CN105929150A - 一种基于金银核壳结构拉曼增强效应的金黄色葡萄球菌肠毒素b免疫检测方法 - Google Patents

一种基于金银核壳结构拉曼增强效应的金黄色葡萄球菌肠毒素b免疫检测方法 Download PDF

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Abstract

一种基于金银核壳结构拉曼增强效应的金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫检测方法，属于免疫分析技术领域。包括：具有强拉曼增强效应的金银核壳结构的合成，检测肠毒素B的免疫分析方法的建立。以对硝基苯硫酚（4‑NTP）修饰15 nm金纳米粒子，用柠檬酸在金纳米粒子表面还原硝酸银形成9nm的银壳，从而得到内嵌拉曼信标4‑NTP的金银核壳结构。该结构本身具有很强的拉曼增强效应，且拉曼信号稳定均一，不易丢失。在金银核壳纳米粒子上标记肠毒素B单抗，微孔板上预先包被金黄色葡萄球菌肠毒素B的捕获抗体。样品中的肠毒素B首先被微孔板上的抗体捕获，再与金银核壳纳米粒子标记的抗体结合，板上的拉曼信号通过拉曼光谱仪扫描得到。本方法肠毒素B的检测限0.002ng/mL，显著低于传统的酶联免疫方法。

Description

一种基于金银核壳结构拉曼增强效应的金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于金银核壳结构拉曼增强效应的金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫检测方法，属于免疫分析技术领域。
背景技术
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的食源性致病菌，金黄色葡萄球菌肠毒素是金黄色葡萄球菌在食品中的主要危害因子。金黄色葡萄球菌肠毒素是一类分子量在28-30kDa，耐酸、耐热、耐蛋白酶的超抗原，人的半数致死剂量（LD50）仅为20ng/kg。肠毒素B是一种广泛被研究的金黄色葡萄球菌肠毒素，是食品的主要肠毒素之一，目前已被美国疾病预防控制中心列为B级生物战剂。
肉制品尤其是熟食肉制品是金黄色葡萄球菌的天然培养基，极易受到金黄色葡萄球菌及其肠毒素的污染。经过热处理可以杀灭金黄色葡萄球菌，然而一旦菌体产生外分泌的肠毒素，那么存在于食物中的肠毒素非常稳定，100℃、30min不被破坏，摄入人体后可以抵抗肠胃液中蛋白酶的分解，并引起人体的呕吐、腹泻等症状。肠毒素的传统免疫学检测方法包括间接血凝技术和免疫扩散方法，在检测小分子量的肠毒素时, 反应时间较长，16-24 h才能出现阳性结果，且检测限无法满足安全限量要求。目前，一些基于双抗体夹心酶联吸附免疫分析（ELISA）原理的检测试剂盒已经在部分地区使用，检测的灵敏度可达ng/L的水平，然而由于食品基质如肉制品、乳制品干扰严重，常常需要对检测样本进行稀释，因此传统免疫方法的检测灵敏度有待于提升。
因此，本发明利用贵金属基质的拉曼增强效应，合成了本身具有强拉曼信号的单分散的金银核壳纳米粒子。由于信标分子内嵌在金银壳层之间，保证了强拉曼效应的同时避免了信标分子的脱落。将金银核壳纳米粒子标记金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体后成功应用于金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫检测。该免疫方法可以检测到0.002ng/mL的金黄色葡萄球菌肠毒素B，显著低于传统的酶联免疫方法（0.3-1ng/mL）。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种基于金银核壳结构拉曼增强效应的金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）免疫检测方法，用于食品中SEB的高灵敏、高通量免疫检测。
按照本发明提供的技术方案，为实现上述目的，本发明合成一种具有高拉曼强度的金银核壳纳米粒子，建立了一种食品中SEB的微孔板拉曼免疫检测方法，该方法包括对合成方法的优化。
其中，高拉曼强度的金银核壳纳米粒子是通过先修饰拉曼信标分子对硝基苯硫酚4-NTP到Au表面，然后通过调节AgNO3的量来控制银壳厚度在9nm，此时金银核壳纳米粒子拉曼增强效应和光学活性达到平衡，拉曼信号最强。
同时，选择4-NTP作为信标分子，使得金银核壳纳米粒子拉曼特征峰在1333cm-1，很好的避免了拉曼信号与微孔板在1080cm-1处的强峰形成干扰。
将合成的金银核壳纳米粒子标记抗体，应用于基于微孔板的免疫检测。金银核壳纳米粒子具有很强的拉曼信号，可以显著提高免疫检测的灵敏度。
本发明方法的检测分析原理是：酶标板上包被了捕获抗体金黄色葡萄球菌肠毒素抗体K3，可以有效捕获SEB；洗板3次，洗去未结合的抗体，加入封闭液220μL封闭板孔上多余结合位点；洗板3次，加入样品及对照，37℃孵育1h；洗板3次，加入金银核壳纳米粒子标记的金黄色葡萄球菌肠毒素抗体1F6，37℃孵育1h；洗板4次，拍干后扫描拉曼信号。
首先以对硝基苯硫酚4-NTP修饰15 nm金纳米粒子，用柠檬酸在金纳米粒子表面还原硝酸银形成9nm的银壳，从而得到内嵌拉曼信标4-NTP的金银核壳结构，其具有强拉曼信号的、区别于微孔板本底信号的金银核壳纳米粒子；金银核壳纳米粒子标记肠毒素B单克隆抗体，并应用于金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫检测；具体步骤为：
（1）金银核壳纳米粒子的合成：采用柠檬酸还原法合成15nm金纳米粒子Au NP，通过金巯键与信标分子4-NTP进行偶联：取5mL合成的金纳米粒子8000rpm离心15 min，用1mL 10mM 磷酸盐缓冲液PB重悬；加入25μL 200μM的对硝基苯硫酚4-NTP，室温避光反应6-8h；然后8000rpm离心15 min，加入600μL超纯水和300μL质量体积比为10% 的聚乙烯吡咯烷酮；再加入120μL 2mM AgNO3和100μL 0.1M的柠檬酸三钠，迅速震荡后室温静置10 min；8500rpm离心15 min后，弃去上清，用1mL 10mM PB重悬合成金银核壳纳米粒子；
对金银核壳纳米粒子的银壳厚度、拉曼信号通过投射电镜和拉曼光谱仪进行表征；
（2）金银核壳纳米粒子标记肠毒素B单克隆抗体：
1mL步骤（1）制备的金银核壳纳米粒子中加入终浓度为10μg/mL的金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体1F6，加入8μL 0.2 M Na2CO3调节pH到7.5，室温震荡反应2h；向体系中加入50μL 20mg/mL的BSA，室温震荡反应2h；8500rpm离心15 min后完成金银核壳纳米粒子的标记肠毒素B单克隆抗体；
（3）金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫检测：
a、将终浓度为5μg/mL、0.01M碳酸盐缓冲液为溶剂的金黄色葡萄球菌肠毒素包被抗体K3加入到微孔板中，加入量为100μL/孔，37℃孵育2h；
b、用10mM PBS、0.1% Tween 20的洗液洗步骤a所得微孔板3次，每次间隔3 min；加入封闭液，即质量浓度为0.2%明胶，溶剂为0.01M碳酸盐缓冲液，37℃孵育2h；
c、用10mM PBS、0.1% Tween 20的洗液洗步骤b所得微孔板3次，每次间隔3 min；按100μL/孔加入金黄色葡萄球菌肠毒素B样品到微孔板中，37℃反应1h；
d、用10mM PBS、0.1% Tween 20的洗液洗步骤c所得微孔板3次，每次间隔3 min；加入步骤（2）制备的金银核壳纳米粒子标记的金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体1F6，加入量为100μL/孔，37℃反应1h；
e、用10mM PBS、0.1%Tween 20的洗液洗步骤d所得微孔板4次，每次间隔3 min；最后一次洗板后用吸水纸排干微孔板，然后用拉曼光谱仪扫描样品信号，得到检测结果。
如果样品中SEB浓度≥0.002ng/mL，那么祥品中SEB被捕获抗体K3捕获并与金银核壳纳米粒子标记的1F6抗体结合。此时，酶标微孔板上有拉曼信号检出，并被判定为阳性；如果样品中SEB浓度＜0.002ng/mL那么捕获的肠毒素B数量太小不足以引起足够的拉曼信号，被判定为阴性。
步骤（1）中所述聚乙烯吡咯烷酮、AgNO3和柠檬酸三钠，步骤（2）中所述Na2CO3和BSA的溶剂均为超纯水。
步骤（3）c中所述金黄色葡萄球菌肠毒素B样品的标准品浓度为100 pg/mL、50 pg/mL、20 pg/mL、10 pg/mL、5 pg/mL、2 pg/mL及0 pg/mL。
本发明的有益效果：本发明提供的高拉曼强度的金银核壳纳米粒子合成方法以及金黄色葡萄球菌肠毒素SEB高灵敏、高通量免疫检测方法。合成的金银核壳纳米粒子具有很强的拉曼信号可以区分微孔板自身拉曼信号，并对传统免疫检测进行增敏。该发明建立的免疫方法可以检测到0.002ng/mL的金黄色葡萄球菌肠毒素B，显著低于传统的酶联免疫方法（0.3-1ng/mL）。
生物材料保藏保藏：金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体1F6，保藏编号为CGMCC No.10866，公开于申请号：201510669537.1；金黄色葡萄球菌肠毒素包被抗体K3，保藏编号CGMCC No.10863，公开于申请号：201510669537.1。
附图说明
图1合成的银壳厚度为9nm的金银核壳纳米粒子TEM表征图。
图2 15nm的金纳米粒子以及银壳厚度为9nm的金银核壳纳米粒子紫外图谱。
图3 15nm的金纳米粒子以及银壳厚度为9nm的金银核壳纳米粒子拉曼图谱。
图4 基于金银核壳纳米粒子拉曼增强的金黄色葡萄球菌肠毒素SEB免疫检测的标准曲线。
具体实施方式
（1）具有强拉曼增强效应的金银核壳纳米粒子的合成，具体步骤为：
采用柠檬酸还原法合成15nm金纳米粒子Au NP：先用洗洁精清洗300 mL锥形瓶和磁力搅拌子B500，再用超纯水冲洗6遍；倒入100 mL 0.01% (m/V，超纯水）的氯金酸溶液HAuCl4，用5层保鲜膜封口，并在加热板上加热搅拌至煮沸状态，保持10 min。取200 μL 10% (m/V，超纯水）的柠檬酸三钠溶液并快速加入沸腾的溶液中，再用5层保鲜膜封口并再煮沸15 min，直至溶液颜色变为酒红色并保持不变；停止加热，保持搅拌直至冷却至室温，并加超纯水至溶液体积为100 mL。
通过金巯键将15nm金纳米粒子Au NP与信标分子4-NTP进行偶联：取5mL合成的金纳米粒子8000rpm离心15 min，用1mL 10mM 磷酸盐缓冲液PB重悬；加入25μL 200μM的对硝基苯硫酚4-NTP，室温避光反应6-8h；然后8000rpm离心15 min，加入600 μL超纯水和300 μL的10% (m/V，超纯水）的聚乙烯吡咯烷酮；再加入120 μL 2mM AgNO3（超纯水）和100 μL 0.1M的柠檬酸三钠（超纯水），迅速震荡后室温静置10 min；8500rpm离心15 min后，弃去上清，用1mL 10mM PB重悬合成金银核壳纳米粒子；
对金银核壳纳米粒子的银壳厚度、拉曼信号通过投射电镜和拉曼光谱仪进行表征；合成的银壳厚度为9nm的金银核壳纳米粒子TEM表征图如图1所示，合成的银壳厚度为9nm的金银核壳纳米粒子紫外图谱如图2所示，15nm的金纳米粒子以及银壳厚度为9nm的金银核壳纳米粒子拉曼图谱如图3所示。
（2）金银核壳纳米粒子标记肠毒素B单克隆抗体：
1mL步骤（1）制备的金银核壳纳米粒子中加入终浓度为10μg/mL的金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体1F6，加入8μL 0.2 M Na2CO3调节pH到7.5，室温震荡反应2h；向体系中加入50μL 20mg/mL的BSA，室温震荡反应2h；8500rpm离心15 min后完成金银核壳纳米粒子的标记肠毒素B单克隆抗体；
（3）金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫检测：
a、将终浓度为5μg/mL、0.01M碳酸盐缓冲液为溶剂的金黄色葡萄球菌肠毒素包被抗体K3加入到微孔板中，加入量为100μL/孔，37℃孵育2h；
b、用10mM PBS、0.1% Tween 20的洗液洗步骤a所得微孔板3次，每次间隔3 min；加入封闭液，即质量浓度为0.2%明胶，溶剂为0.01M碳酸盐缓冲液，37℃孵育2h；
c、用10mM PBS、0.1% Tween 20的洗液洗步骤b所得微孔板3次，每次间隔3 min；按100μL/孔加入金黄色葡萄球菌肠毒素B样品到微孔板中，37℃反应1h；所述金黄色葡萄球菌肠毒素B样品的标准品浓度为100 pg/mL、50 pg/mL、20 pg/mL、10 pg/mL、5 pg/mL、2 pg/mL及0 pg/mL。
d、用10mM PBS、0.1% Tween 20的洗液洗步骤c所得微孔板3次，每次间隔3 min；加入步骤（2）制备的金银核壳纳米粒子标记的金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体1F6，加入量为100μL/孔，37℃反应1h；
e、用10mM PBS、0.1%Tween 20的洗液洗步骤d所得微孔板4次，每次间隔3 min；最后一次洗板后用吸水纸排干微孔板，然后用拉曼光谱仪扫描样品信号，得到检测结果。
基于金银核壳纳米粒子拉曼增强的金黄色葡萄球菌肠毒素SEB免疫检测的标准曲线如图4所示。
检测结果如下：若酶标微孔板上有拉曼信号检出，并被判定为阳性，SEB浓度≥0.002ng/mL；若酶标微孔板上没有拉曼信号检出，判定为阴性，则样品中SEB浓度＜0.002ng/mL。
步骤（1）中所述聚乙烯吡咯烷酮、AgNO3和柠檬酸三钠，步骤（2）中所述Na2CO3和BSA的溶剂均为超纯水。

Claims (4)

1.一种基于金银核壳结构拉曼增强效应的金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫检测方法，其特征在于：首先以对硝基苯硫酚4-NTP修饰15 nm金纳米粒子，用柠檬酸在金纳米粒子表面还原硝酸银形成9nm的银壳，从而得到内嵌拉曼信标4-NTP的金银核壳结构，其具有强拉曼信号的、区别于微孔板本底信号的金银核壳纳米粒子；金银核壳纳米粒子标记肠毒素B单克隆抗体，并应用于金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫检测；具体步骤为：
（1）金银核壳纳米粒子的合成：采用柠檬酸还原法合成15nm金纳米粒子Au NP，通过金巯键与信标分子4-NTP进行偶联：取5mL合成的金纳米粒子8000rpm离心15min，用1mL 10mM 磷酸盐缓冲液PB重悬；加入25μL 200μM的对硝基苯硫酚4-NTP，室温避光反应6-8h；然后8000rpm离心15 min，加入600μL超纯水和300μL质量体积比为10% 的聚乙烯吡咯烷酮；再加入120μL 2mM AgNO3和100μL 0.1M的柠檬酸三钠，迅速震荡后室温静置10 min；8500rpm离心15 min后，弃去上清，用1mL 10mM PB重悬合成金银核壳纳米粒子；
对金银核壳纳米粒子的银壳厚度、拉曼信号通过投射电镜和拉曼光谱仪进行表征；
（2）金银核壳纳米粒子标记肠毒素B单克隆抗体：
1mL步骤（1）制备的金银核壳纳米粒子中加入终浓度为10μg/mL的金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体1F6，加入8μL 0.2 M Na2CO3调节pH到7.5，室温震荡反应2h；向体系中加入50μL 20mg/mL的BSA，室温震荡反应2h；8500rpm离心15min后完成金银核壳纳米粒子的标记肠毒素B单克隆抗体；
（3）金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫检测：
a、将终浓度为5μg/mL、0.01M碳酸盐缓冲液为溶剂的金黄色葡萄球菌肠毒素包被抗体K3加入到微孔板中，加入量为100μL/孔，37℃孵育2h；
b、用10mM PBS、0.1% Tween 20的洗液洗步骤a所得微孔板3次，每次间隔3min；加入封闭液，即质量浓度为0.2%明胶，溶剂为0.01M碳酸盐缓冲液，37℃孵育2h；
c、用10mM PBS、0.1% Tween 20的洗液洗步骤b所得微孔板3次，每次间隔3min；按100μL/孔加入金黄色葡萄球菌肠毒素B样品到微孔板中，37℃反应1h；
d、用10mM PBS、0.1% Tween 20的洗液洗步骤c所得微孔板3次，每次间隔3min；加入步骤（2）制备的金银核壳纳米粒子标记的金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体1F6，加入量为100μL/孔，37℃反应1h；
e、用10mM PBS、0.1%Tween 20的洗液洗步骤d所得微孔板4次，每次间隔3min；最后一次洗板后用吸水纸排干微孔板，然后用拉曼光谱仪扫描样品信号，得到检测结果。
2.根据权利要求1所述基于金银核壳结构拉曼增强效应的金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述聚乙烯吡咯烷酮、AgNO3和柠檬酸三钠，步骤（2）中所述Na2CO3和BSA的溶剂均为超纯水。
3.根据权利要求1所述基于金银核壳结构拉曼增强效应的金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫检测方法，其特征在于：步骤（3）c中所述金黄色葡萄球菌肠毒素B样品的标准品浓度为100 pg/mL、50 pg/mL、20 pg/mL、10 pg/mL、5 pg/mL、2 pg/mL及0 pg/mL。
4.根据权利要求1所述基于金银核壳结构拉曼增强效应的金黄色葡萄球菌肠毒素B的免疫检测方法，其特征在于步骤（3）e的检测结果如下：若酶标微孔板上有拉曼信号检出，并被判定为阳性，SEB浓度≥0.002ng/mL；若酶标微孔板上没有拉曼信号检出，判定为阴性，则样品中SEB浓度＜0.002ng/mL。
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