CN102749317B - 一种基于碳纳米管的表面增强拉曼散射探针的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种基于碳纳米管的表面增强拉曼散射探针及其制备方法，该探针利用碳纳米管的结构特性提高表面增强拉曼散射信号强度，包括芯层、吸附在所述芯层外部的包裹层和吸附在所述包裹层外部的表面增强型拉曼散射标记物，芯层由表面包裹有一层带正电性的聚丙烯胺盐酸盐的碳纳米管组成，包裹层为金属纳米粒子构成的金属纳米粒子层。本发明的探针以金属纳米粒子为表面增强拉曼散射基底，以碳纳米管为负载模板制成特定结构的表面增强拉曼散射探针，该探针在激发光照射下，产生具有较高信噪比的表面增强拉曼散射信号。

Description

一种基于碳纳米管的表面增强拉曼散射探针的制备方法

技术领域

本发明属于纳米材料学和生物分析化学领域，具体涉及一种表面增强拉曼散射探针的制备方法。

背景技术

近年来，随着纳米材料制备、表征等技术的高速发展，基于纳米材料的光学探针以其独特的光学性质及小尺寸的特点在生物传感、生物成像与生物检测领域的重大应用前景引起了人们的广泛关注。各种结构和材料的光学探针层出不穷，极大地提高了探测的灵敏度和检测范围，有效的改善了生物、化学领域的研究手段。

在光学探测技术中，荧光探测技术快速且简单，并在生物传感、药物研发、肿瘤诊断治疗等领域中得到广泛应用。但是它存在光漂白、发射谱宽等问题，制约了其在某些探测领域中的进一步应用。

近几年来表面增强型拉曼散射技术（SERS）作为一种兴起的光学探测技术，自发现以来的短短几年内就得到了飞速发展，由于其能对吸附在粗糙的金属表面的分子的拉曼信号进行了极大的增强而受到了广泛的关注。相对于荧光探测技术,表面增强拉曼散射不会被光漂白且谱线更窄，同是又具有高分辨率、超灵敏性和高结构信息等特点,被人们称为指纹光谱被广泛地应用在环境检测、细胞分析和抗原免疫检测等领域。

近十年来，碳纳米管作为一种特殊的一维纳米结构，凭借其良好的机械性能，电学性能，光学性能而得到广泛的研究。例如碳纳米管较高的长径比和负载能力被广泛的用于纳米药物载体技术中，优异的导电性则被应用于电极中等。目前基于碳纳米管和金属纳米粒子复合物的纳米粒子成为碳纳米管研究的一个热点。

尽管关于SERS探针的结构和制备方法已有大量报道，但能适用于生物活体的探针并不多，并且制备方法较为繁琐，灵敏度、稳定性和生物兼容性尚有待进一步提高。目前基于碳纳米管/金属纳米粒子复合结构的研究多数应用在电化学检测领域，作为SERS探针的研究很少，它们主要以长链型单壁或者多壁碳纳米管为模板，通过共价键方式连接金属纳米粒子，制备方法较为繁琐，稳定性差，表面增强型拉曼散射信号强度低，而且由于其尺寸大，生物兼容性较差。然而本发明使用的是以短多壁碳纳米管作为模板，在对碳纳米管所酸化处理后，使其带上负电荷，然后使用正电荷聚合物聚丙烯胺盐酸盐透过静电方式包 裹在碳纳米管表面，再通过静电吸附方式修饰金属纳米粒子，本发明采用静电吸附方式合成探针简化了制备步骤，提高了碳纳米管表面修饰金属纳米粒子的密度且有效的提高了碳纳米管/金属纳米粒子复合结构的稳定性、表面增强型拉曼散射的信号强等，聚合物包裹碳纳米管和混酸处理剪切碳纳米管大大地提高了本探针的生物兼容性。

发明内容

技术问题：本发明提供了一种具有一维结构特性，灵敏度高，稳定性和生物兼容性好，操作简单、可重复性好、成本低廉并且环境友好的基于碳纳米管的表面增强拉曼散射探针的制备方法。

技术方案：本发明的基于碳纳米管的表面增强拉曼散射探针，包括芯层、吸附在所述芯层外部的包裹层和吸附在所述包裹层外部的表面增强型拉曼散射标记物，芯层由表面包裹有一层带正电性的聚丙烯胺盐酸盐的碳纳米管组成，包裹层为金属纳米粒子构成的金属纳米粒子层。

本发明中，表面增强型拉曼散射标记物布满包裹层的整个外表面。

本发明中，碳纳米管为短多壁碳纳米管。

本发明中，金属纳米粒子为金纳米粒子、银纳米粒子或金银复合金属纳米粒子。

本发明中，表面增强型拉曼散射标记物为4-巯基苯甲酸分子、5,5-二硫代双2-硝基苯甲酸分子、4-氨基苯硫酚、4-甲氧基苯硫酚或2-萘硫酚。

本发明的基于碳纳米管的表面增强拉曼散射探针利用吸附在碳纳米管上的密集金属纳米粒子作为SERS基底，其表面粗糙且具有多孔结构特性在激发光照射下，能够产生较强的表面增强型拉曼散射信号。

本发明的基于碳纳米管的表面增强型拉曼散射探针的制备方法，包括以下步骤：

1）制备具有水溶性的羧基功能化的碳纳米管：

将碳纳米管按照质量体积比0.5mg：1mL～1mg：1mL的比例加入到硫酸和硝酸混合溶液中，使用超声波清洗仪超声处理4～8小时，然后加入到装有聚四氟乙烯滤膜的抽滤瓶中使用去离子水过滤清洗至pH值为6～7，得到水溶性的羧基功能化的碳纳米管，所述硫酸和硝酸混合溶液是由质量百分比浓度为96%～98%的浓硫酸和质量百分比浓度为65%～68%的浓硝酸按照体积比1：1～3：1混合而成；

2）制备金属纳米粒子溶液：

采用柠檬酸三钠还原法制备金纳米粒子或银纳米粒子，或采用化学还原法制备金核银壳纳米粒子，得到金属纳米粒子溶液；

3）用带正电的聚电解质对水溶性的羧基功能化的碳纳米管进行修饰：

将所述步骤1）中制备的水溶性的羧基功能化的碳纳米管按照质量体积比1mg：2mL～2mg：2mL的比例加入到5mg/mL～10mg/mL的聚丙烯胺盐酸盐溶液中超声30～60分钟后离心清洗，去除上清中残留的游离的聚丙烯胺盐酸盐，得到的沉淀为聚丙烯胺盐酸盐包裹的碳纳米管；

4）制备金属纳米粒子修饰的碳纳米管溶液：

将所述步骤3）中制备的聚丙烯胺盐酸盐包裹的碳纳米管按照质量体积比0.5mg：10mL～0.5mg：20mL的比例加入到所述步骤2）制备的金属纳米粒子溶液中混合搅拌30～60分钟，离心清洗去除上清中没有吸附在碳纳米管表面的金属纳米粒子，得到沉淀是金属纳米粒子包裹的碳纳米管，并将沉淀按照质量体积比0.5mg：3mL～0.5mg：6mL的比例分散到水溶液中，得到金属纳米粒子修饰的碳纳米管溶液；

5）在金属纳米粒子修饰的碳纳米管表面吸附表面增强型拉曼散射分子：

将含硫的表面增强型拉曼散射分子溶液与所述步骤4）得到的金属纳米粒子修饰碳纳米管溶液按照1：100～1：300体积比混合搅拌反应6～8小时，表面增强型拉曼散射分子即通过金-硫键吸附到金属纳米粒子表面，得到基于碳纳米管的表面增强拉曼散射探针。

本发明中，步骤2）中采用柠檬酸三钠还原法制备金纳米粒子溶液的具体方法为：取质量百分比浓度1%的氯金酸溶液按照体积比1：100入到去离子水中，加热至沸腾，然后按1：25体积比加入质量百分比浓度1%的柠檬酸三钠溶液，持续加热搅拌15min后冷却至常温，得到金纳米粒子溶液。

本发明中，步骤2）中采用柠檬酸三钠还原法制备银纳米粒子的具体方法为：将1毫摩尔/升的硝酸银溶液搅拌加热至沸腾后，按照体积比1：50加入1%的柠檬酸三钠溶液持续加热搅拌1h后冷却至常温，得到银纳米粒子溶液。

本发明中，步骤2）中用化学还原法制备金核银壳纳米粒子的具体方法为：首先制备金纳米粒子溶液，然后将0.1摩尔/升的抗坏血酸溶液按照体积比1：12加入金纳米粒子溶液中搅拌，最后按照体积比1：30滴加0.1摩尔/升硝酸银溶液并持续搅拌30min后即得金核银壳纳米粒子溶液。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明的基于碳纳米管的表面增强拉曼散射探针在结构上使用短多壁碳纳米管作为模板，通过简单的混酸性超声处理，在碳纳米管表面修饰羧基，使其具有良好的水溶性并且在水溶液中带有负电性，然后通过静电吸附作用包裹一层正电性的聚合物聚丙烯胺盐酸盐，最后同样是利用静电吸附作用将使用柠檬酸三钠做为稳定剂的表面为负电性的金属纳米粒子吸附在碳纳米管表面，形成长链结构的SERS活性基底，该基底由于吸附大量密集的金属纳米粒子，因而能对表面增强型拉曼散射标记物具有强的增强效应。

本发明制备基于碳纳米管的表面增强拉曼散射探针的方法操作简单、可重复性好、成本低廉并且环境友好，具体有如下优点：

1.本发明中碳纳米管-金属纳米粒子中使用的是短多壁碳纳米管，尺寸小，价格较已有的使用单笔碳纳米管，长多壁碳纳米管价格低廉，且制备的最终产物生物兼容性更好。

2.本发明利用碳纳米管-金属纳米粒子的复合结构作为SERS基底，与传统的以金属纳米粒子溶胶为增强基底的SERS探针相比，SERS信号明显增强，且碳纳米管表面的金属纳米粒子密集且均一可控；

3.本发明通过简单静电吸附方式在负电性的羧基功能化碳纳米管表面包裹一层正电性的聚合物聚丙烯胺盐酸盐，包裹时间30分钟，且包裹后的碳纳米管稳性和生物兼容性得到了进一步的提高。相对于现有的通过聚电解质层层包覆原始碳纳米管12小时的方法，本发明的方法反应时间短，过程简单，反应试剂量少，稳定性好。

4.本发明中通过简单的静电吸附方式在碳纳米管表面吸附大量的呈负电性的金属纳米粒子；该方法简单有效的在碳纳米管表面吸附了密集的金属纳米粒子。相对于现有的在碳纳米管表面原位生长金属纳米粒子或共价键连接金属纳米子，本方法可以在碳纳米管表面吸附的金属纳米粒子更多，更密集。对SERS信号有更好的增强。

5.本发明的制备方法操作简单、可重复性好、成本低廉并且环境友好，碳纳米管、金属纳米粒子和SERS标记物也只需要极少量就可以完成探针的制备；

6.本发明的光学探针成长链型，可以应用于特定条件下，在外层可以修饰聚合物或者二氧化硅后将具有良好的生物兼容性。

7.本发明的光学探针主要具有表面增强型拉曼散射光学信号和具有载体性质的碳纳米管，易于实现光学探针的多功能，在药物装载运输，生物传感及探测等应用领域具有重要的应用价值。

附图说明

图1是本发明的基于碳纳米管的表面增强拉曼散射探针的整体结构示意图；

图2是以4-巯基苯甲酸分子为表面增强型拉曼散射标记物，以金银复合纳米粒子作为表面增强型拉曼散射活性基底的光学探针的表面增强型拉曼散射光谱，激发波长为633nm。

图3是以5,5-二巯基-2,2-二硝基苯甲酸分子为表面增强型拉曼散射标记物，以金纳米粒子作为表面增强型拉曼散射活性基底的光学探针溶液的表面增强型拉曼散射光谱，激发波长为633nm。

图1中有：碳纳米管1、金属纳米粒子2、表面增强型拉曼散射标记物3。

具体实施方式

本发明的SERS探针采用碳纳米管-金属纳米粒子复合结构作为表面增强拉曼的基底，实现方法简述如：采用改良的强酸混合超声处理的方法制备得到所酸化的碳纳米管，然后将所酸化的碳纳米管采用聚电解质进行功能化修饰改变碳纳米管的电性，利用静电吸附的作用将金属纳米粒子吸附在碳纳米管的的表面，然后将SERS标记物吸附在金属纳米上，形成基于碳纳米管的表面增强拉曼散射探针。

下面结合附图和实施例对本发明作更进一步的说明。

实施例1：制备以修饰金银复合纳米粒子的碳纳米管为SERS基底，以5,5-二硫代双2-硝基苯甲酸分子为SERS标记物的光学探针，该方法包括如下步骤：

1）制备具有水溶性的羧基功能化的碳纳米管。

将购买的原始多壁碳纳米管（直径40-60nm,长度1-2μm）50mg加入到100mL浓度为96%～98%的硫酸和浓度为65%～68%的硝酸（v/v=3：1、2：1或3：1）混合溶液中，然后在超声波清洗仪中超声8h后，在抽滤瓶中使用大量的去离子水过滤清洗至接近中性，得到的羧酸化的碳纳米管长度约为500nm左右。

2）制备金纳米粒子。

取1mL1%的氯金酸溶液加入到100mL去离子水中，加热至沸腾，然后加入4mL1%的柠檬酸三钠溶液，持续加热搅拌15min后，停止反应，冷却溶液以备用，所得金纳米粒子尺寸约为18nm左右。

3）用带正电的聚电解质对水溶性的羧基功能化的碳纳米管进行修饰。

取5mg步骤1）制备的功能化的壁碳纳米管分散到10mL10mg/mL的聚丙烯胺盐酸盐（包含0.5mM氯化钠）溶液中，超声30分钟后，高速离心洗涤去除上清，将沉淀重分散到0.5ml的去离子水中，即得包裹聚丙烯胺盐酸盐的碳纳米管。

4）制备金银复合纳米粒子修饰的碳纳米管溶液。

取0.5mg步骤3）所制的碳纳米管/聚丙烯胺盐酸盐溶液加入到18mL的金纳米粒子溶液中，超声30min后，离心洗涤，重新分散到6mL的去离子水中，即得碳纳米管/金纳米粒子。然后在上述碳纳米管/金纳米粒子水溶液中加500uL0.1M的抗坏血酸和500μL1%的柠檬酸三钠溶液，然后加入200uL0.1M的硝酸银溶液。

5）在金属纳米粒子修饰的碳纳米管表面吸附表面增强型拉曼散射分子

在步骤4）得到的纳米粒子溶液中依次加入10μL5,5二硫代双2-硝基苯甲酸（10-3M）混合搅拌6小时后离心洗涤去除上清中残留的5,5-二硫代双2-硝基苯甲酸分子。所剩的沉 淀即是碳纳米管/金/银纳米粒子复合结构的表面增强新拉曼散射探针。

如图1所示，该光学探针，包括分散于水溶液中的纳米粒子，每个纳米粒子包括芯层和包裹层，芯层为聚丙烯胺盐酸盐包裹的碳纳米管，包裹层为附着在碳纳米管1表面的吸附了一层表面增强性拉曼散射标记物5,5二硫代双2-硝基苯甲酸3的金银复合纳米粒子2。

该金银复合纳米材料修饰碳纳米管光学探针的SERS信号探测是通过将该光学探针滴于硅片上，并固定在共焦拉曼光谱仪上测得。激光源为633nm的氩离子激光器，样品上的照射功率为1.2mW，积分时间为30s。该标记具有信噪比很高的SERS信号，适用于的生物成像和靶分子探测。

实施例2：制备方法和步骤同实施例1，不同之处在于用4-巯基苯甲酸分子替换5,5-二硫代双2-硝基苯甲酸分子。

实施例3：制备以修饰银纳米粒子的碳纳米管为SERS基底，以5，5-二硫代双2-硝基苯甲酸分子为表面增强型拉曼散射标记物的SERS光学探针，包括如下步骤：

1）制备具有水溶性的羧基功能化的碳纳米管。见实例1步骤1）

2）制备银纳米粒子。采用柠檬酸三钠还原法制备银纳米粒子的具体方法为：将1mM的硝酸银溶液搅拌加热至沸腾后，按照体积比1：50加入1%的柠檬酸三钠溶液持续加热搅拌1h后冷却至常温，得到银纳米粒子溶液。

3）用带正电的聚电解质对水溶性的羧基功能化的碳纳米管进行修饰。见实例1步骤3）

4）制备碳纳米管/银纳米粒子。见实例1步骤4）。

5）在金属纳米粒子修饰的碳纳米管表面吸附表面增强型拉曼散射分子。见实例1步骤5

实施例4：制备以修饰金纳米粒子的碳纳米管为SERS基底，以5，5-二硫代双2-硝基苯甲酸分子为表面增强型拉曼散射标记物的SERS光学探针，包括如下步骤：

1）制备具有水溶性的羧基功能化的碳纳米管。见实例1步骤1）

2）制备金纳米粒子。见实例1步骤2）。

3）用带正电的聚电解质对水溶性的羧基功能化的碳纳米管进行修饰。聚丙烯胺盐酸盐的浓度改为5mg/mL。

4）制备碳纳米管/金纳米粒子。取0.5mg步骤3）所制的碳纳米管/聚丙烯胺盐，见实例1步骤4。

5）在金属纳米粒子修饰的碳纳米管表面吸附表面增强型拉曼散射分子。见实例1步骤5。

实施例5：制备以修饰金纳米粒子的碳纳米管为SERS基底，以5，5-二硫代双2-硝基 苯甲酸分子为表面增强型拉曼散射标记物的SERS光学探针，该方法包括如下步骤：

1）制备具有水溶性的羧基功能化的碳纳米管。见实例1步骤1）。

2）制备金纳米粒子。见实例1步骤2）。

3）用带正电的聚电解质对水溶性的羧基功能化的碳纳米管进行修饰。聚丙烯胺盐酸盐的浓度改为2.5mg/mL。

4）制备碳纳米管/金纳米粒子。取0.75mg步骤3）所制的碳纳米管/聚丙烯胺盐，见实例1步骤4。

5）在金属纳米粒子修饰的碳纳米管表面吸附表面增强型拉曼散射分子。见实例1步骤5。

实施例6：制备以修饰金纳米粒子的碳纳米管为SERS基底，以5，5-二硫代双2-硝基苯甲酸分子为表面增强型拉曼散射标记物的SERS光学探针，包括如下步骤：

1）制备具有水溶性的羧基功能化的碳纳米管。见实例1步骤1）并将购买的原始多壁碳纳米管）改为100mg。

2）制备金纳米粒子。见实例1步骤2）。

3）用带正电的聚电解质对水溶性的羧基功能化的碳纳米管进行修饰。见实例1步骤3）。

4）制备碳纳米管/金纳米粒子。见实例1步骤4）。

5）在金属纳米粒子修饰的碳纳米管表面吸附表面增强型拉曼散射分子。见实例1步骤5）。

实施例7：制备以修饰金纳米粒子的碳纳米管为SERS基底，以5，5-二硫代双2-硝基苯甲酸分子为表面增强型拉曼散射标记物的SERS光学探针，包括如下步骤：

1）制备具有水溶性的羧基功能化的碳纳米管。见实例1步骤1）并将购买的原始多壁碳纳米管）改为75mg。

2）制备金纳米粒子。见实例1步骤2）。

3）用带正电的聚电解质对水溶性的羧基功能化的碳纳米管进行修饰。见实例1步骤3）。

4）制备碳纳米管/金纳米粒子。见实例1步骤4）。

5）在金属纳米粒子修饰的碳纳米管表面吸附表面增强型拉曼散射分子。见实例1步骤5）。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种基于碳纳米管的表面增强拉曼散射探针的制备方法，其特征在于，

所述的方法包括以下步骤：

1）制备具有水溶性的羧基功能化的碳纳米管：

将碳纳米管按照质量体积比0.5mg：1mL～1mg：1mL的比例加入到硫酸和硝酸混合溶液中，使用超声波清洗仪超声处理4～8小时，然后加入到装有聚四氟乙烯滤膜的抽滤瓶中使用去离子水过滤清洗至pH值为6～7，得到水溶性的羧基功能化的碳纳米管，所述硫酸和硝酸混合溶液是由质量百分比浓度为96%～98%的浓硫酸和质量百分比浓度为65%～68%的浓硝酸按照体积比1：1～3：1混合而成；

2）制备金属纳米粒子溶液：

采用柠檬酸三钠还原法制备金纳米粒子或银纳米粒子，或采用化学还原法制备金核银壳纳米粒子，得到金属纳米粒子溶液；

3）用带正电的聚电解质对水溶性的羧基功能化的碳纳米管进行修饰：

将所述步骤1）中制备的水溶性的羧基功能化的碳纳米管按照质量体积比1mg：2mL～2mg：2mL的比例加入到5mg/mL～10mg/mL的聚丙烯胺盐酸盐溶液中超声30～60分钟后离心清洗，去除上清中残留的游离的聚丙烯胺盐酸盐，得到的沉淀为聚丙烯胺盐酸盐包裹的碳纳米管；

4）制备金属纳米粒子修饰的碳纳米管溶液：

将所述步骤3）中制备的聚丙烯胺盐酸盐包裹的碳纳米管按照质量体积比0.5mg：10mL～0.5mg：20mL的比例加入到所述步骤2）制备的金属纳米粒子溶液中混合搅拌30～60分钟，离心清洗去除上清中没有吸附在碳纳米管表面的金属纳米粒子，得到沉淀是金属纳米粒子包裹的碳纳米管，并将沉淀按照质量体积比0.5mg：3mL～0.5mg：6mL的比例分散到水溶液中，得到金属纳米粒子修饰的碳纳米管溶液；

5）在金属纳米粒子修饰的碳纳米管表面吸附表面增强型拉曼散射分子：

将含硫的表面增强型拉曼散射分子溶液与所述步骤4）得到的金属纳米粒子修饰碳纳米管溶液按照1：100～1：300体积比混合搅拌反应6～8小时，表面增强型拉曼散射分子即通过金-硫键吸附到金属纳米粒子表面，得到基于碳纳米管的表面增强拉曼散射探针。

2.根据权利要求1所述的基于碳纳米管的表面增强拉曼散射探针的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中采用柠檬酸三钠还原法制备金纳米粒子溶液的具体方法为：取质量百分比浓度1%的氯金酸溶液按照体积比1：100入到去离子水中，加热至沸腾，然后按1：25体积比加入质量百分比浓度1%的柠檬酸三钠溶液，持续加热搅拌15min后冷却至常温，得到金纳米粒子溶液。

3.根据权利要求1所述的基于碳纳米管的表面增强拉曼散射探针的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中采用柠檬酸三钠还原法制备银纳米粒子的具体方法为：将1毫摩尔/升的硝酸银溶液搅拌加热至沸腾后，按照体积比1：50加入1%的柠檬酸三钠溶液持续加热搅拌1h后冷却至常温，得到银纳米粒子溶液。

4.根据权利要求1所述的基于碳纳米管的表面增强拉曼散射探针的制备方法，其特征在于，所述步骤2）中用化学还原法制备金核银壳纳米粒子的具体方法为：首先制备金纳米粒子溶液，然后将0.1摩尔/升的抗坏血酸溶液按照体积比1：12加入金纳米粒子溶液中搅拌，最后按照体积比1：30滴加0.1摩尔/升硝酸银溶液并持续搅拌30min后即得金核银壳纳米粒子溶液。