CN115201489A - 一种大规模合成、干燥金属复合纳米粒子的方法及其crp抗体偶联物制备与应用 - Google Patents

一种大规模合成、干燥金属复合纳米粒子的方法及其crp抗体偶联物制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种大规模合成、干燥金属复合纳米粒子的方法，并进一步制备其CRP抗体偶联物，及将该偶联物应用于CRP检测试纸条的制备及检测方法。采用自氧化还原组装法，可一锅合成体积大于1L的GPIO NPs。通过静电吸附作用在GPIO NPs表面包裹一层PAA，可对纳米粒子进行冷冻干燥及再分散，解决粒子难以干燥储存的难题。该方法能够简单、快速合成大批量金属复合纳米粒子，并解决纳米粒子难以干燥储存的难题，以便于纳米粒子的储存和运输，为实际生产应用提供新技术。此外，利用dAb‑GPIO NPs作为检测探针构建CRP免疫层析试纸条，为CRP水平监测提供一种简单、快速、低成本、高效的检测方法，检测范围可达到超敏CRP检测的需求。

Description

一种大规模合成、干燥金属复合纳米粒子的方法及其CRP抗体 偶联物制备与应用
技术领域
本发明属于材料技术领域，具体涉及一种大规模合成、干燥金属复合纳米粒子的方法及其CRP抗体偶联物制备与应用。
背景技术
贵金属(如，金、钯、铂)和氧化铁纳米粒子因具有独特的光学和光热性质及较高的催化活性，常被应用于化学、医学、环境、食品等领域中。研究表明，多种金属复合的纳米粒子具有比单金属纳米粒子更优异的光学性质和更高的催化活性。然而，由于复合纳米粒子合成过程的复杂性，使其难以满足大规模生产的需求；此外，通常纳米粒子经干燥后难以重新分散，因此纳米粒子合成后即分散于溶液中进行储存，这在一定程度上增加了其运输难度和成本。因此，寻求一种大规模合成、干燥金属复合纳米粒子的方法，将便于纳米粒子的储存和运输，并有利于纳米粒子的实际生产应用。
免疫层析法是一种基于抗原-抗体特异性结合的纸基免疫层析技术，具有操作简单、检测快、成本低、便于携带的优势，适用于现场即时检测。胶体金是最常用标记探针，具有合成快速、使用简单的优势，但受限于本身性质，导致其检测灵敏度相对较低。研究表明，贵金属复合纳米粒子探针具有比标准胶体金更高的检测灵敏度。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种大规模合成、干燥金属复合纳米粒子的方法及其CRP抗体偶联物制备与应用，本发明提供的方法能够简单、快速合成大批量金属复合纳米粒子，并解决纳米粒子难以干燥储存的难题，以便于纳米粒子的储存和运输，为实际生产应用提供新技术。此外，利用dAb-GPIO NPs作为检测探针构建CRP免疫层析试纸条，为CRP水平监测提供一种简单、快速、低成本、高效的检测方法，检测范围可达到超敏CRP检测的需求。
本发明提供了一种大规模合成、干燥金属复合纳米粒子的方法，包括以下步骤：
A)将Na2PdCl4溶液、HAuCl4溶液和去离子水混合后加入氨水溶液混合搅拌，得到反应液；
B)向所述反应液中加入FeCl2溶液混合搅拌，通过自氧化还原组装法合成金、钯、氧化铁复合纳米粒子(GPIO NPs)溶液；
C)将所述金、钯、氧化铁复合纳米粒子(GPIO NPs)溶液与PAA溶液混合，进行反应，得到反应产物；
将得到的反应产物离心后干燥，得到干燥的GPIO-PAA NPs。
优选的，步骤A)中，所述HAuCl4溶液的浓度为0.01～0.1mol/L；
所述Na2PdCl4溶液的浓度为0.01～0.1mol/L；
所述氨水溶液的质量浓度为0.01％～0.5％；
所述加入氨水溶液混合搅拌的时间为1～10min。
优选的，步骤B)中，所述FeCl2溶液的浓度为0.05～1mol/L；
所述加入FeCl2溶液混合搅拌的时间为10～60min。
优选的，步骤C)中，以Fe计，所述金、钯、氧化铁复合纳米粒子(GPIO NPs)溶液的浓度为1～100ppm；
所述PAA溶液的质量浓度为1％～20％；
所述反应的时间为1～5h；
所述干燥的方法为冷冻干燥。
本发明还提供了一种上述方法制备得到的干燥的GPIO-PAA NPs。
本发明还提供了一种dAb-GPIO NPs偶联物，由dAb与上述GPIO-PAA NPs制备得到。
本发明还提供了一种上述dAb-GPIO NPs偶联物的制备方法，包括以下步骤：
将干燥的GPIO-PAA NPs分散于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐，搅拌反应，得到反应液；
向所述反应液中加入CRP单克隆抗体dAb进行反应后，再加入BSA封闭，得到dAb-GPIO NPs偶联物。
本发明还提供了一种上述dAb-GPIO NPs偶联物在CRP检测中的应用。
本发明还提供了一种用于CRP抗原检测的免疫层析试纸条，包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，其中所述检测线包被有用于捕获CRP的CRP单克隆抗体(cAb)，所述质控线包被有羊抗鼠IgG，所述结合垫包括上述dAb-GPIO NPs偶联物。
本发明还提供了一种采用上述用于CRP抗原检测的免疫层析试纸条检测CRP抗原的方法，包括以下步骤：
将待测样品滴加于试纸条表面后，如果待测样品中含有CRP抗原，在检测线处产生有颜色变化的线条，线条颜色深度与抗原浓度呈正相关，并可通过扫描灰度获取比色信号进行定量分析。
与现有技术相比，本发明提供了一种大规模合成、干燥金属复合纳米粒子的方法，包括以下步骤：A)将Na2PdCl4溶液、HAuCl4溶液和去离子水混合后加入氨水溶液混合搅拌，得到反应液；B)向所述反应液中加入FeCl2溶液混合搅拌，通过自氧化还原组装法合成金、钯、氧化铁复合纳米粒子(GPIO NPs)溶液；C)将所述金、钯、氧化铁复合纳米粒子(GPIONPs)溶液与PAA溶液混合，进行反应，得到反应产物；将得到的反应产物离心后干燥，得到干燥的GPIO-PAA NPs。本发明提供一种大规模合成、干燥金属复合纳米粒子的方法，并进一步制备其CRP抗体偶联物，及将该偶联物应用于CRP检测试纸条的制备及检测方法。采用自氧化还原组装法，可一锅合成体积大于1L的GPIO NPs。通过静电吸附作用在GPIO NPs表面包裹一层PAA，可对纳米粒子进行冷冻干燥及再分散，解决粒子难以干燥储存的难题。该方法能够简单、快速合成大批量金属复合纳米粒子，并解决纳米粒子难以干燥储存的难题，以便于纳米粒子的储存和运输，为实际生产应用提供新技术。此外，利用dAb-GPIO NPs作为检测探针构建CRP免疫层析试纸条，为CRP水平监测提供一种简单、快速、低成本、高效的检测方法，检测范围可达到超敏CRP检测的需求。
结果表明，PBS中标准曲线范围为0.62～50μg/mL；血浆中标准曲线范围为0.46～20.4μg/mL，全血中标准曲线范围为0.62～20μg/mL。
附图说明
图1是本发明合成GPIO NPs及GPIO-PAA NPs的方法过程示意图；
图2是本发明合成GPIO NPs的光学图片和GPIO NPs的TEM图；
图3是本发明制备的干燥的GPIO-PAA NPs及其分散于水溶液中的光学图像；
图4是本发明合成的GPIO-PAA NPs干燥前及干燥后分散于水溶液中的TEM图；
图5是本发明检测CRP的方法过程示意图；
图6是本发明方法所获得的CRP检测免疫层析试纸条随PBS中CRP浓度变化而变化的明场照片；
图7是本发明方法所获得的CRP检测免疫层析试纸条随PBS中CRP浓度变化而变化的扫描灰度信号图；
图8是本发明方法获取灰度信号得到的PBS中CRP检测的标准曲线图；
图9是本发明方法所获得的CRP检测免疫层析试纸条随血浆中CRP浓度变化而变化的明场照片；
图10是本发明方法所获得的CRP检测免疫层析试纸条随血浆中CRP浓度变化而变化的扫描灰度信号图；
图11本发明方法获取灰度信号得到的血浆中CRP检测的标准曲线图；
图12是本发明方法所获得的CRP检测免疫层析试纸条随全血中CRP浓度变化而变化的明场照片；
图13是本发明方法所获得的CRP检测免疫层析试纸条随全血中CRP浓度变化而变化的扫描灰度信号图；
图14本发明方法获取灰度信号得到的全血中CRP检测的标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种大规模合成、干燥金属复合纳米粒子的方法，包括以下步骤：
A)将Na2PdCl4溶液、HAuCl4溶液和去离子水混合后加入氨水溶液混合搅拌，得到反应液；
B)向所述反应液中加入FeCl2溶液混合搅拌，通过自氧化还原组装法合成金、钯、氧化铁复合纳米粒子(GPIO NPs)溶液；
C)将所述金、钯、氧化铁复合纳米粒子(GPIO NPs)溶液与PAA溶液混合，进行反应，得到反应产物；
将得到的反应产物离心后干燥，得到干燥的GPIO-PAA NPs。
具体的，本发明首先将Na2PdCl4溶液、HAuCl4溶液和去离子水混合，得到混合溶液。
其中，所述HAuCl4溶液的浓度为0.01～0.1mol/L，优选为0.01、0.03、0.05、0.07、0.09、0.1，或0.01～0.1mol/L之间的任意值。
所述Na2PdCl4溶液的浓度为0.01～0.1mol/L，优选为0.01、0.03、0.05、0.07、0.09、0.1，或0.01～0.1mol/L之间的任意值；
所述Na2PdCl4溶液、HAuCl4溶液的总体积和去离子水的体积比为2:1～1:5。
其中，所述去离子水的用量为0.1～10L。因此，本发明可以一锅合成体积大于1L的金、钯、氧化铁复合纳米粒子。
在搅拌条件下，向所述混合溶液中迅速加入氨水溶液混合搅拌，得到反应液；所述氨水溶液的质量浓度为0.01％～0.5％，优选为0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％，或0.01％～0.5％之间的任意值。所述加入氨水溶液混合搅拌的时间为1～10min，优选为1、3、5、7、9、10，或1～10min之间的任意值。
然后，向反应液中快速加入FeCl2溶液，搅拌反应，利用自氧化还原组装法合成GPIO NPs，离心，水洗，分散于水中。其中，所述FeCl2溶液的浓度为0.05～1mol/L，优选为0.05、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0，或0.05～1mol/L之间的任意值；所述加入FeCl2溶液混合搅拌的时间为10～60min，优选为10、20、30、40、50、60，或10～60min之间的任意值。
在本发明中的一些具体实施方式中，所述的GPIO NPs的合成具体步骤优选为：
分别将5mL 0.024mol/L的Na2PdCl4、HAuCl4溶液和1L去离子水加于三颈烧瓶中，混合均匀后，快速搅拌下，迅速加入50mL 0.075％的氨水溶液，搅拌2min，快速加入30mL0.1mol/L FeCl2溶液，搅拌反应20min，8500rpm离心10min，水洗3次，分散于去离子水中，得到GPIO NPs溶液。
得到GPIO NPs溶液后，将所述金、钯、氧化铁复合纳米粒子(GPIO NPs)溶液与PAA溶液混合，进行反应，得到反应产物。
以Fe计，所述金、钯、氧化铁复合纳米粒子(GPIO NPs)溶液的浓度为1～100ppm，优选为1、5、10、30、50、70、90、100，或1～100ppm之间的任意值；
所述PAA溶液的质量浓度为1％～20％，优选为1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％、17％、20％，或1％～20％；
所述反应的时间为1～5h，优选为1、2、3、4、5，或1～5h之间的任意值；
将得到的反应产物离心后干燥，得到干燥的GPIO-PAA NPs。其中，离心后得到沉淀物的体积量为反应产物总体积的8％～15％；
所述干燥的方法优选为冷冻干燥。
在本发明的一些具体实施方式中，GPIO-PAA NPs的合成与干燥方法，具体步骤优选为：
取1mL GPIO NPs溶液与100μL 5％PAA溶液混合，搅拌反应2h，离心后弃去部分上清，得到约100μL GPIO-PAA NPs溶液，置于冷冻干燥机中干燥，得到干燥的GPIO-PAA NPs。
本发明还提供了一种上述方法制备得到的干燥的GPIO-PAA NPs。
本发明还提供了一种dAb-GPIO NPs偶联物，由dAb与上述GPIO-PAA NPs制备得到。
本发明还提供了一种上述dAb-GPIO NPs偶联物的制备方法，包括以下步骤：
将干燥的GPIO-PAA NPs分散于缓冲溶液中，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐，搅拌反应，得到反应液；
向所述反应液中加入CRP单克隆抗体dAb进行反应后，再加入BSA封闭，得到dAb-GPIO NPs偶联物。
具体的，本发明首先将干燥的GPIO-PAA NPs分散于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，然后加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶液和羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐溶液，搅拌反应，得到反应液。
其中，所述缓冲溶液选自2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液，浓度为1～100mmol/L，优选为1mmol/L、10mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、或1～100mmol/L之间的任意值；
1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶液的浓度为10～500mmol/L，优选为10mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、500mmol/L、或10～500mmol/L之间的任意值；
羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐溶液的浓度为10～500mmol/L，优选为10mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、500mmol/L、或10～500mmol/L之间的任意值。
其中，所述干燥的GPIO-PAA NPs、缓冲溶液、1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐溶液和羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐溶液的质量体积比为21(g，以铁计):106(mL):104(mL):104(mL)。所述搅拌反应的时间为10～60min，优选为10min、30min、60min、或10～60min之间的任意值。
接着，向所述反应液中加入CRP单克隆抗体dAb进行反应后，再加入BSA封闭，得到dAb-GPIO NPs偶联物。
其中，所述CRP单克隆抗体dAb与反应液的质量体积比为1g:102～104mL，优选为1g：102mL、1g：103mL、1g：104mL，或1g:102～104mL之间的任意值。
所述BSA的添加量与CRP单克隆抗体dAb的质量比例为1～100:1，优选为1:1、10:1、50:1、100:1，或1～100:1之间的任意值。
得到dAb-GPIO NPs偶联物后，将dAb-GPIO NPs偶联物分散于缓冲溶液中，得到dAb-GPIO NPs偶联物溶液。其中，所述缓冲溶液选自Tris-HCl溶液，所述的Tris-HCl溶液pH＝8.0，含0.5％吐温20，2％BSA，20％蔗糖和5％海藻糖。
在本发明的一些具体实施方式中，dAb-GPIO NPs偶联物的合成具体步骤为：
干燥的GPIO-PAA NPs分散于1mL 10mmol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，加入10μL 100mmol/L的1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10μL 100mmol/L的羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐，反应30min后，加入10μg的CRP单克隆抗体dAb，继续反应3h后，加入10μL 10mg/mL的BSA封闭30min，离心得到dAb修饰的GPIO NPs偶联物；将其分散于0.02mol/mLTris-HCl溶液中，得到dAb-GPIO NPs偶联物溶液
本发明还提供了一种上述dAb-GPIO NPs偶联物在CRP检测中的应用。
本发明还提供了一种用于CRP抗原检测的免疫层析试纸条，包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，其中所述检测线包被有用于捕获CRP的CRP单克隆抗体(cAb)，所述质控线包被有羊抗鼠IgG，所述结合垫包括上述dAb-GPIO NPs偶联物。
其中，所述样品垫预先浸泡于0.02mol/mL pH＝8.0Tris-HCl溶液中(含0.5％PVP，0.1％吐温20)，于37℃真空烘箱中烘干，组装制备初级试纸条。
所述CRP单克隆抗体cAb和羊抗鼠IgG的浓度均为0.5～2mg/mL，使用三维划膜仪将其喷涂于所述纤维素膜上，划线量为1μg/mL，于37℃真空烘箱中烘干。
所述dAb-GPIO NPs偶联物溶液加于初级试纸条后，置于37℃真空烘箱干燥1～4h。所述dAb-GPIO NPs偶联物溶液的用量为2～6μL，优选为2、3、4、5、6，或2～6μL之间的任意值。
本发明还提供了一种上述用于CRP抗原检测的免疫层析试纸条检测CRP抗原的方法，包括以下步骤：
将待测样品滴加于试纸条表面后，如果待测样品中含有CRP抗原，在检测线处产生有颜色变化的线条，线条颜色深度与抗原浓度呈正相关，并可通过扫描灰度获取比色信号进行定量分析。
将含有CRP的样品加于CRP检测试纸条上，滴加反应缓冲液，反应缓冲液的组成为0.01mol mL-1的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4，含1％Triton X-100)，作用10～20min后，采集灰度信号，制作标准曲线获取待测样品中CRP的含量。
本发明检测CRP抗原的检测原理为：
将CRP样品加于样品垫上，随后滴加反应缓冲液，在毛细力的作用下样品随缓冲液向吸水垫方向迁移；在结合垫处，样品中CRP抗原特异性结合dAb-GPIO NPs偶联物上的抗体；随之到达检测线处，结合dAb-GPIO NPs偶联物的CRP抗原通过与捕获抗体cAb特异性结合被捕获，未与CRP抗原结合的dAb-GPIO NPs偶联物到达质控线，与羊抗鼠IgG结合。由于GPIO NPs的光学特性，在捕获的GPIO NPs的检测线和质控线处形成两条肉眼可见的线，通过扫描获取该线上灰度值信号强度；分析获取的灰度信号，可实现对CRP抗原的检测。
本发明提供一种大规模合成、干燥金属复合纳米粒子的方法，及其C-反应蛋白(C-reactive protein，简称CRP)抗体偶联物制备与应用。本发明采用自氧化还原组装法，一锅合成体积大于1L的金、钯、氧化铁复合纳米粒子(composite nanoparticles with gold,palladium and iron oxide，简称GPIO NPs)。通过静电吸附作用在GPIO NPs表面包裹一层聚丙烯酸钠(Sodium polyacrylate，简称PAA)，可对纳米粒子进行冷冻干燥及再分散，解决粒子难以干燥储存的难题。利用PAA包裹的GPIO NPs标记用于检测的CRP单克隆抗体(CRPmonoclonal antibody for detection，简称dAb)，获得dAb与GPIO NPs(dAb-GPIO NPs)偶联物。以dAb-GPIO NPs为免疫层析试纸条标记物应用于缓冲溶液、血浆以及全血中CRP检测。当滴加含有CRP抗原的待测样品和反应缓冲溶液后，由于抗原和抗体的特异性结合作用，在检测线处产生肉眼可见的线条，线条颜色深度与抗原浓度呈正相关，并可通过扫描灰度获取比色信号进行定量分析。该方法能够简单、快速合成大批量金属复合纳米粒子，并解决纳米粒子难以干燥储存的难题，以便于纳米粒子的储存和运输，为实际生产应用提供新技术。此外，利用dAb-GPIO NPs作为检测探针构建CRP免疫层析试纸条，为CRP水平监测提供一种简单、快速、低成本、高效的检测方法，检测范围可达到超敏CRP检测的需求。PBS中标准曲线范围为0.62～50μg/mL；血浆中标准曲线范围为0.46～20.4μg/mL；全血中标准曲线范围为0.62～20μg/mL。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的大规模合成、干燥金属复合纳米粒子的方法及其CRP抗体偶联物制备与应用进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
采用自氧化还原法，一锅合成GPIO NPs，如示意图图1所示，首先将5mL0.024mol/L的Na2PdCl4、5mL 0.024mol/L的HAuCl4溶液和1L去离子水加于三颈烧瓶中，室温下搅拌，混合均匀，迅速加入50mL 0.075％的氨水溶液，搅拌2min，快速加入30mL 0.1mol/L的FeCl2溶液，溶液由无色变为黄褐色，持续搅拌反应20min，如图2a所示，图2a为合成GPIO NPs时的光学图片；反应完全后，8500rpm离心10min，水洗3次，分散于去离子水中，得到GPIO NPs溶液。
按照以上实验步骤，得到的结果如图2b所示。
图2b是本发明方法所获得GPIO NPs的TEM图像，其平均粒径为52.7nm。
实施例2
采用静电吸附方法合成PAA包覆的GPIO NPs，如图1所示，首先取1mL GPIO NPs溶液(含量为21.45ppm，以Fe计)与100μL 5％PAA溶液混合，搅拌反应2h，8000rpm离心后弃去部分上清，得到约100μL GPIO-PAA NPs溶液，置于冷冻干燥机中干燥，得到干燥的GPIO-PAANPs。
按照以上实验步骤，得到的结果如图3和图4所示。
图3是本发明制备的干燥的GPIO-PAA NPs(图3a)及其分散于水溶液中(图3b)的光学图像；图4是本发明合成的GPIO-PAA NPs干燥前(图4a)及干燥后分散于水溶液中(图4b)的TEM图；由于粒子表面有稳定的PAA层保护，干燥后的GPIO-PAA NPs可重新分散于水溶液中，可实现干燥储存纳米粒子的目的。
实施例3
取上述干燥的GPIO-PAA NPs分散于1mL 10mmol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，加入10μL 100mmol/L的1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10μL 100mmol/L的羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐，搅拌反应30min后，加入10μg的CRP单克隆抗体dAb，继续反应3h后，加入10μL 10mg/mL的BSA封闭30min，离心得到dAb-GPIO NPs偶联物；将其分散于25μL0.02mol/mL Tris-HCl(pH＝8.0，含0.5％吐温20，2％BSA，20％蔗糖和5％海藻糖)溶液中，得到dAb-GPIO NPs偶联物溶液。
使用三维划膜仪将CRP单克隆抗体cAb和羊抗鼠IgG喷涂于纤维素膜上，划线量为1μg/mL，浓度为1mg/mL，于37℃真空烘箱中烘干。样品垫预先浸泡于0.02mol/mL pH＝8.0Tris-HCl溶液中(含0.5％PVP，0.1％吐温20)，于37℃真空烘箱中烘干。将处理好的样品垫、结合垫、吸水垫和硝酸纤维素膜组装，利用ZQ2002自动斩切机剪裁成3mm宽的试纸条，得到初级试纸条。
将4μL合成的dAb-GPIO NPs偶联物溶液加于上述所述的初级试纸条的结合垫上，置于37℃真空烘箱1～4h，烘干，得到用于CRP检测的免疫层析试纸条。
将2μL含有CRP的样品加于CRP检测试纸条上，随后滴加80μL反应缓冲液，作用10～20min后，得到完成检测的试纸条。反应缓冲液的组成为0.01mol mL-1的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4，含1％Triton X-100)，CRP浓度分别为0μg/mL，0.31μg/mL，0.62μg/mL，1.25μg/mL，5.0μg/mL，10.0μg/mL，20.0μg/mL，50.0μg/mL。将完成检测的试纸条置于微阵列扫描仪中，扫描采集灰度信号。
具体过程参照图5，图5为本发明所述CRP检测方法过程的示意图。将2μL含有CRP的样品和80μL反应缓冲液，依次滴加于CRP检测试纸条的样品垫上，在毛细力作用，样品随溶液向吸水垫方向迁移；在结合垫处，样品中CRP抗原特异性结合GPIO NPs偶联物上抗体dAb；随之到达检测线处，结合GPIO NPs偶联物的CRP抗原通过与捕获抗体cAb特异性结合被捕获，未与CRP抗原结合的GPIO NPs偶联物到达质控线，与羊抗鼠IgG结合。由于GPIO NPs的光学特性，在捕获的GPIO NPs的检测线和质控线处形成两条肉眼可见的线，将反应后的试纸条放入微阵列扫描仪中，通过扫描获取灰度信号值，分析获取的灰度信号，可实现对CRP抗原的检测。
按照以上实验步骤，得到的结果如图6和图8所示。
图6为本发明方法所获得的随CRP浓度变化而变化的CRP检测试纸条的明场照片，表示随着CRP浓度不同，在CRP检测试纸条上T/C线处产生肉眼可见的变化。
图7是本发明方法所获得的随CRP浓度变化而变化的CRP检测试纸条的扫描灰度信号图，图8是本发明方法获取灰度信号得到的CRP检测标准曲线图；分别表示在CRP检测试纸条上T/C线随着CRP浓度变化而变化的灰度信号图像以及相应的数据提取图，其中横坐标为CRP浓度的对数值，纵坐标为T/C(T线灰度值/C线灰度值)。CRP浓度分别为0.31μg/mL，0.62μg/mL，1.25μg/mL，5.0μg/mL，10.0μg/mL，20.0μg/mL，50.0μg/mL，利用这一方法所获得的CRP的检测线性范围为：0.62～50μg/mL。
实施例4
取上述干燥的GPIO-PAA NPs分散于1mL 10mmol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，加入10μL 100mmol/L的1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10μL 100mmol/L的羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐，搅拌反应30min后，加入10μg的CRP单克隆抗体dAb，继续反应3h后，加入10μL 10mg/mL的BSA封闭30min，离心得到dAb-GPIO NPs偶联物；将其分散于25μL0.02mol/mL Tris-HCl(pH＝8.0，含0.5％吐温20，2％BSA，20％蔗糖和5％海藻糖)溶液中，得到dAb-GPIO NPs偶联物溶液。
使用三维划膜仪将CRP单克隆抗体cAb和羊抗鼠IgG喷涂于纤维素膜上，划线量为1μg/mL，浓度为1mg/mL，于37℃真空烘箱中烘干。样品垫预先浸泡于0.02mol/mL pH＝8.0Tris-HCl溶液中(含0.5％PVP，0.1％吐温20)，于37℃真空烘箱中烘干。将处理好的样品垫、结合垫、吸水垫和硝酸纤维素膜组装，利用ZQ2002自动斩切机剪裁成3mm宽的试纸条，得到初级试纸条。
将4μL合成的dAb-GPIO NPs偶联物溶液加于上述所述的初级试纸条的结合垫上，置于37℃真空烘箱1～4h，烘干，得到用于CRP检测的免疫层析试纸条。
将2μL含有CRP的血浆样品加于CRP检测试纸条上，随后滴加80μL反应缓冲液，作用10～20min后，得到完成检测的试纸条。反应缓冲液的组成为0.01mol mL-1的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4，含1％Triton X-100)，CRP浓度分别为0.46μg/mL，0.73μg/mL，1.04μg/mL，2.91μg/mL，5.41μg/mL，10.41μg/mL，20.41μg/mL。将完成检测的试纸条置于微阵列扫描仪中，扫描采集灰度信号。
具体过程参照图5，图5为本发明所述CRP检测方法过程的示意图。将2μL含有CRP的血浆样品和80μL反应缓冲液，依次滴加于CRP检测试纸条的样品垫上，在毛细力作用，样品随溶液向吸水垫方向迁移；在结合垫处，样品中CRP抗原特异性结合GPIO NPs偶联物上抗体dAb；随之到达检测线处，结合GPIO NPs偶联物的CRP抗原通过与捕获抗体cAb特异性结合被捕获，未与CRP抗原结合的GPIO NPs偶联物到达质控线，与羊抗鼠IgG结合。由于GPIO NPs的光学特性，在捕获的GPIO NPs的检测线和质控线处形成两条肉眼可见的线，将反应后的试纸条放入微阵列扫描仪中，通过扫描获取灰度信号值，分析获取的灰度信号，可实现对CRP抗原的检测。
按照以上实验步骤，得到的结果如图9～图11所示。
图9为本发明方法所获得的随血浆样品中CRP浓度变化而变化的CRP检测试纸条的明场照片，表示随着血浆样品中CRP浓度不同，在CRP检测试纸条上T/C线处产生肉眼可见的变化。
图10是本发明方法所获得的随血浆样品中CRP浓度变化而变化的CRP检测试纸条的扫描灰度信号图，图11是本发明方法获取灰度信号得到的血浆中CRP检测标准曲线图；分别表示在CRP检测试纸条上T/C线随着CRP浓度变化而变化的灰度信号图像以及相应的数据提取图，其中横坐标为CRP浓度的对数值，纵坐标为T/C(T线灰度值/C线灰度值)。CRP浓度分别为0.46μg/mL，0.73μg/mL，1.04μg/mL，2.91μg/mL，5.41μg/mL，10.41μg/mL，20.41μg/mL，利用这一方法所获得的CRP的检测线性范围为：0.46～20.4μg/mL。
实施例5
取上述干燥的GPIO-PAA NPs分散于1mL 10mmol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，加入10μL 100mmol/L的1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10μL 100mmol/L的羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐，搅拌反应30min后，加入10μg的CRP单克隆抗体dAb，继续反应3h后，加入10μL 10mg/mL的BSA封闭30min，离心得到dAb-GPIO NPs偶联物；将其分散于25μL0.02mol/mL Tris-HCl(pH＝8.0，含1％吐温20，2％BSA，20％蔗糖和5％海藻糖)溶液中。
使用三维划膜仪将CRP单克隆抗体cAb和羊抗鼠IgG喷涂于纤维素膜上，划线量为1μg/mL，浓度为1mg/mL，于37℃真空烘箱中烘干。然后将全血样品垫、结合垫、吸水垫和硝酸纤维素膜组装，利用ZQ2002自动斩切机剪裁成3mm宽的试纸条，得到初级试纸条。
将4μL合成的dAb-GPIO NPs偶联物溶液加于上述所述的初级试纸条的结合垫上，置于37℃真空烘箱1～4h，烘干，得到用于CRP全血样品检测的免疫层析试纸条。
将4μL含有CRP的全血样品加于CRP检测试纸条上，随后滴加70μL反应缓冲液，作用10～20min后，得到完成检测的试纸条。反应缓冲液的组成为0.01mol mL-1的磷酸盐缓冲溶液(pH＝7.4，含1％Triton X-100)，CRP浓度分别为0μg/mL，0.31μg/mL，0.62μg/mL，1.25μg/mL，2.5μg/mL，5.0μg/mL，10.0μg/mL，20.0μg/mL。将完成检测的试纸条置于微阵列扫描仪中，扫描采集灰度信号。
具体过程参照图5，图5为本发明所述CRP检测方法过程的示意图。将4μL含有CRP的全血样品和70μL反应缓冲液，依次滴加于CRP检测试纸条的样品垫上，在毛细力作用，样品随溶液向吸水垫方向迁移；在结合垫处，样品中CRP抗原特异性结合GPIO NPs偶联物上抗体dAb；随之到达检测线处，结合GPIO NPs偶联物的CRP抗原通过与捕获抗体cAb特异性结合被捕获，未与CRP抗原结合的GPIO NPs偶联物到达质控线，与羊抗鼠IgG结合。由于GPIO NPs的光学特性，在捕获的GPIO NPs的检测线和质控线处形成两条肉眼可见的线，将反应后的试纸条放入微阵列扫描仪中，通过扫描获取灰度信号值，分析获取的灰度信号，可实现对CRP抗原的检测。
按照以上实验步骤，得到的结果如图12～图14所示。
图12为本发明方法所获得的随全血样品中CRP浓度变化而变化的CRP检测试纸条的明场照片，表示随着全血样品中CRP浓度不同，在CRP检测试纸条上T/C线处产生肉眼可见的变化。
图13是本发明方法所获得的随全血样品中CRP浓度变化而变化的CRP检测试纸条的扫描灰度信号图，图14是本发明方法获取灰度信号得到的全血中CRP检测标准曲线图；分别表示在CRP检测试纸条上T/C线随着CRP浓度变化而变化的灰度信号图像以及相应的数据提取图，其中横坐标为CRP浓度的对数值，纵坐标为T/C(T线灰度值/C线灰度值)。CRP浓度分别为0.31μg/mL，0.62μg/mL，1.25μg/mL，2.5μg/mL，5.0μg/mL，10.0μg/mL，20.0μg/mL，利用这一方法所获得的CRP的检测线性范围为：0.62～20.0μg/mL。
综上，在本发明实施例提供的一种大规模合成、干燥金属复合纳米粒子的方法，并制备其CRP抗体偶联物，及将其应用于CRP检测试纸条的制备及检测方法中，有益效果：本发明提供一种简单、快速、大规模合成金属复合纳米粒子的方法，提出一种解决纳米粒子干燥难题的方法，以便于纳米粒子的储存和运输，为实际生产应用提供新思路；利用该纳米粒子制备CRP抗体偶联物，将其作为检测探针构建CRP免疫层析试纸条，为CRP水平监测提供一种简单、快速、低成本、高效的检测方法。PBS中标准曲线范围为0.62～50μg/mL；血浆中标准曲线范围为0.46～20.4μg/mL；全血中标准曲线范围为0.62～20μg/mL。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种大规模合成、干燥金属复合纳米粒子的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)将Na2PdCl4溶液、HAuCl4溶液和去离子水混合后加入氨水溶液混合搅拌，得到反应液；
B)向所述反应液中加入FeCl2溶液混合搅拌，通过自氧化还原组装法合成金、钯、氧化铁复合纳米粒子(GPIO NPs)溶液；
C)将所述金、钯、氧化铁复合纳米粒子(GPIO NPs)溶液与PAA溶液混合，进行反应，得到反应产物；
将得到的反应产物离心后干燥，得到干燥的GPIO-PAA NPs。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A)中，所述HAuCl4溶液的浓度为0.01～0.1mol/L；
所述Na2PdCl4溶液的浓度为0.01～0.1mol/L；
所述氨水溶液的质量浓度为0.01％～0.5％；
所述加入氨水溶液混合搅拌的时间为1～10min。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B)中，所述FeCl2溶液的浓度为0.05～1mol/L；
所述加入FeCl2溶液混合搅拌的时间为10～60min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C)中，以Fe计，所述金、钯、氧化铁复合纳米粒子(GPIO NPs)溶液的浓度为1～100ppm；
所述PAA溶液的质量浓度为1％～20％；
所述反应的时间为1～5h；
所述干燥的方法为冷冻干燥。
5.一种如权利要求1～4任意一项所述的方法制备得到的干燥的GPIO-PAA NPs。
6.一种dAb-GPIO NPs偶联物，其特征在于，由dAb与权利要求5所述的GPIO-PAA NPs制备得到。
7.一种如权利要求6所述的dAb-GPIO NPs偶联物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将干燥的GPIO-PAA NPs分散于2-(N-吗啉)乙磺酸缓冲溶液中，加入1-乙基-(3-二甲氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和羟基硫代琥珀酰亚胺钠盐，搅拌反应，得到反应液；
向所述反应液中加入CRP单克隆抗体dAb进行反应后，再加入BSA封闭，得到dAb-GPIONPs偶联物。
8.一种如权利要求6所述的dAb-GPIO NPs偶联物在CRP检测中的应用。
9.一种用于CRP抗原检测的免疫层析试纸条，其特征在于，包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上设置有检测线和质控线，其中所述检测线包被有用于捕获CRP的CRP单克隆抗体(cAb)，所述质控线包被有羊抗鼠IgG，所述结合垫包括权利要求6所述的dAb-GPIO NPs偶联物。
10.一种采用权利要求9所述的用于CRP抗原检测的免疫层析试纸条检测CRP抗原的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待测样品滴加于试纸条表面后，如果待测样品中含有CRP抗原，在检测线处产生有颜色变化的线条，线条颜色深度与抗原浓度呈正相关，并可通过扫描灰度获取比色信号进行定量分析。
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