CN104907019A - 一种磁性荧光拉曼双编码复合微球及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于功能材料技术领域，具体为磁性荧光拉曼双编码复合微球及其制备方法和应用。本发明复合微球是由三聚氰胺与甲醛缩聚反应中加入荧光素形成荧光密胺树脂微球，表面物理吸附磁流体后，再利用化学沉积法沉积银纳米粒子形成以荧光密胺树脂微球为核、磁流体与银纳米粒子为壳的核壳结构微球，再固定拉曼标签分子并包覆SiO₂壳层形成的复合微球，记为FMF/Fe₃O₄-NPs/Ag-NPs/SiO₂复合微球。该复合微球标记有荧光素，且微球粒径为微米级，可作为单微球拉曼增强基底，应用于拉曼检测。本发明方法操作简单，过程可控，并可通过不同荧光素标记以及吸附多种拉曼报告分子来增大复合微球编码容量，可用对于涂料/油墨等的防伪标记。

Description

一种磁性荧光拉曼双编码复合微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于功能材料技术领域，具体涉及一种磁性荧光拉曼增强双重编码复合微球及其制备方法和在涂料及油墨领域防伪方面的应用。

背景技术

涂料是现代工业中一类重要的材料，主要包括传统的以天然物质为原料的涂料产品，以及现代化的以合成化工产品为原料的涂料产品，在现代生活中用途极为广泛。涂料也是家居装修中必不可少的材料，在装修中起到非常重要作用。作为现代工业另一种重要材料，油墨主要由色料、连接料与其他辅助成分组成，可通过印刷将图案、文字等表现在承印物上，在书刊、建筑装饰与电子线路板材印刷等领域有着广泛应用，随着社会需求增大，油墨品种和产量也大规模扩展与增长。但也出现了一些不法厂家置消费者权益与正规企业的市场信誉不顾，生产大量劣质假冒产品，造成消费市场上产品鱼目混珠的混乱局面：目前家居建材市场充斥着很多假冒伪劣的产品，许多知名涂料厂商生产的有品质保障的涂料产品被不法商家“山寨”，假冒劣质涂料往往会对人体造成巨大危害，使得消费者在选购涂料产品时不仅要防毒还要防假；而假冒劣质的油墨易阻塞墨路、损坏电路板或机件，损害消费者权益，同时也会对正规企业的企业品牌及市场信誉造成恶劣的影响。因此对于消费者与正规涂料/油墨生产企业而言，有效的防伪技术不仅能保证消费者购买到的是正规厂家的有质量保障的产品，同时也会保障企业的企业品牌与市场信誉。而目前涂料/油墨产品防伪主要是通过采用利用二维条码、数位水技术与镭射标签等的防伪标签贴于产品筒体或外包装上的方式，这样的防伪标签技术存在无法赋予商品唯一标识码、易被复制假冒的风险，难以满足现代防伪技术难以复制的要求。

与此同时，在高等级防伪领域仍存在着一定空白，目前在涂料/油墨领域已投入商业化的高等级防伪技术主要包括DNA防伪技术与稀土络合物材料荧光技术等。前者主要利用不同DNA具有不同编码结构的原理，通过将DNA信息样本经遗传工程处理后混合到涂料/油墨中按流程生产，使产品自然具备防伪能力，这种防伪方式可以通过DNA序列对比达到高级防伪的目的，但缺点也显而易见，DNA在复杂环境条件下稳定性不高，会最终分解，以及成本昂贵，不适合大规模商业化生产；而后者主要通过荧光标记的方法将稀土络合物材料荧光物质掺入涂料/油墨中起到防伪的作用，方法简便，但其缺点在于荧光标记编码的防伪方式单一，荧光发射峰易重叠，且编码容量有限，因而防伪效果等级较低。此外，二者共同的一个缺点在于，没有富集分离防伪物质的有效手段，因而防伪物质只有在涂料/油墨中的掺混量较大时才能有效检测到以发挥其防伪作用。

荧光微球是利用物理吸附法、自组装法、化学键合法等方法将荧光物质吸附或包埋形成一定粒径的微球体，并能在激发光光源激发下发出相应荧光，具有稳定形态结构及高效发光效率，在诸如生物医学检测等领域有着广泛应用。表面增强拉曼光谱(SERS)被称为“指纹谱”，具有灵敏度高、选择性好、分析速度快等优点，同时可以提供无损检测，被广泛应用于各种化学和生物分子的微量分析等方面。表面增强拉曼散射现象发生在贵金属(如金、银)表面与其接触的或附近的分析物之间，SERS基底上尖锐的金属突起和金属纳米粒子之间能够形成纳米粒子连接点，称为“热点”（hot spots），“热点”对局部表面等离子体的激发可以极大的增强SERS信号，提高检测的灵敏度，从而能够产生巨大的SERS增强效应(Sebastian Schlucker, Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 4756-4795)。目前的SERS基底主要有金或银的粗糙表面，纳米颗粒或沉积在介电微球表面的聚集体，而高SERS活性一直是SERS增强基底的研究热点,但往往因其自身结构导致重现性、可靠性及“热点”数量少使得SERS信号难以精确控制。

本发明中，我们制备出了一种磁性荧光拉曼双编码复合微球，主要利用微球的磁性进行磁力分离富集，利用不同种荧光分子制备出荧光微球，其拥有高效的荧光发光效率；同时将多种拉曼标签分子固定在复合微球上，由于使用了微米级的SERS微球基底，可在显微镜下就实现对基底的各种操作，且可聚焦到单个微球，大大减少由于聚焦多个微球带来的低重复性和不稳定性的发生，通过SERS效应形成特定编码，达到“指纹检测”的效果。这种荧光与增强拉曼结合的功能微球编码技术，可以通过增加荧光素及拉曼报告分子的种类大大扩展编码容量；通过对不同涂料与油墨产品添加不同种的荧光及拉曼报告分子标记的复合微球，可为每个产品提供隐藏在产品内的并且唯一的编码，除了不可改变的编码认证，不同的编码也可以增加或更新数据库的内容。在涂料样品中加入极少量复合微球，利用微球的磁性通过磁铁可将微球富集分离出，便可以对其进行荧光与拉曼特性分析。在实际操作中，我们在乳胶漆中掺混了1ppm(百万分之一)的复合微球，并成功磁力富集分离出完成荧光拉曼检测，真正达到了痕量富集检测的检测限。该发明按照如上所述的编码检测思路，开发制备出这种新型的结合磁性、荧光及拉曼增强的复合功能微球，将其应用于涂料/油墨高等级防伪。本发明的复合微球制作简单，成本低廉，且检测的可操作性、重现性与稳定性高，在涂料/油墨防伪领域具有很好的商业化前景。

发明内容

本发明的目的在于提出一种结构规整、粒径分布均一、检测的可操作性、重现性与稳定性高的结合磁性、荧光与拉曼增强的双重编码复合微球及其制备方法和在涂料/油墨防伪方面的应用。

本发明提出的双重编码复合微球，是指三聚氰胺与甲醛缩聚反应中加入荧光素形成荧光密胺树脂微球，表面物理吸附磁流体后，再利用化学沉积法沉积银纳米粒子形成以荧光密胺树脂微球为核、磁流体与银纳米粒子为壳的核壳结构微球，再固定拉曼标签分子并包覆SiO₂壳层形成的复合微球，记为FMF/Fe₃O₄-NPs/Ag-NPs/SiO₂复合微球。

本发明提出的上述双重编码复合微球的制备方法，具体步骤如下：

（1）首先，三聚氰胺与甲醛按物质的量比为1:（0.8-1.2）比例投料，进行缩聚反应，同时加入一定量荧光物质（质量约为三聚氰胺投料量的0.016%—1.6%），酸性催化下制备得到粒径均匀、单分散的荧光密胺树脂微球，记为FMF微球；

（2）其次，利用含Fe³⁺与Fe²⁺离子的水溶液，N₂保护下加入强碱溶液，高温搅拌一定时间，用酸溶液洗涤至中性，再利用稳定剂稳定制得的磁流体；通过静电相互作用，将FMF微球与磁流体按9:1—1:6的质量比例关系混合，使其能够磁力富集分离，记为FMF/Fe₃O₄-NPs微球；

（3）之后，通过原位化学沉积法，将硝酸银溶液在还原剂作用下在FMF/Fe₃O₄-NPs微球表面沉积均匀、致密饱满的银纳米粒子，得到核壳结构的复合微球，记为FMF/Fe₃O₄-NPs/Ag-NPs微球；

（4）接着，配制一定浓度不同拉曼标签分子溶液，与步骤（3）得到的微球混合，利用其巯基与银纳米粒子的结合作用将其固定在微球表面；均匀致密附着在微球表面的银纳米粒子对拉曼标签分子产生拉曼增强的效果；

（5）随后，利用碱还原正硅酸乙酯方法，得到的SiO₂包覆在步骤（4）得到的微球表面，形成均匀SiO₂壳层，对微球功能结构起保护作用，记为FMF/Fe₃O₄-NPs/Ag-NPs/SiO₂复合微球。

对上述制备的复合微球进行检测，具体方法如下：

称取1mg制备得到的复合微球，充分分散于5ml水中，取出50μl分散液（其中混有0.01mg复合微球），加入10g乳胶漆中，即加入了1ppm的复合微球，再加入20ml水降低体系黏度，充分震荡混匀，利用磁铁磁力将混合体系中复合微球快速分离富集并提取出，将提取液滴在载玻片上，通过荧光显微镜与拉曼光谱仪进行分析。或者，

称取5g乳胶漆，加入7ml离心管底部，掺混入0.5mg复合微球，磁力搅拌30min充分混匀，滴管吸取出，利用旋涂仪将提取物均匀旋涂在约1cm*1cm云母片上，通过荧光检测与拉曼光谱成像进行检测分析。

本发明中，步骤（1）的具体操作如下：将三聚氰胺和甲醛溶液物质的量按比例1：（0.8-1.2）投料，用碱液调节预聚合溶液的pH=10-12，在40℃—100℃预聚合0.5—1h，加入荧光素（质量约为三聚氰胺投料量的0.016%—1.6%），再加入0.5-50mL甲酸，反应1-4h；之后静置，除去上层乳液，得到产物用乙醇与水反复离心洗涤，最后将产物真空烘干，得到尺寸均匀、单分散荧光密胺树脂微球，即FMF微球，粒径为0.5-10μm，粒径大小可调控。

本发明中，步骤（2）的具体操作如下：得到FMF微球与磁流体由9:1-1:6不同质量比在乙醇溶液中充分混合，25-55℃摇床中100-200rpm震荡孵化2-5h，反复离心洗涤并磁力富集分离，得到FMF/Fe₃O₄-NPs微球；再通过磁铁磁力吸附检验磁性富集速度及效果。

本发明中，步骤（3）的具体操作如下：制得的10-200mg FMF/Fe₃O₄-NPs微球，以及20-600mg硝酸银、10-300mg还原剂以及15-120mL无水乙醇，在40-80℃机械搅拌；反应结束，用无水乙醇离心洗涤与磁力分离得到产物，即FMF/Fe₃O₄-NPs/Ag-NPs微球。

本发明中，步骤（4）的具体操作如下：配制10^-11-10^-1g/L的拉曼报告分子乙醇溶液，将5-30mg步骤（3）制得的FMF/Fe₃O₄-NPs/Ag-NPs微球烘干，加入10-30ml的报告分子溶液充分混匀分散，25-55℃摇床中100-200rpm震荡孵化1-5h，多次用乙醇洗去游离的报告分子，离心与磁力分离，由此得到荧光拉曼双编码复合微球。

本发明中，步骤（5）的具体操作如下：将5-30mg双编码微球，与30—60ml乙醇、9—18ml去离子水与1—2ml氨水超声分散均匀，搅拌下缓慢加入100-300μl正硅酸乙酯(TEOS),室温继续搅拌4-6h，产物离心分离后反复用水与乙醇洗涤，最后磁力分离富集，得到FMF/Fe₃O₄-NPs/Ag-NPs/SiO₂复合微球，用于之后测试。

本发明中，所加入的荧光素为异硫氰酸荧光素(FITC)、荧光桃红B、罗丹明B中的一种或几种。

本发明中，制备磁流体时所述的稳定剂为柠檬酸盐(柠檬酸和柠檬酸钠中的一种)，也可以是聚丙烯酸，聚丙烯酸钠，聚谷氨酸及琼脂糖等亲水性高分子中的一种。

本发明中，沉银时所述的还原剂为正丁胺、聚乙烯吡咯烷酮(K30)、硼氢化钠和柠檬酸三钠中的一种。

本发明中，所使用的拉曼报告分子为4-氯苯硫酚(CBT)、4-氨基苯硫酚(ABT)、4-羟基苯硫酚(HBT)、4-硝基苯硫酚(NBT)、4-甲氧基苯硫酚（MBT）以及5, 5-二硫代双-（2-硝基苯甲酸）（DTNB）中的一种或几种。原则上大部分拉曼报告分子均适用此体系，本发明仅选用其中几种。

本发明制备了一种荧光拉曼双编码复合微球，其具有制备简单、成本低廉、检测高效等优点。制备的复合微球粒径均匀、单分散，并可通过调节反应条件来调控微球粒径大小、银或铁纳米粒子覆盖饱满程度等等。荧光微球发光效率高，且微米尺寸的微球SERS基底比传统纳米SERS基底相比更易在显微镜下操作，并可以实现单个微球激光聚焦，从而大大减小激光聚焦到多个微球因微球表面不均匀或“热点”分布不均而引起拉曼信号低重现性与不稳定性等的现象，更易于拉曼光谱与成像检测。

在应用拓展中，我们将低至1ppm含量的复合微球加入乳胶漆中，利用微球的磁性成功通过磁力实现快速富集分离并提取出复合微球，并通过荧光显微镜与拉曼光谱仪成功分析到了荧光与拉曼双编码的微球，真正做到了痕量检测，也就是说,在1吨涂料/油墨中，仅需掺混1g特定编码的复合微球，便可通过磁力快速富集分离提取出并分析出其特定荧光与拉曼编码,起到高等级防伪的效果。同时，我们将含有100ppm微球的乳胶漆旋涂在基板上，通过荧光显微镜观察与拉曼光谱成像，均能观察到相应编码微球明显的荧光与拉曼成像分布图。

本发明制备得到的荧光拉曼双编码的复合微球，其优点在于：

(1)在涂料/油墨体系中，仅需痕量(1ppm)添加入复合微球，便可通过磁力富集分离提取出进行荧光/拉曼检测，且富集分离速度快且高效，而加入的微球对体系自身的性能、颜色等性质无影响；

(2)编码防伪级别高，可以通过不同荧光(一种或几种)与多种拉曼报告分子(一种或几种)的不同组合增加编码容量，可将特定编码的微球添加到指定涂料/油墨产品中便可实现该产品的唯一“指纹身份”编码；

(3)稳定性高，复合功能微球外层的致密SiO₂壳层的保护可使微球功能结构免受环境中酸碱、光照、高温等因素破坏；

(4)检测方式多，将复合功能微球掺混入涂料/油墨体系中，可通过磁力快速富集分离提取出微球进行编码检测(痕量1ppm掺混即可)，也可将涂料/油墨涂写在基板上直接进行荧光与拉曼成像检测(100ppm左右掺混即可)，均能够简单高效地用荧光显微镜与拉曼光谱仪检测出。

相比较于目前常用的DNA防伪技术与稀土络合物材料荧光技术，本发明制备的这种磁性荧光拉曼双编码的复合功能微球的综合性能更加优异，且能实现大容量的编码需求，实现高等级防伪效果，在涂料/油墨防伪方面具有良好的应用推广前景。

附图说明

图1是本发明通过控制不同甲酸加入量制备的不同粒径的密胺树脂微球的场发射扫描电镜照片，下表为不同组的甲酸加入量。 

分组	A	B	C	D	E	F	G	H
									甲酸（μl）	0.5	1	2	5	8	10	25	50

图2是不同FMF微球与磁流体投料质量比得到的表面吸附磁流体的FMF/Fe₃O₄-NPs微球的场发射扫描电镜照片，下表为不同组的FMF微球与磁流体投料质量比。 

分组

A

B

C

D

E

F

微球与磁流体投料比

9:1

6:1

3:1

1:1

1:3

1:6

图3是在外加磁场作用下，复合微球被磁力分离的照片。

图4是同时包覆FITC及PHB荧光素的荧光拉曼双编码的复合微球的荧光显微镜照片。

图5是最终制备得到的荧光拉曼双编码的复合微球的场发射扫描电镜照片以及能谱仪元素分析图谱(EDS)。其中，(A-B)为复合微球扫描电镜照片, (C)是微球的EDS分层图像，(D)是电子图像，(E-F)是微球表面硅与银元素的分布谱图)。

图6是荧光拉曼双编码的复合微球检测不同浓度4-氨基苯硫酚(ABT)的SERS光谱。

图7是将1ppm复合微球加入乳胶漆并成功富集提取并荧光拉曼检测出的显微镜照片与拉曼光谱(所用拉曼报告分子是4-氯苯硫酚(CBT) )。其中， A-C是1ppm微球掺混乳胶漆并磁力分离富集提取出的样本的荧光显微镜照片，D,E分别为10ppm与1ppm样本的显微镜及相应拉曼图谱。

图8是将100ppm微球与乳胶漆掺混后旋涂在基板上的荧光照片及拉曼成像谱图。其中，A是旋涂有乳胶漆的云母片实拍照片，B-D是100ppm微球与乳胶漆混合选涂在基板上得到样本的荧光显微镜照片，E为拉曼光谱成像mapping得到的成像谱图。

具体实施方式

实施例1：制备不同尺寸的MF微球

1、制备粒径为4μm的MF球

三聚氰胺取0.625g，甲醛溶液4.9ml，分散于60ml去离子水，70℃下预聚0.5h，加入1μl甲酸，继续机械搅拌2h，静置、除去上层乳液，得到产物反复用乙醇与水离心洗涤，真空烘干，制得粒径为4μm的MF微球。

2、制备粒径为0.4μm的MF球

将上述反应条件的甲酸含量变为50μl，得到粒径为0.4μm的MF微球。

实施例2：FMF微球与磁流体不同投料比混合吸附

分别将FMF微球与磁流体投料质量比按9:1,6:1,3:1,1:1,1:3与1:6充分混合于20ml乙醇中，摇床中30℃180rpm震荡孵化3h，得到产物先离心洗涤分离出未吸附的磁流体，再磁力分离除去未吸附足够磁流体的FMF微球。发现3:1投料比的磁力富集速度较快(约40s)，且随投料比增加磁力富集速度没有明显提升，且表面吸附的过多磁流体会阻碍之后银纳米粒子的沉积。

实施例3：双编码复合微球检测不同浓度4-ABT

将得到的复合微球烘干，取10mg微球与15ml不同浓度(10^-11-10^-3g/L)的4-ABT乙醇溶液加入离心管，摇床中震荡孵化2h。之后用拉曼光谱仪检测样品的SERS信号。

实施例4：包硅制备FMF/Fe ₃ O ₄ -NPs/Ag-NPs/SiO ₂ 复合微球

将5-30mg双编码微球，与30ml乙醇、9ml去离子水与1ml氨水超声分散均匀，搅拌下缓慢加入100-300μl正硅酸乙酯(TEOS),室温继续搅拌4-6h，产物反复用水与乙醇离心洗涤，最后磁力分离富集，产物真空烘箱40℃烘干。

实施例5：1ppm复合微球与乳胶漆掺混并磁力分离富集检测

称取1mg制备得到的复合微球，充分分散于5ml水中，取出50μl分散液，其中混有0.01mg复合微球，称取10g乳胶漆，将50μl分散液加入其中，即加入了1ppm的复合微球，再加入20ml水降低体系黏度，充分震荡混匀，利用磁铁磁力将混合体系中复合微球快速富集分离并提取出，将提取样本滴在载玻片上，通过荧光显微镜与拉曼光谱仪进行分析。

实施例6：复合微球与乳胶漆掺混旋涂基板并荧光&拉曼成像检测

取5g乳胶漆，加入7ml离心管底部，加入0.5mg复合微球，磁力搅拌30min充分混匀，滴管吸取出，利用旋涂仪将混合样本均匀旋涂在约1cm*1cm云母片上，通过荧光拉曼成像进行检测分析。

Claims (10)

1. 一种磁性荧光拉曼双编码复合微球的制备方法，其特征在于具体步骤为：

（1）首先，三聚氰胺与甲醛物质的量比按1:（0.8-1.2）比例投料，进行缩聚反应，同时加入荧光物质，荧光物质加入量为三聚氰胺投料量的0.016%—1.6%，酸性催化下制备得到粒径均匀、单分散的荧光密胺树脂微球，记为FMF微球；

（2）其次，利用含Fe³⁺与Fe²⁺离子的水溶液，N₂保护下加入强碱溶液，高温搅拌，用酸溶液洗涤至中性，再利用稳定剂稳定制得的磁流体；通过静电相互作用，将FMF微球与磁流体按9:1—1:6的质量比例关系混合，使其能够磁力富集分离，记为FMF/Fe₃O₄-NPs微球；

（3）之后，通过原位化学沉积法，将硝酸银溶液在还原剂作用下在FMF/Fe₃O₄-NPs微球表面沉积均匀、致密饱满的银纳米粒子，得到核壳结构的复合微球，记为FMF/Fe₃O₄-NPs/Ag-NPs微球；

（4）接着，配制不同拉曼标签分子溶液，与步骤（3）得到的微球混合，利用其巯基与银纳米粒子的结合作用将其固定在微球表面；均匀致密附着在微球表面的银纳米粒子对拉曼标签分子产生拉曼增强的效果；

（5）随后，利用碱还原正硅酸乙酯方法，得到的SiO₂包覆在步骤（4）得到的微球表面，形成均匀SiO₂壳层，对微球功能结构起保护作用，记为FMF/Fe₃O₄-NPs/Ag-NPs/SiO₂复合微球。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）的操作过程如下：将三聚氰胺和甲醛溶液物质的量按比例1：（0.8-1.2）与水混合配成30—240ml预聚合水溶液，用碱液调节预聚合溶液的pH=10-12，在40℃—100℃预聚合0.5—1h，加入荧光素，荧光物质加入量为三聚氰胺投料量的0.016%—1.6%，再加入0.5-50mL甲酸，反应1-4h；之后静置，除去上层乳液，得到产物用乙醇与水反复离心洗涤，真空烘干，得到尺寸均匀、单分散荧光密胺树脂微球，即FMF微球，粒径为0.5-10μm。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）的操作过程如下：得到FMF微球与磁流体由9:1-1:6不同质量比在乙醇溶液中充分混合，25-55℃摇床中100-200rpm震荡孵化2-5h，反复离心洗涤并磁力富集分离，得到FMF/Fe₃O₄-NPs微球。

4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）的操作过程如下：制得的10-200mg FMF/Fe₃O₄-NPs微球，以及20-600mg硝酸银、10-300mg还原剂以及15-120mL无水乙醇，在40-80℃机械搅拌；反应结束，用无水乙醇离心洗涤，磁力分离得到产物，即FMF/Fe₃O₄-NPs/Ag-NPs微球。

5.根据权利要求1或4所述的制备方法，其特征在于：所加入的荧光素为异硫氰酸荧光素、荧光桃红B、罗丹明B中的一种，或其中的几种。

6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所加入的催化的酸为甲酸、醋酸中的一种。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述的稳定剂为柠檬酸或柠檬酸钠，或者是聚丙烯酸、聚丙烯酸钠、聚谷氨酸及琼脂糖亲水性高分子中的一种，或其中的几种；所述的还原剂为正丁胺、聚乙烯吡咯烷酮、硼氢化钠和柠檬酸三钠中的一种，或其中的几种。

8.根据权利要求1、2、4、6或7所述的制备方法，其特征在于：所使用的拉曼报告分子为4-氯苯硫酚、4-氨基苯硫酚、4-羟基苯硫酚、4-硝基苯硫酚、4-甲氧基苯硫酚以及5, 5-二硫代双-（2-硝基苯甲酸）中的一种，或其中的几种。

9.一种如权利要求1-8所述的制备方法制备的磁性荧光拉曼双编码复合微球。

10. 如权利要求9所述磁性荧光拉曼双编码复合微球，在涂料或油墨编码防伪中的应用，其特征在于：通过荧光与拉曼不同编码组合加入指定涂料或油墨产品中，作为该产品唯一识别码。