CN102206357A

CN102206357A - 一种sers标签微球及其制备方法

Info

Publication number: CN102206357A
Application number: CN2011100749789A
Authority: CN
Inventors: 汪长春; 李菊梅
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2011-03-28
Filing date: 2011-03-28
Publication date: 2011-10-05
Anticipated expiration: 2031-03-28
Also published as: CN102206357B

Abstract

本发明属于材料及生物技术领域，具体为一种SERS标签微球及其制备方法。本发明首先以表面为羧基官能团的聚合物微球为模板，利用原位化学还原方法，通过还原剂还原硝酸银溶液制备具有均匀、致密的表面银纳米粒子覆盖度的复合微球；然后通过化学吸附拉曼探针分子和硅烷偶联剂，利用溶胶凝胶方法包覆二氧化硅壳层后，制备得到具有高SERS活性的SERS标签微球。该SERS标签微球呈单分散性，具有高稳定性和生物相容性，且二氧化硅表面易于改性为氨基或羧基等官能团，然后通过化学结合生物分子而应用于免疫分析、生物医学成像和疾病的治疗等领域。本发明方法操作简单，过程可控，有良好的应用前景。

Description

一种SERS标签微球及其制备方法

技术领域

本发明属于材料及生物技术领域，具体涉及一种SERS标签微球及其制备方法。

技术背景

拉曼光谱是一种振动光谱，应用于检测分析具有许多优点：（1）可以提供分子水平上的化学结构和官能团的信息而用于识别特定生物分子；（2）光谱峰宽较窄，信号间无重叠，适合多元分析；(3)不受水、氧等的干扰，可以检测水溶液样品；（4）不破坏样品的结构，可以提供无损检测，特别适合生物样品的检测。因此拉曼光谱在生物样品的分子影像和临床诊断等领域得到了广泛的关注。然而，拉曼光谱的信号强度很低，大大限制了其检测灵敏度和应用范围。表面增强拉曼散色光谱（SERS）技术则可以显著提高其检测灵敏度，甚至可以提供单分子水平的检测（Kneipp, J.; Kneipp, H.; Kneipp, K. Chem. Soc. Rev.2008, 37, 1052-1060.Doering,E.D;Nie,S.M.Anal.Chem.2003,75,6171-6176），而受到了广泛关注。

目前，SERS增强基底主要有金或银的粗糙表面，纳米颗粒或沉积在介电微球表面的聚集体。由于介电微球/纳米粒子具有较高的稳定性，应用中简单的操作性，高SERS活性而成为SERS增强基底的研究热点。Halas利用二氧化硅微球为模板，首先吸附一层1-3nm 金纳米粒子作为种子后，再通过逐步沉积方式制备了二氧化硅/银纳米粒子复合微球（Oldenburg, S. J.; Westcott, S. L.; Averitt, R. D.; Halas, N. J. J.chem.phys. 1999, 111, 4729-4735）。Cassagneau利用聚苯乙烯为核，组装聚苯乙烯苯磺酸得到表面带负电荷的微球后，与3-氨丙基硅氧烷稳定的银纳米粒子组装，得到了聚苯乙烯/银纳米粒子复合微球（Cassagneau, T.; Caruso, F. Adv. Mater.2002, 14, 732-736）。上述方法虽然可以得到高SERS活性的基底，但是这些方法需要多重步骤、制备过程繁琐、费时；而且银纳米颗粒和拉曼探针分子裸露在外面，容易受外界环境的影响，造成SERS活性降低和信号易受外界分子干扰。因此，开发制备方法简便、易操作、信号稳定和具有生物相容性的SERS活性基底仍是近年研究的热点。

发明内容

本发明的目的在于提出一种新型的具有高SERS活性、稳定性和生物相容性的SERS标签微球及其制备方法。

本发明针对背景技术中所存在的问题，提出了一种原位化学还原方法制备表面银纳米粒子覆盖均一致密的聚合物/银纳米粒子复合微球，整个制备过程简单、高效、可重复；吸附拉曼探针分子后，再利用溶胶凝胶方法包覆二氧化硅制备了高SERS活性、稳定性和生物相容性的SERS标签微球。

本发明SERS标签微球的制备方法为，首先以苯乙烯和侧链带羧基的烯类单体为原料，通过无皂乳液自由基共聚合制备得到表面带羧基功能团的聚合物模板，与硝酸银溶液充分混合后，使银离子与聚合物微球表面的羧基络合形成均匀的成核位点；然后，加入还原剂，通过原位化学还原方法，制备得到表面具有均匀、致密银纳米粒子的聚合物/银粒子复合微球；再吸附拉曼探针分子和硅烷偶联剂后，通过溶胶凝胶方法包覆二氧化硅壳层，得到了一种新型的SERS标签微球（如图2所示）。该SERS标签微球粒径呈现单分散性，具有高SERS活性、稳定性和生物相容性，二氧化硅表面易于改性为氨基或羧基等功能团，可以通过化学结合各种生物分子，是一种非常有应用前景的生物分析材料。

具体制备步骤如下（其流程如图1所示）：

1．将苯乙烯、侧链带羧基的烯类单体和水加入装备了机械搅拌器和冷凝管的三口烧瓶，通氮气20～40 min，排除烧瓶内的氧气；然后升温到50～90℃，向体系中加入占单体总重量0.1～5%的水溶性引发剂溶液（事先溶解在2--5ml水中），保温反应1～12 h后，用去离子水离心洗涤除去未反应的单体和引发剂，再分散在水中配制成微球含量为0.4～0.6wt%的乳液。

2．将以上得到的聚合物微球和硝酸银水溶液加入单口烧瓶，在室温下磁力搅拌2～6h，使银离子充分和微球表面的羧基络合；然后加入还原剂，升温到30～90℃温度，保温反应7～12h后，用去离子水离心洗涤除去未反应的还原剂和硝酸银，得到表面均匀覆盖银纳米粒子的聚合物/银纳米粒子复合微球。

3．将以上得到的聚合物/银纳米粒子复合微球分散于拉曼探针分子和硅烷偶联剂的乙醇混合溶液中，室温下搅拌0.1～10h后，分别用乙醇和去离子水离心洗涤除去过量的拉曼探针分子和硅烷偶联剂；然后将上述微球分散在水和乙醇的混合溶液中，再加入氨水和一定量的正硅酸乙酯（TEOS），超声乳化0.2～4h，超声功率为400～800W，得到外层包覆二氧化硅的高稳定性和生物相容性的SERS标签微球。

本发明所述的侧链带羧基的烯类单体为甲基丙烯酸和丙烯酸中的一种。

本发明所述的水溶性引发剂为过硫酸铵和过硫酸钾中的一种。

本发明所述的还原剂为不同分子量的聚乙烯吡咯烷酮（PVP），如PVP-K15、PVP-K30或PVP-K90，或者为硼氢化钠，水合肼，甲醛和柠檬酸三钠中的一种。

本发明所述的原位化学还原方法制备聚合物/银纳米粒子复合微球的反应温度为30～90℃。

本发明所述的硝酸银水溶液的浓度为0.01～1mol/L,还原剂浓度为0.05%～10 wt%。

本发明所述的拉曼探针分子为苯硫酚(BT)、4-氨基苯硫酚（4-ABT）、4-羟基苯硫酚（4-HBT）、4-硝基苯硫酚（4-NBT）、4-巯基苯甲酸（4-MBA）等苯硫酚及其衍生物中的一种或几种。

本发明所述的硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、3-氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS）、（3-巯基丙基）三乙氧基硅烷（MPTES）和（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷（MPTMS）中的一种或几种。

目前SERS标签微球主要存在SERS活性低、拉曼信号不稳定、制备方法复杂等问题。本发明通过无皂乳液自由基共聚合方法制备表面带有羧基功能团的聚合物微球后，再通过原位化学还原方法制备表面银纳米粒子覆盖均一、致密的聚合物/银纳米粒子复合微球，吸附拉曼探针分子后，然后通过溶胶凝胶方法包覆二氧化硅得到了高SERS活性、稳定性和生物相容性的SERS标签微球。通过这种方法制备的SERS标签微球具有以下特点：(1) 无皂乳液聚合方法可以作为一种通用的方法制备表面带各种功能团的聚合物微球模板；(2) 原位化学还原方法可以精确控制聚合物微球表面的银纳米粒子覆盖度；(3) 二氧化硅表面易于功能团化，然后化学结合各种生物分子；(4) 二氧化硅壳层使得SERS标签具有高稳定性和生物相容性；(5) SERS标签微球的制备过程简单、高效、可重复。

附图说明

图1为本发明新型SERS标签微球的制备过程流程图。

图2为样品的TEM照片。

图3是以4-氨基苯硫酚为拉曼探针分子的SERS标签在溶液中的SERS光谱。

图4是以4-羟基苯硫酚为拉曼探针分子的SERS标签在溶液中的SERS光谱。

具体实施方式

实施例1：制备以4-氨基苯硫酚(4-ABT)为拉曼探针分子的SERS标签

1、聚合物模板（PSA）的制备

将2.0g苯乙烯、0.1g丙烯酸和100ml去离子水加入装备了机械搅拌器和冷凝管的250 ml三口烧瓶中，通氮气30min排除烧瓶内的氧气；然后升温到70℃，向体系中加入0.08g过硫酸钾水溶液（事先溶解在2ml水中），保温反应10h后，用去离子水离心洗涤除去未反应的单体和引发剂，再分散在去离子水中配制成微球含量为0.5wt%的乳液。

2、聚合物/银纳米粒子复合微球(PSA@AgNPs)的制备

将2ml以上得到的聚合物微球加入100ml单口烧瓶，再加入20ml 0.1mol/L硝酸银水溶液，在室温下磁力搅拌2h，使银离子充分和微球表面的羧基络合；然后加入20ml 3% PVP K30水溶液,升温到70℃，保温反应7h后，用去离子水离心洗涤除去未反应的PVP和硝酸银，得到表面均匀覆盖银纳米粒子的聚合物/银纳米粒子复合微球。

3、SERS标签微球（PSA@AgNPs/4-ABT@SiO₂）的制备

将以上得到的聚合物/银纳米粒子复合微球分散于1mM 4-ABT和 1% 3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）的乙醇混合溶液中，室温下搅拌5h后，分别用乙醇和去离子水离心洗涤除去过量的4-ABT和APTES；然后将上述微球分散在9g水和32g乙醇的混合溶液中，再加入1g氨水和0.2g正硅酸乙酯（TEOS）,超声乳化1h，超声功率为600W，得到外层包覆二氧化硅的高稳定性和生物相容性的SERS标签微球。其SERS光谱如图3所示。

实施例2：制备以4-羟基苯硫酚(4-HBT)为拉曼探针分子的SERS标签

1、聚合物模板（PSA）的制备同实施例1-1中所述。

2、聚合物/银纳米粒子复合微球(PSA@AgNPs)的制备同实施例1-2中所述。

3、SERS标签微球（PSA@AgNPs/4-HBT@SiO₂）的制备同实施例1-3中所述。所不同的是拉曼标记分子为4-羟基苯硫酚（4-HBT），最终得到的SERS标签的SERS光谱如图4所示。

Claims

1.一种SERS标签微球，其特征在于为以带有羧基功能团的聚合物微球为核、以银纳米粒子/拉曼探针分子/二氧化硅为壳的核壳结构微球。

2.一种SERS标签微球的制备方法，其特征在于具体步骤为：首先，用无皂乳液自由基共聚合方法制备表面带有羧基功能团的聚合物微球；其次，通过原位化学还原方法，使用还原剂还原硝酸银溶液制备表面具有均匀、致密银纳米粒子的聚合物/银纳米粒子复合微球；然后，通过吸附拉曼探针分子和硅烷偶联剂，利用溶胶凝胶方法包覆二氧化硅壳层，制备得到高稳定性和生物相容性的SERS标签微球。

3.根据权利要求2所述的SERS标签微球的制备方法，其特征在于，所述的采用无皂乳液自由基共聚合方法制备表面带有羧基功能团的聚合物微球，具体操作如下：

将苯乙烯、侧链带羧基的烯类单体和水加入装备了机械搅拌器和冷凝管的三口烧瓶，通氮气20～40min，排除烧瓶内的氧气；然后升温到50～90℃，向体系中加入占单体总重量0.1～5%的水溶性引发剂溶液，保温反应1～12h后，用去离子水离心洗涤除去未反应的单体和引发剂，再分散在去离子水中配制成微球含量为0.4～0.6 wt%的乳液；

所述的采用原位化学还原方法制备聚合物/银纳米粒子复合微球，具体操作如下：

将以上得到的聚合物微球和硝酸银水溶液加入单口烧瓶，在室温下磁力搅拌2～6h，使银离子充分和微球表面的羧基络合；然后加入还原剂,升温到30～90℃温度，保温反应7～12h后，用去离子水离心洗涤除去未反应的还原剂和硝酸银，得到表面均匀覆盖银纳米粒子的聚合物/银纳米粒子复合微球；

所述的通过吸附拉曼探针分子和硅烷偶联剂后，利用溶胶凝胶方法对聚合物/银纳米粒子复合微球进行壳层二氧化硅包覆，制备具有高稳定性和生物相容性SERS标签微球，具体操作如下：

将以上得到的聚合物/银纳米粒子复合微球分散于拉曼探针分子和硅烷偶联剂的乙醇混合溶液中，室温下搅拌0.1～10h后，分别用乙醇和去离子水离心洗涤除去过量的拉曼探针分子和硅烷偶联剂；然后将上述微球分散在水和乙醇的混合溶液中，再加入氨水和正硅酸乙酯, 超声乳化0.2～4h，超声功率为400～800W，得到外层包覆二氧化硅的高稳定性和生物相容性的SERS标签微球。

4.根据权利要求3所述的SERS标签微球的制备方法，其特征在于，所述的侧链带羧基的烯类单体为甲基丙烯酸和丙烯酸中的一种。

5.根据权利要求3所述的SERS标签微球的制备方法，其特征在于，所述的水溶性引发剂为过硫酸铵和过硫酸钾中的一种。

6.根据权利要求3所述SERS标签微球的制备方法，其特征在于，所述的还原剂为不同分子量的聚乙烯吡咯烷酮，硼氢化钠，水合肼，甲醛和柠檬酸三钠中的一种。

7.根据权利要求3所述的SERS标签微球的制备方法，其特征在于，所述的硝酸银水溶液的浓度为0.01～1 mol/L,还原剂浓度为0.05 wt %～10 wt%。

8.根据权利要求3所述的SERS标签微球的制备方法，其特征在于，所述的拉曼探针分子为苯硫酚、4-氨基苯硫酚、4-羟基苯硫酚、4-硝基苯硫酚或4-巯基苯甲酸，或其衍生物中的一种或几种。

9.根据权利要求3所述的 SERS标签微球的制备方法，其特征在于，所述的硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基三甲氧基硅烷、（3-巯基丙基）三乙氧基硅烷和（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷中的一种或几种。