CN113552341B - 基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于双金属纳米团簇比色‑荧光双信号免疫层析试纸条及其制备方法和应用，制备方法使用聚乙烯亚胺改性金纳米粒子作为比色信号物质，金‑银双金属纳米团簇作为荧光信号物质，结合三氯杀螨醇单克隆抗体通过静电络合作用制备荧光免疫探针，组装比色‑荧光双信号免疫层析试纸条；稀释三氯杀螨醇标准品母液配置不同浓度梯度的标准溶液，测定其比色和荧光抑制曲线。将实际待测样品经前处理，滴加至免疫层析试纸条上，根据线性模型，测定三氯杀螨醇浓度；同时具有比色和荧光两种信号，检测食品中三氯杀螨醇时，在比色信号的基础上，通过荧光信号提高检测的灵敏度，可以快速检测三氯杀螨醇含量，在食品安全检测中具有重要的实际应用价值。

Description

基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于三氯杀螨醇的快速检测技术领域，具体涉及一种基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条及其制备方法和应用，即利用基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条检测食品中三氯杀螨醇的应用。
背景技术
三氯杀螨醇作为一种广谱杀螨剂，是现代农牧业生产中常用的有机氯杀虫剂之一。尽管三氯杀螨醇能在茶叶生长过程中有效防治害虫，但其具有较高的毒性，包括致癌、致畸、致突变等。此外，三氯杀螨醇的残留会对环境和生物造成不良影响。2017年，世界卫生组织国际癌症研究机构将三氯杀螨醇列入3类致癌物清单中。目前，三氯杀螨醇的检测方法主要基于仪器，包括美联免疫吸附分析法、高效液相色谱法、气相色谱法、高效液相色谱-质谱串联法等，但这些方法检测步骤复杂，对于样品处理要求高，耗时长，且需要专业的仪器和操作人员。相比之下，免疫分析法具有快速、简单和方便等优点。
免疫层析试纸条具有快速分析、可携性、成本低、无需专业技术人员、操作简单等优势。目前，基于比色传感的免疫层析试纸条被广泛应用在许多领域，其中，胶体金试纸条由于金纳米粒子高电子密度、粒径可控、颜色鲜艳等物理特性，以及金纳米粒子-蛋白偶联物的免疫学和生物学特性，是目前最成熟的即时检测方法。然而，基于金纳米粒子的免疫层析试纸条由于比色信号有限，只能进行定性或半定量检测，灵敏度较低。目前，未见基于金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条检测三氯杀螨醇的相关研究。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的之一是提供一种基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条在检测食品三氯杀螨醇中的应用，用荧光纳米探针组装制备的比色-荧光双信号免疫层析试纸条，可实现茶叶样品中三氯杀螨醇的快速、高灵敏度的检测。
本发明的目的之二是提供上述基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的制备方法。即设计原理主要以金-银双金属纳米团簇、聚乙烯亚胺改性金纳米粒子和三氯杀螨醇单克隆抗体之间静电络合为基础，制备了具有比色-荧光双信号的荧光纳米探针，其中金纳米粒子可提供比色信号，金-银双金属纳米团簇可提供荧光信号。
本发明的目的之三是提供上述基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条。
本发明的目的之四是利用上述基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条进行茶叶中三氯杀螨醇的检测。
为达到上述目的之一，本发明的解决方案是：
一种基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条在检测食品三氯杀螨醇中的应用。
为达到上述目的之二，本发明的解决方案是：
一种基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的制备方法包括如下步骤：
(1)、制备金-银双金属纳米团簇作为荧光信号分子；
(2)、制备聚乙烯亚胺改性金纳米粒子；
(3)、利用金-银双金属纳米团簇、聚乙烯亚胺改性金纳米粒子与三氯杀螨醇单克隆抗体(MC-44-CT，北京勤邦生物技术有限公司)进行络合，得到荧光纳米探针，然后喷涂在预处理的玻璃纤维膜上，干燥得到荧光探针结合垫；
(4)、将三氯杀螨醇-卵清蛋白偶联物和羊抗鼠二抗分别喷施在硝酸纤维素膜上，制备检测线T线和质控线C线，得到划有T线和C线的硝酸纤维素膜，在干燥环境下准备好样品垫、荧光探针结合垫、划有T线和C线的硝酸纤维素膜、吸收垫和聚氯乙烯底板，在聚氯乙烯底板中央放置硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上表面粘贴吸收垫，硝酸纤维素膜下表面粘贴荧光探针结合垫，荧光探针结合垫下表面粘贴样品垫，组装得到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条。
作为本发明的一种优选实施例，步骤(1)中，金-银双金属纳米团簇的制备方法包括：
将氯金酸溶液和硝酸银溶液混合，然后加入5-6mL、6mmol/L还原型谷胱甘肽溶液得到混合液，搅拌反应，反应结束后冷却至室温，经透析并收集产物，存放在4℃的避光环境中。
作为本发明的一种优选实施例，搅拌反应的温度为70℃，搅拌的速率为150-200rpm，搅拌反应的时间为24h。
作为本发明的一种优选实施例，步骤(1)中，金-银双金属纳米团簇的粒径为1.5-2.5nm。
作为本发明的一种优选实施例，步骤(2)中，聚乙烯亚胺改性金纳米粒子的制备方法包括：
将氯金酸溶液在255℃下加热搅拌至沸腾，然后滴加1.5-2mL、1％(w/v)柠檬酸钠水溶液，持续加热搅拌10min，停止加热，搅拌冷却至室温，得到金纳米粒子溶胶；将金纳米粒子溶胶加入聚乙烯亚胺溶液中，超声，离心，除去上清液，洗涤，再次离心浓缩，存放在4℃避光环境中。
作为本发明的一种优选实施例，超声反应的频率为80-100kHz。
作为本发明的一种优选实施例，离心的转速为8000×g，离心和洗涤的时间为10-15min。
作为本发明的一种优选实施例，步骤(2)中，聚乙烯亚胺改性金纳米粒子的粒径为15-25nm，Zeta-电位为35-50mV。
作为本发明的一种优选实施例，步骤(3)中，荧光探针结合垫的制备方法包括：
将聚乙烯亚胺改性金纳米粒子加入金-银双金属纳米团簇中混合后，静置，离心并浓缩，然后加入羊抗鼠二抗混合后，静置，反应结束后加入封闭液，混合后静置，再次离心并浓缩，最后加入三氯杀螨醇单克隆抗体，混合后静置，得到荧光纳米探针；将荧光纳米探针喷涂在预处理的玻璃纤维膜上，干燥得到荧光探针结合垫。
作为本发明的一种优选实施例，预处理的玻璃纤维膜含有磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液中含有0.5-1wt％牛血清白蛋白和1-2wt％聚乙烯吡咯烷酮。
作为本发明的一种优选实施例，干燥的温度为37℃，干燥的时间为0.5-1h。
作为本发明的一种优选实施例，离心的转速为(4000-6000)×g，离心的时间为8-10min。
作为本发明的一种优选实施例，封闭液为2.5wt％的聚乙二醇20000。
作为本发明的一种优选实施例，步骤(4)中，基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的制备方法包括：
将三氯杀螨醇-卵清蛋白偶联物(C1662，北京勤邦生物技术有限公司)和磷酸盐缓冲液混合稀释，羊抗鼠二抗(羊抗小鼠IgG，北京索莱宝科技有限公司)和磷酸盐缓冲液混合稀释，然后分别喷施在硝酸纤维素膜上分别制得检测线T线和质控线C线，得到划有T线和C线的硝酸纤维素膜，干燥，在干燥环境下准备好样品垫(聚酯纤维膜)、荧光探针结合垫、划有T线和C线的硝酸纤维素膜、吸收垫和聚氯乙烯底板，在聚氯乙烯底板中央放置硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上表面粘贴吸收垫，硝酸纤维素膜下表面粘贴荧光探针结合垫，荧光探针结合垫下表面粘贴样品垫，组装得到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条。
作为本发明的一种优选实施例，样品垫与荧光探针结合垫、荧光探针结合垫与硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜与吸收垫之间各重合0.8-1mm，完成后将试纸板切成宽度为3-4mm的条状。
为达到上述目的之三，本发明的解决方案是：
一种基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条由上述的制备方法得到。
为达到上述目的之四，本发明的解决方案是：
一种利用上述的基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条检测茶叶中三氯杀螨醇的过程，其包括如下步骤：
(a)、配置不同浓度梯度的三氯杀螨醇标准溶液，滴在基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条上，测定其比色和荧光数值，拟合抑制曲线；
(b)、将实际待测样品经前处理，滴加至基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条上，根据线性模型，测定三氯杀螨醇的浓度。
作为本发明的一种优选实施例，步骤(a)中，三氯杀螨醇的抑制曲线拟合的方法：将三氯杀螨醇固体标准品(QCX-508，国家标准物质网)溶解在N,N-二甲基甲酰胺中配制成母液，通过表面活性剂S9对母液稀释至不同浓度，将不同浓度的三氯杀螨醇标准溶液滴加到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的样品垫上，5-8min后先目测其结果，并检测T线和C线上的比色信号和荧光信号，通过T/C值进行抑制曲线的拟合。
作为本发明的一种优选实施例，母液的不同浓度为0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL和5000ng/mL。
作为本发明的一种优选实施例，步骤(b)中，将粉碎的茶叶粉末和表面活性剂S9混合，离心，用表面活性剂S9将上清液稀释所得的溶液，作为检测所需的茶汤，取茶汤滴加至基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的样品垫上，5-8min后先目测其结果，并检测T线和C线上的比色信号和荧光信号，通过T/C值和抑制曲线进行计算茶叶中三氯杀螨醇的含量。
作为本发明的一种优选实施例，步骤(a)和步骤(b)中，表面活性剂S9均为Tetronic 1307。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
第一、本发明合成的金-银双金属纳米团簇，银原子与金原子之间的相互作用可以改变合金团簇的电子结构和表面成分，从而提高化学和光学性能；使用聚乙烯亚胺改性金纳米粒子，使其表面带有正电荷，且不影响其粒径和比色信号；故本发明的免疫层析试纸条通过金-银纳米团簇、改性金纳米粒子与三氯杀螨醇单克隆抗体通过静电络合所得，同时具有比色和荧光两种信号，检测食品中三氯杀螨醇时，在比色信号的基础上，通过荧光信号提高检测的灵敏度。
第二、本发明为高灵敏度、高特异性、比色-荧光双信号免疫层析试纸条的制备提供了新的方法，且制备方法新颖，制备过程简单，可应用于食品检测行业，具体可以快速检测茶叶样品中三氯杀螨醇的含量，在茶叶安全检测中具有重要的实际应用价值。
附图说明
图1为本发明的基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的原理示意图。
图2为本发明的实施例1中金-银纳米团簇的荧光光谱图。
图3为本发明的实施例1中金-银纳米团簇在自然光和紫外光下的示意图。
图4为本发明的实施例1中金纳米团簇的荧光寿命和量子产率示意图。
图5为本发明的实施例1中金-银双金属纳米团簇的荧光寿命和量子产率示意图。
图6为本发明的实施例1中金纳米粒子的透射电镜图。
图7为本发明的实施例1中聚乙烯亚胺改性金纳米粒子的透射电镜图。
图8为本发明的实施例1中金-银双金属纳米团簇的透射电镜图。
图9为本发明的实施例1中纳米粒子-纳米团簇复合物的透射电镜图。
图10为本发明的实施例1中检测三氯杀螨醇的试纸条显色情况图。
图11为本发明的实施例1中检测三氯杀螨醇的比色法测定标曲示意图。
图12为本发明的实施例1中检测三氯杀螨醇的荧光标曲示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条及其制备方法和应用。
<基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的应用>
本发明的基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条在检测食品三氯杀螨醇中的应用。
当金属纳米团簇的尺寸接近电子的费米波长(0.5nm)时，由于量子约束，连续态被分解为离散态，因此表现出独特的电学、光学和化学性质。金纳米团簇因其可调的发射波长、优异的光稳定性、Stokes位移大而在生物成像、光学传感和体外生物分析领域引起了广泛关注。合金金属纳米团簇中组成原子之间的相互作用可以改变合金的电子结构和表面成分，从而提高团簇的化学和光学性能。因此，与单组分体系相比，合金金属纳米团簇表现出独特的特性。与其他金属(铜、铂)相比，银原子的掺杂对金属纳米团簇具有更好的荧光强度增强效果。
总之，具有优异发光和光转换性能的荧光纳米材料被广泛用来制备生物传感器，与传统的基于比色传感的免疫层析试纸条相比，基于荧光信号的生物传感器具有更高的灵敏度。金属纳米团簇是由几个到几百个金属原子组成，由于其制备简单，具有良好的水溶性和生物相容性。合金金属纳米团簇中组成原子之间的相互作用可以改变合金的电子结构和表面成分，从而提高化学和光学性能，其中，银掺杂对NCs荧光强度的增强效果最好。
<基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的制备方法>
如图1所示，本发明的基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的制备方法包括如下步骤：
(1)、制备金-银双金属纳米团簇作为荧光信号分子；
(2)、制备聚乙烯亚胺改性金纳米粒子；
(3)、利用金-银双金属纳米团簇、聚乙烯亚胺改性金纳米粒子与三氯杀螨醇单克隆抗体通过静电吸附力进行络合，得到荧光纳米探针，然后喷涂在预处理的玻璃纤维膜上，干燥得到荧光探针结合垫；
(4)、将三氯杀螨醇-卵清蛋白偶联物和羊抗鼠二抗分别喷施在硝酸纤维素膜上，制备检测线T线和质控线C线，得到划有T线和C线的硝酸纤维素膜，在干燥环境下准备好样品垫、荧光探针结合垫、划有T线和C线的硝酸纤维素膜、吸收垫和聚氯乙烯底板，在聚氯乙烯底板中央放置硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上表面粘贴吸收垫，硝酸纤维素膜下表面粘贴荧光探针结合垫，荧光探针结合垫下表面粘贴样品垫，组装得到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条。
具体地，在步骤(1)中，金-银双金属纳米团簇的制备方法包括：
将氯金酸溶液和硝酸银溶液在室温下充分混合，然后加入5-6mL、6mmol/L还原型谷胱甘肽溶液得到混合液，搅拌反应，反应结束后冷却至室温，在3500kDa透析袋中透析24h。透析结束后，收集透析袋中产物，存放在4℃的避光环境中。
其中，搅拌反应的温度为70℃，搅拌的速率可以为150-200rpm，优选为200rpm；搅拌反应的时间为24h。
在步骤(1)中，金-银双金属纳米团簇的粒径可以为1.5-2.5nm，优选为1.5nm；该金-银双金属纳米团簇在紫外光的照射下具有橙红色荧光，激发波长为360nm，发射波长为610nm。
在步骤(2)中，聚乙烯亚胺改性金纳米粒子的制备方法包括：
将氯金酸溶液在255℃下加热搅拌至沸腾，然后滴加1.5-2mL、1％(w/v)柠檬酸钠水溶液，持续加热搅拌10min，停止加热，搅拌冷却至室温，所得红色溶胶为金纳米粒子溶胶。将金纳米粒子溶胶加入10mL、0.4-0.6mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中，超声，离心，除去上清液，用双蒸水洗涤离心3次，最终用双蒸水定容至1mL，再次离心浓缩20倍，存放在4℃避光环境中。
其中，超声反应的频率可以为80-100kHz，优选为80kHz；超声的时间为30min。
离心的转速为8000×g，离心和洗涤的时间可以为10-15min，优选为12min。
在步骤(2)中，聚乙烯亚胺改性金纳米粒子的粒径可以为15-25nm，优选为17nm；Zeta-电位为35-50mV。
在步骤(3)中，荧光探针结合垫的制备方法包括：
将浓缩20倍的聚乙烯亚胺改性金纳米粒子加入4-6mL金-银双金属纳米团簇中，充分混合后在4℃下静置12h，离心并浓缩，然后加入羊抗鼠二抗，充分混匀后在4℃下静置12h，反应结束后加入封闭液，充分混匀后在4℃下静置12h，再次离心并浓缩，最后加入10-30μL、0.1mg/mL的三氯杀螨醇单克隆抗体，充分混匀后静置5min，得到荧光纳米探针。将荧光纳米探针喷涂在预处理的玻璃纤维膜(在含有0.5-1wt％牛血清白蛋白和1-2wt％聚乙烯吡咯烷酮的0.01mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡0.5h，甩干之后烘干)上，在烘箱中干燥得到荧光探针结合垫。
其中，干燥的温度为37℃，干燥的时间可以为0.5-1h，优选为0.5h。
离心的转速可以为(4000-6000)×g，优选为6000×g；离心的时间可以为8-10min，优选为10min。
封闭液为2.5wt％的聚乙二醇20000。
在步骤(4)中，基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的制备方法包括：
将三氯杀螨醇-卵清蛋白偶联物和磷酸盐缓冲液混合稀释，羊抗鼠二抗和磷酸盐缓冲液混合稀释，然后分别喷施在硝酸纤维素膜上分别制得检测线T线和质控线C线，得到划有T线和C线的硝酸纤维素膜，在37℃烘箱中干燥2-4h。在干燥环境下准备好样品垫、荧光探针结合垫、划有T线和C线的硝酸纤维素膜、吸收垫和聚氯乙烯(PVC)底板，在聚氯乙烯(PVC)底板中央放置硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上表面粘贴吸收垫，硝酸纤维素膜下表面粘贴荧光探针结合垫，荧光探针结合垫下表面粘贴样品垫，组装得到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条。
其中，样品垫与荧光探针结合垫、荧光探针结合垫与硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜与吸收垫之间各重合0.8-1mm，完成后将试纸板切成宽度为3-4mm的条状。
<基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条>
由上述的制备方法得到本发明的基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条。
<基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条检测茶叶中三氯杀螨醇的过程>
本发明利用基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条检测茶叶中三氯杀螨醇的过程包括如下步骤：
(a)、配置不同浓度梯度的三氯杀螨醇标准溶液，滴在基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条上，5-8min后，测定其比色和荧光数值，拟合抑制曲线；
(b)、将实际待测样品经前处理，滴加至基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条上，根据线性模型，测定三氯杀螨醇的浓度。
在步骤(a)中，三氯杀螨醇的抑制曲线拟合的方法：将三氯杀螨醇固体标准品溶解在N,N-二甲基甲酰胺中配制成1mg/mL的母液，通过表面活性剂S9将母液稀释至不同浓度(0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL和5000ng/mL)，将100-120μL不同浓度的三氯杀螨醇标准溶液滴加到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的样品垫上，5-8min后先目测其结果，并检测T线和C线上的比色信号和荧光信号，通过T/C值进行抑制曲线的拟合。
在步骤(b)中，将茶叶样品进行粉碎，然后称取1g茶叶粉末与4-5mL的表面活性剂S9充分混合5min后，在4000×g条件下离心10min，用表面活性剂S9将上层无茶渣溶液稀释40-50倍后所得溶液为检测所需的茶汤。取100-120μL茶汤滴加至基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的样品垫上，5-8min后先目测其结果，并检测T线和C线上的比色信号和荧光信号，通过T/C值和抑制曲线计算茶叶中三氯杀螨醇的含量。
在步骤(a)和步骤(b)中，表面活性剂S9均为Tetronic 1307。
以下结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1：
本实施例利用基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条检测茶叶中三氯杀螨醇的过程包括如下步骤：
(1)、制备金-银双金属纳米团簇作为荧光信号分子：
将5mL氯金酸溶液(4mmol/L)和1mL硝酸银溶液(4mmol/L)在室温下充分混合，然后加入5mL、6mmol/L还原型谷胱甘肽溶液得到混合液，混合液在70℃、200rpm下搅拌反应24h。反应结束后冷却至室温，在3500kDa透析袋中透析24h。透析结束后，收集透析袋中产物，存放在4℃的避光环境中。该金-银双金属纳米团簇在紫外光的照射下具有橙红色荧光，激发波长为360nm，发射波长为610nm，粒径为1.5nm。
(2)、制备聚乙烯亚胺改性金纳米粒子：
将100mL、0.01wt％氯金酸溶液加热搅拌至沸腾，然后滴加1.5mL、1％(w/v)的柠檬酸钠水溶液，持续加热搅拌10min，然后停止加热，搅拌冷却至室温，定容至100mL，所得红色溶胶为金纳米粒子溶胶。将1mL金纳米粒子溶胶加入10mL、0.4mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中，在80kHz条件下超声反应30min，之后在8000×g条件下离心12min，除去上清液，用双蒸水洗涤离心3次，最终用双蒸水定容至1mL，再通过在8000×g条件下离心12min浓缩20倍，存放在4℃避光环境中。该聚乙烯亚胺改性金纳米粒子的粒径为17nm。
(3)、制备荧光探针结合垫：
将200μL浓缩20倍的聚乙烯亚胺改性金纳米粒子加入4mL金-银双金属纳米团簇中，充分混合后在4℃下静置12h，然后在6000×g条件下离心10min浓缩至200μL，然后加入4μL羊抗鼠二抗(16mg/mL)，充分混匀后在4℃下静置2h。反应结束后加入80μL封闭液(含2.5wt％PEG 20000)，充分混匀后在4℃下静置12h。封闭结束后在4000×g条件下离心8min浓缩至200μL，最后加入30μL三氯杀螨醇单克隆抗体(0.1mg/mL)，充分混匀后静置5min，得到荧光纳米探针。将荧光纳米探针喷涂在预处理的玻璃纤维膜(在含有0.5wt％牛血清白蛋白和2wt％聚乙烯吡咯烷酮的0.01mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡0.5h，甩干之后烘干)上，在37℃烘箱中干燥0.5h，得到荧光探针结合垫。
(4)、制备基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条：
将10μL三氯杀螨醇-卵清蛋白偶联物(5mg/mL)和10μL磷酸盐缓冲液(10mmol/L)混合稀释，1μL羊抗鼠二抗(16mg/mL)和99μL磷酸盐缓冲液(10mmol/L)混合稀释，然后以1μL/cm的喷量分别喷施在硝酸纤维素膜上制得检测线T线和质控线C线，在37℃烘箱中干燥2h，得到划有T线和C线的硝酸纤维素膜。在干燥环境下准备好样品垫、荧光探针结合垫、划有T线和C线的硝酸纤维素膜、吸收垫和PVC底板，在PVC底板中央放置硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上表面粘贴吸收垫，硝酸纤维素膜下表面粘贴荧光探针结合垫，荧光探针结合垫下表面粘贴样品垫，组装得到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条。该试纸条样品垫与荧光探针结合垫、荧光探针结合垫与硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜与吸收垫之间各重合0.8mm，完成后将试纸板切成宽度为3mm的条状。
(5)、拟合三氯杀螨醇抑制曲线：
将三氯杀螨醇固体标准品溶解在N,N-二甲基甲酰胺中配制成1mg/mL的母液，通过Tetronic 1307(作为表面活性剂S9)将1mg/mL的母液稀释至不同浓度(0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL和5000ng/mL)，将100μL不同浓度的三氯杀螨醇标准溶液滴加到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的样品垫上，5min后先目测其结果，并检测T线和C线上的比色信号和荧光信号，通过T/C值进行抑制曲线的拟合。
(6)、检测茶叶中三氯杀螨醇的含量：
将茶叶样品需进行粉碎，然后称取1g茶叶粉末与4mL的Tetronic 1307(作为表面活性剂S9)表面活性剂充分混合5min后，在4000×g条件下离心10min，用Tetronic 1307将上层无茶渣溶液稀释50倍后所得溶液为检测所需的茶汤。取100μL茶汤滴加至基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的样品垫上，5min后先目测其结果，并检测T线和C线上的比色信号和荧光信号，通过T/C值和抑制曲线计算茶叶中三氯杀螨醇的含量。
从图2和图3中可以看出，本实施例中当氯金酸溶液与硝酸银溶液体积比为5:1时，纳米团簇在激发波长为360nm，发射波长为610nm处荧光强度最强。由于添加的Ag(I)可连接到金纳米团簇上的Au(I)-硫醇基基序，形成大的Au(I)/Ag(I)-硫醇基基序，从而通过AIE聚集诱导产生强烈的红色发射。
由图4可知，金纳米团簇的荧光寿命为：τ1＝350.48ns，τ2＝2650.33ns，量子产率为4.05％，由图5可知，金-银双金属纳米团簇的荧光寿命为：τ1＝349.83ns，τ2＝2352.12ns，量子产率为9.84％。从图4和图5可以看出，金-银双金属纳米团簇较之金纳米团簇，具有显著提高的量子产率。
从图6和图7可以看出，经聚乙烯亚胺改性，金纳米粒子的粒径和分散性无显著变化。从图8中可以看出，本实施例中所制备的金-银双金属纳米团簇的粒径较小，分散性好。从图9中可以看出，金-银双金属纳米团簇可通过静电力吸附在聚乙烯亚胺改性的金纳米粒子周围，形成纳米粒子-纳米团簇复合物。
从图10可以看出，在三氯杀螨醇浓度为1000ng/mL时，试纸条基本已经消线。从图11和图12可以看出，比色法和荧光法所测得结果的IC50分别为107.09ng/mL和19.07ng/mL，表明相较于比色法，荧光法具有显著提高的灵敏度。
实施例2：
本实施例利用基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条检测茶叶中三氯杀螨醇的过程包括如下步骤：
(1)、制备金-银双金属纳米团簇作为荧光信号分子：
将5mL氯金酸溶液(4mmol/L)和1mL硝酸银溶液(4mmol/L)在室温下充分混合，然后加入6mL、6mmol/L还原型谷胱甘肽溶液得到混合液，混合液在70℃、200rpm下搅拌反应24h。反应结束后冷却至室温，在3500kDa透析袋中透析24h。透析结束后，收集透析袋中产物，存放在4℃的避光环境中。该金-银双金属纳米团簇在紫外光的照射下具有橙红色荧光，激发波长为360nm，发射波长为610nm，粒径为2.5nm。
(2)、制备聚乙烯亚胺改性金纳米粒子：
将100mL、0.01wt％氯金酸溶液加热搅拌至沸腾，然后滴加1.5mL、1％(w/v)的柠檬酸钠水溶液，持续加热搅拌10min，然后停止加热，搅拌冷却至室温，定容至100mL，所得红色溶胶为金纳米粒子溶胶。将1mL金纳米粒子溶胶加入10mL、0.5mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中，在100kHz条件下超声反应30min，之后在8000×g条件下离心10min，除去上清液，用双蒸水洗涤离心3次，最终用双蒸水定容至1mL，再通过在8000×g条件下离心10min浓缩20倍，存放在4℃避光环境中。该聚乙烯亚胺改性金纳米粒子的粒径为15nm。
(3)、制备荧光探针结合垫：
将200μL浓缩20倍的聚乙烯亚胺改性金纳米粒子加入5mL金-银双金属纳米团簇中，充分混合后在4℃下静置12h，然后在6000×g条件下离心10min浓缩至200μL，然后加入4μL羊抗鼠二抗(16mg/mL)，充分混匀后在4℃下静置2h。反应结束后加入80μL封闭液(含2.5wt％PEG 20000)，充分混匀后在4℃下静置12h。封闭结束后在4000×g条件下离心8min浓缩至200μL，最后加入20μL三氯杀螨醇单克隆抗体(0.1mg/mL)，充分混匀后静置5min，得到荧光纳米探针。将荧光纳米探针喷涂在预处理的玻璃纤维膜(在含有1wt％牛血清白蛋白和1wt％聚乙烯吡咯烷酮的0.01mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡0.5h，甩干之后烘干)上，在37℃烘箱中干燥1h，得到荧光探针结合垫。
(4)、制备基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条：
将10μL三氯杀螨醇-卵清蛋白偶联物(5mg/mL)和10μL磷酸盐缓冲液(10mmol/L)混合稀释，1μL羊抗鼠二抗(16mg/mL)和99μL磷酸盐缓冲液(10mmol/L)混合稀释，然后以1μL/cm的喷量分别喷施在硝酸纤维素膜上制得检测线T线和质控线C线，在37℃烘箱中干燥3h，得到划有T线和C线的硝酸纤维素膜。在干燥环境下准备好样品垫、荧光探针结合垫、划有T线和C线的硝酸纤维素膜、吸收垫和PVC底板，在PVC底板中央放置硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上表面粘贴吸收垫，硝酸纤维素膜下表面粘贴荧光探针结合垫，荧光探针结合垫下表面粘贴样品垫，组装得到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条。该试纸条样品垫与荧光探针结合垫、荧光探针结合垫与硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜与吸收垫之间各重合1mm，完成后将试纸板切成宽度为3mm的条状。
(5)、拟合三氯杀螨醇抑制曲线：
将三氯杀螨醇固体标准品溶解在N,N-二甲基甲酰胺中配制成1mg/mL的母液，通过Tetronic 1307(作为表面活性剂S9)将1mg/mL的母液稀释至不同浓度(0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL和5000ng/mL)，将100μL不同浓度的三氯杀螨醇标准溶液滴加到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的样品垫上，5min后先目测其结果，并检测T线和C线上的比色信号和荧光信号，通过T/C值进行抑制曲线的拟合。
(6)、检测茶叶中三氯杀螨醇的含量：
将茶叶样品需进行粉碎，然后称取1g茶叶粉末与5mL的Tetronic 1307(作为表面活性剂S9)表面活性剂充分混合5min后，在4000×g条件下离心10min，用Tetronic 1307将上层无茶渣溶液稀释40倍后所得溶液为检测所需的茶汤。取100μL茶汤滴加至基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的样品垫上，5min后先目测其结果，并检测T线和C线上的比色信号和荧光信号，通过T/C值和抑制曲线计算茶叶中三氯杀螨醇的含量。
实施例3：
本实施例利用基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条检测茶叶中三氯杀螨醇的过程包括如下步骤：
(1)、制备金-银双金属纳米团簇作为荧光信号分子：
将5mL氯金酸溶液(4mmol/L)和1mL硝酸银溶液(4mmol/L)在室温下充分混合，然后加入5mL、6mmol/L还原型谷胱甘肽溶液得到混合液，混合液在70℃、150rpm下搅拌反应24h。反应结束后冷却至室温，在3500kDa透析袋中透析24h。透析结束后，收集透析袋中产物，存放在4℃的避光环境中。该金-银双金属纳米团簇在紫外光的照射下具有橙红色荧光，激发波长为360nm，发射波长为610nm，粒径为2nm。
(2)、制备聚乙烯亚胺改性金纳米粒子：
将100mL、0.01wt％氯金酸溶液加热搅拌至沸腾，然后滴加2mL、1％(w/v)的柠檬酸钠水溶液，持续加热搅拌10min，然后停止加热，搅拌冷却至室温，定容至100mL，所得红色溶胶为金纳米粒子溶胶。将1mL金纳米粒子溶胶加入10mL、0.6mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中，在100kHz条件下超声反应30min，之后在8000×g条件下离心15min，除去上清液，用双蒸水洗涤离心3次，最终用双蒸水定容至1mL，再通过在8000×g条件下离心15min浓缩20倍，存放在4℃避光环境中。该聚乙烯亚胺改性金纳米粒子的粒径为18nm。
(3)、制备荧光探针结合垫：
将200μL浓缩20倍的聚乙烯亚胺改性金纳米粒子加入6mL金-银双金属纳米团簇中，充分混合后在4℃下静置12h，然后在6000×g条件下离心8min浓缩至200μL，然后加入4μL羊抗鼠二抗(16mg/mL)，充分混匀后在4℃下静置2h。反应结束后加入80μL封闭液(含2.5wt％PEG 20000)，充分混匀后在4℃下静置12h。封闭结束后在4000×g条件下离心8min浓缩至200μL，最后加入10μL三氯杀螨醇单克隆抗体(0.1mg/mL)，充分混匀后静置5min，得到荧光纳米探针。将荧光纳米探针喷涂在预处理的玻璃纤维膜(在含有1wt％牛血清白蛋白和1wt％聚乙烯吡咯烷酮的0.01mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡0.5h，甩干之后烘干)上，在37℃烘箱中干燥1h，得到荧光探针结合垫。
(4)、制备基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条：
将10μL三氯杀螨醇-卵清蛋白偶联物(5mg/mL)和10μL磷酸盐缓冲液(10mmol/L)混合稀释，1μL羊抗鼠二抗(16mg/mL)和99μL磷酸盐缓冲液(10mmol/L)混合稀释，然后以1μL/cm的喷量分别喷施在硝酸纤维素膜上制得检测线T线和质控线C线，在37℃烘箱中干燥4h，得到划有T线和C线的硝酸纤维素膜。在干燥环境下准备好样品垫、荧光探针结合垫、划有T线和C线的硝酸纤维素膜、吸收垫和PVC底板，在PVC底板中央放置硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上表面粘贴吸收垫，硝酸纤维素膜下表面粘贴荧光探针结合垫，荧光探针结合垫下表面粘贴样品垫，组装得到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条。该试纸条样品垫与荧光探针结合垫、荧光探针结合垫与硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜与吸收垫之间各重合1mm，完成后将试纸板切成宽度为4mm的条状。
(5)、拟合三氯杀螨醇抑制曲线：
将三氯杀螨醇固体标准品溶解在N,N-二甲基甲酰胺中配制成1mg/mL的母液，通过Tetronic 1307(作为表面活性剂S9)将1mg/mL的母液稀释至不同浓度(0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL和5000ng/mL)，将110μL不同浓度的三氯杀螨醇标准溶液滴加到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的样品垫上，6min后先目测其结果，并检测T线和C线上的比色信号和荧光信号，通过T/C值进行抑制曲线的拟合。
(6)、检测茶叶中三氯杀螨醇的含量：
将茶叶样品需进行粉碎，然后称取1g茶叶粉末与4mL的Tetronic 1307(作为表面活性剂S9)表面活性剂充分混合5min后，在4000×g条件下离心10min，用Tetronic 1307将上层无茶渣溶液稀释50倍后所得溶液为检测所需的茶汤。取110μL茶汤滴加至基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的样品垫上，6min后先目测其结果，并检测T线和C线上的比色信号和荧光信号，通过T/C值和抑制曲线计算茶叶中三氯杀螨醇的含量。
实施例4：
本实施例利用基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条检测茶叶中三氯杀螨醇的过程包括如下步骤：
(1)、制备金-银双金属纳米团簇作为荧光信号分子：
将5mL氯金酸溶液(4mmol/L)和1mL硝酸银溶液(4mmol/L)在室温下充分混合，然后加入5mL、6mmol/L还原型谷胱甘肽溶液得到混合液，混合液在70℃、150rpm下搅拌反应24h。反应结束后冷却至室温，在3500kDa透析袋中透析24h。透析结束后，收集透析袋中产物，存放在4℃的避光环境中。该金-银双金属纳米团簇在紫外光的照射下具有橙红色荧光，激发波长为360nm，发射波长为610nm，粒径为2nm。
(2)、制备聚乙烯亚胺改性金纳米粒子：
将100mL、0.01wt％氯金酸溶液加热搅拌至沸腾，然后滴加2mL、1％(w/v)的柠檬酸钠水溶液，持续加热搅拌10min，然后停止加热，搅拌冷却至室温，定容至100mL，所得红色溶胶为金纳米粒子溶胶。将1mL金纳米粒子溶胶加入10mL、0.4mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中，在100kHz条件下超声反应30min，之后在8000×g条件下离心10min，除去上清液，用双蒸水洗涤离心3次，最终用双蒸水定容至1mL，再通过在8000×g条件下离心10min浓缩20倍，存放在4℃避光环境中。该聚乙烯亚胺改性金纳米粒子的粒径为20nm。
(3)、制备荧光探针结合垫：
将200μL浓缩20倍的聚乙烯亚胺改性金纳米粒子加入4mL金-银双金属纳米团簇中，充分混合后在4℃下静置12h，然后在6000×g条件下离心9min浓缩至200μL，然后加入4μL羊抗鼠二抗(16mg/mL)，充分混匀后在4℃下静置2h。反应结束后加入80μL封闭液(含2.5wt％PEG 20000)，充分混匀后在4℃下静置12h。封闭结束后在4000×g条件下离心8min浓缩至200μL，最后加入30μL三氯杀螨醇单克隆抗体(0.1mg/mL)，充分混匀后静置5min，得到荧光纳米探针。将荧光纳米探针喷涂在预处理的玻璃纤维膜(在含有0.5wt％牛血清白蛋白和2wt％聚乙烯吡咯烷酮的0.01mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡0.5h，甩干之后烘干)上，在37℃烘箱中干燥0.5h，得到荧光探针结合垫。
(4)、制备基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条：
将10μL三氯杀螨醇-卵清蛋白偶联物(5mg/mL)和10μL磷酸盐缓冲液(10mmol/L)混合稀释，1μL羊抗鼠二抗(16mg/mL)和99μL磷酸盐缓冲液(10mmol/L)混合稀释，然后以1μL/cm的喷量分别喷施在硝酸纤维素膜上制得检测线T线和质控线C线，在37℃烘箱中干燥2h，得到划有T线和C线的硝酸纤维素膜。在干燥环境下准备好样品垫、荧光探针结合垫、划有T线和C线的硝酸纤维素膜、吸收垫和PVC底板，在PVC底板中央放置硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上表面粘贴吸收垫，硝酸纤维素膜下表面粘贴荧光探针结合垫，荧光探针结合垫下表面粘贴样品垫，组装得到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条。该试纸条样品垫与荧光探针结合垫、荧光探针结合垫与硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜与吸收垫之间各重合0.8mm，完成后将试纸板切成宽度为4mm的条状。
(5)、拟合三氯杀螨醇抑制曲线：
将三氯杀螨醇固体标准品溶解在N,N-二甲基甲酰胺中配制成1mg/mL的母液，通过Tetronic 1307(作为表面活性剂S9)将1mg/mL的母液稀释至不同浓度(0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL和5000ng/mL)，将120μL不同浓度的三氯杀螨醇标准溶液滴加到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的样品垫上，8min后先目测其结果，并检测T线和C线上的比色信号和荧光信号，通过T/C值进行抑制曲线的拟合。
(6)、检测茶叶中三氯杀螨醇的含量：
将茶叶样品需进行粉碎，然后称取1g茶叶粉末与4mL的Tetronic 1307(作为表面活性剂S9)表面活性剂充分混合5min后，在4000×g条件下离心10min，用Tetronic 1307将上层无茶渣溶液稀释50倍后所得溶液为检测所需的茶汤。取120μL茶汤滴加至基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的样品垫上，8min后先目测其结果，并检测T线和C线上的比色信号和荧光信号，通过T/C值和抑制曲线计算茶叶中三氯杀螨醇的含量。
实施例5：
本实施例利用基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条检测茶叶中三氯杀螨醇的过程包括如下步骤：
(1)、制备金-银双金属纳米团簇作为荧光信号分子：
将5mL氯金酸溶液(4mmol/L)和1mL硝酸银溶液(4mmol/L)在室温下充分混合，然后加入6mL、6mmol/L还原型谷胱甘肽溶液得到混合液，混合液在70℃、200rpm下搅拌反应24h。反应结束后冷却至室温，在3500kDa透析袋中透析24h。透析结束后，收集透析袋中产物，存放在4℃的避光环境中。该金-银双金属纳米团簇在紫外光的照射下具有橙红色荧光，激发波长为360nm，发射波长为610nm，粒径为2.5nm。
(2)、制备聚乙烯亚胺改性金纳米粒子：
将100mL、0.01wt％氯金酸溶液加热搅拌至沸腾，然后滴加1.5mL、1％(w/v)的柠檬酸钠水溶液，持续加热搅拌10min，然后停止加热，搅拌冷却至室温，定容至100mL，所得红色溶胶为金纳米粒子溶胶。将1mL金纳米粒子溶胶加入10mL、0.6mg/mL的聚乙烯亚胺溶液中，在80kHz条件下超声反应30min，之后在8000×g条件下离心12min，除去上清液，用双蒸水洗涤离心3次，最终用双蒸水定容至1mL，再通过在8000×g条件下离心12min浓缩20倍，存放在4℃避光环境中。该聚乙烯亚胺改性金纳米粒子的粒径为25nm。
(3)、制备荧光探针结合垫：
将200μL浓缩20倍的聚乙烯亚胺改性金纳米粒子加入6mL金-银双金属纳米团簇中，充分混合后在4℃下静置12h，然后在6000×g条件下离心8min浓缩至200μL，然后加入4μL羊抗鼠二抗(16mg/mL)，充分混匀后在4℃下静置2h。反应结束后加入80μL封闭液(含2.5wt％PEG 20000)，充分混匀后在4℃下静置12h。封闭结束后在4000×g条件下离心8min浓缩至200μL，最后加入10μL三氯杀螨醇单克隆抗体(0.1mg/mL)，充分混匀后静置5min，得到荧光纳米探针。将荧光纳米探针喷涂在预处理的玻璃纤维膜(在含有0.5wt％牛血清白蛋白和2wt％聚乙烯吡咯烷酮的0.01mol/L磷酸盐缓冲液中浸泡0.5h，甩干之后烘干)上，在37℃烘箱中干燥1h，得到荧光探针结合垫。
(4)、制备基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条：
将10μL三氯杀螨醇-卵清蛋白偶联物(5mg/mL)和10μL磷酸盐缓冲液(10mmol/L)混合稀释，1μL羊抗鼠二抗(16mg/mL)和99μL磷酸盐缓冲液(10mmol/L)混合稀释，然后以1μL/cm的喷量分别喷施在硝酸纤维素膜上制得检测线T线和质控线C线，在37℃烘箱中干燥4h，得到划有T线和C线的硝酸纤维素膜。在干燥环境下准备好样品垫、荧光探针结合垫、划有T线和C线的硝酸纤维素膜、吸收垫和PVC底板，在PVC底板中央放置硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上表面粘贴吸收垫，硝酸纤维素膜下表面粘贴荧光探针结合垫，荧光探针结合垫下表面粘贴样品垫，组装得到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条。该试纸条样品垫与荧光探针结合垫、荧光探针结合垫与硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜与吸收垫之间各重合1mm，完成后将试纸板切成宽度为3mm的条状。
(5)、拟合三氯杀螨醇抑制曲线：
将三氯杀螨醇固体标准品溶解在N,N-二甲基甲酰胺中配制成1mg/mL的母液，通过Tetronic 1307(作为表面活性剂S9)将1mg/mL的母液稀释至不同浓度(0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL和5000ng/mL)，将110μL不同浓度的三氯杀螨醇标准溶液滴加到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的样品垫上，6min后先目测其结果，并检测T线和C线上的比色信号和荧光信号，通过T/C值进行抑制曲线的拟合。
(6)、检测茶叶中三氯杀螨醇的含量：
将茶叶样品需进行粉碎，然后称取1g茶叶粉末与5mL的Tetronic 1307(作为表面活性剂S9)表面活性剂充分混合5min后，在4000×g条件下离心10min，用Tetronic 1307将上层无茶渣溶液稀释40倍后所得溶液为检测所需的茶汤。取110μL茶汤滴加至基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的样品垫上，6min后先目测其结果，并检测T线和C线上的比色信号和荧光信号，通过T/C值和抑制曲线计算茶叶中三氯杀螨醇的含量。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下，所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何方面、实施例或特征。
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述过程步骤组组成。
除非另外具体陈述，否则术语“包含(include、includes、including)”、“具有(have、has或having)”的使用通常应理解为开放式的且不具限制性。
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例，而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。此外，除非具体陈述，否则术语第一、第二等的任何使用不表示任何次序或重要性，而是使用术语第一、第二等来区分一个元素与另一元素。

Claims (18)

1.一种基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条在检测食品三氯杀螨醇中的应用；
所述基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的制备方法包括如下步骤：
（1）、制备金-银双金属纳米团簇作为荧光信号分子；
（2）、制备聚乙烯亚胺改性金纳米粒子；
（3）、利用所述金-银双金属纳米团簇、所述聚乙烯亚胺改性金纳米粒子与三氯杀螨醇单克隆抗体进行络合，得到荧光纳米探针，然后喷涂在预处理的玻璃纤维膜上，干燥得到荧光探针结合垫；
（4）、利用三氯杀螨醇-卵清蛋白偶联物制备检测线T线，利用羊抗鼠二抗制备质控线C线，喷涂，组装，得到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条；
步骤（1）中，所述金-银双金属纳米团簇的制备方法包括：
将氯金酸溶液和硝酸银溶液混合，然后加入5-6mL、6mmol/L还原型谷胱甘肽溶液得到混合液，搅拌反应，反应结束后冷却至室温，经透析并收集产物，存放在4℃的避光环境中；
所述搅拌反应的温度为70℃，搅拌的速率为150-200rpm，搅拌反应的时间为24h；
步骤（2）中，所述聚乙烯亚胺改性金纳米粒子的制备方法包括：
将氯金酸溶液在255℃下加热搅拌至沸腾，然后滴加1.5-2mL、1%（w/v）柠檬酸钠水溶液，持续加热搅拌10min，停止加热，搅拌冷却至室温，得到金纳米粒子溶胶；将所述金纳米粒子溶胶加入聚乙烯亚胺溶液中，超声，离心，除去上清液，洗涤，再次离心浓缩，存放在4℃避光环境中；
步骤（3）中，所述荧光探针结合垫的制备方法包括：
将所述聚乙烯亚胺改性金纳米粒子加入所述金-银双金属纳米团簇中混合后，静置，离心并浓缩，然后加入羊抗鼠二抗混合后，静置，反应结束后加入封闭液，混合后静置，再次离心并浓缩，最后加入三氯杀螨醇单克隆抗体，混合后静置，得到荧光纳米探针；将所述荧光纳米探针喷涂在预处理的玻璃纤维膜上，干燥得到荧光探针结合垫。
2.一种基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于：其包括如下步骤：
（1）、制备金-银双金属纳米团簇作为荧光信号分子；
（2）、制备聚乙烯亚胺改性金纳米粒子；
（3）、利用所述金-银双金属纳米团簇、所述聚乙烯亚胺改性金纳米粒子与三氯杀螨醇单克隆抗体进行络合，得到荧光纳米探针，然后喷涂在预处理的玻璃纤维膜上，干燥得到荧光探针结合垫；
（4）、利用三氯杀螨醇-卵清蛋白偶联物制备检测线T线，利用羊抗鼠二抗制备质控线C线，喷涂，组装，得到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条；
步骤（1）中，所述金-银双金属纳米团簇的制备方法包括：
将氯金酸溶液和硝酸银溶液混合，然后加入5-6mL、6mmol/L还原型谷胱甘肽溶液得到混合液，搅拌反应，反应结束后冷却至室温，经透析并收集产物，存放在4℃的避光环境中；
所述搅拌反应的温度为70℃，搅拌的速率为150-200rpm，搅拌反应的时间为24h；
步骤（2）中，所述聚乙烯亚胺改性金纳米粒子的制备方法包括：
将氯金酸溶液在255℃下加热搅拌至沸腾，然后滴加1.5-2mL、1%（w/v）柠檬酸钠水溶液，持续加热搅拌10min，停止加热，搅拌冷却至室温，得到金纳米粒子溶胶；将所述金纳米粒子溶胶加入聚乙烯亚胺溶液中，超声，离心，除去上清液，洗涤，再次离心浓缩，存放在4℃避光环境中；
步骤（3）中，所述荧光探针结合垫的制备方法包括：
将所述聚乙烯亚胺改性金纳米粒子加入所述金-银双金属纳米团簇中混合后，静置，离心并浓缩，然后加入羊抗鼠二抗混合后，静置，反应结束后加入封闭液，混合后静置，再次离心并浓缩，最后加入三氯杀螨醇单克隆抗体，混合后静置，得到荧光纳米探针；将所述荧光纳米探针喷涂在预处理的玻璃纤维膜上，干燥得到荧光探针结合垫。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，所述金-银双金属纳米团簇的粒径为1.5-2.5nm。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述超声反应的频率为80-100kHz。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述离心的转速为8000×g，离心和洗涤的时间为10-15min。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，所述聚乙烯亚胺改性金纳米粒子的粒径为15-25nm，Zeta-电位为35-50mV。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述预处理的玻璃纤维膜含有磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液中含有0.5-1wt%牛血清白蛋白和1-2wt%聚乙烯吡咯烷酮。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述干燥的温度为37℃，所述干燥的时间为0.5-1h。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述离心的转速为（4000-6000）×g，离心的时间为8-10min。
10.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，所述封闭液为2.5wt%的聚乙二醇 20000。
11.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，所述基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的制备方法包括：
将三氯杀螨醇-卵清蛋白偶联物和磷酸盐缓冲液混合稀释，羊抗鼠二抗和磷酸盐缓冲液混合稀释，然后分别喷施在硝酸纤维素膜上分别制得检测线T线和质控线C线，得到划有T线和C线的硝酸纤维素膜，干燥，在干燥环境下准备好样品垫、荧光探针结合垫、划有T线和C线的硝酸纤维素膜、吸收垫和聚氯乙烯底板，在聚氯乙烯底板中央放置硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上表面粘贴吸收垫，硝酸纤维素膜下表面粘贴荧光探针结合垫，荧光探针结合垫下表面粘贴样品垫，组装得到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于：所述样品垫与荧光探针结合垫、荧光探针结合垫与硝酸纤维素膜、硝酸纤维素膜与吸收垫之间各重合0.8-1mm。
13.一种基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条，其特征在于：其由权利要求2-12任一项所述的制备方法得到。
14.一种利用权利要求13所述的基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条检测茶叶中三氯杀螨醇的方法，其特征在于：其包括如下步骤：
（a）、配置不同浓度梯度的三氯杀螨醇标准溶液，滴在所述基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条上，测定其比色和荧光数值，拟合抑制曲线；
（b）、将实际待测样品经前处理，滴加至基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条上，根据线性模型，测定三氯杀螨醇的浓度。
15.根据权利要求14所述的检测茶叶中三氯杀螨醇的方法，其特征在于：步骤（a）中，所述三氯杀螨醇的抑制曲线拟合的方法：将三氯杀螨醇固体标准品溶解在N,N-二甲基甲酰胺中配制成母液，通过表面活性剂S9将母液稀释至不同浓度，将不同浓度的三氯杀螨醇标准溶液滴加到基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的样品垫上，5-8min后先目测其结果，并检测T线和C线上的比色信号和荧光信号，通过T/C值进行抑制曲线的拟合。
16.根据权利要求15所述的检测茶叶中三氯杀螨醇的方法，其特征在于：所述母液的不同浓度为0ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL和5000ng/mL。
17.根据权利要求14所述的检测茶叶中三氯杀螨醇的方法，其特征在于：步骤（b）中，将粉碎的茶叶粉末和表面活性剂S9混合，离心，用表面活性剂S9将上清液稀释所得的溶液，作为检测所需的茶汤，取茶汤滴加至基于双金属纳米团簇比色-荧光双信号免疫层析试纸条的样品垫上，5-8min后先目测其结果，并检测T线和C线上的比色信号和荧光信号，通过T/C值和抑制曲线进行计算茶叶中三氯杀螨醇的含量。
18.根据权利要求15和17所述的检测茶叶中三氯杀螨醇的方法，其特征在于：步骤（a）和步骤（b）中，所述表面活性剂S9均为Tetronic 1307。
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