CN110286112B - 一种拉曼探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种拉曼探针，具有纳米核、第一拉曼信号层和壳层；纳米核被第一拉曼信号层包被；第一拉曼信号层内分布有拉曼信号分子；壳层具有第一层和第二层；第一拉曼信号层被第一层包被；第二层包覆在第一层外，具有缝隙。本发明所涉及的拉曼探针具有拉曼信号强、信号重复性好的优点。本发明还涉及该拉曼探针的制备方法和应用。其制备方法简单，该拉曼探针可用于超灵敏、超快拉曼检测、成像技术。

Description

一种拉曼探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于纳米材料领域，涉及一种拉曼探针及其制备方法和应用。
背景技术
拉曼光谱是一种表征分子振动的指纹光谱。金属纳米颗粒在入射光的作用下产生等离激元共振现象，使得金属纳米颗粒表面吸附的分子的拉曼光谱得到极大增强，这称为表面增强拉曼散射效应(SERS)。近年来，结合了金属纳米颗粒(即SERS基底)和拉曼信号分子的新型拉曼探针受到越来越多的关注。在金属纳米颗粒上标记不同拉曼信号分子，可以得到具有不同信号的超灵敏拉曼探针，并有望实现多指标的分子检测和生物成像应用。
传统的探针是将拉曼信号分子吸附在金纳米颗粒表面，增强效果一般、拉曼信号重复性差、稳定性较差(Qian X M,Nie S M.Chem.Soc.Rev.,2008,37,912–920)。因此制备一种拉曼信号强、颗粒稳定性高、拉曼信号重复性好，特别是能够适用于不同拉曼信号分子标记的拉曼探针是一个迫切的科学和技术问题。
经对现有技术的文献检索发现，Dong-Kwon Lim等人(Lim D K,Jeon K S,Hwang JH,et al.Nature nanotechnology,2011,6(7):452-460)制备了具有1.2nm缝隙的核壳金纳米颗粒，通过将特制的DNA和拉曼信号分子包裹在缝隙结构中，可以得到具有较强拉曼信号的金纳米颗粒。
Srikanth Singamaneni和叶坚等人(Gandra N,Singamaneni S.Adv.Mater.2013,25,1022–1027；Lin L,Zapata M,Ye J,et al.Nano Lett.,2015,15(10),6419–6428；LinL,Gu H C,Ye J.Chem.Commun.,2015,51,17740-17743；Zhang Y Q,Xiao Z Y,Ye J,etal.ACS Appl.Mater.Interfaces 2017,9,3995-4005)制备了具有亚纳米缝隙的内嵌拉曼信号分子的核壳结构金纳米颗粒，内嵌的拉曼信号分子在金核和完整的金壳之间形成缝隙结构，使颗粒的拉曼信号得到增强。
然而，由于检测灵敏度和成像速度的需求，目前在近红外区拉曼探针的增强性能还需提高，以及在近红外区拉曼成像速度也还需提高。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种拉曼探针，其特征在于，具有纳米核、第一拉曼信号层和壳层；所述纳米核被所述第一拉曼信号层包被；所述第一拉曼信号层内分布有拉曼信号分子；所述壳层具有第一层和第二层；所述第一拉曼信号层被所述第一层包被；所述第二层包覆在所述第一层外，具有缝隙。
进一步地，所述缝隙为能够增强拉曼光谱信号强度的结构。
在一个具体实施方式中，所述纳米核、所述第一拉曼信号层和所述壳层组合成盛开的花朵状，花朵的相邻花瓣之间形成所述缝隙。
在另一个具体实施方式中，在所述拉曼探针的截面上，所述壳层呈齿轮状，齿轮的相邻齿之间形成所述缝隙。
进一步地，所述缝隙的数目为多个；所述缝隙的大小、形状不完全一致。
进一步地，所述缝隙在所述第一拉曼信号层中的拉曼信号分子的作用下形成。
进一步地，所述第一拉曼信号层中的拉曼信号分子包括带有硝基的硫醇化合物。
进一步地，所述第一拉曼信号层中的拉曼信号分子选自同时含有巯基和硝基的化合物。
进一步地，所述第一拉曼信号层中的拉曼信号分子选自同时含有巯基、硝基和苯环的化合物。
进一步地，所述第一拉曼信号层中的拉曼信号分子选自4-硝基苯硫醇(4-NITROBENZENETHIOL，简称4-NBT)、3-硝基苯甲基硫醇、2-氨基-5-硝基苯硫醇、邻硝基苯硫酚、2-巯基-6-硝基苯并噻唑和2-巯基-5-硝基苯并咪唑中的一种或多种；结构式如下：
Figure BDA0001601104740000021
进一步地，所述第一层为封闭结构。
进一步地，所述缝隙内分布有拉曼信号分子。
在一个具体实施方式中，所述第一拉曼信号层的拉曼信号分子与所述缝隙内的拉曼信号分子是相同的。这有利于进一步增强该拉曼探针的拉曼信号。
在另一个具体实施方式中，所述第一拉曼信号层的拉曼信号分子与所述缝隙内的拉曼信号分子是不同的。这有利于该拉曼探针形成多指标检测的拉曼信号。
进一步地，所述缝隙内的拉曼信号分子通过作用力吸附到所述壳层上。
进一步地，所述壳层为金壳层、银壳层、铜壳层或者铂壳层。
进一步地，所述缝隙内的拉曼信号分子包括可与所述壳层产生静电吸附作用或化学共价结合的分子。优选地，所述缝隙内的拉曼信号分子选自对腈基苯硫醇、3-氟苯硫醇、2-苯硫酚、3、4-二氯苯硫酚、4-硝基苯硫醇、3-硝基苯甲基硫醇、2-氨基-5-硝基苯硫醇、邻硝基苯硫酚、2-巯基-6-硝基苯并噻唑和2-巯基-5-硝基苯并咪唑中的一种或多种。
进一步地，所述纳米核为金纳米核、银纳米核、铜纳米核或铂纳米核。
进一步地，还具有外层结构；所述外层结构为介孔二氧化硅、巯基化合物或者可与所述壳层产生静电吸附作用或化学共价结合的高分子化合物；所述外层结构包被在所述第二层外。带氨基的高分子化合物，如多环芳烃(PAH)；带负电的高分子化合物，如聚乙二醇(PEG)、聚苯乙烯磺酸钠(PSS)等；巯基化合物，如巯基十一烷酸(MUA)、巯基十一烷醇等。
本发明还涉及一种如上所述的拉曼探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、将原料纳米核颗粒加入到表面活性剂的水溶液里，离心，重分散在表面活性剂的水溶液中，得到以表面活性剂为稳定剂的纳米核；
步骤二、在所述步骤一得到的以表面活性剂为稳定剂的纳米核中加入拉曼信号分子溶液，离心，重分散在表面活性剂的水溶液中，制备得到在纳米核的外表面包被有所述第一拉曼信号层的纳米颗粒，即在纳米核的外表面修饰有所述拉曼信号分子的纳米颗粒；
步骤三、将所述步骤二得到的在纳米核的外表面包被有所述第一拉曼信号层的纳米颗粒加入到含有表面活性剂的水溶液、金属离子化合物溶液、还原剂混合的生长液中，得到具有所述壳层包被在所述第一拉曼信号层外的纳米颗粒，即得到所述拉曼探针；所述金属离子化合物溶液选自氯金酸溶液、硝酸银溶液、氯化铜溶液、硫酸铜溶液和氯铂酸溶液中的一种或多种。当壳层为金壳层时，与还原剂反应的所述金属离子化合物溶液一般是氯金酸溶液；当壳层为银壳层时，与还原剂反应的所述金属离子化合物溶液一般是硝酸银溶液；当壳层为铜壳层时，与还原剂反应的所述金属离子化合物溶液一般是氯化铜溶液和/或硫酸铜溶液；当壳层为铂壳层时，与还原剂反应的所述金属离子化合物溶液一般是氯铂酸溶液。
进一步地，步骤二在步骤一得到的以表面活性剂为稳定剂的纳米核中加入拉曼信号分子溶液后，混合震荡2-20分钟后，再进行后续操作。
进一步地混合震荡时间为5-10分钟，优选为5分钟。
进一步地，在所述步骤三得到的具有所述壳层的纳米颗粒外包覆介孔二氧化硅、巯基化合物或者可与所述壳层产生静电吸附作用或化学共价结合的高分子化合物。
进一步地，还包括步骤四，向所述步骤三得到的具有所述壳层的纳米颗粒中加入拉曼信号分子，离心，重分散在表面活性剂的水溶液中，得到所述第二层的缝隙中修饰有拉曼信号分子的纳米颗粒。
进一步地，在所述步骤四得到的所述第二层的缝隙中修饰有拉曼信号分子的纳米颗粒外包覆介孔二氧化硅、巯基化合物或者可与所述壳层产生静电吸附作用或化学共价结合的高分子化合物。
进一步地，所述步骤一中的原料纳米核颗粒的制备方法包括柠檬酸钠热还原法、种子生长法、聚乙烯吡咯烷酮保护还原法或紫外光引发还原法。
进一步地，所述表面活性剂选自十六烷基氯化铵、十六烷基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或者多种。
进一步地，所述步骤三中的还原剂选自抗坏血酸、盐酸羟胺、甲醛中的一种或者多种。
本发明还涉及如上所述的拉曼探针的应用，比如，在单颗粒检测方面的应用。
在一个具体实施方式中，所述拉曼探针的第二层外包被有外层结构；所述外层结构为介孔二氧化硅、巯基化合物或者可与所述壳层产生静电吸附作用或化学共价结合的高分子化合物；包括以下步骤：
A、将所述拉曼探针的溶液滴于硅片上，干燥后将硅片固定在原子力-显微共焦拉曼联用光谱仪上进行单颗粒测试；
B、首先对有拉曼探针的硅片进行原子力显微成像，找到并确认硅片上的多个单颗粒；然后对单颗粒依次进行拉曼光谱采集，并对结果进行分析。
在另一个具体实施方式中，所述应用基于拉曼流式的单颗粒标记液相芯片；包括以下步骤：
a、基于拉曼流式的单颗粒标记液相芯片，单颗粒拉曼探针作为生物标记物，内嵌不同的拉曼信号分子实现编码，得到编码后的单颗粒拉曼探针；然后将每种所述编码后的单颗粒拉曼探针共价交联上针对特定检测物，即靶分子的捕获分子，得到针对不同检测物的编码单颗粒拉曼探针；所述捕获分子包括抗原、抗体和/或核酸探针；
b、先把多种所述针对不同检测物的编码单颗粒拉曼探针混合，再加入微量待检样本，形成悬液；在所述悬液中，所述待检样本中的靶分子与所述针对不同检测物的编码单颗粒拉曼探针表面交联的捕获分子发生特异性结合；最后使用显微共焦拉曼光谱仪识别所述针对不同检测物的编码单颗粒拉曼探针的编码及与之特异性结合的靶分子，从而识别待检样本。
又如，在细胞水平成像中的应用。
进一步地，所述拉曼探针的第二层外包被有外层结构；所述外层结构为介孔二氧化硅、巯基化合物或者可与所述壳层产生静电吸附作用或化学共价结合的高分子化合物；包括以下步骤：
1)、将细胞与所述拉曼探针的溶液共孵育，使所述拉曼探针进入细胞内部；
2)、用拉曼光谱仪对经所述步骤1)处理过的细胞进行拉曼成像，对成像结果进行分析。
进一步地，所述步骤1)中将细胞与0.001-100n mol/L的所述拉曼探针的溶液共同置于细胞培养箱中，以37℃孵育0.5-24h，使所述拉曼探针进入细胞内部。
进一步地，所述步骤2)中每个像素点的积分时间为0.7-10ms，激光功率为1％-10％，高分辨率的细胞成像可在3-20s内完成；所述高分辨率的细胞成像指细胞成像的像素点大于等于50×50像素点。
再如，在医学成像中的应用。
进一步地，包括以下步骤：
I、将所述拉曼探针均匀分散于生理盐水或pH＝7.4的PBS溶液中制成0.01-50nmol/L的拉曼探针溶液；
II、向试验动物体内局部注射经超声分散的所述步骤I制得的0.01-50n mol/L的拉曼探针溶液；
III、注射0.5-24h后，使用拉曼光谱仪对经所述步骤II处理的试验动物的感兴趣部位进行拉曼成像，并对成像结果进行分析。
进一步地，所述步骤III中每个像素点的积分时间为0.7-100ms。优选地，所述步骤III中每个像素点的积分时间为0.7-10ms。
再如，在离体组织、离体器官、已经死亡的人体或已经死亡的动物体成像中的应用。
进一步地，包括以下步骤：
I、将所述拉曼探针均匀分散于生理盐水或pH＝7.4的PBS溶液中制成0.01-50nmol/L的拉曼探针溶液；
II、将离体组织、离体器官与经超声分散的所述步骤I制得的0.01-50n mol/L的拉曼探针溶液共孵育10-60分钟，或者向已经死亡的人体或已经死亡的动物体内局部注射经超声分散的所述步骤I制得的0.01-50n mol/L的拉曼探针溶液；
III、使用拉曼光谱仪对经所述步骤II处理的离体组织、离体器官、已经死亡的人体或已经死亡的动物体的感兴趣部位进行拉曼成像，并对成像结果进行分析。
进一步地，所述步骤III中每个像素点的积分时间为0.7-100ms。优选地，所述步骤III中每个像素点的积分时间为0.7-10ms。
进一步地，所述步骤III为在孵育10-60分钟后，使用拉曼光谱仪对经所述步骤II处理的离体组织、离体器官、已经死亡的人体或已经死亡的动物体的感兴趣部位进行拉曼成像，并对成像结果进行分析。
本发明还涉及如上所述的拉曼探针在生物医学检测领域中的应用，在DNA检测、RNA检测、外泌体检测和/或抗原抗体检测中的应用，在制备肿瘤检测试剂盒、肿瘤治疗试剂盒、肿瘤检测治疗一体化试剂盒或者肿瘤药物中的应用，以及在防伪领域中的应用。
SERS的增强原理：目前学术界普遍认同的SERS机理主要有电磁场增强机理和化学增强机理两类。电磁场增强机理：表面等离子体共振引起的局域电磁场增强被认为是最主要的贡献。化学增强机理：金属与吸附分子在入射光的作用下发生电荷转移而产生电子共振。一般认为化学增强的作用较电磁场增强的作用弱。
缝隙增强拉曼探针的增强机理：首先，与传统的二聚体相比，纳米核与壳层(简称核壳)之间的亚纳米缝隙提供了大量的电磁场增强和化学增强热点。其次，核壳之间的分子连接处的电荷转移效应，会产生强的化学增强和适当的电磁增强。强的化学增强主要是由于电子由分子的高能轨道转移到金属层(包括纳米核和壳层)，再由金属层转移到分子的低能轨道。
本发明的拉曼探针的第一拉曼信号层位于核壳之间，其相对于由金、银、铜或铂构成的核壳结构(纳米核与壳层)来说，相当于核壳之间的缝隙层，当其大小属于亚纳米级别时，即等同于上一段所述的核壳之间的亚纳米缝隙。因此本发明的拉曼探针能够具有缝隙增强拉曼探针的增强机理。此外，本发明的拉曼探针壳层的第二层上的缝隙也提供了大量的电磁场增强和化学增强热点。从而使得本发明的拉曼探针，当第一拉曼信号层的拉曼信号分子与第二层上的缝隙中的拉曼信号分子是相同的时，其拉曼信号得到更进一步的增强；当第一拉曼信号层的拉曼信号分子与第二层上的缝隙中的拉曼信号分子是不同的时，具备多指标编码的功能。
本发明的拉曼探针的优点有：近红外区增强性能好，高材料稳定性、高光稳定性、非共振激发下的低光热损伤等。
非共振激发下低光热损伤：本发明的拉曼探针的紫外可见光谱吸收峰在590nm左右，在可见光区域。而使用近红外区域的785nm波长的激发光去激发该拉曼探针，避开了其吸收最大处，显著地减少了光吸收引起的热效应，可以极大的降低生物组织的热损伤，尤其适合于生物成像应用。
紫外可见光谱的最大吸收峰由金属的形貌决定。传统的选择是激光尽量靠近其最大吸收峰。本发明用了远离最大吸收峰的激光波长来激发。好处是：(1)减少了光吸收引起的热效应，使得材料的光稳定性非常优异。光稳定性指在连续成像的时候拉曼探针的稳定性。(2)降低了对生物组织的光热损伤。
对比本发明的拉曼探针与传统球形拉曼探针(见图4A和图4B)：
1、传统球形拉曼探针：其吸收峰在530nm左右，在可见光区域，使用共振波长532nm激光去激发时，拉曼增强性能较好。而使用近红外激光785nm激发，增强效果非常不好。
2、本发明的拉曼探针：吸收峰在590nm左右，使用吸收较强的532nm激光去激发时，拉曼增强性能不好。而使用吸收非常弱的近红外激光785nm激发，增强效果非常好。
本发明的拉曼探针的新特点：
a)利用内嵌的拉曼信号分子4-硝基苯硫醇既可形成核壳之间的缝隙层，此缝隙层为拉曼探针内部的完整的缝隙层，又可造成壳层第二层上的缝隙(形成具有大量的电磁场“热点”)，这样得到的纳米颗粒内部(核壳之间的缝隙层)和外部(第二层上的缝隙)都具有大量的电磁场“热点”，因此可实现高性能的拉曼增强效果。大量内部和外部电磁场“热点”的结合，实现高增强倍数，目前已实现单颗粒拉曼信号的检测(高灵敏度)。
b)不同的拉曼信号分子(比如4-硝基苯硫醇、3-硝基苯甲基硫醇和2-巯基-5-硝基苯并咪唑)吸附时间影响核壳之间的缝隙层的结构和第二层上的缝隙的形貌，同时影响最终的拉曼增强性能(电镜照片见图2)。
c)外部(第二层上的缝隙)电磁场的大量“热点”提供了吸附不同拉曼信号分子的机会，可容易实现多指标检测和成像。
本发明的有益效果包括：
1、进一步提高了拉曼增强性能。与本申请人的前期研究成果专利CN201610200580.8的核壳结构相比提高1-2个数量级；与普通的纳米金球，纳米金棒等探针相比，增强性能提高4-5个数量级。
2、可以实现单颗粒的拉曼信号检测。
3、50×50像素的细胞层面的拉曼成像时间为6s，其中这6s包括积分时间、激光移动时间和机器对数据的处理输出时间。实现了细胞层面的高分辨率(比如50×50像素)高速(比如6s)的拉曼成像。根据文献结果这是目前全球在高分辨成像下最快的速度。而现有技术中的拉曼探针由于积分时间长(目前已报道的数据最快是30s)，因此即使在激光移动时间和机器对数据的处理输出时间不变的情况下，其50×50像素的细胞层面的拉曼成像时间也远远大于6s。
4、3.2cm×2.7cm组织层面的拉曼成像时间是52s。即实现了组织层面大范围(比如3.2cm×2.7cm)的超快速(比如52s)拉曼成像。这52s包括积分时间，样品移动时间，机器对数据的处理输出时间。
5、本发明的拉曼探针稳定、生物相容性好。
6、可实现多指标的分子检测和生物细胞和组织成像。
本发明的拉曼探针具有拉曼信号强、信号重复性好、能够适用于不同拉曼信号分子标记、制备简单等优点，可用于超灵敏拉曼检测技术、多指标分子检测应用、及超快速的生物医学拉曼成像。
本发明所述的“化合物”，包括所有立体异构体、几何异构体、互变异构体和同位素。
本发明所述的“化合物”，可以是不对称的，例如，具有一个或多个立体异构体。除非另有说明，所有立体异构体都包括，如对映异构体和非对映异构体。本发明中含有不对称碳原子的化合物，可以光学活性纯的形式或外消旋形式被分离出来；光学活性纯的形式可以从外消旋混合物拆分，或通过使用手性原料或手性试剂合成。
本发明所述的“化合物”，还包括互变异构体形式；互变异构体形式来源于一个单键与相邻的双键交换并一起伴随一个质子的迁移。
本发明还包括所有同位素的原子，无论是在中间体或最后的化合物；同位素的原子包括具有相同的原子数、但不同质量数的，例如，氢的同位素包括氘和氚。
本发明中的“治疗”意味着对哺乳动物体内疾病的任何治疗，包括：(1)防止疾病，即造成临床疾病的症状不发展；(2)抑制疾病，即阻止临床症状的发展；(3)减轻疾病，即造成临床症状的消退。
附图说明
图1是本发明的拉曼探针的截面的结构示意图。
图2是本发明所实现的4-硝基苯硫醇在金纳米核上吸附不同时间(0min、5min、10min、20min、30min、60min、960min)生长的核壳结构金颗粒(即实施例1)的形貌，图中标尺为50nm。
图3是本发明所实现的在金纳米核上吸附不同时间((0min、5min、10min、20min、30min、60min、960min)形成的拉曼探针的拉曼光谱图，所用拉曼信号分子为4-硝基苯硫醇。
图4A是传统球形拉曼探针与本发明的拉曼探针的紫外可见吸收光谱的对比。
图4B是传统球形拉曼探针与本发明的拉曼探针的拉曼光谱的对比。
图5A是本发明的拉曼探针与CN201610200580.8专利的拉曼探针(具有双层核壳结构)的形貌的对比，图中的标尺均为50nm，左边图像是CN201610200580.8专利的拉曼探针，右边图像是本发明的拉曼探针。
图5B是本发明的拉曼探针与CN201610200580.8专利的拉曼探针(具有双层核壳结构)的拉曼信号强度对比。
图6是本发明实施例2所实现的3-硝基苯甲基硫醇在金纳米核上吸附10分钟时生长的核壳结构金颗粒，(A：颗粒的形貌，图中标尺为50nm；B：拉曼光谱)。
图7是本发明实施例3所实现的2-巯基-5-硝基苯并咪唑在金纳米核上吸附10分钟时生长的核壳结构金颗粒，(A：颗粒的形貌，图中标尺为50nm；B：拉曼光谱)。
图8是本发明实施例5所实现的可具有多种拉曼信号的拉曼探针的拉曼光谱，所使用的核壳结构内部(即第一拉曼信号层)的拉曼信号分子为4-硝基苯硫醇，金壳层外部(即第二层上的缝隙中)的拉曼信号分子分别为2-苯硫酚，对腈基苯硫醇，3-氟苯硫醇，3、4-二氯苯硫酚。
图9是本发明实施例9-1所实现的拉曼探针的单颗粒拉曼信号检测图(A：颗粒的原子力显微成像图，图中标尺为1μm；B：A中箭头所指的单颗粒的拉曼光谱)。
图10是本发明实施例10肺癌细胞(H1299)的超快拉曼成像结果图(A：细胞明场图，B：细胞拉曼图)，50×50像素点，每个像素点的积分时间为0.7ms，总成像时间为6s，图中标尺均为10um。
图11是本发明实施例11肺癌细胞(H1299)的多指标拉曼成像结果图，使用4种拉曼信号分子的拉曼探针(A：细胞明场图，B：4种拉曼信号分子的拉曼探针分布叠加图，C：拉曼信号分子为2-苯硫酚的拉曼探针在细胞内分布图，D：拉曼信号分子为3、4-二氯苯硫酚的拉曼探针在细胞内分布图，E：拉曼信号分子为3-氟苯硫醇的拉曼探针在细胞内分布图，F：拉曼信号分子为对腈基苯硫醇的拉曼探针在细胞内分布图)，图中标尺为10um。
图12是本发明实施例12小鼠组织层面成像-腘窝淋巴结的超快拉曼成像结果图，A：明场照片，B：明场照片与拉曼叠加，图中标尺均为1cm。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步的说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
如图1和3所示，本发明的拉曼探针具有纳米核1、第一拉曼信号层2和壳层3。纳米核1被第一拉曼信号层2包被；第一拉曼信号层2内分布有拉曼信号分子。壳层3具有第一层31和第二层32。第一拉曼信号层2被第一层31包被；第二层32包覆在第一层31外，具有缝隙4。第一层31为封闭结构。
图1和图3所示的拉曼探针看上去就如同盛开的花朵，花朵的相邻花瓣之间形成了第二层32上的缝隙4；或者如同齿轮，在截面上其壳层3呈齿轮状，齿轮的相邻齿之间形成第二层32上的缝隙4。
实施例1制备以4-硝基苯硫醇作为第一拉曼信号层中拉曼信号分子的拉曼探针
步骤一：将400uL 1nmol/L的采用种子生长法制备得到的金纳米核颗粒(粒径为25nm)，加入到1mL 0.02mol/L十六烷基氯化铵溶液里，离心分离、重分散在400uL 0.02mol/L十六烷基氯化铵溶液中，得到以十六烷基氯化铵为稳定剂的金纳米核。
步骤二：在步骤一得到的以十六烷基氯化铵为稳定剂的金纳米核中加入20uL10mmol/L 4-硝基苯硫醇的乙醇溶液，分别混合震荡(即4-硝基苯硫醇在金纳米核上吸附)0、5、10、20、30、60、960分钟后，离心分离、重分散在200uL 0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液中，重复三次，得到在金纳米核的外表面修饰有一层4-硝基苯硫醇拉曼信号分子层(即第一拉曼信号层，其中的拉曼信号分子是4-硝基苯硫醇)的金纳米颗粒。
步骤三：将步骤二得到的在金纳米核的外表面修饰有一层4-硝基苯硫醇拉曼信号分子层的金纳米颗粒加入到4mL 0.05mol/L十六烷基氯化铵溶液、200uL 4.86mmol/L氯金酸溶液、120uL 40mmol/L抗坏血酸溶液混合的生长液中，振荡搅拌，使得第一拉曼信号层外依次包被上金壳层的第一层和第二层，且第二层上具有缝隙，得到以4-硝基苯硫醇作为第一拉曼信号层中拉曼信号分子的拉曼探针，其截面大体形态如图1所示，真实形貌如图2所示，其拉曼光谱图如图3所示。图3中拉曼探针的拉曼信号强度随着混合震荡时间的延长，呈现出先增加后降低的趋势；最高的拉曼强度出现在5分钟这个时间点，之后随着混合震荡时间的延长，拉曼信号强度逐渐降低。
4-硝基苯硫醇在金纳米核上吸附0分钟，即加入4-硝基苯硫醇后立即离心分离，不给予混合震荡的时间，这影响了壳层中第二层缝隙的形成，其形貌如图2中0min所示。其拉曼信号强度显著弱于吸附时间5和10min的拉曼探针(如图3所示)。因此，可以推断：第二层的缝隙结构能够增强拉曼信号强度。
如图3所示，在5分钟时间点，得到的拉曼探针的性能最好。强度排序为：5min>10min>20min>30min≈60min≈960min>0min。
对比例1(对应实施例1)制备CN201610200580.8专利中具有双层核壳结构的拉曼探针
见专利CN201610200580.8说明书的实施例1：
步骤一：将400uL 1nmol/L的采用种子生长法制备得到的金纳米核颗粒(粒径为20nm)，加入到1mL 0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液里，离心分离、重分散在400uL 0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液中，得到以十六烷基氯化铵为稳定剂的金纳米核；
步骤二：在金纳米核中加入50uL 2mmol/L对二巯基苯的乙醇溶液，混合震荡30分钟后，离心分离、重分散在200uL 0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液中，重复三次，得到在金纳米核的外表面修饰有一层拉曼分子层的第一金纳米颗粒；
步骤三：将第一金纳米颗粒加入到4mL 0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液、200uL4.86mmol/L氯金酸溶液、200uL 40mmol/L抗坏血酸溶液混合的生长液中，振荡搅拌，得到在第一金纳米颗粒的外表面贴覆有一层金壳层的第二金纳米颗粒，即双层核壳结构金纳米颗粒。此处所说的双层核壳结构金纳米颗粒从内到外依次包括金纳米核、拉曼分子层和金壳层(金壳层的层数为一层)。
通过电镜观察对比例1的拉曼探针与实施例1的拉曼探针的形貌上的差别，主要在对比例1的拉曼探针虽然具有实施例1的拉曼探针的纳米核、第一拉曼信号层和壳层中的第一层，但是不具带有缝隙的第二层，如图5A所示。图5A中左边图像是对比例1的拉曼探针的电镜形貌图；右边图像是实施例1的拉曼探针吸附10min时的电镜形貌图(同图2中10min时的图片)。这个明显的形貌差异主要通过第一拉曼信号层上的拉曼信号分子4-硝基苯硫醇产生，并在拉曼强度上表现出巨大差异，如图5B所示。在统一的测试采集时间的条件下，实施例1的拉曼探针的拉曼信号强度非常显著的大于对比例1的拉曼探针的拉曼信号强度。除4-硝基苯硫醇外，其他一些同时含有巯基和硝基的化合物也具备生成如图2所示的拉曼探针形貌，比如：3-硝基苯甲基硫醇、2-氨基-5-硝基苯硫醇、邻硝基苯硫酚、2-巯基-6-硝基苯并噻唑和2-巯基-5-硝基苯并咪唑。
实施例2制备以3-硝基苯甲基硫醇作为第一拉曼信号层中拉曼信号分子的拉曼探针
步骤一：将400uL 1nmol/L的采用种子生长法制备得到的金纳米核颗粒(粒径为25nm)，加入到1mL 0.02mol/L十六烷基氯化铵溶液里，离心分离、重分散在400uL 0.02mol/L十六烷基氯化铵溶液中，得到以十六烷基氯化铵为稳定剂的金纳米核。
步骤二：在步骤一得到的以十六烷基氯化铵为稳定剂的金纳米核中加入20uL10mmol/L 3-硝基苯甲基硫醇的乙醇溶液，混合震荡10分钟后，离心分离、重分散在200uL0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液中，重复三次，得到在金纳米核的外表面修饰有一层3-硝基苯甲基硫醇拉曼信号分子层(即第一拉曼信号层)的金纳米颗粒。
步骤三：将步骤二得到的在金纳米核的外表面修饰有一层3-硝基苯甲基硫醇拉曼信号分子层的金纳米颗粒加入到4mL 0.05mol/L十六烷基氯化铵溶液、200uL 4.86mmol/L氯金酸溶液、120uL 40mmol/L抗坏血酸溶液混合的生长液中，振荡搅拌，使得第一拉曼信号层外依次包被上金壳层的第一层和第二层，且第二层上具有缝隙，得到以3-硝基苯甲基硫醇作为第一拉曼信号层中拉曼信号分子的拉曼探针，其截面大体形态如图1所示，真实形貌如图6A所示,其拉曼光谱图如图6B所示。
实施例3制备以2-巯基-5-硝基苯并咪唑作为第一拉曼信号层中拉曼信号分子的拉曼探针
步骤一：将400uL 1nmol/L的采用种子生长法制备得到的金纳米核颗粒(粒径为25nm)，加入到1mL 0.02mol/L十六烷基氯化铵溶液里，离心分离、重分散在400uL 0.02mol/L十六烷基氯化铵溶液中，得到以十六烷基氯化铵为稳定剂的金纳米核。
步骤二：在步骤一得到的以十六烷基氯化铵为稳定剂的金纳米核中加入20uL10mmol/L 2-巯基-5-硝基苯并咪唑的乙醇溶液，混合震荡10分钟后，离心分离、重分散在200uL 0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液中，重复三次，得到在金纳米核的外表面修饰有一层2-巯基-5-硝基苯并咪唑拉曼信号分子层(即第一拉曼信号层)的金纳米颗粒。
步骤三：将步骤二得到的在金纳米核的外表面修饰有一层2-巯基-5-硝基苯并咪唑拉曼信号分子层的金纳米颗粒加入到4mL 0.05mol/L十六烷基氯化铵溶液、200uL4.86mmol/L氯金酸溶液、120uL 40mmol/L抗坏血酸溶液混合的生长液中，振荡搅拌，使得第一拉曼信号层外依次包被上金壳层的第一层和第二层，且第二层上具有缝隙，得到以2-巯基-5-硝基苯并咪唑作为第一拉曼信号层中拉曼信号分子的拉曼探针，其截面大体形态如图1所示，真实形貌如图7A所示,其拉曼光谱图如图7B所示。
实施例4制备以4-硝基苯硫醇作为第一拉曼信号层中拉曼信号分子的拉曼探针
步骤一：将400uL 1nmol/L的采用种子生长法制备得到的金纳米核颗粒(粒径为25nm)，加入到1mL 0.02mol/L十六烷基氯化铵溶液里，离心分离、重分散在400uL 0.02mol/L十六烷基氯化铵溶液中，得到以十六烷基氯化铵为稳定剂的金纳米核。
步骤二：在步骤一得到的以十六烷基氯化铵为稳定剂的金纳米核中加入20uL10mmol/L 4-硝基苯硫醇的乙醇溶液，混合震荡10分钟后，离心分离、重分散在200uL0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液中，重复三次，得到在金纳米核的外表面修饰有一层4-硝基苯硫醇拉曼信号分子层(即第一拉曼信号层)的金纳米颗粒。
步骤三：将步骤二得到的在金纳米核的外表面修饰有一层4-硝基苯硫醇拉曼信号分子层的金纳米颗粒加入到4mL 0.05mol/L十六烷基溴化铵溶液、200uL 4.86mmol/L氯金酸溶液、120uL 40mmol/L抗坏血酸溶液混合的生长液中，振荡搅拌，使得第一拉曼信号层外依次包被上金壳层的第一层和第二层，且第二层上具有缝隙，得到以4-硝基苯硫醇作为第一拉曼信号层中拉曼信号分子的拉曼探针，其截面大体形态如图1所示，真实形貌类似于图2的60min时间点所示。
实施例5制备多指标的拉曼探针
步骤一：将2mL 0.2nmol/L的实施例1制备出的拉曼探针(粒径约为70nm)，加入到4mL 0.01mol/L十六烷基氯化铵溶液里，得到以十六烷基氯化铵为稳定剂的拉曼探针溶液，平均分成4份，每份1mL。
步骤二：分别在上述4份拉曼探针溶液中加入50uL 10mmol/L的2-苯硫酚，对腈基苯硫醇，3-氟苯硫醇，3、4-二氯苯硫酚的乙醇溶液，混合震荡60-360分钟后，离心分离，重分散在1mL 0.05mol/L十六烷基氯化铵溶液中，重复三次，使得拉曼探针第二层缝隙中分别修饰上2-苯硫酚，对腈基苯硫醇，3-氟苯硫醇，3、4-二氯苯硫酚，从而分别得到以4-硝基苯硫醇作为第一拉曼信号层中拉曼信号分子且第二层缝隙中修饰2-苯硫酚的拉曼探针，以4-硝基苯硫醇作为第一拉曼信号层中拉曼信号分子且第二层缝隙中修饰对腈基苯硫醇的拉曼探针，以4-硝基苯硫醇作为第一拉曼信号层中拉曼信号分子且第二层缝隙中修饰3-氟苯硫醇的拉曼探针，以4-硝基苯硫醇作为第一拉曼信号层中拉曼信号分子且第二层缝隙中修饰3、4-二氯苯硫酚的拉曼探针。
从图8可以看出，上述4种第二层缝隙中分别修饰不同拉曼信号分子的拉曼探针分别具有2-苯硫酚的拉曼特征峰(637cm-1,1379cm-1)，对腈基苯硫醇的拉曼特征峰(1177cm-1,2230cm-1)，3-氟苯硫醇的拉曼特征峰(876cm-1,999cm-1)，3、4-二氯苯硫酚的拉曼特征峰(568cm-1)，但都同时具有4-硝基苯硫醇的拉曼特征峰(1340cm-1)，因此为多指标的拉曼探针。
实施例6制备外层结构为介孔二氧化硅的拉曼探针
步骤一：将5mL 0.4nmol/L实施例1制备出的拉曼探针(颗粒粒径为70nm)，加入到5mL 0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液里，离心分离、重分散在5mL0.001mol/L十六烷基氯化铵溶液中，加入0.1mol/L的NaOH溶液30μl将溶液的pH值调整至10-11，得到金纳米颗粒溶液。
步骤二：将本实施例步骤一所得的金纳米颗粒溶液中分三次加入含有5％正硅酸四乙酯的甲醇溶液，每次50μl，继续搅拌反应15h，获得第二层外包覆10-15nm介孔二氧化硅层的拉曼探针。
步骤三：将步骤二得到的第二层外包覆10-15nm介孔二氧化硅层的拉曼探针离心，分散于乙醇中，加入6-8粒固体硝酸铵颗粒超声，重复洗涤3-4次后离心分散于乙醇中，以去除十六烷基氯化铵，得到第二层外包覆介孔二氧化硅的拉曼探针，即外层结构为介孔二氧化硅的拉曼探针。
本实施例制备的外层结构为介孔二氧化硅的拉曼探针的第二层上具有缝隙，虽然是以4-硝基苯硫醇作为第一拉曼信号层中拉曼信号分子，具有4-硝基苯硫醇的拉曼特征峰。但是若步骤一中的出发拉曼探针的第一拉曼信号层上是其他拉曼信号分子(比如3-硝基苯甲基硫醇、2-氨基-5-硝基苯硫醇、邻硝基苯硫酚、2-巯基-6-硝基苯并噻唑和2-巯基-5-硝基苯并咪唑等)，那么通过本实施例的制备方法获得外层结构为介孔二氧化硅的拉曼探针则具有其他拉曼信号分子的拉曼特征峰。由于制备方法类似，这里不再赘述。
实施例7制备外层结构为巯基化合物的拉曼探针
步骤一：将5mL 0.4nmol/L实施例1制备出的拉曼探针(颗粒粒径为70nm)，加入到0.5mL 0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液里，离心分离，重分散在0.5mL 0.001mol/L十六烷基氯化铵溶液中，得到金纳米颗粒溶液。
步骤二：将步骤一所得的金纳米颗粒溶液中加入0.5mL 1-丁基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐，在涡旋震荡仪上涡旋5分钟，使上层液体澄清。
步骤三：向步骤二所得的溶液中加入1mL 0.2mol/L巯基十一烷酸的1-丁基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐溶液，涡旋5分钟，使上层液体变成深红色，加入5mL水将上层的巯基十一烷酸修饰的金纳米颗粒提取出来。
步骤四：向步骤三所得的上层液体中反复加水提取巯基十一烷酸修饰的金纳米颗粒，直到溶液澄清为止，离心去除残存的1-丁基-3-甲基咪唑双三氟甲磺酰亚胺盐，得到在水中分散性良好的外层结构为巯基化合物的拉曼探针，其中巯基化合物为巯基十一烷酸。
除巯基十一烷酸外，当采用其他巯基化合物代替巯基十一烷酸时，则制备得到的外层结构为巯基化合物的拉曼探针中的巯基化合物为其他巯基化合物，比如巯基十一烷醇等。由于方法类似，故这里不再赘述。
本实施例制备的外层结构为巯基化合物的拉曼探针的第二层上具有缝隙，虽然是以4-硝基苯硫醇作为第一拉曼信号层中拉曼信号分子，具有4-硝基苯硫醇的拉曼特征峰。但是若步骤一中的出发拉曼探针的第一拉曼信号层上是其他拉曼信号分子(比如3-硝基苯甲基硫醇、2-氨基-5-硝基苯硫醇、邻硝基苯硫酚、2-巯基-6-硝基苯并噻唑和2-巯基-5-硝基苯并咪唑等)，那么通过本实施例的制备方法获得外层结构为巯基化合物的拉曼探针则具有其他拉曼信号分子的拉曼特征峰。由于制备方法类似，这里不再赘述。
实施例8制备外层结构为介孔二氧化硅的多指标的拉曼探针
步骤一：将40mL 0.2nmol/L的实施例1制备出的拉曼探针(粒径约为70nm)，加入到80mL 0.01mol/L十六烷基氯化铵溶液里，得到以十六烷基氯化铵为稳定剂的拉曼探针溶液，平均分成4份，每份20mL。
步骤二：分别在上述4份拉曼探针溶液中加入800uL 10mmol/L的2-苯硫酚，对腈基苯硫醇，3-氟苯硫醇，3、4-二氯苯硫酚的乙醇溶液，混合震荡60-360分钟后，离心分离，重分散在20mL 0.05mol/L十六烷基氯化铵溶液中，重复三次，使得拉曼探针第二层缝隙中分别修饰上2-苯硫酚，对腈基苯硫醇，3-氟苯硫醇，3、4-二氯苯硫酚，从而分别得到以4-硝基苯硫醇作为第一拉曼信号层中拉曼信号分子且第二层缝隙中修饰2-苯硫酚的拉曼探针，以4-硝基苯硫醇作为第一拉曼信号层中拉曼信号分子且第二层缝隙中修饰对腈基苯硫醇的拉曼探针，以4-硝基苯硫醇作为第一拉曼信号层中拉曼信号分子且第二层缝隙中修饰3-氟苯硫醇的拉曼探针，以4-硝基苯硫醇作为第一拉曼信号层中拉曼信号分子且第二层缝隙中修饰3、4-二氯苯硫酚的拉曼探针。
步骤三：将上述4份修饰后的拉曼探针溶液，加入到20mL 0.1mol/L十六烷基氯化铵溶液里，离心分离、重分散在5mL 0.001mol/L十六烷基氯化铵溶液中，加入0.1mol/L的NaOH溶液30μl将溶液的pH值调整至10-11，得到金纳米颗粒溶液。
步骤四：将本实施例步骤三所得的金纳米颗粒溶液中分三次加入含有5％正硅酸四乙酯的甲醇溶液，每次50μl，继续搅拌反应15h，获得第二层缝隙中分别修饰不同拉曼信号分子且第二层外包覆10-15nm介孔二氧化硅层的拉曼探针。
步骤五：将步骤四得到的第二层外包覆10-15nm介孔二氧化硅层的拉曼探针离心，分散于乙醇中，加入6-8粒固体硝酸铵颗粒超声，重复洗涤3-4次后离心分散于乙醇中，以去除十六烷基氯化铵，得到第二层缝隙中分别修饰不同拉曼信号分子且外包覆介孔二氧化硅的拉曼探针，即外层结构为介孔二氧化硅的多指标拉曼探针。
本实施例制备的外层结构为介孔二氧化硅的多指标拉曼探针的第二层上具有缝隙，且缝隙内分别修饰了不同的拉曼信号分子。虽然是以4-硝基苯硫醇作为第一拉曼信号层中拉曼信号分子，具有4-硝基苯硫醇的拉曼特征峰。但是若步骤一中的出发拉曼探针的第一拉曼信号层上是其他拉曼信号分子(比如3-硝基苯甲基硫醇、2-氨基-5-硝基苯硫醇、邻硝基苯硫酚、2-巯基-6-硝基苯并噻唑和2-巯基-5-硝基苯并咪唑等)，那么通过本实施例的制备方法获得外层结构为介孔二氧化硅的拉曼探针则具有其他拉曼信号分子的拉曼特征峰。由于制备方法类似，这里不再赘述。
实施例9本发明的拉曼探针在单颗粒检测方面的应用
实施例9-1
步骤一：将10uL 0.1pmol/L的根据实施例1制备出的拉曼探针滴于硅片上，干燥后将硅片固定在原子力-显微共焦拉曼联用光谱仪上；
步骤二：对有拉曼探针的硅片进行原子力显微成像，找到并确认硅片上的多个单颗粒；然后对单颗粒依次进行拉曼光谱采集，积分时间为10s，激光功率为1％，并对结果进行分析。结果如图9所示，单个拉曼探针(即单颗粒)的拉曼强度依然可以明显检测出。图9B为图9A箭头所指的单个拉曼探针的拉曼光谱，表现出明显的4-硝基苯硫醇的拉曼特征峰，且峰形尖锐、信噪比好、识别度高。
对比例2(对应实施例9-1)
步骤一：将10uL 0.1pmol/L专利CN201610200580.8中公开的介孔二氧化硅包被的内嵌对二巯基苯的拉曼探针(双层核壳结构)滴于硅片上，干燥后将硅片固定在原子力-显微共焦拉曼联用光谱仪上；
步骤二：对有拉曼探针的硅片进行原子力显微成像，找到并确认硅片上的多个单颗粒；然后对单颗粒依次进行拉曼光谱采集，积分时间为30s，激光功率为100％，并对结果进行分析。拉曼光谱强度弱，信噪比差，识别度低。
实施例9-2应用基于拉曼流式的单颗粒标记液相芯片。
步骤一、基于拉曼流式的单颗粒标记液相芯片，单颗粒拉曼探针作为生物标记物，内嵌不同的拉曼信号分子实现编码，得到编码后的单颗粒拉曼探针；然后将每种所述编码后的单颗粒拉曼探针共价交联上针对特定检测物，即靶分子的捕获分子，得到针对不同检测物的编码单颗粒拉曼探针；所述捕获分子包括抗原、抗体和/或核酸探针；
步骤二、先把多种所述针对不同检测物的编码单颗粒拉曼探针混合，再加入微量待检样本，形成悬液；在所述悬液中，所述待检样本中的靶分子与所述针对不同检测物的编码单颗粒拉曼探针表面交联的捕获分子发生特异性结合；最后使用显微共焦拉曼光谱仪识别所述针对不同检测物的编码单颗粒拉曼探针的编码及与之特异性结合的靶分子，从而识别待检样本。
实施例10细胞层面超快速的拉曼成像
步骤一：将实施例6制备的外层结构为介孔二氧化硅的拉曼探针均匀分散于pH＝7.4的PBS溶液中制成0.05n mol/L的外层结构为介孔二氧化硅的拉曼探针溶液。
步骤二：选用肺癌细胞(H1299)作为研究对象，将无菌的0.05n mol/L的外层结构为介孔二氧化硅的拉曼探针溶液与处于对数生长期的H1299细胞置于细胞培养箱中，以37℃孵育6h，使该拉曼探针进入细胞内部。
步骤三：用拉曼光谱仪对经步骤二处理的肺癌细胞(H1299)进行超快速的拉曼成像，通过拉曼图谱对成像结果进行分析。实验结果如图10所示，共2500个像素点，每个像素点的积分时间为0.7ms，完整细胞成像所用的时间为6s，使用拉曼探针内的拉曼信号分子4-硝基苯硫醇的拉曼特征峰(1340cm-1)重构出图像(如图10B所示)，可观察到该拉曼探针聚集在H1299细胞表面和细胞内部，并可实现超快速的成像。该结果与本申请人的前期研究申请的专利CN201610200580.8所涉及的表面增强拉曼探针(不具备第二层上的缝隙结构)相比，每个像素点的积分时间提高了1个数量级，完整细胞成像所用的时间也提高了1个数量级。CN201610200580.8中双层核壳结构(CN201610200580.8说明书的实施例5)的每个像素点的积分时间为10ms，完整细胞成像所用的时间为53s；三层核壳结构(CN201610200580.8说明书的实施例6)的每个像素点的积分时间为1ms，完整细胞成像所用的时间为40s。
实施例11多种信号的多指标检测
步骤一：将制备的介孔二氧化硅包被的第一拉曼信号层为4-NBT，第二层缝隙内分别为对腈基苯硫醇、3-氟苯硫醇、2-苯硫酚和3、4-二氯苯硫酚这4种拉曼信号分子的拉曼探针(即实施例8制备的外层结构为介孔二氧化硅的多指标的拉曼探针)均匀分散于pH＝7.4的PBS溶液中制成0.05n mol/L的混合拉曼探针溶液，其中每种拉曼探针浓度为0.0125nmol/L。
步骤二：选用肺癌细胞(H1299)作为研究对象，将无菌的0.05n mol/L的混合拉曼探针溶液与处于对数生长期的H1299细胞置于细胞培养箱中，以37℃孵育6h，使该拉曼探针进入细胞内部。
步骤三：用拉曼光谱仪对肺癌细胞(H1299)进行多指标拉曼成像，通过拉曼图谱对成像结果进行分析。实验结果如图11所示，共2500个像素点，每个像素点的积分时间为10ms，完整细胞成像所用的时间为40s。图11A和图11B分别为细胞明场图和4种拉曼信号分子的拉曼探针分布叠加图。分别使用拉曼探针内的拉曼信号分子2-苯硫酚的拉曼特征峰(637cm-1)，3、4-二氯苯硫酚的拉曼特征峰(568cm-1)，3-氟苯硫醇的拉曼特征峰(999cm-1)，对腈基苯硫醇的拉曼特征峰(2230cm-1)重构出图像(分别见图11C、D、E、F)，可观察到4种拉曼信号分子的拉曼探针在H1299细胞表面和细胞内部的分布。实现多种信号(上述4种拉曼信号分子)的多指标(第一拉曼信号层中的拉曼信号分子与第二层缝隙中的拉曼信号分子)检测。
实施例12本发明的拉曼探针在生物医学成像、离体组织、离体器官、已经死亡的人体或已经死亡的动物体成像中的应用
步骤一：将介孔二氧化硅包被的第一拉曼信号层中内嵌4-硝基苯硫醇的拉曼探针(即实施例5制备的外层结构为介孔二氧化硅的拉曼探针)均匀分散于生理盐水中制成1nmol/L的溶液。
步骤二：向正常小鼠左下肢爪垫部位皮下注射25ul经超声分散的1n mol/L的步骤一配制的拉曼探针溶液，并按摩注射部位5分钟。
步骤三：注射24小时后，将小鼠麻醉并暴露出左侧腘窝淋巴结，使用拉曼光谱仪对小鼠的左下肢进行超快的拉曼成像并对成像结果进行分析。实验结果如图10所示，使用拉曼探针内的拉曼信号分子4-硝基苯硫醇的拉曼特征峰(1340cm-1)重构出图像，可实现对腘窝淋巴结位置的快速、精确定位，大范围(3×2.7cm)成像仅需52s。
本发明的拉曼探针用于生物医学成像极大地提高了成像的速度，较传统的拉曼成像更有潜力应用于临床。当然也可应用于离体组织、离体器官、已经死亡的人体或已经死亡的动物体成像中。对于已经死亡的人体或已经死亡的动物体由于不能进行血液循环和淋巴循环，因此只能对注射部位进行拉曼成像。
对比例3(对应实施例12)
步骤一：将专利CN201610200580.8中公开的介孔二氧化硅包被的内嵌对二巯基苯的拉曼探针(双层核壳结构)均匀分散于生理盐水中制成1n mol/L的溶液。
步骤二：向正常小鼠左下肢爪垫部位皮下注射25ul经超声分散的1n mol/L的步骤一配制的拉曼探针溶液，并按摩注射部位5分钟。
步骤三：注射24小时后，将小鼠麻醉并暴露出左侧腘窝淋巴结，使用拉曼光谱仪对小鼠的左下肢进行超快的拉曼成像并对成像结果进行分析。使用拉曼探针内的拉曼信号分子对二巯基苯的拉曼特征峰(1555cm-1)重构出图像，可实现对腘窝淋巴结位置的快速、精确定位，大范围(2.6×2.4cm)成像需22分钟。
本发明的拉曼探针，通过改变核壳金纳米颗粒外部(即第二层上)的拉曼信号分子的种类和/或第一拉曼信号层中的拉曼信号分子的种类，可获得具有不同信号特征的拉曼探针；通过对该拉曼探针进行一定的生物修饰，可用于实现靶向不同肿瘤细胞的多指标成像。
本发明的拉曼探针在生物医学检测领域方面的应用还包括DNA检测、RNA检测、外泌体检测和抗原抗体检测等。比如在DNA和RNA检测中，将一段特定的DNA/RNA序列标记上该拉曼探针，然后利用碱基互补配对原则去探测待测样品中是否带有与之匹配的DNA/RNA序列。
在外泌体检测中，将外泌体表面特定的标记物标记在该拉曼探针上，利用标记物与外泌体特异性结合的原理去检测待测样品中是否含有相应的外泌体。
在抗原抗体检测中，将特定抗原或抗体标记上该拉曼探针后，利用抗原抗体特异性结合的原理去检测待测样品中是否含有相应的抗体或抗原。
本发明的拉曼探针在肿瘤检测和治疗领域也具有重要的应用价值。在肿瘤检测方面，该拉曼探针可以通过肿瘤部位血管的高滞留通透效应被动富集到肿瘤区域，并对肿瘤区域进行成像检测。因此本发明的拉曼探针能够用于制备肿瘤检测试剂盒、肿瘤治疗试剂盒、肿瘤检测治疗一体化试剂盒或者肿瘤药物。
进一步地，在肿瘤治疗方面，本发明的拉曼探针可以作为药物的载体，进行肿瘤化疗药物的载带，然后通过肿瘤部位血管的高滞留通透效应被动富集到肿瘤区域，对肿瘤区域进行定点的热化疗。
本发明的拉曼探针也可用于防伪领域。比如，使用该拉曼探针制作成不同的商标字体或图案，然后通过拉曼检测来进行真伪辨别。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (41)

1.一种拉曼探针，其特征在于，具有纳米核、第一拉曼信号层和壳层；所述纳米核被所述第一拉曼信号层包被；所述第一拉曼信号层内分布有拉曼信号分子，所述第一拉曼信号层中的拉曼信号分子为同时含有巯基和硝基的化合物；所述壳层具有第一层和第二层；所述第一拉曼信号层被所述第一层包被，所述第一层为封闭结构；所述第二层包覆在所述第一层外，具有缝隙，所述缝隙在所述第一拉曼信号层中的拉曼信号分子的作用下形成。
2.如权利要求1所述的拉曼探针，其特征在于，所述缝隙为能够增强拉曼光谱信号强度的结构。
3.如权利要求1所述的拉曼探针，其特征在于，在所述拉曼探针的截面上，所述纳米核、所述第一拉曼信号层和所述壳层组合成盛开的花朵状，花朵的相邻花瓣之间形成所述缝隙。
4.如权利要求1所述的拉曼探针，其特征在于，在所述拉曼探针的截面上，所述壳层呈齿轮状，齿轮的相邻齿之间形成所述缝隙。
5.如权利要求2-4任一项所述的拉曼探针，其特征在于，所述缝隙的数目为多个；所述缝隙的大小、形状不完全一致。
6.如权利要求1所述的拉曼探针，其特征在于，所述第一拉曼信号层中的拉曼信号分子选自同时含有巯基、硝基和苯环的化合物。
7.如权利要求1所述的拉曼探针，其特征在于，所述第一拉曼信号层中的拉曼信号分子选自4-硝基苯硫醇、3-硝基苯甲基硫醇、2-氨基-5-硝基苯硫醇、邻硝基苯硫酚、2-巯基-6-硝基苯并噻唑和2-巯基-5-硝基苯并咪唑中的一种或多种；结构式如下：
Figure FDA0003328126860000011
Figure FDA0003328126860000021
8.如权利要求1所述的拉曼探针，其特征在于，所述缝隙内分布有拉曼信号分子。
9.如权利要求8所述的拉曼探针，其特征在于，所述第一拉曼信号层的拉曼信号分子与所述缝隙内的拉曼信号分子是相同的。
10.如权利要求8所述的拉曼探针，其特征在于，所述第一拉曼信号层的拉曼信号分子与所述缝隙内的拉曼信号分子是不同的。
11.如权利要求8所述的拉曼探针，其特征在于，所述缝隙内的拉曼信号分子通过作用力吸附到所述壳层上。
12.如权利要求8所述的拉曼探针，其特征在于，所述壳层为金壳层、银壳层、铜壳层或者铂壳层。
13.如权利要求12所述的拉曼探针，其特征在于，所述缝隙内的拉曼信号分子包括可与所述壳层产生静电吸附作用或化学共价结合的分子。
14.如权利要求1所述的拉曼探针，其特征在于，所述纳米核为金纳米核、银纳米核、铜纳米核或铂纳米核。
15.如权利要求1所述的拉曼探针，其特征在于，还具有外层结构；所述外层结构为介孔二氧化硅、巯基化合物或者可与所述壳层产生静电吸附作用或化学共价结合的高分子化合物；所述外层结构包被在所述第二层外。
16.一种如权利要求1所述的拉曼探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一、将原料纳米核颗粒加入到表面活性剂的水溶液里，离心，重分散在表面活性剂的水溶液中，得到以表面活性剂为稳定剂的纳米核；
步骤二、在所述步骤一得到的以表面活性剂为稳定剂的纳米核中加入拉曼信号分子溶液，离心，重分散在表面活性剂的水溶液中，制备得到在纳米核的外表面包被有所述第一拉曼信号层的纳米颗粒，即在纳米核的外表面修饰有所述拉曼信号分子的纳米颗粒；
步骤三、将所述步骤二得到的在纳米核的外表面包被有所述第一拉曼信号层的纳米颗粒加入到含有表面活性剂的水溶液、金属离子化合物溶液、还原剂混合的生长液中，得到具有所述壳层包被在所述第一拉曼信号层外的纳米颗粒，即得到所述拉曼探针；所述金属离子化合物溶液选自氯金酸溶液、硝酸银溶液、氯化铜溶液、硫酸铜溶液和氯铂酸溶液中的一种或多种。
17.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二在所述步骤一得到的以表面活性剂为稳定剂的纳米核中加入拉曼信号分子溶液后，混合震荡2-20分钟后，再进行后续操作。
18.如权利要求17所述的制备方法，其特征在于，混合震荡时间为5-10分钟。
19.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤三得到的具有所述壳层的纳米颗粒外包覆介孔二氧化硅、巯基化合物或者可与所述壳层产生静电吸附作用或化学共价结合的高分子化合物。
20.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，还包括步骤四、向所述步骤三得到的具有所述壳层的纳米颗粒中加入拉曼信号分子，离心，重分散在表面活性剂的水溶液中，得到所述第二层的缝隙中修饰有拉曼信号分子的纳米颗粒。
21.如权利要求20所述的制备方法，其特征在于，在所述步骤四得到的所述第二层的缝隙中修饰有拉曼信号分子的纳米颗粒外包覆介孔二氧化硅、巯基化合物或者可与所述壳层产生静电吸附作用或化学共价结合的高分子化合物。
22.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中的原料纳米核颗粒的制备方法包括柠檬酸钠热还原法、种子生长法、聚乙烯吡咯烷酮保护还原法或紫外光引发还原法。
23.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述表面活性剂选自十六烷基氯化铵、十六烷基溴化铵、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或者多种。
24.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的还原剂选自抗坏血酸、盐酸羟胺、甲醛中的一种或者多种。
25.如权利要求1所述的拉曼探针在单颗粒检测方面的应用。
26.如权利要求25所述的拉曼探针在单颗粒检测方面的应用，其特征在于，所述拉曼探针的第二层外包被有外层结构；所述外层结构为介孔二氧化硅、巯基化合物或者可与所述壳层产生静电吸附作用或化学共价结合的高分子化合物；包括以下步骤：
A、将包被有外层结构的拉曼探针的溶液滴于硅片上，干燥后将硅片固定在原子力-显微共焦拉曼联用光谱仪上进行单颗粒测试；
B、首先对有包被有外层结构的拉曼探针的硅片进行原子力显微成像，找到并确认硅片上的多个单颗粒；然后对单颗粒依次进行拉曼光谱采集，并对结果进行分析。
27.如权利要求25所述的拉曼探针在单颗粒检测方面的应用，其特征在于，所述应用基于拉曼流式的单颗粒标记液相芯片；包括以下步骤：
a、基于拉曼流式的单颗粒标记液相芯片，单颗粒拉曼探针作为生物标记物，内嵌不同的拉曼信号分子实现编码，得到编码后的单颗粒拉曼探针；然后将每种所述编码后的单颗粒拉曼探针共价交联上针对特定检测物，即靶分子的捕获分子，得到针对不同检测物的编码单颗粒拉曼探针；所述捕获分子包括抗原、抗体和/或核酸探针；
b、先把多种所述针对不同检测物的编码单颗粒拉曼探针混合，再加入微量待检样本，形成悬液；在所述悬液中，所述待检样本中的靶分子与所述针对不同检测物的编码单颗粒拉曼探针表面交联的捕获分子发生特异性结合；最后使用显微共焦拉曼光谱仪识别所述针对不同检测物的编码单颗粒拉曼探针的编码及与之特异性结合的靶分子，从而识别待检样本。
28.如权利要求1所述的拉曼探针在细胞水平成像中的应用。
29.如权利要求28所述的拉曼探针在细胞水平成像中的应用，其特征在于，所述拉曼探针的第二层外包被有外层结构；所述外层结构为介孔二氧化硅、巯基化合物或者可与所述壳层产生静电吸附作用或化学共价结合的高分子化合物；包括以下步骤：
1)、将细胞与包被有外层结构的拉曼探针的溶液共孵育，使包被有外层结构的拉曼探针进入细胞内部；
2)、用拉曼光谱仪对经所述步骤1)处理过的细胞进行拉曼成像，对成像结果进行分析。
30.如权利要求29所述的拉曼探针在细胞水平成像中的应用，其特征在于，所述步骤1)中将细胞与0.001-100n mol/L的包被有外层结构的拉曼探针的溶液共同置于细胞培养箱中，以37℃孵育0.5-24h，使包被有外层结构的拉曼探针进入细胞内部。
31.如权利要求29所述的拉曼探针在细胞水平成像中的应用，其特征在于，所述步骤2)中每个像素点的积分时间为0.7-10ms，激光功率为1％-10％，高分辨率的细胞成像可在3-20s内完成；所述高分辨率的细胞成像指细胞成像的像素点大于等于50×50像素点。
32.如权利要求1所述的拉曼探针在医学成像中的应用。
33.如权利要求32所述的拉曼探针在医学成像中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
I、将所述拉曼探针均匀分散于生理盐水或pH＝7.4的PBS溶液中制成0.01-50n mol/L的拉曼探针溶液；
II、向试验动物体内局部注射经超声分散的所述步骤I制得的0.01-50nmol/L的拉曼探针溶液；
III、注射0.5-24h后，使用拉曼光谱仪对经所述步骤II处理的试验动物的感兴趣部位进行拉曼成像，并对成像结果进行分析。
34.如权利要求33所述的拉曼探针在医学成像中的应用，其特征在于，所述步骤III中每个像素点的积分时间为0.7-100ms。
35.如权利要求1所述的拉曼探针在离体组织、离体器官、已经死亡的人体或已经死亡的动物体成像中的应用。
36.如权利要求35所述的拉曼探针在离体组织、离体器官、已经死亡的人体或已经死亡的动物体成像中的应用，其特征在于，包括以下步骤：
I、将所述拉曼探针均匀分散于生理盐水或pH＝7.4的PBS溶液中制成0.01-50n mol/L的拉曼探针溶液；
II、将离体组织或离体器官与经超声分散的所述步骤I制得的0.01-50n mol/L的拉曼探针溶液共孵育10-60分钟，或者向已经死亡的人体或已经死亡的动物体内局部注射经超声分散的所述步骤I制得的0.01-50n mol/L的拉曼探针溶液；
III、使用拉曼光谱仪对经所述步骤II处理的离体组织、离体器官、已经死亡的人体或已经死亡的动物体的感兴趣部位进行拉曼成像，并对成像结果进行分析。
37.如权利要求36所述的拉曼探针在离体组织、离体器官、已经死亡的人体或已经死亡的动物体成像中的应用，其特征在于，所述步骤III中每个像素点的积分时间为0.7-100ms。
38.如权利要求1所述的拉曼探针在生物医学检测领域中的应用。
39.如权利要求1所述的拉曼探针在DNA检测、RNA检测、外泌体检测和/或抗原抗体检测中的应用。
40.如权利要求1所述的拉曼探针在制备肿瘤检测试剂盒、肿瘤治疗试剂盒、肿瘤检测治疗一体化试剂盒或者肿瘤药物中的应用。
41.如权利要求1所述的拉曼探针在防伪领域中的应用。
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