合成物5-（4-（3-甲基-苯乙烯）-绕丹宁-3-乙酸氨基-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷作为反应底物，这种底物成本相对低廉，反应生成物显色能力强，提高了试剂的灵敏度；

2）在试剂R1和R2中分别使用了MES(2-(N-吗啡啉）乙磺酸)缓冲液和AMP（2-氨基-2-甲基-1-丙醇）缓冲液，这两种缓冲液都是生物缓冲液，在保证缓冲能力的同时，R1缓冲液能够促进NAG酶的催化作用，R2缓冲液能够有效提高强碱性环境，保证了显色的效率；

3）在试剂的R1中加入了十六烷基三甲基溴化铵和3-磺丙基十四烷基二甲基甜菜碱这两种表面活性剂能够有效提高试剂的乳化作用，提高NAG酶的活性，抑制其他的副反应；在R2试剂中添加了曲拉通405作为表面活性剂，对最后的显色反应能有很强的增效作用；

4）在试剂R1中加入了环己二胺四乙酸（CDTA），能够有效的螯合重金属离子，能够较好的提高试剂的准确性；

5）本发明在R1中使用了氯化钾和氯化锂作反应的离子平衡剂，同时氯化锂作为反应的激活剂，激活酶催化底物的能力，保证反应的特异性和准确性；

6）本法明优选选择较为廉价的叠氮钠作为防腐剂。

附图说明

图1为实施例1和酶联免疫吸附试验相关性曲线图；

图2为实施例2和酶联免疫吸附试验相关性曲线图；

图3为实施例3和酶联免疫吸附试验相关性曲线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。

实施例1

一种传统的PNP-NAG法检测试剂，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：

R1试剂：

甘氨酸缓冲液30mmol/L

对硝基苯-β-D-氨基葡萄糖苷16mmmol/L

叠氮钠1g/L

R2试剂：

pH10.2的硼砂缓冲液_·100mmol／L

叠氮钠1g/L。

实施例2

一种分析灵敏度高的NAG检测试剂，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：

R1试剂组成：

MES(2-(N-吗啡啉）乙磺酸)缓冲液30mmol/L

5-（4-（3-甲基-苯乙烯）-绕丹宁-3-乙酸氨基-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷5.3mmol/L

环己二胺四乙酸（CDTA）5mmol/L

抗坏血酸氧化酶1KU/L

氯化钾10g/L

氯化锂13.5g/L

叠氮钠2g/L

十六烷基三甲基溴化铵1g/L

3-磺丙基十四烷基二甲基甜菜碱5g/L

R2试剂组成：

AMP100mmol/L

曲拉通4053mL/L

叠氮钠2g/L。

实施例3

一种分析灵敏度高的NAG检测试剂，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1和试剂R2的组成如下：

R1试剂组成：

MES缓冲液30mmol/L

5-（4-（3-甲基-苯乙烯）-绕丹宁-3-乙酸氨基-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷5.3mmol/L

环己二胺四乙酸（CDTA）10mmol/L

抗坏血酸氧化酶5KU/L

氯化钾20g/L

氯化锂18g/L

叠氮钠5g/L

十六烷基三甲基溴化铵2g/L

3-磺丙基十四烷基二甲基甜菜碱10g/L

R2试剂组成：

AMP100mmol/L

曲拉通4055mL/L

叠氮钠5g/L。

分别将实施例1、实施例2和实施例3所得试剂在具有双试剂功能的全自动生化分析仪检测使用，利用速率法进行测定。

1）检测使用方法：将试剂R1和R2按照3:1的比例放置到对应的试剂位上，在样品盘的对应位置放置好蒸馏水、标准品和样本，操作如表1：

计算：一种分析灵敏度高的NAG含量（U/L）＝（ΔA测定÷ΔA标准）×C标准。

2）干扰性试验：取新鲜混合血清，分成2等份，然后将每等份再分成6等份，加入不同的干扰物质，使其在血清中的浓度达到表2的要求。然后分别用实施例2和实施例3所得试剂，同时对比测定血清中NAG的含量，加入不同干扰物质后各组的测定结果见表2。相对偏差(%)=(干扰样本的测定均值－无干扰物质的样本的测定均值)/无干扰物质的测定均值×100%。

由表2可以看出，实施例2和3的试剂在抗坏血酸≤1500μmol/L、胆红素≤4.6mg/L、丙酮酸≤20mg／L、尿酸≤800μmol／L、葡萄糖≤50mmol/L对测试结果没有明显干扰，因而本试剂的抗干扰性能较好。

3）相关性实验：利用实施例1、2和实施例3中的配方配制试剂，与酶联免疫吸附试验检测血清NAG进行对照检测，同时检测了20个临床血清样本，检测结果如表3所示。并获得了3种试剂分别与酶联免疫吸附试验检测结果的相关性曲线（如图1-图3所示）。

表3实施例1-3试剂与酶联免疫吸附试验检测血清对比检测结果

样本号	实施例1试剂（U/L）	实施例2试剂（U/L）	实施例3试剂（U/L）	酶联免疫吸附试验（U/L）
					1	0	0.2	0.3	0.2
2	1.2	1.6	1.4	1.5
					3	50.1	55.1	55.3	56.9
4	36.8	30.2	30.2	32.6
					5	15.1	14.6	14.5	15.1
6	0.1	0.2	0.3	0.3
					7	1.1	1.9	1.2	1.5
8	3.6	2.1	2.4	2.5
					9	5.5	6.4	6.3	6.9
10	4.6	4.8	4.5	3.3
					11	2.1	3.1	3.3	2.4
12	9.6	12.9	12.9	12.5
					13	15.6	12.5	10.4	11.1
14	20.3	24.3	28.6	25.6
					15	17.3	20.3	19.6	17.6
16	5.1	5.3	5.5	5.6
					17	2.1	3.1	3.1	3.3
18	1.1	0.6	0.6	0.5
					19	0.5	0.7	0.6	0.8
20	15.5	17.1	16.5	16.3
					与酶免相关性	r=0.9848	r=0.9971	r=0.9967

通过检测结果显示，实施例1试剂和实施例2以及实施例3与酶联免疫吸附试验检测血清的NAG相关系数r分别为0.9848、0.9971、0.9967，说明了实施例2和实施例3中的试剂与酶联免疫吸附试验的相关性要比实施例1与酶联免疫吸附试验的相关性要好很多。

4）灵敏度实验：

分别将实施例1、实施例2、实施例3与酶联免疫吸附试验对9个不同浓度的样本进行检测，样本浓度由低到高，分别记录对比检测结果，如表4所示。

表4实施例1-3与酶联免疫吸附试验检测不同浓度血清对比检测结果

理论浓度	实施例1试剂（U/L）	实施例2试剂（U/L）	实施例3试剂（U/L）	酶联免疫吸附试验（U/L）
					0.1	0	0.09	0.11	0.1
0.2	0	0.21	0.22	0.19
					0.4	0.1	0.39	0.42	0.4
0.8	0.3	0.84	0.81	0.81
					1.6	1.9	1.72	1.63	15.5
3.2	2.7	3.12	3.12	3.35
					6.4	5.5	6.5	6.2	6.3
12.8	12.1	12.9	12.2	12.5
					25.6	22.6	25.3	25.3	25.6

通过表4中的内容可以看出，实施例1中的对于低值的样本检测结果非常的不准确，甚至出现0值，而实施例2与实施例3和酶联免疫吸附试验检测结果较好，这说明实施例2和实施例3检测试剂有非常高的灵敏度和准确度。

Claims (5)

1.一种分析灵敏度高的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶检测试剂，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2，

所述试剂R1的组成如下：

MES缓冲液30mmol/L

底物5.3mmol/L

金属离子螯合剂5mmol/L-10mmol/L

抗坏血酸氧化酶1KU/L-5KU/L

氯化钾10g/L-20g/L

氯化锂13.5g/L-18g/L

叠氮钠2g/L-5g/L

十六烷基三甲基溴化铵1g/L-2g/L

3-磺丙基十四烷基二甲基甜菜碱5g/L-10g/L；

所述试剂R2的组成如下：

AMP缓冲液100mmol/L

曲拉通4053mL/L-5mL/L

叠氮钠2g/L-5g/L。

2.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述MES缓冲液为25℃，pH为4.6的MES缓冲液。

3.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述底物为5-[4-(3-甲氧基-苯甲烯-绕丹宁)]-3-乙酸铵-N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷。

4.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述金属离子螯合剂为环己二胺四乙酸。

5.根据权利要求1所述的检测试剂，其特征在于，所述AMP缓冲液为25℃，pH为9.85的AMP缓冲液。