CN1687450A - 一种N－乙酰－β－D－氨基葡萄糖苷酶测定方法及液体型稳定试剂 - Google Patents

一种N－乙酰－β－D－氨基葡萄糖苷酶测定方法及液体型稳定试剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测N－乙酰－β－D－氨基葡萄糖苷酶的测定方法及其液体型稳定试剂。其特点是：通过采用固定时间两点法和连续监测法，以稳定的液体试剂实现对体液中N－乙酰－β－D－氨基葡萄糖苷酶的自动化测定。底物分解的速率与N－乙酰－β－D－氨基葡萄糖苷酶的含量成正比，以固定时间两点法和连续检测法实现体液样本中N－乙酰－β－D－氨基葡萄糖苷酶的含量测定。采用本法制备的液体型测定试剂稳定、方便、抗干扰能力强，测定试剂置2－8℃保存可稳定12个月以上，特别适合进行批量自动化检测。

Description

一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶 测定方法及液体型稳定试剂
技术领域
本发明涉及一种N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶测定方法及其液体型稳定试剂领域。
背景技术
目前N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶在临床应用中的测定方法主要包括：放免分析法、荧光分析法、终点显色法等。放免分析法、荧光分析法和终点显色法的共同特点是需要特殊的仪器，操作烦琐，试验时间长，不适用于临床大流量的自动化分析。现在国内测定尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖(NAG)活性使用最广的是CPNA连续监测法测定试剂盒(干粉)和PNP固定时间两点法测定试剂盒(干粉+缓冲液)。CPNP连续监测法干粉测定试剂在复溶后，稳定期短(4℃保存只能稳定7天)，用户使用成本高。PNP固定时间两点法测定试剂盒(型号：干粉+缓冲液)其测定灵敏度是CPNP连续监测法的三倍，但由于该试剂盒干粉底物非常难溶解，临床实际使用时间十分不便，且干粉底物用缓冲复溶后也只能稳定15天左右。
本发明的目的是为了解决上述技术的不足，提供一种能够直接使用、无需复溶、稳定性强、测定结果受外界干扰小的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶测定方法及其液体型稳定试剂。该测定试剂置2-8℃保存可至少可稳定12个月，提供的方法和试剂可以应用于目前广泛使用的临床生化自动分析仪，从而达到大规模测定样本的要求。
发明内容
本发明提供了一种基于液体试剂稳定技术的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶测定方法及其液体型稳定试剂，用于体液样本中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性的测定。该测定体系主要是通过体液样本中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶作用于对硝基苯-β-D-N-乙酰-氨基葡萄糖苷、间甲氧基硝基乙烯基-β-D-N-乙酰-氨基葡萄糖苷、6-甲基-2-吡啶-N-乙酰-1-硫-β-D-N-乙酰-氨基葡萄糖苷、4-羟甲基-2-吡啶-N-乙酰-1-硫-β-D-氨基葡萄糖苷等底物，使底物分解，以固定时间两点法或连续检测法进行测定底物分解速率，实现对样本中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷的含量测定。
为了达到理想的检测效果与足够的稳定性，本发明提供的固定时间两点法N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷检测试剂，特别可以分为A、B、C三个组份；提供的连续监测法N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷检测试剂，特别可以分为A、B二个组份。两种测定试剂的各个组份的具体成份组成如下。
1.固定时间两点法N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷检测试剂：
A组份：
底物液                               5-30mmol/L
表面活性剂                           0.5-15g/L
稳定剂                               10-100mmol/L
防腐剂                               0.5-5g/L
去干扰剂                             0.1-10mmol/L
B组份：
缓冲液                               100-500mol/L
防腐剂                               0.5-5g/L
表面活性剂                           0.5-15g/L
C组份：
终止液                               50-500mmol/L
2.连续监测法N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷检测试剂：
A组份：
缓冲液                               100-500mmol/L
防腐剂                               0.5-5g/L
表面活性剂                           0.5-15g/L
去干扰剂                             0.1-10mmol/L
B组份：
底物液                               5-30mmol/L
表面活性剂                           0.5-15g/L
稳定剂                              10-100mmol/L
防腐剂                              0.5-5g/L
为了提高上述测定试剂的准确性和稳定性，消除测定结果受外界的多种干扰，所述的固定时间两点法测定试剂中优选的底物是硝基苯-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷、间甲氧基硝基乙烯基-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷；连续测法测定试剂中优先的底物是6-甲基-2-吡啶-N-乙酰-1-硫-β-D-氨基葡萄糖苷、4-羟甲基-2-吡啶-N-乙酰-1-硫-β-D-氨基葡萄糖苷；表面活性剂为Tween20、Tween80、Brij35、Brij98、乳化剂OP、TritonX-100、F68、F-88等非离子型表面活性剂；缓冲液是GOOD’S缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸、醋酸钠缓冲液、柠檬酸、柠檬酸三钠缓冲液、邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液等；稳定剂是EDTA-2Na、抗生素、多元醇、BSA、冠醚、二价金属离子等；去干扰剂是抗坏血酸氧化酶、亚铁氰化钾、亚铁氰化钠、铁氰化钾等；防腐剂是NaN3、PC系列防腐剂等。
具体实施方式
实施例1：固定时间两点法测定试剂，选用对硝基苯-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷为NAG作用的底物，表面活性剂优选为F88，稳定剂优选为EDTA-2Na。
A组份：
对硝基苯-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷              20mmol/L
F88(表面活性剂)                               5g/L
EDTA-2Na(稳定剂)                              50mmol/L
NaN3(防腐剂)                                  1g/L
坏血酸氧化酶(去干扰剂)                        8mmol/L
B组份：
pH4.6柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液                 50mmol/L
NaN3(防腐剂)                                  1g/L
F88(表面活性剂)                               5g/L
C组份：
NaOH(终止液)                                  100mmol/L
在实施例1的试剂用于测定前，将A组份和B给份按5∶1的比例混合为测定试剂R1，C组份为测定试剂R2。测定样本时，采用固定时间两点法，温度为37℃，R1：样本：R2为300∶20∶100，测定波长为405nm-410nm，R1加入样本或标准后在测定温度孵育300秒后读取第1点吸光度，然后加入R2继续孵育150-300秒后读取第2点吸光度。
实施例2：固定时间两点法测定试剂，选用间甲氧硝基乙烯基-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷为NAG作用的底物，表面活性剂优选为乳化剂OP，稳定剂优选为甘露醇。
A组份：
间甲氧基硝基苯-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷        16mmol/L
乳化剂OP                                      10ml/L
甘露醇                                        12g/L
PC800                                         1g/L
坏血酸氧化酶                                  8mol/L
B组份：
pH4.4甘氨酸缓冲液                            80mmol/L
PC800                                         1g/L
乳化剂OP                                      10ml/L
C组份：
PH10.0硼砂缓冲液                             100mmol/L
实施例2的测定方法与实施例1相同，但测定波长调整为505nm，以便有效地提高测定试剂的灵敏度和抗干扰能力。
实施例3：连续监测法测定试剂，选用6-甲基-2-吡啶-N-乙酰-1-硫-β-D-氨基葡萄苷为NAC作用的底物，表面活性剂优选为Brij35，稳定剂优选为18-冠5醚。
A组份：
PH4.4醋酸-醋酸纳缓冲液                       200mmol/L
PC800                                         1g/L
Brij35                                        8g/L
亚铁氰化钾                                       1mmol/L
B级分：
6-甲基-2-吡啶-N-乙酰-1-硫-β-D-氨基葡萄苷        12mmol/L
Brij35                                           8g/L
18-冠5醚                                         200mmol/L
PC800                                            1g/L
实施例3的试剂用于测定时，试剂无需配制直接使用，A组份为测定试剂R1，B组份为测定试剂R2。测定样本时，采用连续监测法，温度为37℃，R1∶样本∶R2为300∶20∶100，测定波长为340nm，R1加入样本或标准后在测定温度孵育180秒后加入R2，延迟120秒开始读数，连续读取180秒吸光度的变化，用于计算样本中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的活性。
实施例4：连续监测法测定试剂，选用4-羟甲基-2-吡啶-N-乙酰-1-硫-β-D-氨基葡萄糖苷为NAG作用的底物，表面活性剂优选为TritonX-100，稳定剂优选为18-冠5醚和EDTA-2Na的组合。
A组份：
pH4.5邻苯二甲酸氢钾缓冲液                       150mmol/L
PC800                                            1g/L
TritonX-100                                      2ml/L
铁氰化钾                                         1mmol/L
B组份：
4-羟甲基-2-吡啶-N-乙酰-1-硫-β-D-氨基葡萄糖苷    15mmol/L
TritonX-100                                      2ml/L
18-冠5醚                                         200mmol/L
EDTA-2Na                                         20mmol/L
PC800                                            1g/L

Claims (7)

1  一种检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的测定方法，其特征在于：所述的固定时间两点法测定试剂底物，是基硝基苯-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷、间甲氧基硝基乙烯基-β-D-N-乙酰氨基葡萄糖苷；连续监测法测定试剂，底物是6-甲基-2-吡啶-N-乙酰-1-硫-β-D-氨基葡萄糖苷、4-羟甲基2-吡啶-N-乙酰-1-硫-β-D-氨基葡萄糖苷；表面活性剂为Tween20、Tween80、Brij35、Brij98、乳化剂OP、TritonX-100、F68、F-88等非离子型表面活性剂；缓冲液是GOOD’S缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸-醋酸钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液、邻苯二甲酸氢钾-盐酸缓冲液等；稳定剂是DETA-2Na、抗生素、多元醇、BSA、冠醚、二价金属离子等；去干扰剂是抗坏血酸氧化酶、亚铁氰化钾、亚铁氰化钠、亚铁化钾等；防腐剂是NaN3、PC系列防腐剂等。
2、根据权利要求1所述，固定时间两点检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体稳定试剂，其特征在于：A、B、C三个组份的成份组成。
A组份：底物液                   5-30mmol/L
       表面活性剂               0.5-15g/L
       稳定剂                   10-100mmol/L
       防腐剂                   0.5-5g/L
       去干扰剂                 0.1-10mmol/L
B组份：缓冲液                   100-500mol/L
       防腐剂                   0.5-5g/L
       表面活性剂               0.5-15g/l
C组份：终止液                   50-500mmol/L。
3、根据权利要求1所述：连续检测法检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体稳定试剂，其特征在于：A、B二个组份的成份组成。
A组份：缓冲液                   100-500mol/L
       防腐剂                   0.5-5g/L
       表面活性剂               0.5-15g/L
       去干扰剂                 0.1-10mmol/L
B组份：底物液                   5-30mmol/L
       表面活性剂               0.5-15g/L
       稳定剂                   10-100mmol/L
       防腐剂                   0.5-5g/L。
4、根据权利要求1、2、3所述：检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体稳定试剂，其特征在于：选用的缓冲液为柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。
5、根据权利要求1、2、3所述：检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体稳定试剂，其特征在于：特别优选非离子型表面活性剂。
6、根据权利要求1、2、3所述：检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体稳定试剂，其特征在于：冠醚类试剂。
7、根据权利要求1、2、3所述：检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的液体稳定试剂，其特征在于：抗坏血酸氧化酶。
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