CN1261766C - 血清铜、铁、锌检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

血清铜、铁、锌检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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CN1261766C CN 200410096340 CN200410096340A CN1261766C CN 1261766 C CN1261766 C CN 1261766C CN 200410096340 CN200410096340 CN 200410096340 CN 200410096340 A CN200410096340 A CN 200410096340A CN 1261766 C CN1261766 C CN 1261766C
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Abstract

本发明公开了一种用于测定血清中铜、铁、锌含量的操作简便快速、灵敏度高且不需去蛋白的试剂盒，为此，本发明还提供了该试剂盒的制备方法。本发明试剂盒在表面活性剂存在下的缓冲体系中，血清中与蛋白结合的铜、铁、锌解离，与吡啶偶氮类有机物络合显色，显色络合物在波长550-600nm处有最大吸收波长，反应液在波长550-600nm处的吸光度与铜、铁、锌离子浓度在一定范围内成正比，适用手工测定和自动分析。

Description

血清铜、铁、锌检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及分别用于检测血清中铜、铁、锌含量的快速灵敏检测试剂盒及其各试剂盒的制备方法。
背景技术
铜、铁、锌是人体必需的微量元素。
血清铜增高见于白血病、何杰金氏病、色素沉着症、肺结核、恶性贫血、恶性肿瘤等。血清铜降低见于婴儿贫血、婴儿营养不良Menkes卷发综合症、肝豆状核变性等。测定血清铜的方法很多，目前临床上首选的方法是原子吸收分光光度法、国外大部分实验室采用该法，但该法仪器昂贵，在我国临床实验室中难以普及，目前临床上广泛实验的是分光光度法，分光光度法第一种方法是采用双环己酮酰二腙(简称铜试剂)，该法灵敏度低(ε为1.6×104L·mol-1·cm-1)，血清用量大，且需去蛋白，操作时间长、繁；第二种方法是采用2，9-二甲基4，7-二苯基-1，10-菲啰啉，该法灵敏度不高(ε为1.4×104L·mol-1·cm-1)，试剂价格贵，需进口。
锌是许多金属酶的辅助因子。由于合成DNA、RNA必需的许多金属酶都需要锌，因此它是细胞分裂所必不可少的，尤其是在生命的高速生长期是如此，如婴儿、青少年、孕妇。血清锌有“生命之花”的美称。血清锌升高常见于锌中毒。目前，锌的测定方法较多，但长期以来，尚缺乏可以在临床上推广的检测法。络合物滴定法样品用量大(血清2ml)，操作费时，特异性低；荧光光度法仪器价格贵，难以普及；原子吸收分光光度法也存在操作繁、成本高等缺点。目前已有报道的分光光度比色法，均需引入抗坏血酸还原，剧毒氰化钾掩蔽干扰离子，再用水合氯醛解蔽。因其试剂种类多，操作步骤繁且要求高而难以推广。
血清铁降低，常见于生理性铁需要量增加、各种慢性失血引起的铁丢失过多及铁摄入不足，如缺铁性贫血、急性感染、恶性肿瘤等。血清铁增高，常见于急性肝炎、恶性贫血、再生障碍性贫血、溶血性贫血等。血清铁水平不稳定，易受进食状况及其他生理情况影响。目前，常用的铁的测定方法有亚铁嗪比色法，利用血清铁和运铁蛋白结合成复合物，在酸性介质中铁从复合物中解离出来，再被还原剂还原成二价铁，并与亚铁嗪生成紫红色化合物，在波长562nm处有一吸收峰，与同样处理的标准液比较，即可求得血清铁的含量，该法价格昂贵、步骤繁杂；还有利用双联吡啶比色法，其是利用在酸性条件下使铁从与蛋白质结合状态中游离出来。用盐酸羟胺作还原剂使血清中三价铁还原成二价铁，后者与双联吡啶显色剂反应生成红色螯合物，在520nm处比色定量。本法简便快速，但灵敏度差，干扰因素较多，尤以铁质污染最为严重，溶血也会影响结果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于测定血清中铜、铁、锌含量的操作简便快速、灵敏度高且不需去蛋白的试剂盒，为此，本发明还要提供一种该试剂盒的制备方法。
本发明试剂盒的原理是：在表面活性剂存在下的缓冲体系中，血清中与蛋白结合的铜、铁、锌解离，与吡啶偶氮类有机物络合显色，显色络合物在波长550-600nm处有最大吸收波长，反应液在波长550-600nm处的吸光度与铜、铁、锌离子浓度在一定范围内成正比，适用手工测定和自动分析。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
1、用于检测血清中铜含量的检测试剂盒，它由下列试剂组成：
(1)氧化剂：浓度为30g/L的双氧水或过硫酸钾；
(2)吡啶偶氮类显色液：每升显色液中固形物由5-100mg吡啶偶氮类有机物、5-20g表面活性剂和20-100g掩蔽剂组成，液体由pH＝3.5-5.0醋酸-醋酸钠水溶液和无水乙醇按199∶1-19∶1的比例组成，所述表面活性剂为聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯异辛基苯基醚、聚乙二醇辛基苯基醚、聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸单脂、聚氧乙烯失水山梨醇油酸单脂或聚乙烯吡咯烷酮，所述掩蔽剂为柠檬酸、氟化钠或六偏磷酸钠；
(3)铜标准液：浓度为15.74-31.48μmol/L。
所述吡啶偶氮类显色液的制备方法为：每升显色液称取吡啶偶氮类有机物100-500mg，用无水乙醇配成100ml贮备液，取贮备液5-20ml，加5-20g的表面活性剂和20-100g掩蔽剂，用pH＝3.5-5.0的醋酸-醋酸钠水溶液稀释至1000ml；
所述吡啶偶氮类有机物为2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(二乙氨基酚)、2-(3，5-二溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚、2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-二甲氨基酚、2-(3，5-二溴-2-吡啶偶氮)-5-二甲氨基酚或2-(5-硝基-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚二钠。
2、用于检测血清中锌含量的检测试剂盒，它由下列试剂组成：
(1)吡啶偶氮类显色液：每升显色液中固形物由5-250mg吡啶偶氮类有机物、5-20g表面活性剂和20-100g掩蔽剂组成，液体由pH＝8.0-10的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐水溶液和无水乙醇按199∶1-19∶1的比例组成，所述表面活性剂为聚氧乙烯异辛基苯基醚、聚乙二醇辛基苯基醚、聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸单脂、聚氧乙烯失水山梨醇油酸单脂或聚乙烯吡咯烷酮，所述掩蔽剂为铜铁试剂、柠檬酸、巯基乙酸、硫脲或六偏磷酸钠；
(2)锌标准液：浓度为15.3-30.6μmol/L。
所述吡啶偶氮类显色液的制备方法为：每升显色液称取吡啶偶氮类有机物100-500mg，用无水乙醇配成100ml贮备液，取贮备液5-50ml，加5-20g的表面活性剂和20-100g的掩蔽剂，用pH＝8.0-10.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐水溶液稀释至1000ml；
所述吡啶偶氮类有机物为2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(二乙氨基酚)、2-(3，5-二溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚、2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-二甲氨基酚、2-(3，5-二溴-2-吡啶偶氮)-5-二甲氨基酚或2-(5-硝基-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚二钠。
3、用于检测血清中铁含量的检测试剂盒，它由下列试剂组成：
(1)吡啶偶氮类显色液：每升显色液中固形物由5-250mg吡啶偶氮类有机物、5-20g表面活性剂和20-100g掩蔽剂组成，液体由pH＝3.5-5.0醋酸-醋酸钠水溶液和无水乙醇按199∶1-19∶1的比例组成，所述表面活性剂为聚氧乙烯异辛基苯基醚、聚乙二醇辛基苯基醚、聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸单脂、聚氧乙烯失水山梨醇油酸单脂或聚乙烯吡咯烷酮，所述掩蔽剂为巯基乙酸或硫脲；
(2)铁标准液：浓度为17.9-35.8μmol/L。
所述吡啶偶氮类显色液的制备方法为：称取吡啶偶氮类有机物100-500mg，用无水乙醇配成100ml贮备液，取贮备液5-50ml，加5-20g的表面活性剂和20-100g掩蔽剂，用pH＝3.5-5.0的醋酸-醋酸钠水溶液稀释至1000ml；
所述吡啶偶氮类有机物为2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(二乙氨基酚)、2-(3，5-二溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚、2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-二甲氨基酚、2-(3，5-二溴-2-吡啶偶氮)-5-二甲氨基酚或2-(5-硝基-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚二钠。
本发明所能达到的有益效果是：血清用量少，试剂单一温定，且不必去蛋白操作快速简便，准确度好，灵敏度高。
具体实施方式
实施例一
一种血清铜快速灵敏检测试剂盒，本试剂盒是由以下物质组成的：
氧化剂(30g/L的双氧水)                1瓶
显色液(吡啶偶氮类显色剂)             1瓶
铜标准液(浓度为31.48μmol/L)         1瓶
本试剂盒的制备方法是通过如下步骤实现的：
(1)30g/L的双氧水是常规方法配置；
(2)吡啶偶氮类显色液的制备方法：
a、称取2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(二乙氨基酚)200mg，
b、将a中的试剂用无水乙醇配成100ml的贮备液，
c、取b的贮备液5ml加入10g聚氧乙烯异辛基苯基醚和20g柠檬酸，用pH4.0的醋酸-醋酸钠水溶液稀释至1000ml；
(3)铜标准液：精确称取100.0mg的金属铜(99.9％)，用适量50％的醋酸水溶液溶解后以双蒸水稀释至1000ml，再用水稀释为50倍的31.48μmol/L的铜标准液。
检测方法：
1.手工分析法：血清(U管)、铜标准液(S管)、去离子水(B管)各取0.20ml，然后在各管中分别加入3％的双氧水0.05ml，静置1分钟，再分别加入2.5ml吡啶偶氮类显色液，混匀，置37℃水浴保温5分钟，可保证血清铜完全释出。在分光光度计上用1cm光径比色皿空白管调零，然后在550-600nm处读取各管的吸光度(A)。
2.自动分析仪分析参数：反应类型：终点法；波长：600nm；反应温度：37℃；3％的双氧水5μl；吡啶偶氮类显色液：250μl；标本：30μl；读数时间：180秒。
血清铜的含量(μmol/L)＝31.48×Au/As
实施例二
一种血清铜快速灵敏检测试剂盒，本试剂盒是由以下物质组成的：
氧化剂(30g/L的过硫酸钾)                1瓶
显色液(吡啶偶氮类显色剂)               1瓶
铜标准液(浓度为15.74μmol/L)           1瓶
本试剂盒的制备方法是通过如下步骤实现的：
(1)30g/L的过硫酸钾是常规方法配置
(2)吡啶偶氮类显色剂的制备方法：
a、称取2-(3，5-二溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚100mg，
b、将a中的试剂用无水乙醇配成100ml的贮备液，
c、取b的贮备液50ml加入20g聚氧乙烯月桂醚和50g氟化钠，用PH3.8的醋酸-醋酸钠水溶液稀释至1000ml。
(3)铜标准液：精确称取100.0mg的金属铜(99.9％)，用适量50％的醋酸水溶液溶解后以双蒸水稀释至1000ml，再用水稀释为100倍的15.74μmol/L的铜标准液。
检测方法：
1.手工分析法：血清(U管)、铜标准液(S管)、去离子水(B管)各取0.20ml，然后在各管中分别加入3％的双氧水0.05ml，静置1分钟，再分别加入2.5ml吡啶偶氮类显色液，混匀，置37℃水浴保温5分钟，可保证血清铜完全释出。在分光光度计上用1cm光径比色皿空白管调零，然后在550-600nm处读取各管的吸光度(A)。
2.自动分析仪分析参数：反应类型：终点法；波长：600nm；反应温度：37℃；3％的双氧水5μl；吡啶偶氮类显色液：250μl；标本：30μl；读数时间：180秒。
血清铜的含量(μmol/L)＝15.74×Au/As
实施例三
一种血清锌快速灵敏检测试剂盒，本试剂盒是由以下试剂组成的：
显色液(吡啶偶氮类显色剂)               1瓶
锌标准液(浓度为15.3μmol/L)            1瓶
本试剂盒的制备方法是通过如下步骤实现的：
(1)吡啶偶氮类显色液的制备方法：
a、称取2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-二甲氨基酚300mg，
b、将a中的试剂用无水乙醇配成100ml的贮备液，
c、取b的贮备液30ml加入15g聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸单脂和20g的铜铁试剂，用pH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐水溶液稀释至1000ml。
(2)锌标准液：精确称取100.0mg的金属锌(99.9％)，用适量50％的硝酸溶液溶解后以双蒸水稀释至1000ml，再用水稀释为15.30μmol/L的锌标准液。
检测方法：
1.手工分析法测定管(U)、标准管(S)、空白管(B)分别加入血清、锌标准液、蒸馏水各0.3ml，每管各加吡啶偶氮类显色液2.50ml，混匀，置37℃水浴保温5分钟，以空白管调零，用1cm光径比色杯，在550--600nm波长处测定各管吸光度A。
2.自动分析仪分析参数反应类型：终点法；波长：600nm；反应温度：37℃；吡啶偶氮类显色液：250μl；标本：30μl；读数时间：180秒。
血清锌的含量(μmol/L)＝15.30×Au/As
实施例四
一种血清锌快速灵敏检测试剂盒，本试剂盒是由以下试剂组成的：
显色液(吡啶偶氮类显色剂)               1瓶
锌标准液(浓度为30.6μmol/L)           1瓶
本试剂盒的制备方法是通过如下步骤实现的：
(1)吡啶偶氮类显色剂的制备方法：
a、称取2-(5-硝基-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚二钠150mg，
b、将a中的试剂用无水乙醇配成100ml的贮备液，
c、取b的贮备液15ml加入15g聚乙二醇辛基苯基醚和80g的硫脲，用PH8.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐水溶液稀释至1000ml。
(2)锌标准液：精确称取100.0mg的金属锌(99.9％)，用适量50％的醋酸水溶液溶解后以双蒸水稀释至1000ml，再用水稀释为50倍的30.60μmol/L的锌标准液。
检测方法：
1.手工分析法测定管(U)、标准管(S)、空白管(B)分别加入血清、铁标准液、蒸馏水各0.3ml，每管各加吡啶偶氮类显色液2.50ml，混匀，置37℃水浴保温5分钟，以空白管调零，用1cm光径比色杯，在550--600nm波长处测定各管吸光度A。
2.自动分析仪分析参数反应类型：终点法；波长：600nm；反应温度：37℃；吡啶偶氮类显色液：250μl；标本：30μl；读数时间：180秒。
血清锌的含量(μmol/L)＝30.60×Au/As
实施例五
一种血清铁快速灵敏检测试剂盒，本试剂盒是由以下试剂组成的：
显色液(吡啶偶氮类显色剂)               1瓶
铁标准液(浓度为17.9μmol/L)            1瓶
本试剂盒的制备方法是通过如下步骤实现的：
(2)吡啶偶氮类显色液的制备方法：
a、称取2-(3，5-二溴-2-吡啶偶氮)-5-二甲氨基酚300mg，
b、将a中的试剂用无水乙醇配成100ml的贮备液，
c、取b的贮备液30ml加入15g聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸单脂和20g的巯基乙酸，用pH3.5的醋酸醋酸钠水溶液稀释至1000ml。
(3)铁标准液(浓度为17.9μmol/L)：精确称取100.0mg的金属铁(99.9％)，用适量的硝酸溶解后以双蒸水稀释至1000ml，再用水稀释为浓度为17.9μmol/L标准液。
检测方法：
1.手工分析法测定管(U)、标准管(S)、空白管(B)分别加入血清、铁标准液、蒸馏水各0.3ml，每管各加吡啶偶氮类显色液2.50ml，混匀，置37℃水浴保温5分钟，以空白管调零，用1cm光径比色杯，在550--600nm波长处测定各管吸光度A。
2.自动分析仪分析参数反应类型：终点法；波长：600nm；反应温度：37℃；吡啶偶氮类显色液：250μl；标本：30μl；读数时间：300秒。
血清铁的含量(μmol/L)＝17.90×Au/As
实施例六
一种血清铁快速灵敏检测试剂盒，本试剂盒是由以下试剂组成的：
显色液(吡啶偶氮类显色剂)               1瓶
铁标准液(浓度为35.8μmol/L)            1瓶
本试剂盒的制备方法是通过如下步骤实现的：
(1)吡啶偶氮类显色剂的制备方法：
a、称取2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(二乙氨基酚)150mg，
b、将a中的试剂用无水乙醇配成100ml的贮备液，
c、取b的贮备液15ml加入15g聚乙二醇辛基苯基醚和40g硫脲，用PH4.0的醋酸醋酸钠水溶液稀释至1000ml。
(2)锌标准液：精确称取100.0mg的金属锌(99.9％)，用适量50％的醋酸水溶液溶解后以双蒸水稀释至1000ml，再用水稀释为50倍的35.80μmol/L的锌标准液。
检测方法：
1.手工分析法测定管(U)、标准管(S)、空白管(B)分别加入血清、铁标准液、蒸馏水各0.3ml，每管各加吡啶偶氮类显色液2.50ml，混匀，置37℃水浴保温5分钟，以空白管调零，用1cm光径比色杯，在550--600nm波长处测定各管吸光度A。
2.自动分析仪分析参数反应类型：终点法；波长：600nm；反应温度：37℃；吡啶偶氮类显色液：250μl；标本：30μl；读数时间：300秒。
血清铁的含量(μmol/L)＝35.80×Au/As

Claims (9)

1、用于检测血清中铜含量的检测试剂盒，其特征在于：它由下列试剂组成：
(1)氧化剂：浓度为30g/L的双氧水或过硫酸钾；
(2)吡啶偶氮类显色液：每升显色液中固形物由5-100mg吡啶偶氮类有机物、5-20g表面活性剂和20-100g掩蔽剂组成，液体由pH＝3.5-5.0醋酸-醋酸钠水溶液和无水乙醇按199∶1-19∶1的比例组成，所述表面活性剂为聚氧乙烯月桂醚、聚氧乙烯异辛基苯基醚、聚乙二醇辛基苯基醚、聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸单脂、聚氧乙烯失水山梨醇油酸单脂或聚乙烯吡咯烷酮，所述掩蔽剂为柠檬酸、氟化钠或六偏磷酸钠；
(3)铜标准液：浓度为15.74-31.48μmol/L。
2、根据权利要求1所述的用于检测血清中铜含量的检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述吡啶偶氮类显色液的制备方法为：每升显色液称取吡啶偶氮类有机物100-500mg，用无水乙醇配成100ml贮备液，取贮备液5-20ml，加5-20g的表面活性剂和20-100g掩蔽剂，用pH＝3.5-5.0的醋酸-醋酸钠水溶液稀释至1000ml。
3、根据权利要求1所述的用于检测血清中铜含量的检测试剂盒，其特征在于：所述吡啶偶氮类有机物为2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(二乙氨基酚)、2-(3，5-二溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚、2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-二甲氨基酚、2-(3，5-二溴-2-吡啶偶氮)-5-二甲氨基酚或2-(5-硝基-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚二钠。
4、用于检测血清中锌含量的检测试剂盒，其特征在于：它由下列试剂组成：
(1)吡啶偶氮类显色液：每升显色液中固形物由5-250mg吡啶偶氮类有机物、5-20g表面活性剂和20-100g掩蔽剂组成，液体由pH＝8.0-10的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐水溶液和无水乙醇按199∶1-19∶1的比例组成，所述表面活性剂为聚氧乙烯异辛基苯基醚、聚乙二醇辛基苯基醚、聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸单脂、聚氧乙烯失水山梨醇油酸单脂或聚乙烯吡咯烷酮，所述掩蔽剂为铜铁试剂、柠檬酸、巯基乙酸、硫脲或六偏磷酸钠；
(2)锌标准液：浓度为15.3-30.6μmol/L。
5、根据权利要求4所述的用于检测血清中锌含量的检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述吡啶偶氮类显色液的制备方法为：每升显色液称取吡啶偶氮类有机物100-500mg，用无水乙醇配成100ml贮备液，取贮备液5-50ml，加5-20g的表面活性剂和20-100g的掩蔽剂，用pH＝8.0-10.0的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐水溶液稀释至1000ml。
6、根据权利要求4所述的用于检测血清中锌含量的检测试剂盒：所述吡啶偶氮类有机物为2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(二乙氨基酚)、2-(3，5-二溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚、2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-二甲氨基酚、2-(3，5-二溴-2-吡啶偶氮)-5-二甲氨基酚或2-(5-硝基-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚二钠。
7、用于检测血清中铁含量的检测试剂盒，其特征在于：它由下列试剂组成：
(1)吡啶偶氮类显色液：每升显色液中固形物由5-250mg吡啶偶氮类有机物、5-20g表面活性剂和20-100g掩蔽剂组成，液体由pH＝3.5-5.0醋酸-醋酸钠水溶液和无水乙醇按199∶1-19∶1的比例组成，所述表面活性剂为聚氧乙烯异辛基苯基醚、聚乙二醇辛基苯基醚、聚氧乙烯失水山梨醇月桂酸单脂、聚氧乙烯失水山梨醇油酸单脂或聚乙烯吡咯烷酮，所述掩蔽剂为巯基乙酸或硫脲：
(2)铁标准液：浓度为17.9-35.8μmol/L。
8、根据权利要求7所述的用于检测血清中铁含量的检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述吡啶偶氮类显色液的制备方法为：称取吡啶偶氮类有机物100-500mg，用无水乙醇配成100ml贮备液，取贮备液5-50ml，加5-20g的表面活性剂和20-100g掩蔽剂，用pH＝3.5-5.0的醋酸-醋酸钠水溶液稀释至1000ml。
9、根据权利要求7所述的用于检测血清中铁含量的检测试剂盒，其特征在于：所述吡啶偶氮类有机物为2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-(二乙氨基酚)、2-(3，5-二溴-2-吡啶偶氮)-5-二乙氨基酚、2-(5-溴-2-吡啶偶氮)-5-二甲氨基酚、2-(3，5-二溴-2-吡啶偶氮)-5-二甲氨基酚或2-(5-硝基-2-吡啶偶氮)-5-[N-正丙基-N-(3-磺酸丙基)氨基]苯酚二钠。
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