CN103357887A

CN103357887A - 一种海胆状空心金银合金纳米颗粒及其制备方法和应用

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Publication number: CN103357887A
Application number: CN2013102723388A
Authority: CN
Inventors: 方吉祥; 刘真; 张蕾; 杨忠波
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2013-07-01
Filing date: 2013-07-01
Publication date: 2013-10-23
Anticipated expiration: 2033-07-01
Also published as: CN103357887B

Abstract

一种海胆状空心金银合金纳米颗粒及其制备方法和应用，将硝酸银溶于的水中并加热至沸腾，然后加入柠檬酸三钠水溶液，保持沸腾3-30分钟，得到银胶体，将氯金酸水溶液以及水混合，在搅拌条件下于15℃加入银胶体，再加入左旋多巴水溶液，反应5min，得反应溶液；将反应溶液离心分离，对离心得到的沉淀进行洗涤，即得海胆状空心金银合金纳米颗粒。该纳米颗粒的直径为80nm-300nm，中空尺寸为20nm-50nm，刺的长度为10nm-30nm，刺的直径10nm。本发明工艺方法简单、成本低、条件温和、时间短、过程容易控制且产量较多。得到的纳米颗粒在有机分子检测、肿瘤的早期检测以及光热治疗方面均有良好的应用。

Description

一种海胆状空心金银合金纳米颗粒及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于纳米科学和生物科学交叉领域，特别涉及一种海胆状空心金银合金纳米颗粒及其制备方法和应用。

背景技术

纳米技术是人们认识材料的重大突破，纳米材料独特的力学、热学、光学等方面的性能使它在各领域有巨大的应用前景。当入射电磁波照射到纳米尺度的金属纳米颗粒表面尤其是贵金属纳米颗粒表面时，入射电磁波与金属表面的自由电荷相互作用，产生表面等离子基元，能极大的增加光场强度。金纳米颗粒由于其稳定性，生物相容性比较好而被广泛的用于化学痕量检测、有机污染物检测、肿瘤的早期检测和治疗等。不同颗粒体积、形状、组装结构的金纳米颗粒具有不同的电场增强。制备增强效果好的金纳米颗粒是目前纳米科学和生物科学交叉领域的研究热点。

现有技术中，制备的金纳米颗粒如：金纳米球、金花、金星等的电场增强效果不好、检测灵敏度偏低、重复性差，制备方法复杂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种电场增强效果好、检测灵敏度高、重复性好，制备方法简便的海胆状空心金银合金纳米颗粒及其制备方法和应用，该海胆状空心金银合金纳米颗粒在有机分子检测、肿瘤的早期检测和光热治疗方面均有良好的应用。

为了达到上述目的，本发明的海胆状空心金银合金纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

1）将硝酸银溶于水中并加热至沸腾，然后加入质量浓度为1%的柠檬酸三钠水溶液，保持沸腾3-30分钟后，得到银胶体；其中，每50mL水中溶解4mg-18mg的硝酸银，用于溶解硝酸银的水与所加入的柠檬酸三钠水溶液的体积比为50:（0.6-2.4）；

2）将浓度为10×10^-3mol/L的氯金酸水溶液以及水混合，然后在搅拌条件下于15℃加入银胶体，再加入浓度为10×10^-3mol/L的左旋多巴水溶液，然后将搅拌速度降低，继续搅拌反应4-5分钟，得反应溶液；将反应溶液离心分离，对离心得到的沉淀进行洗涤，即得海胆状空心金银合金纳米材料;其中，所述的氯金酸水溶液、水、银胶体以及有左旋多巴水溶液的体积比为2.4:（4-5.1）:（0.1-1.0）:2.4。

所述的步骤2）中沉淀是采用如下方法进行洗涤的：将沉淀依次用500mmol/L的甲酸水溶液、质量浓度为25-28%的氨水以及水洗涤。

所述的步骤2）中离心速度为6000转每分钟。

一种采用该方法制备的海胆状空心金银合金纳米颗粒直径为80nm-300nm，海胆状空心金银合金纳米颗粒的中空尺寸为20nm-50nm，刺的长度10nm-30nm，刺的直径为10nm。

一种海胆状空心金银合金纳米颗粒在制备用于检测有机分子的拉曼基体中的应用。

所述的有机分子为结晶紫或邻苯二甲酸二异辛酯。

一种海胆状空心金银合金纳米颗粒在制备肿瘤早期检测生物传感器中的应用。

所述的肿瘤早期检测生物传感器为肺癌细胞早期检测生物传感器或膀胱癌细胞早期检测生物传感器。

一种海胆状空心金银合金纳米颗粒在制备光热治疗肿瘤药物中的应用。

所述的光热治疗肿瘤药物为光热治疗乳腺癌细胞药物。

进一步，一种所述的海胆状空心金银合金纳米颗粒在制备基于表面拉曼增强光谱的肿瘤早期检测生物传感器中的应用。

进一步，所述的步骤1）和步骤2）中的水为超纯水或去离子水。

进一步，所述的步骤2）在加完左旋多巴水溶液后搅拌均匀，然后再降低搅拌速度。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明的海胆状空心金银合金纳米金的质量百分含量在80%-95%，银的质量百分含量为5%-20%，且金银均匀分布，形貌均一，尺寸可调，海胆状空心金银合金纳米颗粒均匀排列的表面拉曼散射基体颗粒之间的电磁耦合作用使其热点密度进一步提高且热点分布更均匀。虽然目前已有类似的制备方法，如制备海胆状金和金纳米团簇。但是在制备海胆状金时，现有技术采用的先加还原剂左旋多巴后加氯金酸的做法，这种方法制备的100nm直径的海胆状金，成分单一，在100nm的尺寸内刺不多，热点密度低，拉曼检测灵敏度低，信号一致性低，光热效果不好。而在制备金纳米团簇时没采用种子生长法，所制备的金纳米团簇，尺寸过大，热点密度低同样不利于应用。

2、本发明以颗粒尺寸为20nm-50nm的银胶体作为籽晶，用左旋多巴将氯金酸还原，得到海胆状空心金银合金纳米颗粒，该工艺方法简单、成本低、条件温和、时间短、过程容易控制且产量较多。

3、本发明制备的海胆状空心金银合金纳米颗粒能够通过简单的处理形成大面积均匀重复性好的拉曼基体用于检测各种有机分子，且在拉曼光谱检测中表现出极高的灵敏度和很好的信号一致性。

4、采用海胆状空心金银合金纳米颗粒做生物传感器和光热治疗，提高了检测灵敏度和治疗效果，避免了使用侨联剂，又减小了对细胞活性的影响，简化了操作过程，因此海胆状空心金银合金纳米颗粒的生物相容性较好，具有很好的光热治疗肿瘤的效果。

进一步的，将所述海胆状空心金银合金纳米颗粒用做拉曼基体用于有机分子的检测，如结晶紫和邻苯二甲酸二异辛酯；对有机分子进行拉曼检测具体方法为：将海胆状空心金银合金纳米颗粒的悬浮液滴加到硅片上，待干燥后，将50uL浓度为10^-7M-10^-15M的有机分子溶液滴到该基体上，待溶剂干燥后做拉曼检测。结果显示：结晶紫用波长为633nm的激光进行拉曼检测，检测的浓度限可达到10^-9mol/L；邻苯二甲酸二异辛酯用波长为785nm的激光进行拉曼检测，检测的浓度限可达到10^-12mol/L。

将海胆状空心金银合金纳米颗粒用做基于表面拉曼增强光谱的肿瘤早期检测，如肺癌和膀胱癌；其对肿瘤的早期检测的方法是：将海胆状空心金银合金纳米颗粒在结晶紫分子溶液中浸泡1h，然后用水洗三次，得到包覆好结晶紫的海胆状空心金银合金纳米颗粒；将包覆好结晶紫的海胆状空心金银合金纳米颗粒用癌细胞抗体浸泡2h，得到包覆好结晶紫、癌细胞抗体的海胆状空心金银合金纳米颗粒；将包覆好结晶紫、癌细胞的海胆状空心金银合金纳米颗粒与癌细胞共培养24h，将培养后得到的悬浮液进行拉曼检测。结果显示：特异性抗体的靶向作用使颗粒被癌细胞吞噬，从而实现癌细胞的早期检测。

将海胆状空心金银合金纳米颗粒用做肿瘤的光热治疗，其方法是：将所述一定量的海胆状空心金银合金纳米颗粒与过量的巯基化的聚乙二醇(PEG-SH)在水中混合均匀，在室温下静置24小时。然后用水洗掉多余的PEG-SH，得到复合结构；将此复合结构和小鼠乳腺癌细胞（4T1）共同培养24小时，然后用一定密度的红外激光照射细胞5分钟，对死细胞进行染色，用共聚焦荧光显微镜观察细胞的死亡情况，结果显示：5分钟后大多数细胞已经死亡。

进一步，当纳米颗粒直径在80nm时，纳米颗粒表面仍然具有比较多的刺，且在此纳米颗粒直径下，表面增强拉曼光谱信号增强能达到10⁹。

附图说明

图1为实施例1得到的海胆状空心金银合金纳米颗粒的电镜图片；其中，a为实施例1得到的海胆状空心金银合金纳米颗粒扫描电镜图片，b为实施例得到的海胆状空心金银合金纳米颗粒透射电镜图片；

图2为实施例1得到的海胆状空心金银合金纳米颗粒单颗粒的拉曼谱图；

图3为实施例1得到的海胆状空心金银合金纳米颗粒构建的大面积表面拉曼散射基体对结晶紫检测的重复性图像；

图4为实施例1得到的海胆状空心金银合金纳米颗粒构建的大面积表面拉曼散射基体对邻苯二甲酸二异辛酯的检测结果；

图5为实施例1得到的海胆状空心金银合金纳米颗粒的生物传感器对肺癌细胞的探测结果；其中，a为Au-CV的SERS曲线，b为肺癌细胞的特异性抗体的SERS曲线，c为肺癌细胞下非特异性抗体的SERS曲线；

图6为实施例1得到的海胆状空心金银合金纳米颗粒的生物传感器对膀胱癌的探测结果；其中，a为Au-CV的SERS曲线，b为膀胱癌细胞的特异性抗体的SERS曲线，c为膀胱癌细胞下非特异性抗体的SERS曲线；

图7为海胆状空心金银合金纳米颗粒的光热性能升温曲线；

图8为海胆状空心金银合金纳米颗粒对小鼠乳腺癌细胞（4T1）肿瘤细胞的光热治疗效果；其中，（a）为和0.08mg/ml海胆状空心金银合金纳米颗粒悬浮液共培养但没用激光照射的后4T1癌细胞的共聚焦荧光显微镜图片，（b）为和0.08mg/ml的100nm金胶体共培养后用1W/cm²的激光照射5分钟后洗4T1癌细胞的死亡情况，（c）、（d）、（e）是分别和0.08mg/ml海胆状空心金银合金纳米颗粒悬浮液共培养后对应用0.5W/cm²，0.8W/cm²，1.0W/cm²激光照射后4T1细胞的共聚焦荧光显微镜图片。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明，这些实施例仅用于解释本发明而不用于限制本发明的保护范围。

1、海胆状空心金银合金纳米颗粒的制备

实施例1：

1）将9mg的硝酸银溶于50mL的超纯水中，加热至沸腾，然后快速加入1.2mL质量浓度为1%的柠檬酸三钠水溶液，保持沸腾20分钟，再冷却至室温，得到颗粒尺寸为20nm的银胶体；

2）将2.4mL浓度为10×10^-3mol/L的氯金酸溶液和4.3mL的超纯水加入25mL的玻璃瓶子里，然后在15℃下以300转每分钟的搅拌速度搅拌，搅拌过程中依次加入0.9mL的银胶体以及2.4mL浓度为10×10^-3mol/L的左旋多巴水溶液，加完左旋多巴水溶液继续以300转每分钟的搅拌速度搅拌1分钟，再以100转每分钟的搅拌速度搅拌4分钟，得反应溶液；将反应溶液离心分离，对离心得到的固体产物依次用500mmol/L的甲酸、质量浓度为25-28%的氨水各洗涤一次，然后用超纯水洗涤两次，即得海胆状空心金银合金纳米颗粒；

对实施例1得到的海胆状空心金银合金纳米颗粒进行电镜检测，其结果如图1所示。其中，图1a表明纳米颗粒的直径是80nm，图1b刺长10nm-20nm，颗粒尺寸均匀。

实施例2：

1）将9mg的硝酸银溶于50mL的去离子水中，加热至沸腾，然后快速加入1.2mL质量浓度为1%的柠檬酸三钠水溶液，保持沸腾20分钟，再冷却至室温，得到颗粒尺寸为20nm的银胶体；

2）将2.4mL浓度为10×10^-3mol/L的氯金酸溶液和5.1mL的去离子水加入到25mL的玻璃瓶子里，然后在15℃下以200转每分钟的搅拌速度搅拌，搅拌过程中依次加入0.9mL的银胶体以及2.4mL浓度为10×10^-3mol/L的左旋多巴水溶液，然后以小于200转每分钟的搅拌速度搅拌反应4分钟，得反应溶液；将反应溶液离心分离，对离心得到的固体产物依次用500mmol/L的甲酸、质量浓度为25-28%的氨水各洗涤一次，然后用超纯水洗涤两次，即得颗粒直径为300nm的海胆状空心金银合金纳米颗粒。

实施例3：

1）将4mg的硝酸银溶于50mL的去离子水中，加热至沸腾，然后快速加入0.6mL质量浓度为1%的柠檬酸三钠水溶液，保持沸腾3分钟，再冷却至室温，得到银胶体；

2）将2.4mL浓度为10×10^-3mol/L的氯金酸溶液和4mL的去离子水加入到25mL的玻璃瓶子里，然后在15℃下以200转每分钟的搅拌速度搅拌，搅拌过程中依次加入0.1mL的银胶体以及2.4mL浓度为10×10^-3mol/L的左旋多巴水溶液，然后以小于200转每分钟的搅拌速度搅拌反应4分钟，得反应溶液；将反应溶液离心分离，对离心得到的固体产物依次用500mmol/L的甲酸、质量浓度为25-28%的氨水各洗涤一次，然后用超纯水洗涤两次，即得海胆状空心金银合金纳米颗粒。本实施例得到的海胆状空心金银合金纳米颗粒直径为80nm-300nm，纳米颗粒中空尺寸为20nm-50nm，刺的直径10nm，刺长10nm-30nm。

实施例4：

1）将18mg的硝酸银溶于50mL的去离子水中，加热至沸腾，然后快速加入2.4mL质量浓度为1%的柠檬酸三钠水溶液，保持沸腾30分钟，再冷却至室温，得到的银胶体；

2）将2.4mL浓度为10×10^-3mol/L的氯金酸溶液和4mL的去离子水加入到25mL的玻璃瓶子里，然后在15℃下以200转每分钟的搅拌速度搅拌，搅拌过程中依次加入1.0mL的银胶体以及2.4mL浓度为10×10^-3mol/L的左旋多巴水溶液，然后以小于200转每分钟的搅拌速度搅拌反应4分钟，得反应溶液；将反应溶液离心分离，对离心得到的固体产物依次用500mmol/L的甲酸、质量浓度为25-28%的氨水各洗涤一次，然后用超纯水洗涤两次，即得海胆状空心金银合金纳米颗粒。本发明得到的海胆状空心金银合金纳米颗粒直径为80nm-300nm，纳米颗粒中空尺寸为20nm-50nm，刺的直径10nm，刺长10nm-30nm。

2、海胆状空心金银合金纳米颗粒在检测有机分子中的应用

将实施例1制备的海胆状空心金银合金纳米颗粒加水配制成海胆状空心金银合金纳米颗粒悬浮液，分别用于检测结晶紫和邻苯二甲酸二异辛酯。

1）海胆状空心金银合金纳米颗粒拉曼探测结晶紫：

将海胆状空心金银合金纳米颗粒悬浮液分别滴加到到几个硅片上并室温下干燥，使海胆状空心金银合金纳米颗粒转移到硅片上；向已经转移到硅片的海胆状空心金银合金纳米颗粒上滴加浓度为10^-7mol/L到10^-11mol/L的结晶紫(CV)溶液，且每个硅片上滴加一种浓度的结晶紫溶液，然后自然干燥并用配备波长633nm的拉曼仪器进行拉曼表征，拉曼检测结果如图2所示：结果显示实施例1得到的海胆状空心金银合金纳米颗粒单颗粒拉曼探测的灵敏度可达到10^-9mol/L，其增强因子可达到10⁹，达到了单分子探测的水平。

本发明还对海胆状空心金银合金纳米颗粒的大面积均匀表面拉曼增强基体的信号一致性进行了表征，表征结果如图3所示。在表征前将20uL海胆状空心金银合金纳米颗粒悬浮液滴到硅片上室温下干燥，然后滴加50uL摩尔浓度为10^-8mol/L的结晶紫水溶液再进行表征。由图3可以看出此基体的信号一致性较好，将海胆状空心金银合金纳米颗粒用作检测有机分子结晶紫不但灵敏度高而且结果可靠。

2）海胆状空心金银合金纳米颗粒拉曼探测邻苯二甲酸二异辛酯（DEHP）：

将海胆状空心金银合金纳米颗粒悬浮液分别滴加到到几个硅片上并室温下干燥，使海胆状空心金银合金纳米颗粒转移到硅片上；向已经转移到硅片的海胆状空心金银合金纳米颗粒上滴加50uL浓度为10^-9mol/L、10-¹²mol/L、10^-15mol/L的邻苯二甲酸二异辛酯的乙醇溶液，且每个硅片上滴加一种浓度的结晶紫溶液，然后室温干燥再用激光波长为785的拉曼仪器进行检测，结果如图4所示，由于金刺的紫外可见吸收峰在800nm左右，所以在此激光下，此基体的检测灵敏度大幅提高，能检测到10^-12mol/L的DEHP溶液。

3、一种海胆状空心金银合金纳米颗粒在制备肿瘤早期检测生物传感器中的应用。

将实施例1制备的海胆状空心金银合金纳米颗粒加水配制成悬浮液，分别用于肺癌细胞早期检测和膀胱癌细胞早期检测。

将悬浮液用浓度分别为1.2×10^-9mol/L的结晶紫溶液浸泡1h，然后用水离心洗涤三次，离心洗涤后得到的固体即为用结晶紫分子包覆好的海胆状空心金银合金纳米颗粒；将用结晶紫分子包覆好的海胆状空心金银合金纳米颗粒分别用肺癌抗体（EGFR抗体）浸泡2h，得到包覆好结晶紫、EGFR抗体的海胆状空心金银合金纳米颗粒；然后用酶标仪测试未进行包覆海胆状空心金银合金纳米颗粒前EGFR抗体的浓度，再测试包覆海胆状空心金银合金纳米颗粒后EGFR抗体的浓度，两者相减即可得到包覆上海胆状空心金银合金纳米颗粒的EGFR抗体；最后将包覆好结晶紫（CV）、EGFR抗体的海胆状空心金银合金纳米颗粒与肺癌细胞共培养24h，再对此培养后得到的悬浮液进行拉曼检测，检测结果如图5所示。

将悬浮液用浓度分别为9×10^-10mol/L的结晶紫溶液浸泡1h，然后用水离心洗涤三次，离心洗涤后得到的固体即为用结晶紫分子包覆好的海胆状空心金银合金纳米颗粒；将用结晶紫分子包覆好的海胆状空心金银合金纳米颗粒分别用膀胱癌抗体（SURVIVIN抗体）浸泡2h，得到包覆好结晶紫、SURVIVIN抗体的海胆状空心金银合金纳米颗粒；然后用酶标仪测试未进行包覆海胆状空心金银合金纳米颗粒前SURVIVIN抗体的浓度，再测试包覆海胆状空心金银合金纳米颗粒后SURVIVIN抗体的浓度，两者相减即可得到包覆上海胆状空心金银合金纳米颗粒的SURVIVIN抗体；最后将包覆好结晶紫（CV）、SURVIVIN抗体的海胆状空心金银合金纳米颗粒与膀胱癌细胞共培养24h,再对此培养后得到的悬浮液进行拉曼检测，检测结果如图6所示。

由图5a-c和图6a-c可以看出特异性抗体的靶向作用使颗粒分别被肺癌细胞和膀胱癌细胞吞噬，从而实现癌细胞的早期检测。

4、基于海胆状空心金银合金纳米颗粒的肿瘤的光热治疗应用。

实施例1制备的海胆状空心金银合金纳米颗粒加水配成不同浓度的海胆状空心金银合金纳米颗粒悬浮液，然后测定其在红外激光下的升温曲线，其结果如图7所示。由图7可以看出，海胆状空心金银合金纳米颗粒悬浮液的光热转换速率很高。

将0.425mg/mL的海胆状空心金银合金纳米颗粒悬浮液与过量的巯基化的聚乙二醇(PEG-SH)混合均匀，于室温下静置24小时；然后用水洗掉多余的PEG-SH，得到复合结构；将一定量的复合结构加入到装有4T1癌细胞的96孔板中，使海胆状金在混合悬浮液中的最终浓度为0.08mg/mL,共培养24小时，然后用波长为808nm的红外激光在功率密度为1W/cm²下，照射细胞5分钟后立即用染料对死细胞进行染色，把染色后的悬浮液滴到玻璃片上，用共聚焦荧光显微镜观察细胞的死亡情况，观察结果如图8所示。由图8（a）-8（e）可以看出5分钟后大多说细胞已经死亡。

Claims

1.一种海胆状空心金银合金纳米颗粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的海胆状空心金银合金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的步骤2）中沉淀是采用如下方法进行洗涤的：将沉淀依次用500mmol/L的甲酸水溶液、质量浓度为25-28%的氨水以及水洗涤。

3.根据权利要求1所述的海胆状空心金银合金纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述的步骤2）中离心速度为6000转每分钟。

4.一种如权利要求1～3任意一项中所述的方法制备的海胆状空心金银合金纳米颗粒，其特征在于：所述海胆状空心金银合金纳米颗粒直径为80nm-300nm，海胆状空心金银合金纳米颗粒的中空尺寸为20nm-50nm，刺的长度10nm-30nm，刺的直径为10nm。

5.一种海胆状空心金银合金纳米颗粒在制备用于检测有机分子的拉曼基体中的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于：所述的有机分子为结晶紫或邻苯二甲酸二异辛酯。

7.一种海胆状空心金银合金纳米颗粒在制备肿瘤早期检测生物传感器中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的肿瘤早期检测生物传感器为肺癌细胞早期检测生物传感器或膀胱癌细胞早期检测生物传感器。

9.一种海胆状空心金银合金纳米颗粒在制备光热治疗肿瘤药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的光热治疗肿瘤药物为光热治疗乳腺癌细胞药物。