CN110819343A - 一种红色荧光铜纳米簇的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红色荧光铜纳米簇的制备方法及应用，本发明使用超声法以2‑巯基‑5‑苯并咪唑磺酸二水合钠盐为保护剂和还原剂，硝酸铜溶液作为基体制得红色荧光铜纳米簇水溶液。在合成过程中避免了常用的还原剂水合肼、抗坏血酸等的加入，简化了操作且绿色环保。制得的红色荧光铜纳米簇荧光量子产率为0.31％，具有Stocks位移大、水溶性好、抗光漂白能力强等优点，且对谷胱甘肽具有高灵敏度、高选择性的响应，可应用于荧光增强型谷胱甘肽的检测。

Description

一种红色荧光铜纳米簇的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及铜纳米簇的制备，具体涉及一种红色荧光铜纳米簇的制备方法及应用。

背景技术

金属纳米簇是一种尺寸小于2nm的超小纳米粒子，具有荧光性能强、斯托克斯(Stocks)位移大、光稳定性和水溶性好、抗光漂白能力强等优点，不仅可应用于物理、化学领域作为具有催化性能的先进材料，还可应用于生物学、医学、材料科学和国防等许多必要领域。但由于金属纳米簇的粒径一般小于2nm，表面能非常大，易团聚成不发光的大颗粒，因此，制备稳定性好的金属纳米簇有十分重要的科学意义。与金银等贵金属纳米簇相比，铜纳米簇有着不可比拟的价格优势，且电化学性能好，荧光性强，生物相容性良好。铜纳米簇作为一类新型的光致发光和纳米催化材料，在光致发光分析，生物探针成像和催化等领域越来越受到广泛的关注，是一类较为理想的金属纳米簇材料。

目前已有采用脱氧核糖核酸(DNA)、肽、蛋白质、小分子配体和聚合物等作为模板制备铜纳米簇的文献报道。如：Mao等人将DNA先在90℃加热10分钟后，加入硫酸铜和抗坏血酸还原剂在25℃下孵育15分钟制备得到铜纳米簇(Analytica Chimica Acta，2016，909：101-108)。Luo等人以谷胱甘肽作为还原剂和配体保护剂，在生理温度(37℃)下，1小时内合成了铜纳米簇(Talanta，2015，144：488-495)。Wang等人采用牛血清白蛋白作为稳定剂，水合肼作为还原剂，制备了水溶性好的荧光铜纳米簇(Nanoscale，2014，6(3)：1775-1781)。Li等人利用腐殖酸作为还原剂和稳定剂，在600℃下反应2h合成稳定的铜纳米簇(AppliedMicrobiology and Biotechnology，2004，64(4)：588-592)。Wang等人以抗坏血酸作为还原剂，制备了聚乙烯吡咯烷酮负载的铜纳米簇(Nanoscale，2016，8(13)：7197-7202)。但是目前已报道的方法需要在加热条件下进行，或者需要加入水合肼、抗坏血酸等还原剂，环保、绿色、简单的化学合成方法一直都是研究者努力的方向。

谷胱甘肽(Glutathione，缩写GSH)是一种含有巯基、氨基和γ-酰胺键的三肽，主要由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成。谷胱甘肽是细胞内一种重要的调节代谢物质，不仅能够清除体内的过氧化物及其他自由基，促进肝脏酶活性、解毒和维持红细胞膜完整性等作用，同时还具有维持DNA的生物合成和细胞免疫等多种生理功能。研究表明，多种疾病都与细胞内谷胱甘肽含量的异常相关，如癌症、心血管疾病和艾滋病等。因此，定量检测细胞内谷胱甘肽对疾病的诊断及治疗具有重要的意义。目前，测定谷胱甘肽的常用方法有：高效液相色谱法、毛细管电泳法、分光光度法、电化学法、酶法等。这些方法各有优点，但存在操作繁琐，耗时等不足。与其它方法相比，荧光分析法具有操作简便、灵敏度高及能够可视化观察等优点，能将微观上分子识别过程转化为宏观上荧光信号的变化，从而实现对靶标的检测。近年来，已有大量用于检测生物巯基的荧光探针被研究报道。然而，能够在复杂生命体中专一检测谷胱甘肽而完全不受其它硫醇干扰旳荧光探针仍然存在较大的挑战。

发明内容

鉴于此，本发明的目的在于，提供一种红色荧光铜纳米簇的制备方法及应用，该方法制备简单，且所制备的红色荧光铜纳米簇对谷胱甘肽的检测具有高灵敏度和选择性，可用于构建检测谷胱甘肽的传感体系。

为了达到上述发明目的，进而采取的技术方案如下：

一种红色荧光铜纳米簇，是以2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐为保护剂和还原剂，硝酸铜溶液作为基体，通过超声法制备而成的红色荧光铜纳米簇水溶液。

一种如上所述的红色荧光铜纳米簇的制备方法，包括以下步骤：以体积份数计，将1份浓度为50-150mmol/L硝酸铜溶液和1-10份浓度为50-150mmol/L 2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐水溶液混合，使用0.1mol/L NaOH溶液将pH调节至5.0-8.0，在室温下搅拌10min，然后在100-500W下超声10-25min，得到红色荧光铜纳米簇水溶液。

较佳的，所述硝酸铜溶液和2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐水溶液的体积份数比为1:3。

较佳的，所述硝酸铜溶液的浓度为100mmol/L，所述2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐水溶液的浓度为100mmol/L。

较佳的，硝酸铜溶液与2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐水溶液混合后使用0.1mol/L NaOH溶液调节至pH＝6.3。

较佳的，硝酸铜溶液与2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐水溶液混合后使用300W超声15min。

所述的红色荧光铜纳米簇在荧光增强型谷胱甘肽检测中的应用。

一种荧光增强型谷胱甘肽的检测方法，所述检测方法包括以下步骤：取如上所述的红色荧光铜纳米簇水溶液100μL和pH＝6.3浓度为0.03mol/L的磷酸缓冲液1mL加入到荧光比色皿中，加入不同浓度的谷胱甘肽标准溶液，以332nm为激发波长，测定其荧光光谱，获得荧光强度与谷胱甘肽浓度的线性关系，然后加入待检测样品，通过荧光强度的变化定量检测待测样品中谷胱甘肽的浓度。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明采用超声法一步合成红色荧光铜纳米簇，无需添加还原剂水合肼、抗坏血酸等，具有效率高，仪器要求低，处理时间短、低成本以及绿色环保等优点。

(2)制得的红色荧光铜纳米簇荧光量子产率为0.31％，具有Stocks位移大、水溶性好、抗光漂白能力强、不易聚集成大的纳米颗粒等优点。

(3)2-巯基-5-苯并咪唑磺酸钠是一种带有巯基基团和咪唑环的化合物，含有的巯基可以与贵金属形成较强的键合作用，且2-巯基-5-苯并咪唑磺酸钠中含有的磺酸基可使制得的红色荧光铜纳米簇具有良好的水溶性及良好的生物相容性。

(4)谷胱甘肽对制备的红色荧光铜纳米簇有荧光增强作用，可将所制备的红色荧光铜纳米簇应用于谷胱甘肽的检测。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为实施例3红色荧光铜纳米簇的形成过程示意图；

图2为实施例3红色荧光铜纳米簇紫外-可见吸收光谱图和荧光光谱图；图中：a线：紫外-可见吸收光谱图，b线：激发光谱图，c线：发射光谱图；插图：左图为铜纳米簇在日光下的照片，右图为铜纳米簇在365nm紫外灯下的照片；

图3为实施例3红色荧光铜纳米簇在332nm激发下的抗光漂白性曲线图；

图4为实施例3红色荧光铜纳米簇和2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐的红外光谱图；a线：2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐，b线：铜纳米簇；插图：2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐的结构式；

图5为实施例3红色荧光铜纳米簇在365nm紫外灯照射下有无加入谷胱甘肽的铜纳米簇在滤纸上的照片；左图为未滴加谷胱甘肽的照片，右图为滴加了谷胱甘肽的照片；

图6为实施例3红色荧光铜纳米簇和铜纳米簇+谷胱甘肽的Zeta电位图；a柱：铜纳米簇，b柱：铜纳米簇+谷胱甘肽；

图7为实施例3红色荧光铜纳米簇在15种小分子存在下的荧光强度图；

图8为实施例3红色荧光铜纳米簇在日光(上图)和365nm紫外灯(下图)照射下加入不同小分子后铜纳米簇的照片；

图9为实施例3红色荧光铜纳米簇加入不同浓度的谷胱甘肽后铜纳米簇的荧光光谱图；

图10为实施例3红色荧光铜纳米簇荧光强度F与谷胱甘肽浓度的线性关系图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。

如图1所示，本发明的红色荧光铜纳米簇的形成过程为：首先硝酸铜水溶液和2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐(MBISA)水溶液混合，MBISA通过咪唑环与二价铜Cu(Ⅱ)发生配位形成Cu(Ⅱ)-MBISA配合物；使用NaOH溶液调节pH为5-8，然后在室温下搅拌10min，2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐(MBISA)的咪唑环成为一个富电子中心，其还原性增强，把Cu(Ⅱ)还原为Cu(I)，形成Cu(I)-MBISA配合物；再使用100-500W功率对上述溶液超声并控制反应时间为10-25min时，Cu(I)-MBISA配合物在超声波的能量下被还原为Cu(0)，此时Cu(I)-MBISA配合物的壳聚集在Cu(0)核周围，形成了红色荧光铜纳米簇。

实施例1

一种红色荧光铜纳米簇的制备方法，包括以下步骤：将100μL 50mmol/L硝酸铜溶液和1mL 150mmol/L 2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐水溶液混合摇匀，用0.1mol/LNaOH溶液调节pH至5.0，在室温下搅拌10min，然后将反应混合物以500W的功率超声10min后得到红色荧光铜纳米簇水溶液。该红色荧光铜纳米簇的荧光发射峰在618nm左右，在紫外灯下，以黑色背景观察时，呈现红色荧光，量子产率为0.04％。

实施例2

一种红色荧光铜纳米簇的制备方法，包括以下步骤：将100μL 70mmol/L硝酸铜溶液和500μL 120mmol/L 2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐水溶液混合摇匀，用0.1mol/LNaOH溶液调节pH至5.7，在室温下搅拌10min，然后将反应混合物以150W的功率超声20min后得到红色荧光铜纳米簇水溶液。该红色荧光铜纳米簇的荧光发射峰在630nm左右，在紫外灯下，以黑色背景观察时，呈现红色荧光，量子产率为0.09％。

实施例3

一种红色荧光铜纳米簇的制备方法，包括以下步骤：将100μL 100mmol/L硝酸铜溶液和300μL 100mmol/L 2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐水溶液混合摇匀，用0.1mol/LNaOH溶液调节pH至6.3，在室温下搅拌10min，然后将反应混合物以300W的功率超声15min后得到红色荧光铜纳米簇水溶液。该红色荧光铜纳米簇的荧光发射峰在642nm左右，在紫外灯下，以黑色背景观察时，呈现红色荧光，量子产率为0.31％。

把100μL红色荧光铜纳米簇水溶液和1mL的磷酸缓冲液(PBS，pH＝6.3 0.03mol/L)一起加入到紫外比色皿和荧光比色皿中，测定其紫外-可见吸收光谱及荧光激发和发射光谱图。如图2所示红色荧光铜纳米簇分别在332nm和642nm处显示最大激发和发射峰，较大的斯托克斯位移(310nm)可以避免激发和发射峰的重叠。红色荧光铜纳米簇在332nm处的紫外-可见吸收峰信号与荧光激发光谱相一致。

将该红色荧光铜纳米簇水溶液进行抗光漂白性实验，如图3所示，该红色荧光铜纳米簇水溶液在50min内能保持良好的发光性能，说明其抗光漂白性较好。

将所制备的红色荧光铜纳米簇水溶液中分子的振动能级和转动能级变化进行了探究。将实施例3中合成的红色荧光铜纳米簇水溶液，冷冻干燥，得到粉末。移取少量的红色荧光铜纳米簇固体粉末与一定量的溴化钾粉末混合，压片，放置红外光谱仪中，在4000-375cm^-1波数范围内的吸收光谱进行扫描。如图4所示，比较两者的FTIR光谱时，观察到2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐的S-H拉伸带(2580cm^-1)在铜纳米簇的光谱中消失，说明2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐分子以硫醇盐的形式保护铜纳米簇。铜纳米簇和游离配体的仲胺υ_NH发生在～3394cm^-1，而与游离2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐相比，在～1653cm^-1处观察到明显的差异，蓝移了29cm^-1，且归属于C＝N双键组的在1690-1500cm^-1范围内具有宽松散的峰，可能是归因于铜原子的诱导效应和2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐的官能团与铜纳米簇之间的相互作用。1625-1450cm^-1处的吸收带归属于苯环框架振动，这证实了2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐中苯环的存在。此外，由于传导电子的影响，与自由配体相比，铜纳米簇在<1400cm^-1的吸收带中的精细结构变宽。简而言之，IR光谱证明了2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐以硫醇盐形式附着到铜纳米簇的铜上。

实施例4

一种红色荧光铜纳米簇的制备方法，包括以下步骤：将100μL 120mmol/L硝酸铜溶液和800μL 70mmol/L 2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐水溶液混合摇匀，用0.1mol/LNaOH溶液调节pH至7.3，在室温下搅拌10min，然后将反应混合物以380W的功率超声22min后得到红色荧光铜纳米簇水溶液。该红色荧光铜纳米簇的荧光发射峰在632nm左右，在紫外灯下，以黑色背景观察时，呈现红色荧光，量子产率为0.05％。

实施例5

一种红色荧光铜纳米簇的制备方法，包括以下步骤：将100μL 150mmol/L硝酸铜溶液和100μL 50mmol/L 2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐水溶液混合摇匀，用0.1mol/LNaOH溶液调节pH至8.0，在室温下搅拌10min，然后将反应混合物以100W的功率超声25min后得到红色荧光铜纳米簇水溶液。该红色荧光铜纳米簇的荧光发射峰在622nm左右，在紫外灯下，以黑色背景观察时，呈现红色荧光，量子产率为0.03％。

实施例6

移取100μL实施例3中制备的红色荧光铜纳米簇水溶液和1mL的磷酸缓冲液(PBS，pH＝6.3 0.03mol/L)一起加入到荧光比色皿中，在332nm激发波长下测定加入15种小分子后红色荧光铜纳米簇的荧光强度，如图7所示，谷胱甘肽的加入能显著增强红色荧光铜纳米簇的荧光，其他潜在干扰物对其荧光强度几乎无影响，说明该红色荧光铜纳米簇对谷胱甘肽具有良好的选择性。如图8所示，在自然光下和365nm紫外灯下加入15种小分子后红色荧光铜纳米簇的颜色变化，其中加入谷胱甘肽后红色荧光铜纳米簇在紫外灯照射下有明显的荧光增强，其原因可能由于谷胱甘肽和红色荧光铜纳米簇中的2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐配体交换，而使荧光强度显著增强。

应用上述检测谷胱甘肽的方法考察了其他各种可能存在的物质对红色荧光铜纳米簇荧光强度的影响，15种小分子分别为：氨基葡萄糖、谷胱甘肽、维生素B1、维生素B6、维生素B12、N-羟基琥珀酰亚胺、DL-半胱氨酸、DL-苯丙氨酸、高半胱氨酸、谷氨酰胺、L-半胱氨酸、NAC、天门冬氨酸、VC以及缬氨酸。分别测量在体系中只加入铜纳米簇，和加入15种小分子之后的荧光强度F，并测量其只加入红色荧光铜纳米簇的荧光强度(F₀)作为空白对照组。其中，其他干扰物浓度均高于谷胱甘肽浓度的10倍。

实施例7

红色荧光铜纳米簇在荧光增强型谷胱甘肽检测中的应用

将实施例3制备的红色荧光铜纳米簇水溶液，移取1.5mL滴加在2个剪好的滤纸条上，其中一个滴加10μL谷胱甘肽(0.01μmol·L^-1)，将上述2个滤纸条自然风干后在365nm的紫外灯下观察滤纸条的颜色，如图5所示。结果表明：在365nm紫外灯下滴加谷胱甘肽的滤纸条荧光增强。

移取100μL实施例3制备的红色荧光铜纳米簇水溶液和2mL的磷酸缓冲液(PBS，pH6.3，0.03mol·L^-1)加入到样品池中，放置于纳米粒径电位分析仪中，扫描其Zeta电位值。如图6所示，谷胱甘肽加入前后Zeta电位值没有发生明显的变化，且带负电荷，表明加入谷胱甘肽后该红色荧光铜纳米簇在水溶液中仍具有良好的稳定性。

取实施例3制备的红色荧光铜纳米簇水溶液100μL和1mL的磷酸缓冲液(PBS，pH＝6.3，0.03mol/L)一起加入到荧光比色皿中，分别加入不同浓度的谷胱甘肽标准溶液，以332nm为激发波长，测定其荧光光谱。如图9所示，随着谷胱甘肽标准溶液浓度的增大，红色荧光铜纳米簇的荧光逐渐增强；如图10所示，荧光强度变化值与谷胱甘肽浓度呈线性关系，图中荧光强度的变化以F表示，其中F表示谷胱甘肽存在下铜纳米簇的荧光强度，其线性范围为6.59×10^-7M至4.26×10^-5M(Y＝0.334X+1924，线性系数R²＝0.996)。谷胱甘肽的检测限为4.46×10^-7M。该红色荧光铜纳米簇可应用于水体以及生物样品中谷胱甘肽含量的检测。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进或组合等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种红色荧光铜纳米簇，其特征在于：是以2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐为保护剂和还原剂，硝酸铜溶液作为基体，通过超声法制备而成的红色荧光铜纳米簇水溶液。

2.一种如权利要求1所述的红色荧光铜纳米簇的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以体积份数计，将1份浓度为50-150mmol/L硝酸铜溶液和1-10份浓度为50-150mmol/L2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐水溶液混合，使用0.1mol/L NaOH溶液将pH调节至5.0-8.0，在室温下搅拌10min，然后在100-500W下超声10-25min，得到红色荧光铜纳米簇水溶液。

3.如权利要求2所述的一种红色荧光铜纳米簇的制备方法，其特征在于：所述硝酸铜溶液和2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐水溶液的体积份数比为1:3。

4.如权利要求2所述的一种红色荧光铜纳米簇的制备方法，其特征在于：所述硝酸铜溶液的浓度为100mmol/L，所述2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐水溶液的浓度为100mmol/L。

5.如权利要求2所述的一种红色荧光铜纳米簇的制备方法，其特征在于：硝酸铜溶液与2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐水溶液混合后使用0.1mol/L NaOH溶液调节至pH＝6.3。

6.如权利要求2所述的一种红色荧光铜纳米簇的制备方法，其特征在于：硝酸铜溶液与2-巯基-5-苯并咪唑磺酸二水合钠盐水溶液混合后使用300W超声15min。

7.如权利要求1所述的红色荧光铜纳米簇在荧光增强型谷胱甘肽检测中的应用。

8.一种荧光增强型谷胱甘肽的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：取权利要求1所述的红色荧光铜纳米簇水溶液100μL和pH＝6.3浓度为0.03mol/L的磷酸缓冲液1mL加入到荧光比色皿中，加入不同浓度的谷胱甘肽标准溶液，以332nm为激发波长，测定其荧光光谱，获得荧光强度与谷胱甘肽浓度的线性关系，然后加入待检测样品，通过荧光强度的变化定量检测待测样品中谷胱甘肽的浓度。

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