CN110982518A

CN110982518A - 一种用于半胱氨酸检测的氮硫共掺杂碳量子点荧光探针及其制备与应用

Info

Publication number: CN110982518A
Application number: CN201911136435.8A
Authority: CN
Inventors: 李明中; 梅杰; 方振; 徐虎; 王宇红
Original assignee: Shanghai Institute of Technology
Current assignee: Shanghai Institute of Technology
Priority date: 2019-11-19
Filing date: 2019-11-19
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2039-11-19
Also published as: CN110982518B

Abstract

本发明涉及一种用于半胱氨酸检测的氮硫共掺杂碳量子点荧光探针及其制备与应用，制备方法包括以下步骤：1)将乙二胺、去离子水和DTNB在室温下均匀混合，得到混合溶液；2)将混合溶液在高压釜内温度设置为160‑220℃范围内进行碳化处理，得到碳化处理液；3)将碳化处理液依次经过滤、浓缩、硅胶柱层析纯化、干燥后，得到N,S‑CQDs；4)将N,S‑CQDs配制成N,S‑CQDs溶液；5)将N,S‑CQDs溶液与钯源均匀混合，即得到Pd²⁺/N,S‑CQDs。该Pd²⁺/N,S‑CQDs用于检测水样中半胱氨酸。与现有技术相比，本发明中的荧光探针具有制备方法简单、灵敏性高、重现性好等优点，同时荧光探针对半胱氨酸表现出较强的选择性，可有效减少其他金属离子或氨基酸类物质对检测的干扰，使检测结果具有较高的可靠性。

Description

一种用于半胱氨酸检测的氮硫共掺杂碳量子点荧光探针及其制备与应用

技术领域

本发明属于纳米材料制备及应用技术领域，涉及一种用于半胱氨酸检测的氮硫共掺杂碳量子点荧光探针及其制备与应用，具体涉及一种Pd²⁺介导的氮、硫共掺杂碳量子点荧光探针及其制备方法与在半胱氨酸检测领域的应用。

背景技术

半胱氨酸(Cys)、L-半胱氨酸(L-cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和还原型谷胱甘肽(GSH)等生物硫醇在人的生理活动中起着重要作用。如半胱氨酸是人体所需的必需氨基酸和生糖氨基酸，可由体内的蛋氨酸转化而来，可与胱氨酸互相转化。同时，半胱氨酸通过改变蛋白质分子之间和蛋白质分子内部的二硫键，减弱了蛋白质的结构，这样蛋白质就伸展开来，就在面团中起到改良剂的作用。L-半胱氨酸，目前已在医药、食品添加剂和化妆品中广泛应用。特别是作为一种氨基酸类解毒药，可与有毒的芳香族化合物缩合为硫醚氨酸而起到解毒作用，用于保护人体肝细胞不受损害以及促进肝脏功能的恢复。同型半胱氨酸是一种含巯基的氨基酸，主要来源于饮食摄取的蛋氨酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中一个重要的中间产物，其本身并不参加蛋白质的合成。同型半胱氨酸可以直接或间接导致血管内皮细胞损伤，促进血管平滑肌细胞增殖，影响低密度脂蛋白的氧化，增强血小板功能，促进血栓形成，是研究心血管病和阿尔茨海默氏病重要检测因素。谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统功能，并具有抗氧化作用、整合解毒作用。半胱氨酸易与某些药物、毒素等结合，使其具有整合解毒作用。谷胱甘肽不仅可用于药物，更可作为功能性食品的基料，在延缓衰老、增强免疫力、抗肿瘤等功能性食品广泛应用。因此，构建一种高效、快速、高选择性、高灵敏性和响应时间短的方法用于检测小分子生物硫醇(如半胱氨酸等)引起了人们的广泛关注。

经典的检测小分子生物硫醇的方法，如电化学检测法与高效液相色谱法，只能检测生物硫醇的总量，并且需要大量的样品才能检测准确。而在大多数情况下，为了提高检测的灵敏度和选择性，需要将离子交换柱色谱，气相色谱-火焰光度法，电泳，循环伏安法和差分脉冲伏安法(DPV)这些技术结合使用。然而，这些方法不仅费时费力，操作过程复杂以及对人员要求更高等缺点。因此，近年来，研究者尝试利用荧光分析法通过在样品中使用荧光探针以及分析物来检测半胱氨酸。

碳量子点(CQDs)作为荧光探针，具有很好的选择性和灵敏性地检测各种金属离子，阴离子，苦味酸以及抗坏血酸，核酸，蛋白质，谷胱甘肽等。这是与碳量子点的性质有关。如与激发波长相关的光致发光特性，尺寸效应(小于10nm)、量子限域效应、表面(发射)陷阱位点和良好的水溶性、稳定性以及生物相容性等。然而，迄今为止，很少有研究者报道使用碳量子点(N,S-CQDs)作为光学探针检测半胱氨酸的报道。

中国专利CN110066655A公开了一种银掺杂碳量子点及其制备方法和应用，所述制备方法包括：将柠檬酸、硝酸银和蒸馏水混合，经水热反应，离心收集产物，得到银掺杂碳量子点，可以实现对半胱氨酸的实时监测，但该专利制备的银掺杂碳量子点时引入了贵金属离子，在使用时，对环境有一定的危害作用。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种用于半胱氨酸检测的氮硫共掺杂碳量子点荧光探针及其制备与应用，用于获得一种制备方法简单、条件温和、制备成本较低的荧光探针，并基于该荧光探针实现对半胱氨酸的高选择性、高灵敏性的检测。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种氮硫共掺杂碳量子点荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

1)将乙二胺、去离子水及5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)混合均匀，得到混合溶液；

其中，乙二胺作为氮源和表面钝化剂，能够控制氮硫共掺杂碳量子点的尺寸，而DTNB可在合成碳量子点的同时提供氮源和硫源，保证氮、硫元素的同时掺入，进而提高氮硫共掺杂碳量子点的荧光量子产率；

2)将步骤1)中的混合溶液进行碳化处理，得到深棕色的碳化处理液；

3)将步骤2)中的碳化处理液依次经过滤、浓缩、硅胶柱层析纯化、干燥过程后，得到水溶性的氮硫共掺杂碳量子点，即N,S-CQDs，其中制备的N,S-CQDs可在0-5℃下低温保存；

4)将步骤3)中的N,S-CQDs配制成N,S-CQDs溶液；

5)将步骤4)中的N,S-CQDs溶液与钯源均匀混合，得到氮硫共掺杂碳量子点荧光探针，即Pd²⁺/N,S-CQDs荧光探针。

本专利中的PBS缓冲液可选用pH为7.4，浓度为8-12mM的PBS缓冲溶液，荧光分光光度计的参数可设置为：扫描速度(1000nm/min)，激发带宽(10nm)，发射带宽(10nm)，增益(高，900V)。

进一步地，步骤1)中，所述的乙二胺、去离子水及DTNB的投料比为(3-10)mL:(20-60)mL:(0.5-1.5)mmol；混合条件为在室温下超声处理5-40min；

其中：该投料比的限定范围是为了获得较高的N,S-CQDs的荧光量子产率；

步骤2)中，所述的碳化处理具体为将混合溶液在160-220℃(优选180-200℃)下以300-500r/min的转速搅拌8-18h；

其中，碳化温度的限定原因为：温度高于220℃或低于160℃分别会造成碳化程度过高或过低进而导致荧光强度变弱，所以最佳温度范围选择160-220℃；

转速限定原因为：转速在300-500r/min条件下能够使液体在反应前后混合均匀；

碳化时间的限定原因为：时间低于8h会导致碳化程度不足，时间高于18h可能会导致其他碳化产物增多，进而影响所需碳量子点发光效率。

因此，合适的反应温度、转速和时间是保证碳化过程能获得较高的荧光强度的条件，进而使N,S-CQDs获得较高的荧光量子产率。

进一步地，步骤3)中，所述的过滤过程为通过常见的过滤器，如0.22μm过滤器，可将溶液中较大颗粒去除，所述的浓缩过程为通过旋转蒸发仪将溶液体积浓缩至原体积的0.05-0.12倍；

所述的硅胶柱层析纯化过程中，所用的洗脱剂为去离子水，且在荧光检测中，所得的N,S-CQDs的最佳激发波长和发射波长分别为λ_ex＝420nm，λ_em＝520nm，使N,S-CQDs表现出最佳的荧光特性，因此从纯化成本的角度考虑，以去离子水作为洗脱剂是本实验的一个重要特征；

作为优选的技术方案，所述的N,S-CQDs在规格为365nm的紫外灯照射下呈绿色荧光状，因此在硅胶柱层析纯化过程中的洗脱过程可在紫外灯的照射下进行，集中收集呈绿色荧光状的滤液，提高收集过程的便捷性。

进一步地，步骤3)中，所述的干燥过程为在80-160℃下加热6-12h，或在130-150℃下真空干燥4-8h。在上述干燥条件下得到的N,S-CQDs具有最佳的发光性质和最少的制备合成时间。

进一步地，步骤4)中，所述的N,S-CQDs溶液的配制过程为将N,S-CQDs与PBS缓冲液混合并超声5-30min，所述的N,S-CQDs溶液的浓度为0.08-0.12mg/mL。

选择N,S-CQDs溶液的浓度在0.08-0.12mg/mL的原因是：(1)当N,S-CQDs浓度高于0.12mg/mL，N,S-CQDs不能全部溶解在PBS缓冲液里；(2)当N,S-CQDs浓度低于0.08mg/mL，N,S-CQDs能全部溶解在PBS缓冲液，但是在后续实验中N,S-CQDs用量较大，容易增大测量的误差。因此选择N,S-CQDs溶液的浓度范围为0.08-0.12mg/mL。

进一步地，步骤5)中，所述的钯源为氯化钯、硝酸钯、醋酸钯中的一种或一种以上；

N,S-CQDs溶液与钯源的混合过程为：将钯源与PBS缓冲液混合配制得到Pb²⁺浓度为120-160μM的含钯溶液，再将该含钯溶液与N,S-CQDs溶液均匀混合，再超声处理5-30min，得到氮硫共掺杂碳量子点荧光探针，即Pd²⁺/N,S-CQDs荧光探针。其中，含钯溶液浓度的限定原因是要保证钯离子不会在溶液中有沉淀物产生，同时该浓度下的含钯溶液对于碳量子点具有较高程度的荧光淬灭效果。

进一步地，所述的含钯溶液与N,S-CQDs溶液的混合体积比为(30-50):(1-20)。

一种氮硫共掺杂碳量子点荧光探针采用如上所述的方法制备而成。

一种如上所述的氮硫共掺杂碳量子点荧光探针的应用，所述的氮硫共掺杂碳量子点荧光探针用于检测水样中半胱氨酸。

进一步地，水样中半胱氨酸的检测方法包括如下步骤：

S1，绘制标准曲线：将荧光探针与多个不同浓度或不同用量的半胱氨酸溶液混合并搅拌均匀(荧光探针与半胱氨酸的优选体积比为60-80μL/1.94-3.94mL)，之后用PBS缓冲液稀释，得到半胱氨酸浓度范围为0-200μM的标准溶液，每个标准溶液都使用荧光分光光度计测试在激发波长为360-440nm下的荧光强度并记录，之后将荧光强度与半胱氨酸浓度线性拟合，得到标准曲线图；

其中，荧光探针与标准溶液的体积比为60-80μL/3.5-4.5mL；

S2，未知溶液的半胱氨酸浓度检测：将荧光探针与未知溶液以体积比1:(1-1.4)混合，并用PBS缓冲液稀释，得到待测液，之后测定待测液的荧光强度并记录，结合标准曲线图，获得未知溶液中半胱氨酸的浓度；

其中，荧光探针与待测液的体积比，与步骤S1中荧光探针与标准溶液的体积比相同；

步骤S1及S2中，所述的荧光强度均为使用荧光分光光度计，在激发波长为360-440nm范围内(其中最佳激发波长为420nm)测定的荧光强度。

由于N,S-CQDs具有较高的荧光量子产率，使得N,S-CQDs固体及N,S-CQDs溶液在紫外灯(365nm)的激发下，均呈绿色荧光状，通过荧光分光光度计检测，两者的最佳激发波长均为λ_ex＝420nm，最佳发射波长均为λ_em＝520nm；而由于Pd²⁺的荧光淬灭能力，使得Pd²⁺/N,S-CQDs在紫外灯的激发下，无荧光，加入半胱氨酸后，由于半胱氨酸中的巯基可与Pd²⁺形成强配位键，从而弱化Pd²⁺的荧光淬灭能力，致使N,S-CQDs的荧光强度大幅回升，荧光恢复，并在一定的浓度范围内，荧光强度与半胱氨酸的浓度线性相关，本发明即是基于上述特性而提供的一种氮硫共掺杂碳量子点荧光探针及其制备方法与在半胱氨酸检测方面的应用，该荧光探针在不同水样中对半胱氨酸具有很好的选择性和灵敏性，而其他的金属离子或氨基酸类物质对该检测体系干扰极小。因此，通过Pd²⁺/N,S-CQDs可实现对半胱氨酸的有效检测，并在环境、化学、生物和医学等领域具有很好的应用价值和应用前景。

与现有技术相比，本发明具有以下特点：

1)本发明的荧光探针包含绿色荧光状的N,S-CQDs(λ_ex＝420nm，λ_em＝520nm)以及Pd²⁺，Pd²⁺的加入使得N,S-CQDs的荧光淬灭，最终得到水溶性且无荧光的Pd²⁺/N,S-CQDs荧光探针；

2)在Pd²⁺/N,S-CQDs荧光探针中加入半胱氨酸后，荧光探针的荧光恢复，并且其荧光强度与半胱氨酸浓度具有较好的线性关系；

3)本发明中的荧光探针对半胱氨酸表现出较强的选择性，可有效减少其他的金属离子或氨基酸类物质对检测的干扰；

4)本发明中的荧光探针制备过程简单，产品性能稳定，信号响应强，灵敏度高，重现性好；

5)本发明中的荧光探针具有良好的水溶性、毒性小、生物相容性好等优点，可以实现对各种水体中半胱氨酸的检测，并且不会造成环境污染；

6)在N,S-CQDs的分离纯化阶段，以水作为“特殊的”洗脱剂，取代常规的分离提纯技术中所用的石油醚、乙酸乙酯或其它有机溶剂，所得的N,S-CQDs性质相同，使实验成本可大大降低。

附图说明

图1为本发明中一种用于半胱氨酸检测的氮硫共掺杂碳量子点荧光探针的制备原理及检测原理示意图；

图2为N,S-CQDs的透射电镜图；

图3为Pd²⁺、N,S-CQDs及Pd²⁺/N,S-CQDs的紫外吸收光谱图；

图4为N,S-CQDs的荧光激发谱图；

图5为不同Pd²⁺浓度下N,S-CQDs溶液的荧光发射谱图；

图6为Pd²⁺浓度与N,S-CQDs溶液荧光强度的关系图；

图7为不同金属离子对N,S-CQDs溶液荧光强度影响的对比图；

图8为不同半胱氨酸浓度下Pd²⁺/N,S-CQDs的荧光发射谱图；

图9为半胱氨酸浓度与Pd²⁺/N,S-CQDs荧光强度的关系图；

图10为不同氨基酸对Pd²⁺/N,S-CQDs荧光强度影响的关系图；

图11为不同金属离子对Pd²⁺/N,S-CQDs荧光强度影响的关系图；

图12为Pd²⁺/N,S-CQDs中是否加入半胱氨酸的荧光寿命曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：

制备水溶性的N,S-CQDs。

如图1所示，将1.16mmol的5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)和7.2mL乙二胺加入到40mL的去离子水中，超声10min，之后置于100mL衬有聚四氟乙烯的不锈钢高压釜(YZPR-100mL)中，在200℃下持续加热12h，之后自然冷却至室温，得到深棕色溶液。

用0.22μm的过滤器除去深棕色溶液中的较大颗粒，然后用旋转蒸发仪(RE-52C)将溶液浓缩至原体积的0.05倍。

通过硅胶柱层析法对浓缩液进行纯化，其中采用去离子水作为洗脱剂，在手持紫外灯(365nm)照射下收集绿色荧光的溶液。最后，将收集到的溶液在110℃下加热8h。得到N,S-CQDs固体材料并置于4℃环境下保存。

对N,S-CQDs固体材料进行透射电镜表征及荧光表征，表征结果如下：

透射电镜表征：如图2(a)所示，从图中可以观察到N,S-CQDs的平均粒径为5.2±0.8nm，纳米粒子没有发生明显聚集，呈现出较好的单分散状态，表现出较好的分散性；如图2(b)所示，N,S-CQDs的晶格间距为0.146nm；

荧光表征：如图4所示为N,S-CQDs在不同的激发波长(λ_ex＝360-440nm)照射下的荧光发射光谱，从图中可以看出最佳激发波长和发射波长分别为λ_ex＝420nm，λ_em＝520nm。

实施例2：

制备Pd²⁺/N,S-CQDs探针体系。

称取10mg实施例1所制备的N,S-CQDs固体材料，溶于100mL PBS缓冲液(pH 7.4，10mM)中，超声处理10min，得到浓度为0.10mg/mL的N,S-CQDs溶液。

在紫外灯(365nm)照射下，N,S-CQDs溶液发出绿色荧光。使用荧光分光光度计对N,S-CQDs溶液进行检测。

如图1所示，将PdCl₂ PBS液(50μL 150μM)与N,S-CQDs(20μL 0.10mg/mL)溶液混合制得Pd²⁺/N,S-CQDs溶液。经检测Pd²⁺/N,S-CQDs溶液在紫外灯照射下无荧光。

分别对相同浓度的PdCl₂溶液、N,S-CQDs溶液以及Pd²⁺/N,S-CQDs进行紫外吸收光谱表征，表征结果如下：

如图3所示，可以看到PdCl₂与N,S-CQDs的紫外吸收峰重叠，Pd²⁺/N,S-CQDs的吸收峰与PdCl₂及N,S-CQDs相比，明显左移，由此推断，PdCl₂与N,S-CQDs的荧光淬灭机理是基于内滤效应。

实施例3：

(1)取20μL 0.1mg/mL实施例2所得到的N,S-CQDs溶液加入至5mL的离心管中，再用PBS缓冲液(pH 7.4,10mM)稀释至4mL，快速搅拌10s，移入4mL的比色皿中，通过荧光仪检测并记录其荧光强度，记为F₀；

(2)取13个5mL的离心管，分别加入20μL 0.1mg/mL N,S-CQDs溶液，再分别加入0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60μL的PdCl₂溶液(150μM)，之后分别加入PBS缓冲液稀释至4mL，快速搅拌10s后，测量并记录荧光强度，检测结果如图5所示，可以看到，当Pd²⁺溶液浓度在0-150μM范围内时，N,S-CQDs的荧光强度随着Pd²⁺浓度的增加而降低；

(3)将Pd²⁺浓度与N,S-CQDs溶液的荧光强度进行线性拟合，拟合结果如图6所示，可以看到在0-150μM范围内的Pd²⁺浓度与N,S-CQDs溶液的荧光强度呈线性关系(R²＝0.99088)；

(4)取10个5mL的离心管，分别加入20μL 0.10mg/mL N,S-CQDs溶液，再分别加入50μL 10mM的CaCl₂、KI、NaCl、NiCl₂、FeCl₂、FeCl₃、CuCl₂、Ba(NO)₂、Hg(NO₃)₂、Sr(NO₃)₂PBS缓冲液，之后用PBS缓冲液稀释至4mL，快速搅拌10s，测量并记录荧光强度(F)。以相对荧光强度F/F₀作为Y轴，以不同金属离子作为X轴作图，结果如图7所示，可以看到与其他金属离子相比，Pd²⁺对N,S-CQDs具有最佳的淬灭效果。

实施例4：

(1)配制10mM的半胱氨酸溶液。取15个5mL的离心管，依次分别加入20μL 0.10mg/mL N,S-CQDs溶液、50μL的PdCl₂溶液(150μM)，再分别加入0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65及70μL 10mM的半胱氨酸溶液，之后用PBS缓冲液稀释至4mL，快速搅拌10s，测量并记录荧光强度(F₁)，检测结果如图8所示，可以看到当半胱氨酸溶液浓度在0-200μM范围内时，Pd²⁺/N,S-CQDs的荧光强度随着半胱氨酸溶液浓度的增加而增加；

将半胱氨酸溶液浓度与荧光强度进行线性拟合，拟合结果如图9所示，可以看到当半胱氨酸溶液浓度在0-200μM范围内时，半胱氨酸溶液浓度与荧光强度之间具有较好的线性关系(R²＝0.9928)；

(2)分别称取0.1M的L-抗坏血酸、L-胱氨酸、L-半胱氨酸、L-高胱氨酸、L-高半胱氨酸、L-胳氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、多巴胺、谷胱甘肽、半胱氨酸、AlCl₃、Ba(NO)₂、CaCl₂、CuCl₂、FeCl₂、FeCl₃、Hg(NO₃)₂、KI、MgCl₂、NaCl、NiCl₂、Sr(NO₃)₂的固体，置于10mL离心管，并用PBS缓冲液稀释至10mL刻度；

(3)取多个5mL的离心管分别依次加入20μL 0.1mg/mL N,S-CQDs溶液以及50μL的PdCl₂溶液(150μM)，再分别加入70μL 0.1M的L-抗坏血酸、L-胱氨酸、L-半胱氨酸、L-高胱氨酸、L-高半胱氨酸、L-胳氨酸、L-精氨酸、L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-苏氨酸、多巴胺、谷胱甘肽及半胱氨酸，用PBS缓冲液稀释至4mL，快速搅拌10s，测量并记录荧光强度(F₁)，并以相对荧光强度F₁/F作为Y轴，不同氨基酸种类作为X轴作图，结果如图10所示，可以看到Pd²⁺/N,S-CQDs对半胱氨酸具有较好的选择性；

(4)取多个5mL的离心管分别依次加入20μL 0.1mg/mL N,S-CQDs溶液以及50μL的PdCl₂溶液(150μM)，再分别加入70μL 0.1M的AlCl₃、Ba(NO)₂、CaCl₂、CuCl₂、FeCl₂、FeCl₃、Hg(NO₃)₂、KI、MgCl₂、NaCl、NiCl₂、Sr(NO₃)₂溶液，并用PBS缓冲液稀释至4mL，快速搅拌10s，测量并记录荧光强度(F₁)，并以相对荧光强度F₁/F作为Y轴，不同氨基酸种类作为X轴作图，结果如图11所示，从图10及图11中可以看出，半胱氨酸对Pd²⁺/N,S-CQDs体系具有很强的作用，使N,S-CQDs量子点的荧光恢复；如图12所示为Pd²⁺/N,S-CQDs中是否加入半胱氨酸的荧光寿命曲线图，未加半胱氨酸时荧光寿命为0.46ns，加入半胱氨酸后荧光寿命为4.66ns；

(5)在5mL离心管中依次加入20μL 0.1mg/mL N,S-CQDs溶液、50μL的Pd²⁺溶液(150μM)、70μL待测溶液，用PBS缓冲液稀释至4mL，测量并记录荧光强度，根据上述的荧光强度及半胱氨酸浓度的关系图(如图9所示)，通过下式计算待测溶液中的半胱氨酸的浓度，

y＝13.57X+358.58 (1)

4mL×X＝70μL×C (2)

其中：

y——荧光强度；

C——未知待测液中半胱氨酸的物质的量浓度，单位：mmol/L；

X——4mL中半胱氨酸浓度。

实施例5：

1)将7.2mL乙二胺、40mL去离子水及1.16mmol DTNB在室温下超声混合20min，得到混合溶液；

2)将步骤1)中的混合溶液在200℃下以400r/min的转速搅拌12h，得到深棕色的碳化处理液；

3)将步骤2)中的碳化处理液依次经过滤、浓缩、硅胶柱层析纯化、干燥后，得到氮硫共掺杂的水溶性碳量子点(N,S-CQDs)，其中，制得的N,S-CQDs可在3℃下低温保存；

4)将步骤3)中的N,S-CQDs与PBS缓冲液混合并超声20min，得到浓度为0.1mg/mL的N,S-CQDs溶液；

5)将N,S-CQDs溶液(20μL,0.1mg/mL)与PdCl₂ PBS液(50μL,150μM)混合，并超声处理20min，得到氮硫共掺杂碳量子点荧光探针，即Pd²⁺/N,S-CQDs荧光探针；

其中，步骤3)中，采用0.22μm过滤器完成过滤过程并将溶液中较大颗粒去除，浓缩过程为通过旋转蒸发仪将溶液体积浓缩至原体积的0.05倍，硅胶柱层析纯化过程中，所用的洗脱剂为去离子水，洗脱过程在紫外灯的照射下进行，集中收集呈绿色荧光状的滤液，提高收集过程的便捷性；干燥过程为在110℃的烘箱内加热8h。

实施例6：

1)将3mL乙二胺、20mL去离子水及1.5mmol DTNB在室温下超声混合5min，得到混合溶液；

2)将步骤1)中的混合溶液在220℃下以500r/min的转速搅拌8h，得到深棕色的碳化处理液；

3)将步骤2)中的碳化处理液依次经过滤、浓缩、硅胶柱层析纯化、干燥后，得到氮硫共掺杂的水溶性碳量子点(N,S-CQDs)，其中，制得的N,S-CQDs可在5℃下低温保存；

4)将步骤3)中的N,S-CQDs与PBS缓冲液混合并超声5min，得到浓度为0.08mg/mL的N,S-CQDs溶液；

5)将N,S-CQDs溶液(20μL,0.08mg/mL)与硝酸钯的PBS液(50μL,150μM)混合，再超声处理5min，即得到Pd²⁺/N,S-CQDs荧光探针。

其中，步骤3)中，采用0.22μm过滤器完成过滤过程并将溶液中较大颗粒去除，浓缩过程为通过旋转蒸发仪将溶液体积浓缩至原体积的0.12倍，硅胶柱层析纯化过程中，所用的洗脱剂为去离子水，洗脱过程在紫外灯的照射下进行，集中收集呈绿色荧光状的滤液，提高收集过程的便捷性；干燥过程为在160℃的烘箱内加热6h。

实施例7：

1)将6mL乙二胺、25mL去离子水及1mmol DTNB在室温下超声混合20min，得到混合溶液；

2)将步骤1)中的混合溶液在160℃下以400r/min的转速搅拌12h，得到深棕色的碳化处理液；

3)将步骤2)中的碳化处理液依次经过滤、浓缩、硅胶柱层析纯化、干燥后，得到氮硫共掺杂的水溶性碳量子点(N,S-CQDs)，其中，制得的N,S-CQDs可在4℃下低温保存；

4)将步骤3)中的N,S-CQDs与PBS缓冲液混合并超声30min，得到浓度为0.12mg/mL的N,S-CQDs溶液；

5)将N,S-CQDs溶液(30μL,0.12mg/mL)与醋酸钯的PBS液(20μL,150μM)混合，再超声处理25min，即得到Pd²⁺/N,S-CQDs荧光探针。

其中，步骤3)中，采用0.22μm过滤器完成过滤过程并将溶液中较大颗粒去除，浓缩过程为通过旋转蒸发仪将溶液体积浓缩至原体积的0.08倍，硅胶柱层析纯化过程中，所用的洗脱剂为去离子水，洗脱过程在紫外灯的照射下进行，集中收集呈绿色荧光状的滤液，提高收集过程的便捷性；干燥过程为在80℃的烘箱内加热12h。

实施例8：

1)将10mL乙二胺、60mL去离子水及0.5mmol DTNB在室温下超声混合40min，得到混合溶液；

2)将步骤1)中的混合溶液在180℃下以300r/min的转速搅拌18h，得到深棕色的碳化处理液；

3)将步骤2)中的碳化处理液依次经过滤、浓缩、硅胶柱层析纯化、干燥后，得到氮硫共掺杂的水溶性碳量子点(N,S-CQDs)，其中，制得的N,S-CQDs可在0℃下低温保存；

4)将步骤3)中的N,S-CQDs与PBS缓冲液混合并超声25min，得到浓度为0.1mg/mL的N,S-CQDs溶液；

5)将N,S-CQDs溶液(50μL 0.1mg/mL)与含钯溶液(1μL,120μM)混合，其中含钯溶液为硝酸钯及醋酸钯以摩尔比1:1组成的混合钯盐与PBS缓冲液配制得到，再超声处理15min，即得到Pd²⁺/N,S-CQDs荧光探针。

其中，步骤3)中，采用0.22μm过滤器完成过滤过程并将溶液中较大颗粒去除，浓缩过程为通过旋转蒸发仪将溶液体积浓缩至原体积的0.06倍，硅胶柱层析纯化过程中，所用的洗脱剂为水，洗脱过程在紫外灯的照射下进行，集中收集呈绿色荧光状的滤液，提高收集过程的便捷性；干燥过程为在150℃下真空干燥4h。

实施例9：

1)将7mL乙二胺、50mL去离子水及1.25mmol DTNB在室温下超声混合15min，得到混合溶液；

2)将步骤1)中的混合溶液在190℃下以400r/min的转速搅拌12h，得到深棕色的碳化处理液；

5)将N,S-CQDs溶液(40μL 0.1mg/mL)与含钯溶液(15μL,160μM)混合，其中含钯溶液为氯化钯、硝酸钯及醋酸钯以摩尔比1:1:1组成的混合钯盐与PBS缓冲液配制得到，再超声处理30min，即得到Pd²⁺/N,S-CQDs荧光探针。

其中，步骤3)中，采用0.22μm过滤器完成过滤过程并将溶液中较大颗粒去除，浓缩过程为通过旋转蒸发仪将溶液体积浓缩至原体积的0.1倍，硅胶柱层析纯化过程中，所用的洗脱剂为水，洗脱过程在紫外灯的照射下进行，集中收集呈绿色荧光状的滤液，提高收集过程的便捷性；干燥过程为在130℃下真空干燥8h。

实施例10：

本实施例中，

步骤1)中，碳化处理温度为200℃；

步骤3)中，干燥过程为在140℃下真空干燥6h；

步骤5)具体为：将N,S-CQDs溶液(20μL 0.1mg/mL)与PdCl₂ PBS液(50μL,150μM)混合，用PBS缓冲液稀释至4mL，再超声处理20min，即得到氮硫共掺杂碳量子点荧光探针；

其余同实施例9。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种氮硫共掺杂碳量子点荧光探针的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)将乙二胺、去离子水及DTNB混合均匀，得到混合溶液；

2)将步骤1)中的混合溶液进行碳化处理，得到碳化处理液；

3)将步骤2)中的碳化处理液依次经过滤、浓缩、硅胶柱层析纯化、干燥过程后，得到N,S-CQDs固体；

4)将步骤3)中的N,S-CQDs固体配制成N,S-CQDs溶液；

5)将步骤4)中的N,S-CQDs溶液与钯源均匀混合，即得到Pd²⁺/N,S-CQDs荧光探针。

2.根据权利要求1所述的一种氮硫共掺杂碳量子点荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的乙二胺、去离子水及DTNB的投料比为(3-10)mL:(20-60)mL:(0.5-1.5)mmol；混合条件为在室温下超声处理5-40min；

步骤2)中，所述的碳化处理具体为将混合溶液在160-220℃下以300-500r/min的转速搅拌8-18h。

3.根据权利要求1所述的一种氮硫共掺杂碳量子点荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述的硅胶柱层析纯化过程中，所用的洗脱剂为去离子水。

4.根据权利要求1所述的一种氮硫共掺杂碳量子点荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述的干燥过程为在80-160℃下加热6-12h，或在130-150℃下真空干燥4-8h。

5.根据权利要求1所述的一种氮硫共掺杂碳量子点荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤4)中，所述的N,S-CQDs溶液的配制过程为将N,S-CQDs与PBS缓冲液混合并超声5-30min，所述的N,S-CQDs溶液的浓度为0.08-0.12mg/mL。

6.根据权利要求1所述的一种氮硫共掺杂碳量子点荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤5)中，所述的钯源为氯化钯、硝酸钯、醋酸钯中的一种或一种以上；

N,S-CQDs溶液与钯源的混合过程为：将钯源与PBS缓冲液混合配制得到Pb²⁺浓度为120-160μM的含钯溶液，再将该含钯溶液与N,S-CQDs溶液均匀混合并超声处理5-30min，得到氮硫共掺杂碳量子点荧光探针，即Pd²⁺/N,S-CQDs荧光探针。

7.根据权利要求6所述的一种氮硫共掺杂碳量子点荧光探针的制备方法，其特征在于，所述的含钯溶液与N,S-CQDs溶液的混合体积比为(30-50):(1-20)。

8.一种氮硫共掺杂碳量子点荧光探针，其特征在于，采用如权利要求1至7任一项所述的方法制备而成。

9.一种如权利要求8所述的氮硫共掺杂碳量子点荧光探针的应用，其特征在于，所述的氮硫共掺杂碳量子点荧光探针用于检测水样中半胱氨酸。

10.根据权利要求9所述的一种氮硫共掺杂碳量子点荧光探针的应用，其特征在于，水样中半胱氨酸的检测方法包括如下步骤：

S1，绘制标准曲线：将荧光探针分别与多个不同浓度或不同用量的半胱氨酸溶液混合并搅拌均匀，之后用PBS缓冲液稀释，得到半胱氨酸浓度范围为0-200μM的标准溶液，每个标准溶液都使用荧光分光光度计测试在激发波长为360-440nm下的荧光强度并记录，之后将荧光强度与半胱氨酸浓度线性拟合，得到标准曲线图；

S2，未知溶液的半胱氨酸浓度检测：将荧光探针与未知溶液混合，并用PBS缓冲液稀释，得到待测液，之后测定待测液的荧光强度并记录，结合标准曲线图，获得未知溶液中半胱氨酸的浓度。