CN106092984B - 一种基于钝化碳量子点的荧光分析方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于钝化碳量子点的荧光分析方法及其应用,一种基于钝化碳量子点的荧光分析方法,主要包括以下步骤:(1)采用高温煅烧法制备碳量子点溶液;(2)取不同浓度的谷胱甘肽与钝化剂1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺混合5~30 min,接着加入到碳量子点溶液中反应10~30 min,然后进行荧光分析;(3)记录钝化后碳量子点溶液在360 nm激发波长下的荧光光谱图,分析不同浓度谷胱甘肽下钝化后碳量子点溶液荧光强度的变化。本发明提出了一种新型的利用钝化碳量子点的用于检测谷胱甘肽的荧光分析方法。且方法制备过程环保、快速、简便,不需要过于复杂的仪器,是一种兼具便捷性和实际应用前景的谷胱甘肽检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及属于新型功能材料、生物小分子分析新领域,尤其涉及一种基于钝化碳量子点荧光分析方法,及其在血清、化妆品、水果中谷胱甘肽检测的应用。
背景技术
谷胱甘肽在生命体的各种新陈代谢过程中扮演着重要的角色,它们在人体中的含量跟许多疾病息息相关,因此,对生命体中谷胱甘肽进行定性定量检测具有非常重要的意义。因此,研究生命体中谷胱甘肽的检测方法显得尤为重要。目前用于检测谷胱甘肽的方法主要有:质谱、高效液相色谱、电化学、荧光分析等其中,质谱与色谱方法虽然有较高的灵敏度,检测速度快,分析时间短的优点,但检测程序复杂,需要专业的人才可以操作。电化学方法需要在电极上对巯基化合物进行电化氧化处理,其过程复杂,耗时较长,需要很大的过电压,将其应用于活细胞中,实现定位和定时检测目标物还有待进一步研究,难度较大。荧光分析法除具有灵敏度高,简单方便等优点外,还具有一个显著的优势就是可以实现对细胞内谷胱甘肽的检测。
近年来,半导体量子点(CdTe/CdSe等)以其出色的光学性质得到了研究者们广泛的关注。目前,人们已经利用量子点设计了许多可以检测金属离子、非金属离子,有机小分子以及与生命相关物质的荧光传感器。但CdTe/CdSe等量子点合成过程对实验操作人员有一定危害,同时CdTe/CdSe等量子点都含有有毒的重金属,生物相容性差。
作为一种新型碳纳米材料,碳量子点的光致发光机制现在还没有确定的解释。Sun等将碳量子点的光致发光特性归因于表面能量陷阱,从而解释了表面钝化剂对碳量子点荧光性能增强的原因。Pang等的研究发现,碳量子点的粒径差异也导致了其荧光性能的不同,而碳量子点的表面缺陷则没有相应的影响。但在后来的研究中,Pang等以碳纤维为碳源,采用电化学法,氧化碳纤维通过控制电压制备了不同粒径的碳量子点。碳量子点的性能测试显示,碳量子点的粒径对其荧光性能几乎没有影响,而碳量子点的表面状态对其性能影响显著。控制氧化电压造成最终的碳量子点具有不同的表面状态(缺陷),而碳量子点表面状态的不同又引起了荧光性能的差异。Chen等则通过研究推测,光致发光现象可能是由碳量子点的微观表面缺陷、电子能级结构以及量子限域效应等综合作用的结果。
虽然碳量子点的发光机制尚没有明确,但大量研究显示,表面经有机物钝化处理后,碳量子点的荧光性能确实可以大大提高。因此整体来看,碳量子点的光致发光现象可能不仅取决于碳量子点的粒径情况,更与碳量子点的表面钝化状态(表面缺陷)紧密相关。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于钝化碳量子点的荧光分析方法及其应用,以克服现有量子点合成过程对实验操作人员有一定危害,且含有有毒的重金属及生物相容性差等问题。
本发明采用的技术方案是:一种基于钝化碳量子点的荧光分析方法,主要包括以下步骤:
(1)采用高温煅烧法制备碳量子点溶液;
(2)取不同浓度的谷胱甘肽与钝化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)混合5~30 min,接着加入碳量子点溶液中反应10~30 min,然后进行荧光分析;
(3)记录钝化后碳量子点溶液在360nm激发波长下的荧光光谱图,分析不同浓度谷胱甘肽下钝化后碳量子点溶液荧光强度的变化。
高温煅烧法制备的碳量子点表面基团较少,荧光量子产率较低。与其他方法合成出来的碳量子点相比无优势,在发光性质上甚至是劣势。但是其在EDC钝化后荧光量子产率能达到41.1%,比大部分用其他方法合成出来的碳量子点荧光产率高。
进一步的,步骤(1)所述高温煅烧法制备碳量子点溶液主要包括:在180~220℃马弗炉中对柠檬酸进行高温煅烧20~45 min,将得到的淡黄色液体冷却至室温;再用碱性试剂溶解,将pH调至中性。直接高温煅烧柠檬酸得到的碳量子点pH为1左右。
进一步的,所述碱性试剂为NaOH或者KOH。用NaOH或者KOH是为了调pH至中性,同时不引入其他可能会有影响的干扰离子。
进一步的,每10 μL 0.03~0.05 mg mL-1碳量子点溶液,添加100 μL 200 mmol L-1钝化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺。
进一步的,所述荧光分析的条件为pH为7.0~7.8。EDC在pH为7.0~7.8环境下钝化碳量子点,效果较好。
进一步的,所述谷胱甘肽、所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺均用pH为7.0~7.8的10 mmol L-1 PBS缓冲溶液配制。
进一步的,所述NaOH或KOH的浓度为50~200 mg mL-1。
进一步的,所述碳量子点的粒径分布为2.0~5.0 nm。
一种上述荧光分析方法的应用,用于在血清、化妆品或水果中检测谷胱甘肽。
不同于以往其他荧光分析法通过猝灭基团猝灭发光基团或者荧光共振能量转移的方式来构建荧光传感器。本发明发现一种通过高温煅烧柠檬酸得到的碳量子点可以通过EDC的钝化来提高其荧光强。EDC引入碳量子点表面,促进了碳量子点的表面能的陷阱发射,进而提高了碳量子点的荧光强度。于是设计了一种通过混合谷胱甘肽与EDC使部分EDC与谷胱甘肽结合,剩余的EDC参与钝化碳量子点的方案,使碳量子点溶液的荧光强度与谷胱甘肽的浓度呈一定的线性关系来定量谷胱甘肽的浓度。EDC钝化碳量子点以后,荧光强度增大。此时再加入谷胱甘肽对碳量子点的荧光强度并无影响。因为碳量子点的表面钝化已经完成。
与现有技术相比,本发明提出了一种新型的利用钝化碳量子点的用于检测谷胱甘肽的荧光分析方法。而与其它检测方法相比,本发明的方法制备过程环保、快速、简便,不需要过于复杂的仪器,是一种兼具便捷性和实际应用前景谷胱甘肽检测方法。本发明中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺钝化后的碳量子点的荧光强度显著增大。荧光量子产率从0.8%增加至41.1%(以硫酸奎宁为标准参考物质)。实现了高灵敏度检测,所测试得到的线性范围为1.0~50 μmol L-1,检测限为0.943 μmol L-1。
附图说明
图1为本发明的荧光分析方法的过程示意图;
图2为实施例1合成的碳量子点的高分辨透射电镜图;
图3为实施例1合成的碳量子点在不同激发波长(320~400 nm)下得到的荧光光谱图;
图4为实施例1中为不同的pH环境下对EDC钝化碳量子点的影响;
图5为实施例1中本发明方法检测机理的紫外可见光谱表征图;
图6为实施例1中不同浓度谷胱甘肽与200 mmol L-1 EDC混合反应后加入碳量子点溶液后的荧光光谱图;
图7为实施例1中不同浓度谷胱甘肽与荧光强度变化比率的线性关系;
图8为干扰物质对实施例1中构建的基于钝化碳量子点的荧光分析方法检测谷胱甘肽的影响。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例1
一种基于钝化碳量子点的荧光分析方法过程如图1所示,主要包括以下步骤:
1)碳量子点的制备。
称取2 g柠檬酸固体,倒入15 mL的带盖小烧杯中。然后将小烧杯放置在220℃马弗炉加热。20分钟后,柠檬酸由固体变成浅黄色的液体,将小烧杯从马弗炉中取出,冷却至室温。此时小烧杯中的浅黄色液体凝固。向小烧杯中加入2mL NaOH (200 mg mL-1),在磁力搅拌下溶解完全后加入8 mL NaOH (200 mg mL-1)混合均匀。最后将得到10 mL pH≈7碳量子点溶液储存在4℃冰箱中待用。得到的碳量子点的粒径分布为2.0~5.0 nm。
将透析过后的碳量子点溶液稀释至透明无色,取10 μL滴到200目铜载网微栅支撑膜(超薄碳膜)上,自然干燥后用Tecnai F20 G2 S-TWIN型高分辨透射电子显微镜测试。由图2可知,样品的分散性良好,无明显的团聚现象,近似球形。图3为在不同激发波长(320~400 nm)下得到的碳量子点的光致发光光谱图。从图3可以看出,在激发波长为360 nm时,荧光强度最大。由此,本发明选择360 nm为荧光分析的最佳激发波长。为了提高这种荧光传感器的检测灵敏度,获得最佳检测条件,我们研究了不同pH条件下EDC对碳量子点钝化的影响。从图4中可以看出,在不同的pH环境下,EDC对碳量子点的钝化作用有一定影响。在偏酸性的环境下,EDC对碳量子点的钝化作用较弱;在偏碱性的环境下,EDC对碳量子点的钝化作用较强。从图4中可以看出,在pH为7.0~7.8的时候,EDC对碳量子点的钝化作用最强。因此,我们选择pH值为7.0~7.8的PBS作为荧光分析的pH。
2)谷胱甘肽检测机理的紫外-可见光谱表征
将EDC、谷胱甘肽、EDC钝化后的碳量子点及EDC混合谷胱甘肽后钝化碳量子点溶液在紫外-可见分光光度计上进行光谱表征。从图3中可以看出,谷胱甘肽(a)与EDC(b)在300~500 nm波长下基本没有吸收,碳量子点溶液(c)在330 nm的波长下有轻微的吸收。在EDC的钝化下,碳量子点溶液(d)的在361 nm波长下有很强的吸收。当EDC与少量谷胱甘肽混合反应后加入碳量子点溶液,部分EDC与谷胱甘肽结合,剩余未反应完的EDC钝化碳量子点,此时混合溶液(e)在361 nm波长下的吸光度明显小于EDC直接钝化的碳量子点溶液(d)。
3)谷胱甘肽的检测
1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和谷胱甘肽的检测中溶液均用10 mmol L-1pH 7.0 的PBS缓冲溶液配制。100 μL 200 mmol L-1EDC加入到1 mL不同浓度(1~100 μmolL-1)的谷胱甘肽溶液中反应5-30分钟。接着,加入10 μL 0.03~0.05 mg mL-1碳量子点溶液反应10-30分钟。然后用日立F-7000型荧光分光光度计记录荧光强度,选择激发波长360nm,激发光狭缝宽度为10 nm, 记录荧光光谱,设置光电倍增管电压450 V,扫描速度1200nm/min,在380到600 nm的范围内扫描记录体系的荧光性质。如图4所示,不同浓度的谷胱甘肽(0 ~100 μmol L-1)与200 mmol L-1的EDC混合反应后加入碳量子点溶液,得到不同的荧光曲线。随着谷胱甘肽浓度不断增大,荧光强度逐渐减小。
该实验结果表明,随着谷胱甘肽的浓度与荧光强度减弱的比率呈线性关系。如图5所示,谷胱甘肽的浓度从1.0到50 μmol L-1范围内存在这线性关系。线性方程为(F0-F)/F0=0.0322+5002.443C (C: mol L-1),其R2=0.9951,通过计算得到检出限为0.943 μmol L-1(S/N=3)。其中F0为200 mmol L-1 EDC活化后碳量子点的荧光强度,F为不同浓度谷胱甘肽与200mmol L-1 EDC预混合反应后,加入碳量子点后的荧光强度。
4)干扰实验
为了考察钝化的碳量子点荧光检测体系对谷胱甘肽的选择性,用氯化镁、氯化钾、甘氨酸、赖氨酸、丝氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸代替谷胱甘肽在相同的实验条件下进行测试。如图6实验结果显示,只有谷胱甘肽能够影响碳量子点的钝化程度,使得碳量子点显示出不同的荧光强度。同时,说明该方法对于谷胱甘肽的检测有着良好的选择性。
实施例2
碳量子点的制备
称取2 g柠檬酸固体,倒入15 mL的带盖小烧杯中。然后将小烧杯放置在:180℃马弗炉加热。45分钟后,柠檬酸由固体变成浅黄色的液体,将小烧杯从马弗炉中取出,冷却至室温。此时小烧杯中的浅黄色液体凝固。向小烧杯中加入2 mL KOH (50 mg mL-1),在磁力搅拌下溶解完全后加入8 mL KOH (50 mg mL-1)混合均匀。最后将得到10 mL pH≈7碳量子点溶液储存在4℃冰箱中待用。
其它的均同实施例1。
实施例3
碳量子点的制备
称取2 g柠檬酸固体,倒入15 mL的带盖小烧杯中。然后将小烧杯放置在:220℃马弗炉加热。20分钟后,柠檬酸由固体变成浅黄色的液体,将小烧杯从马弗炉中取出,冷却至室温。此时小烧杯中的浅黄色液体凝固。向小烧杯中加入2 mL NaOH (100 mg mL-1),在磁力搅拌下溶解完全后加入8 mL NaOH (100 mg mL-1)混合均匀。最后将得到10 mL pH≈7碳量子点溶液储存在4℃冰箱中待用。其它的均同实施例1
实施例4
人血清中谷胱甘肽的检测。
取1 mL人血清样本用10 mmol L-1 pH 7.0的PBS缓冲溶液将血清样品稀释50倍。取3份进行检测求平均值。然后取9份,分3组,每组添加不同浓度的谷胱甘肽到稀释后的血清样本中去。分别取上述1 mL样品加入到100 μL 200 mmol L-1 EDC中反应10分钟。接着,加入10 μL 碳量子点溶液反应10分钟。然后用日立F-7000型荧光分光光度计记录荧光强度,选择激发波长360 nm,激发光狭缝宽度为10 nm, 记录荧光光谱,设置光电倍增管电压450 V,扫描速度1200 nm/min, 在380到600 nm的范围内扫描记录体系的荧光性质。测定回收率的检测结果如表1所示。
表1 人血清中谷胱甘肽含量的检测
样品 | 原始样浓度(μmol L<sup>-1</sup>) | 添加浓度(μmol L<sup>-1</sup>) | 发现浓度 (μmol L<sup>-1</sup>) | 回收率(%) n=3 | 相对标准偏差 (%)n=3 |
人血清 1 | 1.54 | 5.00 | 6.37 | 96.7 | 3.1 |
10.00 | 11.72 | 101.8 | 2.7 | ||
15.00 | 16.46 | 99.48 | 3.7 |
实施例5
化妆品中谷胱甘肽的检测。
取1 g自制的化妆品样品(橄榄油、蜂蜡)含0.5% 谷胱甘肽,用5 mol L-1氯化钠溶液稀释至50 mL容量瓶中并剧烈摇晃。在4000 rpm转速下离心20 min取上清液。将上清液用10 mmol L-1 pH 7.0 的PBS缓冲溶液稀释30倍,为检测样品。取3份做检测。分别取3份上述1 mL样品加入到100 μL 200 mmol L-1 EDC中反应10分钟。接着,加入10 μL 碳量子点溶液反应10分钟。然后用日立F-7000型荧光分光光度计记录荧光强度,选择激发波长360 nm,激发光狭缝宽度为10 nm, 记录荧光光谱,设置光电倍增管电压450 V,扫描速度1200 nm/min, 在380到600 nm的范围内扫描记录体系的荧光性质。最后根据测量的荧光强度带入标准曲线计算得到的谷胱甘肽的平均浓度为 10.2 μmol L-1,即其在自制化妆品的含量为0.47%,回收率为94%。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已,当然不能以此来限定本发明之权利范围,因此依本发明权利要求所作的等同变化,仍属本发明所涵盖的范围。
Claims (8)
1.一种基于钝化碳量子点的荧光分析方法,其特征在于,主要包括以下步骤:
(1)采用高温煅烧法制备碳量子点溶液;
(2)取不同浓度1~50μmol L-1的谷胱甘肽与100μL 200mmol L-1钝化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺混合5~30min,接着加入10μL 0.03~0.05mg mL-1碳量子点溶液中反应10~30min,使部分EDC与谷胱甘肽结合,剩余的EDC参与钝化碳量子点;然后进行荧光分析;
(3)记录钝化后碳量子点溶液在360nm激发波长下的荧光光谱图,分析不同浓度谷胱甘肽下钝化后碳量子点溶液荧光强度的变化。
2.根据权利要求1所述荧光分析方法,其特征在于,步骤(1)所述高温煅烧法制备碳量子点溶液主要包括:在180~220℃马弗炉中对柠檬酸进行高温煅烧20~45min,将得到的淡黄色液体冷却至室温;再用碱性试剂溶解,将pH调至中性。
3.根据权利要求2所述荧光分析方法,其特征在于,所述碱性试剂为NaOH或者KOH。
4.根据权利要求1所述荧光分析方法,其特征在于,所述荧光分析的条件为pH为7.0~7.8。
5.根据权利要求4所述荧光分析方法,其特征在于,所述谷胱甘肽、所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺均用pH为7.0~7.8的10mmol L-1PBS缓冲溶液配制。
6.根据权利要求3所述荧光分析方法,其特征在于,所述NaOH或KOH的浓度为50~200mgmL-1。
7.根据权利要求1所述荧光分析方法,其特征在于,所述碳量子点的粒径分布为2.0~5.0nm。
8.根据权利要求1-7任一项所述荧光分析方法的应用,其特征在于,用于在血清、化妆品或水果中检测谷胱甘肽。
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |