CN103403546A - 核材和壳材之间形成有纳米间隙的单个纳米粒子及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种包括核和包围所述核的壳且在所述核和所述壳之间形成纳米间隙的纳米粒子及其制备方法，由于该纳米粒子通过由纳米间隙导致的等离子体偶联效应而具有非常高的信号放大效应和再现性，故该纳米粒子可以有效地用于拉曼分析。此外，本发明提供了一种用于使用所述纳米粒子检测分析物的方法和用于检测分析物的含有所述纳米粒子的试剂盒。

Description

核材和壳材之间形成有纳米间隙的单个纳米粒子及其制备方法

技术领域

本发明涉及单个纳米粒子及其制备方法，该单个纳米粒子具有由在该单个纳米粒子内部的核材和形成外壳的壳材之间形成的纳米间隙的等离子体偶联（plasomonic coupling）引起的极高的电磁信号放大能力，并且该单个纳米粒子示出由核材的表面上的信号物质的均匀分布和定量控制引起的均匀的信号强度和相比于粒子浓度的定量信号。

背景技术

对于来自生物样品和其他样品的单分子的高精度的检测可以广泛应用于医学诊断、病理学、毒理学、环境采样、化学分析及其他许多领域，为此，在过去的几年中，在生物-化学领域中利用特定物质标记的纳米粒子及化学物质已经广泛用于研究少量的合成物质和生物分子的代谢、分布及偶联等。典型地，存在利用放射性同位素、有机荧光材料和无机材料的量子点（quantum dots）的方法。

利用放射性同位素的方法中，生物体中广泛存在的¹H、¹²C、³¹P、³²S和¹²⁷I等的放射性同位素³H、¹⁴C、³²P、³⁵S和¹²⁵I广泛用作放射性示踪剂。因为放射性同位素和非放射性同位素的化学性质类似使得能够任意替换，以及放射性同位素的放射能量比较大使得能够进行少量的检测，所以长期以来一直使用放射性同位素。但是，因为对人体有害的辐射，因此难以处理放射性同位素，而且，一些同位素的辐射具有较短的半衰期而具有高辐射能，这导致长期存储或实验上的不便。

有机荧光染料（Organic fluorescent dyes）被广泛用作放射性同位素的替代方案。当荧光染料被特定波长的光激活时，荧光染料发出具有固有波长的光。尤其是，随着检测装置的小型化，放射性物质表现出检测上的限制，这需要长的检测时间，但是在适当的条件下荧光染料每分子发射出成千上万个光子，从而理论上甚至能实现单分子水平的检测。然而，荧光染料的局限性在于：荧光染料需要通过借助构效关系相对较小地影响活性的部分的变形而连接，且不能够像放射性同位素一样直接取代活性配体的元素。此外，这些荧光标记物质的缺点为：在一段时间之后发出较弱强度的荧光（光漂白），并且激活光的波长范围非常窄而发射的光的波长范围非常宽，从而导致不同的荧光染料之间具有干涉。此外，可用的荧光染料的数量极其有限。

此外，半导体纳米材料的量子点由CdSe、CdS、ZnS和ZnSe等构成，并且根据大小和类型分别发出不同颜色的光。因为量子点与有机荧光染料相比具有宽的激活波长和窄的发射波长，因此发出不同颜色的光的情况的数量比有机荧光染料多。因此，近年来，量子点已经用作克服有机荧光染料的缺点的方法而广泛使用。但是，它们具有高毒性且难以大规模生产的缺点。此外，虽然可用的量子点的数量在理论上可变，然而在实际中极其有限。

为了解决该问题，近来拉曼光谱和/或表面等离子共振已经用于标记。

其中，表面增强拉曼散射（SERS）是利用在金、银等金属纳米结构的粗糙的表面吸附分子时拉曼散射的强度急剧增加10⁶到10⁸倍以上的现象的光谱法。当光穿过具体介质时，一定量的光偏离固有方向，这称为拉曼散射。由于一些散射的光被吸收且激发电子到更高的能级，故拉曼发射光谱的波长不同于受激光的波长，并且示出样品内的光吸收分子的化学组成和结构特性。因此，结合目前高速发展的纳米技术，拉曼光谱可以发展为可以直接检测单分子的高度灵敏的技术，且尤其是非常期待用作重要的医用传感器。这种表面增强拉曼散射（SERS）与等离子共振现象相关，其中，由于金属纳米粒子响应于由金属内导电电子的集体偶联引起的入射电磁辐射而示出明显的光学共振，故本质上金、银、铜及一些其他金属的纳米粒子可以用作用于改善电磁辐射的聚焦效应的小型天线。位于这些粒子附近处的分子对于拉曼光谱分析呈现出更高的灵敏度。

因此，正在积极地进行使用SERS传感器早期诊断与各种疾病相关的基因、蛋白质（生物标记）的研究。与其他分析法（红外光谱法）不同，拉曼光谱具有多种优点。尽管红外光谱法在分子偶极矩变化的分子的情况下获得强信号，但是拉曼光谱甚至在分子的激发极化率变化的非极性分子的情况下也可以获得强信号，这导致几乎所有的有机分子具有固有的拉曼位移（cm^-1）。此外，由于拉曼光谱不受水分子干涉的影响，因此拉曼光谱更适用于诸如蛋白质、基因等的生物分子的检测。然而，由于较低的信号强度，故尽管进行了长期研究，但是还没有达到实际应用的水平。

在自从表面增强拉曼散射被发现后的持续研究中，在能够在吸附荧光分子的纳米粒子的无序的聚集体中检测单分子水平的信号的表面增强拉曼散射（SERS）被报道（Science1997,275(5303),1102；Phys rev lett1997,78(9),1667）后，已经报道了关于利用各种纳米结构（纳米粒子、纳米壳、纳米线）的SERS增强现象的研究。最近，Mirkin研究小组利用与DNA结合的金纳米粒子成功实现了高灵敏度的DNA分析，以在开发生物传感器中利用具有高灵敏度的SERS现象，其检测极限为20fM（2002,science,297,1536）。然而，基于具有拉曼活性分子（例如，若丹明6G）的银（Ag）纳米粒子的盐诱导聚集（salt-inducedaggregation）的单分子SERS活性基质的制备方法在首次研究后没有什么进展。据报道，在不均匀的凝固胶体中，仅一部分（少于1%）具有单分子SERS活性（J Phys Chem B2002,106(2),311）。尽管随机不均匀的（粗糙的）表面提供与SERS相关的大量有趣且必要的数据，然而由于小表面形态变化引起明显的增强（enhancement）变化，故这种策略基本上可以再现。最近，Fang等报道了在SERS中的增强区域的分布的定量测量。最密集的区域（EF>10⁹）据报道是总1,000,000区域中的64区域，这些区域促成总SERS强度的24%（Science,2008,321,388）。如果可以获得SERS信号可以被最大化的具有再性现的结构，则其可以成为非常可靠的超高灵敏度的生物分子分析法，并且其对于体内成像技术和体外诊断是有用的。

然而，在前面的用于各种分析物的SERS检测方法中，通常采用基质和/或载体上涂覆的胶体金属粒子(例如，聚集的银纳米粒子),其有时产生灵敏度增大10⁶倍至10⁸倍的SERS检测，但是不能检测诸如核苷酸的小分析物的单分子。然而，尽管SERS具有优点，然而不仅SERS现象的机理没有被完全理解，而且明确定义的纳米结构的制备和控制也是困难的，以及在根据用于测量光谱的光的波长和偏光方向的增强效率的变化所引起的再现性和可靠性方面存在很多未解决的问题，这对于包括纳米生物传感器的开发和商业化的SERS现象的应用仍然是未解决的问题。为了解决这些问题，需要理解明确定义的纳米结构的光学性质以及利用其精确控制SERS现象的研究。

在这点上，L.Brus等（JACS.2002）报道，在金属粒子二聚体的情况下，在两个或更多个纳米粒子之间形成非常强的电磁场的热点（间隙场），导致根据理论电磁计算预测通过热点导致的SERS信号增强和SERS增强为10¹²倍。

因此，拉曼检测的增强的灵敏度在胶体粒子聚集体内不是明显的均匀，而是取决于热点的存在。然而，还未示出以下特性：热点的物理结构、来自实现了增强的灵敏度的纳米粒子的距离范围、以及增强灵敏度的分析物和纳米粒子的聚集体之间的空间关联性。此外，聚集的纳米粒子本质上在溶液中是不稳定的，并且对单粒子分析物的检测的再现性产生不利影响。

就光信号的放大而言，可以通过在两个或更多个纳米结构体外部的结合区域处的电磁信号的放大来检测发出位于间隙中光信号的分子的特征放大信号（例如，拉曼、荧光和散射等）。然而，如果表面增强拉曼散射（SERS）使用这些结构来获得，则信号的量化、结果的再现性、合成的简易性、成本和探针的稳定性仍然是问题。换句话说，如果两个或更多个纳米粒子通过纳米间隙结合，则可以检测放大的光信号，但是难以调节这种纳米粒子的纳米间隙的大小，因此不能确保材料合成的简单性、稳定性、信号的再现性和量化。

因此，能够强烈地放大信号的纳米结构是内部具有纳米间隙的单纳米粒子，尽管到目前为止还没有报道，然而期望可以通过在纳米间隙内放置各种信号物质来形成稳定的信号。

同时，尽管已经深入研究了DNA的各种纳米结构的合成和组装，但是对DNA的其他作用的研究还非常少。于是，本发明人脱离使用两个以上的纳米粒子形成纳米间隙的概念，使用DNA制备了单纳米粒子，该纳米粒子包括核和壳并且在核和壳之间形成纳米间隙。对于本文的纳米粒子，尤其当通过DNA改性核的表面时，在核和壳之间的空间的一部分通过纳米桥来连接，纳米间隙可以被调整成形成在核和壳之间，通过调整DNA的核苷酸序列可以容易地调整拉曼活性分子的数量和位置，其合成是简单的，由于通过纳米间隙内的等离子体偶联而示出非常高的信号放大效果，已知商业化的重要前提的信号再现性和量化的问题由于高再现性而被克服，以完成本发明。

本发明人还确定，通过形成可以与金纳米粒子的表面结合的有机分子（聚合物，作为一示例，具有带正电的聚合物的聚-烯丙胺、聚-L-赖氨酸，以及带负电的聚-苯乙烯-磺酸盐的叠层结构的聚合物层），随后形成附加的金属壳，而可以在核和壳之间形成无纳米桥的纳米间隙。

发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种新型纳米粒子及其制备方法，该纳米粒子基于由在单个纳米粒子内部形成的纳米间隙的等离子体偶联引起的极高的电磁信号放大效果和高再现性，而可以有效地用于光信号分析，并且该纳米粒子包括核和包围该核的壳，在核和壳之间具有形成纳米间隙，核和壳可以通过纳米桥连接或可以不通过纳米桥连接。

本发明还提供了用于使用上述纳米粒子检测分析物的方法和包括上述纳米粒子的分析物检测试剂盒。

技术方案

为了解决上述问题，本发明提供了一种纳米粒子，该纳米粒子包括核、包围该核的壳、和在该核和该壳之间形成的纳米间隙。该核和壳可以通过纳米桥连接或可以不通过纳米桥连接。

本发明中所使用的术语“核”是指由示出表面等离子体共振的金属构成、直径为1nm到900nm的球形或伪球形的粒子。金、银或铜可以被用作示出表面等离子体共振的金属。

本发明中所使用的术语“壳”是指包围所述核的由示出表面等离子体共振的金属构成的涂层。壳的厚度是0.1nm到900nm，并且优选地为1nm到100nm。纳米间隙形成在壳和核之间，因此在壳和核之间形成空间。金、银或铜可以用作示出表面等离子体共振的金属。

本发明中所使用的术语“纳米间隙”是指在核和壳之间形成的空间。纳米间隙的厚度优选地是0.01nm到100nm。纳米间隙可以隔开核和壳，核和壳可以通过纳米间隙而完全不接触或者可以通过纳米桥接触。因此，本文所用的术语“纳米间隙”不一定是指完全隔开核和壳的空间。

本发明中所使用的术语“纳米桥”是指直径为0.5nm到20nm的连接核和壳的纳米间隙中的桥。本发明中的纳米粒子可包括在核和壳之间的“具有纳米桥的纳米间隙”或“没有纳米桥的纳米间隙”。

因此，作为本发明的优选方面，本发明涉及选自以下种类的的纳米粒子：i）由金核和银壳构成且具有在金核和银壳之间形成的纳米间隙的纳米粒子，ii）由银核和金壳构成且具有在银核和金壳之间形成的纳米间隙的纳米粒子，iii）由金核和金壳构成且具有在金核和金壳之间形成的纳米间隙的纳米粒子，iv）由银核和银壳构成且具有在银核和银壳之间形成的纳米间隙的纳米粒子。本发明中最优选的纳米粒子是由金核和金壳构成且具有在金核和金壳之间形成的纳米间隙的纳米粒子。其还不受构成核的粒子的形状的限制。

尤其，如果核和壳在一些区域中接触，则通过纳米桥接触。即，如果壳形成在核上，则纳米间隙形成在核的整个表面和壳之间，但是在一些区域中形成壳的物质中的一部分可以在内部形成纳米桥且具有与核接触的结构。在图1和图2（a4）中示出了典型的结构。如图1和图2（a4）所示，在形成壳的过程中，一些可以朝向核形成，这导致纳米桥的形成。纳米桥的数量在从1到能够形成纳米间隙的程度内不受限制。直径优选地是0.5nm到20nm。纳米桥可以使核和壳的结构更稳定地保持，并且可以是进一步增大SERS信号的一个因素。

根据本发明的纳米粒子可以用于检测放大的光信号，其中，通过纳米间隙在核和壳之间形成空间，这使得能够放大拉曼信号。尤其是，纳米间隙的再现性非常高，并且当表面增强拉曼散射（SERS）信号被获取时，可以显著改善信号的量化、结果的再现性、合成的容易性和简单性、成本、和探针的稳定性。

为了使上述内容清楚，图1被用作参考。尽管广泛使用的多聚体纳米结构（图1，左侧）具有用于等离子体偶联和SERS的多点间隙，然而其具有极小的表面面积和不均匀的点间隙的缺陷。尤其，合成具有高再现性和发出定量SERS信号的间隙的特定纳米结构是非常困难的且基本上是不可能的。

另一方面，根据本发明的具有纳米桥式纳米间隙的纳米粒子提供了具有大的表面面积的固定和均匀的间隙（图1，右侧）。在单个内部间隙结构中，例如，核的整个表面可用于增强SERS，且染料的位置还可精确地定位在该结构的内部。此外，在实际应用中，其可以简单地合成且具有高合成产率。此外，纳米桥形成在核和壳连接的一些区域中使得纳米粒子的结构可以被更稳定地保持。

可以通过在核上结合聚合物并且在结合聚合物的核上形成壳，而形成本发明中的纳米间隙。也就是说，在核和壳之间存在的聚合物防止核和壳之间的完全接触，这导致形成隔离空间的纳米间隙。寡核苷酸或在叠层组装方法中所用的聚合物可以被用作聚合物并且将在下文更详细地描述。

如果使用寡核苷酸，则特征在于通过静电吸引或共价键将寡核苷酸附接到纳米粒子的核的表面。特别地，本发明特征在于，核的表面通过寡核苷酸的一个末端被改性且寡核苷酸的一部分被插入壳中。

本发明中所使用的术语“寡核苷酸”是由少量的核苷酸构成的聚合物，通常是指可化学合成的最短核苷酸链，其在根据本发明的纳米粒子的制备中起重要作用。具体地，寡核苷酸的聚腺嘌呤（poly A）优选地置于核的表面上，这是因为当在核的周围形成壳时，通过寡核苷酸壳与核没有完全接触，从而导致形成纳米间隙。然而，例如，如果替代寡核苷酸而使用柠檬酸盐或BSPP（二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾），则不能形成纳米间隙。

此外，使核的表面改性的寡核苷酸还可以充当光信号物质(诸如拉曼活性分子)所在的光信号物质改性平台。也就是说，可以通过结合光信号物质(诸如拉曼活性分子)与寡核苷酸，将光信号物质(诸如拉曼活性分子)定位在核的表面上、纳米间隙中或壳内，并且可以精确地控制光信号物质的位置和数量。

寡核苷酸的3'末端或5'末端被改性到连接化合物，从而可以通过连接化合物而被附接到核的表面。本发明中所使用的术语“连接化合物”是指被连接到各个寡核苷酸的3'末端或5'末端并且用于将寡核苷酸附接到核粒子的表面的化合物。本领域中已知用于通过连接化合物使纳米粒子交联的方法（Feldheim，TheElectrochemical Society Interface，Fall，2001，第22页到第25页）。连接化合物的一个端部处包括结合到核粒子的表面的表面结合官能团。优选地，表面结合官能团是含硫基，诸如硫醇或巯基（HS）。因此，该官能团可以是由取代氧原子而存在硫原子的RSH（醇衍生物或酚衍生物）表示的化合物。可替选地，官能团可以是分别由RSSR'或RSR'表示的硫酯或二硫酯、或氨基（-NH₂）。

在本发明中，3'-HS-（CH₂）₃-A₁₀-PEG₁₈-AAACTCTTTGCGCAC-5'被用作寡核苷酸的示例，但不限于此。

如果使用可用于叠层组装方法的聚合物，则纳米粒子的核的表面涂覆有聚合物并且壳形成在所涂覆的核上并且形成纳米间隙，而没有形成纳米桥。聚合物涂覆是可以通过共价键或静电吸引而进行，并且如果应用静电吸引，则叠层组装方法是可以的。“叠层组装方法”是指用于通过交替叠置带正电的聚合物电解质和带负电的聚合物电解质来制造多层的方法。因此，可以仅涂覆一层来最小化纳米间隙的厚度或者通过调整多层的数量来控制纳米间隙的厚度。在“叠层组装方法”中所用的任何聚合物材料可以被使用，而没有限制，例如，可以使用带正电的聚合物聚-烯丙胺、聚-L-赖氨酸等和带负电的聚-苯乙烯-磺酸盐等。

此外，根据本发明的纳米粒子特征在于，在纳米间隙内包括信号物质。具体地，用于测量拉曼信号的信号物质光活性分子可以是任何由选自C、H、O、N、S和它们的组合的原子构成的分子而没有限制，可以使用金属离子、金属离子螯合物或金纳米粒子。具体地，在本发明中所用的信号物质具有包含荧光有机分子、非荧光有机分子、无机纳米粒子和拉曼活性分子的广义的概念，可包括显色能力的任何标记而没有限制，优选的是拉曼活性分子。本发明中所使用的术语“拉曼活性分子”是指，当本发明的纳米粒子被附接到一种或多种分析物时，通过拉曼检测装置促进检测和测量分析物的物质。在拉曼光谱中所用的拉曼活性分子包括有机原子和分子、或无机原子或分子等。具体地，拉曼活性分子包括但不限于FAM、Dabcyl、TRITC（四甲基罗丹明-5-异硫氰酸酯）、MGITC（孔雀绿异硫氰酸酯）、XRITC（X-罗丹明-5-异硫氰酸酯）、DTDC（3,3-二乙基硫二碳碘化氰）、TRIT（四甲基罗丹明异硫醇）、NBD（7-硝基-2,1,3-苯并氧杂恶二唑）、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、对氨基苯甲酸、红霉素、生物素、异羟基洋地黄毒苷、5-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基、荧光素、5-羧基-2',4',5',7'-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、偶氮甲碱、菁（Cy3、Cy3.5、Cy5）、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、氨基吖啶、量子点、碳同素异形体、氰化物、硫醇、氯气、溴、甲基、磷或硫，所使用的拉曼活性分子必须表现出明显的拉曼光谱，并且尤其是能够结合不同类型的分析物或与不同类型的分析物相关。拉曼活性分子优选地为与拉曼分析中所用的激发激光的波长共振而示出较高的拉曼信号强度的分子。

本文中的可以包括在纳米间隙中的信号物质可以通过借助共价键或静电吸引附接在寡核苷酸上而被置于纳米间隙的内部，或者拉曼活性分子可以通过共价键或静电吸引结合在核粒子的表面上而与寡核苷酸无关。如果寡核苷酸通过拉曼活性分子被改性，则特征在于拉曼活性分子的位置是可调整的。也就是说，如果拉曼活性分子被附接在靠近附接在核上的寡核苷酸的末端的位置中，则拉曼活性分子可以被定位成靠近纳米粒子中的核，并且可以通过调整定位在纳米间隙中。例如，拉曼信号可以根据拉曼活性分子的位置而变化，并且，如果拉曼活性分子位于间隙内部，则可以检测具有高均匀性和再现性的最强拉曼信号。

如果拉曼活性分子被结合在核的表面上而与寡核苷酸无关，则可以最大化拉曼活性分子的结合量。

根据本发明的纳米粒子的总直径优选地是1nm到990nm，并且更优选地是20nm到500nm。

此外，可以在根据本发明的纳米粒子的壳上再形成金纳米粒子及壳，这使得能够通过重复上述纳米间隙和壳的制备方法而形成内部具有多层壳的纳米粒子。

根据本发明的纳米粒子的壳的表面还可以与各种物质结合，从而产生纳米粒子特性上的改进。例如，如果纳米粒子用在活体中，则可以通过生物相容性的聚合物使该表面改性。此外，在根据本发明的纳米粒子的壳的表面上可以使生物分子功能化。如果根据本发明的纳米粒子的表面通过生物分子被功能化，纳米粒子可以仅结合至特定的靶，这导致进一步改善使用纳米粒子的分析能力。功能化到纳米粒子的生物分子的示例可以是抗体、抗体片段、基因工程抗体、单链抗体、蛋白质受体、结合蛋白、酶、蛋白抑制剂、植物凝集素、细胞粘着蛋白、寡核苷酸、多核苷酸、核酸或适体。

本发明还提供了用于制备纳米粒子的方法，该纳米粒子包括核、包围核的壳以及形成在核和壳之间的纳米间隙，该方法包括通过寡核苷酸改性核；以及在寡核苷酸改性的核上形成壳。

第一步骤是通过寡核苷酸使核改性并且可以根据公知文献使用本领域中已知的方法来进行。在本发明的示例中，参考文献'S.J.Hurst，A.K.R.Lytton-Jean，C.A.Mirkin，Anal.Chem.78，8313（2006）'。

第二步骤是，通过使金属前驱体（例如，金前驱体HAuCl4）、还原剂（NH₂OH-HCl）和聚-N-乙烯基-2-吡咯烷酮（PVP）和磷酸盐缓冲液反应而形成壳。

根据上述用于制备纳米粒子的方法，核-纳米间隙-壳的纳米粒子可以以高产率（至少约95%）来制备，并且特别是纳米间隙具有很好的再现性。此外，如果在第一步骤中使用结合信号物质的寡核苷酸，则可以制备包括信号物质的纳米粒子，因此可以容易地调整在纳米粒子中的信号物质的位置和数量。

此外，本发明还提供了用于制备包括核、包围核的壳以及形成在核和壳之间的纳米间隙的纳米粒子的方法，该方法包括用聚合物涂覆核；以及在所涂覆的核上形成壳。可以通过叠层组装进行聚合物的涂覆，可以使用在“叠层组装”中所用的任何材料而没有限制，例如，可以使用带正电的聚合物聚-烯丙胺、聚-L-赖氨酸等和带负电的聚-苯乙烯-磺酸盐。

此外，本发明还提供了用于检测分析物的方法，该方法包括：合成根据本发明的纳米粒子；用能够检测分析物的生物分子使所述纳米粒子的所述壳的表面功能化；使所述纳米粒子暴露于含有至少一种分析物的样品；和通过激光激发和拉曼光谱检测和识别所述至少一种分析物。

本文的分析物的示例可以是氨基酸、肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖、碳水化合物、低聚糖、多糖、脂肪酸、脂类、激素、代谢物、细胞激素、趋化激素、受体、神经传导物质、抗原、过敏原、抗体、基质、代谢物、辅酶因子、抑制剂、药物、药用物质、营养素、朊病毒、霉素、毒物、炸药、农药、化学战剂、生物有害物质、放射性同位素、维生素、杂环芳香族化合物、致癌物质、诱变剂、麻醉剂、安非他命、巴比妥盐、致幻剂、废物或污染物。此外，如果分析物是核酸、则本文的核酸可以是基因、病毒RNA和病毒DNA、细菌DNA、真菌DNA、哺乳动物DNA、cDNA、mRNA、RNA和DNA片段、寡核苷酸、合成寡核苷酸、改性的寡核苷酸、单链和双链核酸、天然核酸和合成核酸。

本文中功能化到纳米粒子的生物分子的示例可以是抗体、抗体片段、基因工程抗体、单链抗体、蛋白质受体、结合蛋白、酶、蛋白抑制剂、植物血凝素、细胞粘附蛋白、寡核苷酸、多核苷酸、核酸或适体。可以通过静电吸引将生物分子附接在纳米粒子的表面上，或者通过直接结合或者通过键合来进行功能化，该功能化的方法不是特别地受限制。

优选地，本发明中的分析物可以使用公知的拉曼光谱来检测或识别，优选地使用表面增强拉曼散射（SERS）、表面增强共振拉曼散射（SERRS）、超拉曼和/或相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）。

本发明中所使用的术语“表面增强拉曼散射（SERS）”是指使用一种拉曼散射的现象的光谱法，当吸附在粗糙处理的特定金属的表面上或者位于数百纳米的距离内时发生该拉曼散射，其拉曼的强度比一般的拉曼的强度增加10⁶到10⁸倍以上。术语“表面增强共振拉曼光谱（SERRS）”是指使用对于在SERS活性表面上的吸收物的激光激发波长的共振现象的光谱法。术语“相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）”是指测量通过入射到拉曼活性介质上的两种固定的且可变的激光的组合而获得的反斯托克斯辐射的光谱的光谱法。

在本文的示例中，拉曼活性基质可以与一种或多种拉曼检测单元在操作上结合。本领域中已知用于通过拉曼光谱检测分析物的多种方法（例如，美国专利第6,002,471号、第6,040,191号、第6,149,868号、第6,174,677号、第6,313,914号）。在SERS和SERRS中，对于吸附在粗糙的金属表面（例如，银、金、铂、铜或铝的表面）上的分子，拉曼检测的灵敏度增大10⁶倍以上。

在美国专利第6,002,471号中公开了拉曼检测装置的非限制性示例。通过在532nm波长处的倍频的Nd：YAG激光，或者在365nm波长处的倍频的Ti：蓝宝石激光来产生激发光束。可以使用脉冲激光束或连续的激光束。激发光束通过共焦光学器件和显微镜镜头，并且聚集在含有一种或多种分析物的拉曼活性基质上。来自分析物的拉曼发射光通过显微镜镜头和共焦光学器件收集并且与分光器组合用于光谱分离。共焦光学器件包括用于减少背景信号的二向色滤光片、消色滤光片、共焦针孔、物镜和镜子。可以使用标准全视场光学器件与共焦光学器件。拉曼发射信号通过拉曼检测器来检测，该拉曼检测器包括通过接口与计数和数字化信号的计算机连接的雪崩光电二极管。

在美国专利第5,306,403号中公开了检测装置的另一示例，该装置是配备有以单光子计数方法运行的砷化镓光电倍增管（RCA型号C31034或Burle公司型号C3103402）的双光栅分光计（Spex型号1403）。激发源包括514.5nm线的氩粒子激光器（SpectraPhysics型号166）和氪粒子激光器（Innova70，不相干的）的647.1nm线。

其他激发源包括在337nm处的氮激光器（Laser Science公司）和在325nm处的氦-镉激光器（Liconox）（美国专利第6,174,677号）、发光二极管、Nd：YLF激光器、和/或各种离子激光器和/或染料激光器。激发光束可以通过带通滤波器（Corion）被光谱精化和集中于使用6倍物镜（Newport，型号L6X）的拉曼活性基质上。物镜可以用来通过使用全息分光镜（Kaiser Optical Systems公司，型号HB647-26N18）激发分析物，收集拉曼信号和使所发出的拉曼信号垂直于激发光束偏振。全息带阻滤光片（Kaiser Optical Systems公司）可以用来减少瑞利散射辐射。其他拉曼检测器包括配备有红色增强的高灵敏度的电荷耦合器件（RE-ICCD）检测系统（Princeton Instruments）的ISA HR-320分光仪。可以使用其他类型的检测器，诸如傅里叶变换分光仪（基于迈克尔逊干涉仪）、电荷注入装置、光电二极管阵列、InCaAs检测器、电子倍增CCD、高灵敏度CCD和/或光电晶体管阵列。

任何已知的适合的形式或配置的拉曼光谱或相关技术可以用于检测分析物。示例包括普通拉曼散射、共振拉曼散射、表面增强拉曼散射、表面增强共振拉曼散射、相干反斯托克斯拉曼光谱、分子光学激光检验器（MOLE）、拉曼微探针或拉曼显微镜、共焦拉曼显微分光计、三维或扫描拉曼、拉曼饱和光谱、时间分辨共振拉曼、拉曼分离光谱或紫外拉曼显微镜，但不限于此。

在本发明的特定示例中，拉曼检测装置可以在操作上与计算机连接。来自检测装置的数据通过处理器来处理并且存储在主存储装置中。对于标准分析物的发射剖面中的数据也可以被存储在主存储装置或ROM中。处理器可以比较来自拉曼活性基质上的分析物的发射光谱并且识别样品中的分析物的类型。处理器可以分析来自检测装置的数据并且确定各种分析物的同一性和/或浓度。不同配置的计算机可以用于不同的目的。因此，在本发明的不同的示例中系统的结构可以是不同的。在被收集之后，数据通常被转移到分析处理。为了使分析处理变得容易，从检测装置获得的数据通常通过数字计算机分析。通常，计算机被恰当地编程以接收和存储来自检测装置的数据且分析和报告所收集的数据。

本发明还提供了包括根据本发明的纳米粒子的分析物检测试剂盒。检测试剂盒将包括本领域中通常使用的工具和试剂。这些工具/试剂可以包括但不限于适当的载体、可以产生可检测的信号的标记、溶剂、清洁剂、缓冲剂和稳定剂。如果该标记是酶，则其可包括能够测量酶活性的基质和链终止剂。适当的载体可包括但不限于可溶性基质，例如，本领域中已知的生理上可接受的缓冲液，其可以是例如PBS；不溶性载体，其示例可以是聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、交联的葡萄聚糖、多糖、聚合物诸如磁性微粒（镀金属的乳胶）、其他纸、玻璃、金属、琼脂糖和它们的组合。

根据本发明的纳米粒子可以代替常规的用于检测的分子诊断芯片或常规的成像诊断中所使用的纳米粒子。根据本发明的纳米粒子可以被应用到分子诊断芯片诸如DNA芯片和蛋白质芯片。待检测的分析物可以是基因、病毒RNA和病毒DNA、细菌DNA、真菌DNA、哺乳动物DNA、cDNA、mRNA、RNA、DNA片段、寡核苷酸、合成的寡核苷酸、改性的寡核苷酸、单链和双链核酸、天然和合成核酸、氨基酸、肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖、碳水化合物、低聚糖、多糖、脂肪酸、脂类、激素、代谢物、细胞激素、趋化激素、受体、神经传导物质、抗原、过敏原、抗体、基质、代谢物、辅酶因子、抑制剂、药物、药用物质、营养素、朊病毒、霉素、毒物、炸药、农药、化学战剂、生物有害物质、放射性同位素、维生素、杂环芳香族化合物、致癌物质、诱变剂、麻醉剂、安非他命、巴比妥盐、致幻剂、废物或污染物。

根据本发明的纳米粒子可以非常适用于分析物（诸如DNA与特定疾病的发作和进展相关的蛋白质（生物标记））的检测，并且可应用到分子诊断技术和分子成像领域，诸如大规模基因组序列分析、单核苷酸多态性（SNP）检测、序列比较、基因型特异性分析、护理和药物开发。

此外，在根据本发明的纳米粒子的表面上，示出其他信号的物质可以被包括在纳米粒子的内部或外部。例如，还可以包括CT造影剂、MRI造影剂、光学造影剂、超声造影剂、或这些物质的组合，因此，特征在于，使用纳米粒子的拉曼分析同时可以与CT、MRI、光学或超声分析一起进行。

此外，根据本发明的纳米粒子可包括基因、抗体或药物，并且因此可以作为药物载体用在疾病的治疗中。

有益效果

根据本发明的纳米间隙粒子的纳米结构具有对于信号物质的较大的表面面积并且提供了高再现性和均匀厚度的纳米间隙。因此，核的整个表面可以用来增强SERS，并且信号物质的位置还可以精确地定位在纳米间隙内。此外，在实际应用中，其可以简单地合成且具有高的合成产率。因此，示出非常高的信号放大效应，并且由于高的再现性而可以克服商业化的重要先决条件的信号再现性和量化问题。

附图说明

图1示出常规的多纳米结构和根据本发明的示例的NNP纳米结构；

图2示出用于制备根据本发明的示例的纳米粒子的方法和其分析结果。图2a示出壳的形成过程，图2b示出中间体1、2、3和纳米粒子（4，5）的可见光光谱图，图2c示出中间体1、2、3和纳米粒子（4，5）的透射电子显微镜（TEM）图像，并且图2c的6示出纳米粒子的原子映射结果；

图3示出根据在制备根据本发明的示例的纳米粒子的过程中所用的各溶液的浓度所观察到的TEM图像；

图4示出根据本发明的示例制备的NNP（200个）的粒子尺寸和内部-纳米间隙的尺寸分布；

图5示出柠檬酸盐稳定化的20nm的金纳米粒子用作种子的情况下所制备的纳米粒子的可见光光谱图和TEM图像；

图6示出使用BSPP（二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾）改性的金核所制备的纳米粒子的可见光光谱图和TEM图像；

图7示出将mPEG改性的金纳米粒子用作种子所制备的纳米粒子的TEM图像；

图8示出将T₁₀-寡核苷酸改性的金纳米粒子用作种子所制备的纳米粒子的TEM图像；

图9示出基于NNP和二氧化硅包围的纳米粒子的3D-FEM的计算结果。图9a示出NNP的电磁场分布的计算结果（假定间隙充满DNA和拉曼报道分子并且粒子的周围充有水），图9b示出通过与NNP相同尺寸的二氧化硅包围的金-金核-间隙-壳纳米粒子的的电磁场分布的计算结果，图9c示出在632.8nm处沿着中心线的电磁场分布的比较结果，以及图9d示出NNP对入射光束的依赖性；

图10示出根据本发明的示例的被改性成三种不同种类的染料的纳米粒子的时间相关的拉曼结果。图10A示出不同波长处的拉曼信号，图10B示出染料位于纳米间隙中的纳米粒子的拉曼结果，图10C示出染料位于壳内的纳米粒子的拉曼结果，以及图10D示出染料位于壳外的纳米粒子的拉曼结果；

图11示出用于调整拉曼荧光物质的数量的方法；

图12示出根据本发明的示例的纳米粒子的拉曼信号的结果。图11a示出根据染料数量的拉曼信号的结果，图11b示出根据染料数量的拉曼信号的强度，以及图11c示出根据壳的厚度的拉曼信号的强度；

图13示出具有其他荧光染料和非荧光拉曼报道分子的NNP的SERS光谱。

图14示出根据本发明的示例的根据纳米粒子的浓度的拉曼信号的强度和增强因子。图14a示出对于具有Cy3的纳米粒子的拉曼信号的强度，以及图14b示出对于具有4,4’-联吡啶的纳米粒子的拉曼信号的强度；

图15a示意性地示出用于AFM-相关的纳米拉曼测量的方法，图15a到图15e示出纳米粒子的轻敲模式中的AFM图像，并且图15f到图15h示出不同波长处的增强因子的图。

具体实施方式

下文，为了帮助理解本发明，提出了优选的实施例。然而，下面的实施例仅仅是为了更容易地理解本发明而提供的，并不限制本发明的内容。

所用的材料

从Ted Pella公司（Redding，CA，美国）购买金纳米粒子。从Sigma-Aldrich公司（St.Louis，MO，美国）购买所有其他的化学材料（HAuCl₄.3H₂O、聚乙烯吡咯烷酮（K值：29到32）、NH₂OH.HCl、二硫苏糖醇、BSPP）并且收到后使用而无需进一步的纯化。HPLC-净化的染料-编码的硫醇化寡核苷酸购买于IDT公司（Coralville，IA，美国）并且通过在磷酸盐缓冲液(0.17M,pH=8.0)中使用二硫苏糖醇（DTT，0.1M）而还原。所还原的寡核苷酸随后通过NAP-5脱盐柱（Sephadex G-25medium,DNA grade）被纯化。使用Milli-Q水净化系统净化的超纯水（nanopure H₂O；>18.0MΩ）被用于所有的实验。配置有EDS单元（Link oxford ISIS310）的聚醋酸甲基乙烯酯/碳涂覆的铜载网（Ted Pella公司；Redding，CA，美国）和HR-TEM（JEOL，日本，300kV）被用于TEM分析。

对于NNP和用二氧化硅包围的纳米粒子的光学计算方法

为了理解电磁波和桥接的金核-间隙-壳之间的关联性，使用市售的FEM软件COSMOL研究3D有限元模型，该FEM软件COSMOL能够在给定边界条件下计算时谐麦克斯韦方程。线性（x）偏振的波（λ=632nm）入射在桥接的金核-间隙-壳粒子上。Johnson和Christy的金的实验介电常数与插值法一起使用（（1）P.B.Johnson，R.W.Christy，Phys.Rev.B.6，4370-4379（1972）；（2）P.G.Etchegoin，E.C.Le Ru，M.Meyer，J.Chem.Phys.125，164705（2006））。

金的相对磁导率为μ_r=1，复折射率以

计算。水、空气和二氧化硅的介电常数分别是ε_water=1.33²,ε_air=1,ε_SiO2=1.46²。在间隙区域中的空气和DNA的混合物的有效介电常数通过以下Maxwell-Garnett方程来确定：

${\mathrm{\ϵ}}_{\mathrm{tff}}={\mathrm{\ϵ}}_0\frac{{\mathrm{\ϵ}}_{\mathrm{DNA}}(1+2\mathrm{\φ})+2{\mathrm{\ϵ}}_0(1-\mathrm{\φ})}{{\mathrm{\ϵ}}_{\mathrm{DNA}}(1-\mathrm{\φ})+{\mathrm{\ϵ}}_0(2+\mathrm{\φ})}$

其中，ε_eff是水（或空气）和DNA的混合物的有效介电常数，ε₀是水（或空气）的介电常数，ε_DNA是DNA的介电常数（G.Rong，A.Najmaie，J.E.Sipe，S.M.Weiss，Biosensors and Bioelectronics，23，1572-1576（2008））（e_DNA～1.5），以及表示在间隙区域中的DNA的体积分数。假定在间隙区域中存在300个核苷酸且相应地在间隙区域中的DNA的体积分数是约0.0048。

纳米-拉曼实验装置

用配备有反向光学显微镜（inverted optical microscope）的纳米拉曼分光仪（Axiovert200，Zeiss）和可独立调整的压电式x，y样品扫描仪（PhysikInstrumente）来测量拉曼光谱。514.5nm的氩粒子激光仪（Melles Griot，美国）、632.8nm的He-Ne激光仪（JDSU，美国）和785nm的二极管激光仪（B&W TEKINC.）被用作与单模式光学纤维耦合的激发源（excitation source）。利用双色镜（Chroma Technology公司）使50nW到1mW的激发激光束反射在油浸显物镜（×100，1.3数值孔径；×50，0.5数值孔径；Zeiss）上，且该激发激光束被集中在盖玻片的上表面上的衍射限制的点（当使用632.8nm的激光时，对于×100物镜和×50物镜分别为<300nm和<3μm）。配备有毫微秒示波器IV控制器的AFM（放映机，数字仪表，Veeco Metrology Group）被安装在微机械台上。背景拉曼信号通过在液氮（-125°C）下冻结的CCD（电荷耦合器件）收集。在闭环压电弯曲样品台上的轻敲模式的闭环AFM扫描仪被使用以使拉曼或瑞利散射信号与具有<50nm的重叠精度（overlap precision）的AFM地形图像（topographicalimage）和样品图像相关联。使激光的焦点与AFM尖端一致以对称地分散到AFM尖端。在500cm^-1～2000cm^-1范围内单个且每隔10秒测量散射光谱。通过从Si去除背景信号而基线校正所有的数据。对于在拉曼分析中使用的所有溶液，使用384个良好的光学底板（NuncTM，纽约，美国）。在AFM关联纳米拉曼分析中，使用涂覆有聚-L-赖氨酸的盖玻片（食人鱼蚀液处理的）。

实施例1：核-间隙-壳纳米粒子的制备

使用DNA链作为具有非常精确的位置调整能力的拉曼染色改性平台，根据以下方法来制备具有内部纳米间隙的单个NNP纳米粒子。在图2a中还示意性地示出该方法。

作为典型的制备方法，根据文献'S.J.Hurst，A.K.R.Lytton-Jean，C.A.Mirkin，Anal.Chem.78，8313（2006）来制备DNA改性的金纳米粒子（20nm粒子；DNA序列：3'-HS-（CH₂）₃-A₁₀-PEG₁₈-AAACTCTTTGCGCAC-5'）。为了形成包围DNA改性的金纳米粒子的核的壳（Au），使DNA改性的金纳米粒子与金前驱体（HAuCl₄）、还原剂（NH₂OH-HCl）和1%的聚-N-乙烯基-2-吡咯烷酮（PVP；MW40,000）在磷酸盐缓冲液（0.3MNaCl；10mM的PB；pH=7.4）中反应并且在室温下温和地漩涡振荡30分钟。为了确定根据壳的形成过程的纳米粒子形式变化，基于种子（DNA改性的金纳米粒子，1nM）的量来调整金前驱体（HAuCl₄）和还原剂（NH₂OH-HCl）的量。

具体地，DNA改性的金纳米粒子溶液（100μL；在0.3M PBS中1nM浓度）与50μL的1%PVP溶液混合。得到的溶液分别与1.5μL、5.2μL、10.3μL或30.4μL的盐酸羟胺溶液（10mM）混合后，分别与1.5μL、5.2μL、10.3μL或30.4μL的氯金酸溶液（5mM）混合。根据反应物的量形成各种纳米结构（图2b和图2c；中间体（1、2和3）和生成物（4，5））。在图3中观察到对于各种溶液所制备的纳米结构的图案。

在制备过程中，如图2b所示，粒子溶液的颜色从粉红色（DNA改性的金纳米粒子）变成淡粉红色（中间体1；突出结构（budding structures））、蓝色（中间体2）、紫色（中间体3；中间壳结构）并且最终变为酒红色（NNP结构），这分别与在图2b和图2c中示出的UV-Vis光谱和HR-TEM图像一致。

有趣的是，随着加入更多的反应物，更小的突出（budding sphere）开始出现并且在DNA改性的金表面上朝向侧面形成。壳状结构逐渐形成，在该过程中观察到纳米间隙（图2b、图2c和图3）。UV-Vis光谱示出溶液的颜色变化与HR-TEM图像密切相关（图2b）。中间体1的UV-Vis光谱（图2b的1）示出，约680nm的等离子体共振峰是由沿着合成的突出结构（图2c的1）的长轴的横模引起的并且这样的峰随着壳的形成而逐渐消失（图2b的4）。对于最终产品（Au-NNP（金核-纳米桥接的纳米间隙-金壳结构的纳米粒子）；约20nm的核，约1.2nm的间隙，和约11nm的壳），等离子体共振峰与通过完美的纳米壳结构引起较宽的峰形状（图2b的4）一起接近于样本粒子（template particles；对于DNA改性的金纳米粒子（DNA-Au-NNP）约520nm），但是UV吸光度比DNA-Au-NNP（图2b的4的UV光谱从2倍稀释的溶液中获得）提高4倍以上。所计算的生成物的吸光系数约为7.2×10⁹M^-1cm^-1。

重要地，中间体2、中间体3和最终产品（4，5）的HRTEM图像示出，通过壳和核的表面之间的部分接触而形成纳米桥，并且纳米桥接的纳米间隙形成在核的表面上（平均间隙大小是约1.2nm；图2c的4、5、6）。以高产率（约95%）制备最终产品（Au-NNP），并且所有的粒子如图2c的4和5所示的TEM图像具有均匀的内部-纳米桥接的纳米间隙。通过TEM图像测量的平均直径是42nm±5nm（图4）。在图2c的6所示的Au-NNP的元线映射（element line mapping）示出减小的金原子区域（约1.2nm），这与图2c的5中观察到的纳米间隙一致。所制备的NNP在溶液中、大气条件（室温和0.3M的PBS）下基本上能稳定超过6个月。

比较实施例1：通过与寡核苷酸不同的物质的表面改性的纳米粒子的制备

为了理解表面改性的寡核苷酸的作用，比较实施例的制备如下。

除了使用柠檬酸盐稳定化的20nm金纳米粒子作为种子和使用10mM磷酸盐缓冲液或去离子水以外，使用与实施例1相同的方法制备纳米粒子。支链形式或纳米壳形成在金核上而没有形成内部纳米间隙（图5）。

除了BSPP（二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾）使金纳米粒子的表面改性并且得到的BSPP改性的金纳米粒子被用作种子以外，使用与实施例1相同的方法制备纳米粒子。在该情况下，壳的生长有些不规则的并且高度多分散的纳米结构被制备而没有形成内部纳米间隙（图6）。

对于这两种情况，尽管表面电荷（柠檬酸盐-金纳米粒子和BSPP-金纳米粒子的ζ电位分别是-35±3mV和-45±3mV）没有明显不同于DNA-AuNP（-25±1mV），但壳的生长图案是完全不同的。

此外，除了使用mPEG（分子量5,000）硫醇改性的金纳米粒子作为种子以外，使用与实施例1相同的方法制备纳米粒子。在该情况下，稍微扭曲的五边形结构或球形结构的纳米例粒子被制备而没有形成内部-纳米间隙（图7）。

结果显示，DNA在制备根据本发明的核-纳米间隙-壳结构的纳米粒子中是非常重要的。

比较实施例2：替代A10间隔物使用T10间隔物的纳米粒子的制备

除了替代A₁₀间隔物使用T₁₀间隔物以外，使用与实施例1相同的方法制备纳米粒子。在该情况下，在少量的前驱体存在的条件下没有观察到单独成核的纳米结构（中间体1）（图8）。如果使用更大量的前驱体，则多成核位置形成在金核的表面上并且在最终的纳米结构中没有形成内部-纳米间隙。

基于腺嘌呤比胸腺嘧啶对金表面具有更高的亲和力，当胸腺嘧啶被用作间隔物时，预期比当腺嘌呤用作间隔物时具有高约40%的DNA负载能力（（1）S.J.Hurst，A.K.R Lytton-Jean，C.A.Mirkin，Anall.Chem.78，8313（2006）；（2）Z.Wang，J.Zhang，J.M.Ekman，P.J.A.Kenis，Y.Lu，Nano Lett.DOI：10.1021/nl100675p（2010））。上述结果表明适当的DNA序列在制备NNP纳米结构中的重要性，以及内部纳米桥和纳米间隙的形成被认为是由硫醇化的DNA改性的金核的表面、核苷酸碱基的AuCl4-离子捕获效应（鸟嘌呤的胺基）（（1）A.Schimanski，E.Freisinger，A.Erxleben，B.Lippert，Inorganica Chimica Acta283，223（1998）（2）K.R.Brown，M.J.Natan，Langmuir14，726（1998）;（3）Z.Ma，S.Sui，Angew.Chem.Int.Ed.41，2176（2002））、PVP等而引起的。

实施例2：金纳米粒子、没有桥的纳米间隙粒子和二氧化硅包围的核-壳粒子的 FEM计算

为了理解Au-NNP和电磁波之间的关系，FEM（3D有限元方法被应用到该计算（Wustholz，K.L.等，Structure-activity relationships in gold nanoparticle dimersand trimers for surface-enhanced Raman spectroscopy.J.Am.Chem.Soc.132,10903-10910（2010）），以及结果与通过二氧化硅包围的Au核-Au壳纳米粒子比较（图9）。在每次计算中，四个内部-纳米桥假定形成在Au核和Au壳之间。核的半径是20nm，纳米桥是2.5nm×1.2nm的圆柱形状，间隙的大小或二氧化硅的厚度是1.2nm，并且壳的厚度是11nm。沿着x轴线入射的线性偏振平面波用于等离子体激发。EM增强的强度在图9a中示出，这表明EM增强集中位于NNP的内部间隙中并且相比入射光增强最大33倍。另一方面，在二氧化硅包围的Au核-Au壳结构中，在同样的区域中EM仅增强3.2倍。通过NNP和二氧化硅包围的粒子的EF值分别是1.2×10⁶和1.0×10²。所计算的EF值（1.2×10⁶）可以与由三个100nm金核和二氧化硅涂层构成的“L”型三聚体纳米天线结构的EF值（1.1×10⁶）相比较（Wustholz,K.L.等的Structure-activity relationships in goldnanoparticle dimers and trimers for surface-enhanced Raman spectroscopy.J.Am.Chem.Soc.132,10903-10910（2010））。在所述计算中没有考虑表面粗糙度和化学增强，这两种因素预计将增加总SERS增强。结果表明，在NNP中的高EM增强归因于核和壳之间的纳米间隙（约1.2nm）。重要地，内部-纳米桥也影响增强因子。对于没有纳米桥的Au-纳米间隙粒子的计算结果与NNP的计算结果相比较（图9c中的黑线），计算结果示出纳米桥的加入导致10²倍以上的增强。对称破裂可能是另外的场增强的来源（Sonnefraud,Y.等的Experimental realizationof subradiant,superradiant,and fano resonance in ring/disk plasmonic nanocavities.ACS Nano4,1664-1670（2010））。以三种不同的波长（514nm、632nm和785nm；图9d）研究NNP结构对入射波长的依赖性。632nm的入射波长显示出最高的信号强度。这种强烈的波长依赖性与实验结果（图10a）相符。

实施例3：拉曼染料的位置被调整的纳米粒子的制备

DNA链被用于形成用于拉曼染料改性的平台和形成内部-纳米间隙.

三种不同的具有改性的染料位置的还原的硫醇化的寡核苷酸（ROX_间隙（760μL，4.3μM）：3'-HS-（CH₂）₃-（ROX）-A₁₀-PEG₁₈-AAACTCTTTGCGCAC-5'、ROX_壳（131μL，24.9μM）：3'-HS-（CH₂）₃-A₁₀-PEG₁₈-（ROX）-AAACTCTTTGCGCAC-5'和ROX_外部（456μL，7.1μM）：3'-HS-（CH₂）₃-A₁₀-PEG₁₈-AAACTCTTTGCGCAC-（ROX）-5'）分别与柠檬酸盐-金纳米粒子（1ml，1.0nM）混合并且在室温下反应20分钟。为了获得10mM（pH=7.4）的最终磷酸盐的浓度，利用100mM磷酸盐缓冲液（对于ROX_间隙、ROX_壳和ROX_外部，分别加入176μL、113μL和146μL）调节获得的溶液，并且利用10%SDS溶液（对于ROX_间隙、ROX_壳和ROX_外部，分别加入1.9μL、1.2μL和1.6μL）调节至0.1%（wt/vol）SDS的最终浓度。得到的溶液在定轨振荡器（orbital shaker）中另外反应20分钟之后，将2M的NaCl溶液（10mM的PB，0.1%的SDS）每隔20分钟分四次加入到反应混合物（0.05M2次，0.1M2次）以调整到0.3M的NaCl（对于ROX_间隙，分别加入48.5μL、48.5μL、97μL、97μL；对于ROX_壳，分别加入31.1μL、31.1μL、62.3μL、62.3μL；对于ROX_外部，分别加入40μL、40μL、80μL、80μL）。仅加入ROX_外部序列的溶液在水浴（60°C）中加热约5分钟，以最小化在ROX分子和金表面之间的非特异相互作用。得到的溶液（胶态的）在室温下漩涡振荡1天。

然后，得到的溶液被离心分离（12,000rpm，15分钟），去除上层清液，并且使沉淀物分散在10mM的PB溶液（pH=7.4）中，该过程重复两次。最后，使得到的溶液再次分散在0.3M的PBS（1ml）中，并且用紫外-可见光光谱仪（ultraviolet visible spectrophotometer;Agilent8453光谱仪，美国）来测量粒子浓度。在使用0.1DTT发出的上层清液的荧光强度量化DNA负载数量一天之后（S.J.Hurst,A.K.R Lytton-Jean,CA Mirkin,Anal.Chem.78,8313（2006）），以下使用约100个DNA改性的金纳米粒子。

所有的拉曼实验用配备有倒置光学显微镜的纳米拉曼分光镜（Axiovert200，Zeiss）来实施（D.K.Lim，K.S.Jeon，H.M.Kim，J.M.Nam，Y.D.Suh，NatureMater.9，60（2010））。通常，在整个分析中采用50倍物镜（NA0.5）和300μW激光功率。

各样品溶液（20μL）均被置于384孔光学底板（Nunc^TM，纽约，美国）上。首先，入射波长依赖性用图4A中示出的Au-g（ROX_间隙）-AuNP探针（0.5nM）来分析。尽管在514.5nm和785nm的激发波长处没有观测到SERS信号，然而在ROX的1504cm^-1和1645cm^-1处观察到具有拉曼位移的强烈的SERS信号，其与以前报道的文献相符（（1）P.Zhang，Y.Guo，J.Am.Chem.Soc.131，3808（2009）；（2）C.L.Zavaleta等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA116，13511（2009）；（3）K.Faulds，W.E.Smith，D.Graham，Anal.Chem.76，412（2004））。在没有金壳的ROX改性的金纳米粒子的情况下，在632.8nm的激发波长处没有观测到SERS光谱。

然后，三种不同种类的染料改性的NNP纳米粒子的时间相关的拉曼结果表明，信号紧密关联于NNP结构中的染料的位置（图10B、图10C和图10D）。在Au-NNP（ROX_间隙）中观测到具有优异的再现性的最强的信号。随着染料从内部-间隙移开，拉曼信号变弱并且再现性降低（Au-NNP（ROX_间隙）>Au-NNP（ROX_壳）>Au-NNP（ROX_外部））。

实验结果确定可以从拉曼染料位于内部-纳米间隙的Au-NNP（ROX_间隙）重复地获取强SERS信号。此外，具有高度均匀性和再现性的信号被视为来源于在金核表面上均匀分布且定量控制的染料分子。可以发现，在金核和硫醇化的寡核苷酸之间的Au-S键合以及包括寡核苷酸的金壳使得能够形成非常稳定的探针并且将拉曼染料均匀地限定到非常窄的内部-纳米间隙。此外，纳米粒子在室温下保持相同的光学特征6个月以上。

实施例4：具有调整的染料用量的纳米粒子的制备

在内部-纳米间隙中的拉曼染料的数量被调整如下，相应地特征被识别并且在图11a中示意性地示出整个过程。

众所周知，如果多聚腺苷酸间隔物用于0.3M的PBS的条件，则根据纳米粒子的大小和DNA间隔物的DNA负载特性，在20nm金纳米粒子上的寡核苷酸负载的数量可以是大约100（S.J.Hurst,A.K.R.Lytton-Jean,C.A.Mirkin,Anal.Chem.78,8313（2006））。因此，四种不同比率（99：1（259μL，12.6μM：2.4μL，13.8μM），90：10（235μL，12.6μM：24μL，13.8μM），50：50（131μL，12.6μM：120μL，13.8μM）和0：100（0：760μL，4.3μM）的表面保护序列和ROX_间隙-改性的序列的混合物（表面保护序列：3'-HS-（CH₂）₃-A₁₀-PEG₁₈-AAACTCTTTGCGCAC-5'，ROX_间隙-改性的序列：3'-HS-(CH₂)₃-(ROX)-A₁₀-PEG₁₈-AAACTCTTTGCGCAC-5'））分别被键合至柠檬酸盐-金纳米粒子（柠檬酸盐-AuNP；1ml，1.0nM）并且在室温下反应20分钟。为了获得10mM（pH=7.4）的最终磷酸盐浓度，用100mM磷酸盐缓冲液（对于99：1、90：10、50：50和0：100分别加入126.1μL、125.9μL、125.1μL和176μL）调整得到的溶液，并且利用10%SDS溶液（对于99：1、90：10、50：50和0：100分别加入1.3μL、1.3μL、1.3μL和1.9μL）调整至0.1%（wt/vol）SDS的最终浓度。得到的溶液在定轨振荡器中另外反应20分钟之后，将2M的NaCl溶液（10mM的PB，0.1%的SDS）每隔20分钟分四次加入到反应混合物（0.05M两次，0.1M两次）中以调整成0.3M的NaCl（对于99：1，分别加入34.7μL、34.7μL、69.4μL、69.4μL；对于90：10，分别加入34.6μL、34.6μL、69.3μL、69.3μL、；对于50：50，分别加入34.4μL、34.4μL、68.8μL、68.8μL；对于0：100，分别加入48.5μL、48.5μL、97μL、97μL）。得到的溶液（胶态的）在室温下漩涡振荡一天。

然后，得到的溶液被离心分离（12,000rpm，15分钟），去除上层清液，并且使沉淀物分散在10mM的PB溶液（pH=7.4）中，该过程重复两次。最后，使得到的溶液再次分散在0.3M的PBS（1ml）中，并且用紫外-可见光光谱仪（Agilent8453光谱仪，美国）测量粒子浓度。在使用0.1DTT释放出的上层清液的荧光强度量化DNA负载数量一天之后（S.J.Hurst，A.K.R Lytton-Jean，CAMirkin，Anal.Chem.78，8313（2006）），结果如图11b中所示。如图11b所示，可以确定，可以按预期调整染料的量。在下文使用所制备的DNA-改性的金纳米粒子。

对于所有四种类型的浓度比例，无论寡核苷酸组合物如何，以高产率（>95%）制备Au-NNP（ROX_间隙），以及所有NNP探针在超纯水（>18MΩ）中的浓度被调节成0.5nM。

然后，针对上述NNP探针进行基于该溶液的拉曼研究（图12）。当探针上染料没有被改性时，没有检测到拉曼信号。当探针上仅一种染料被改性时，拉曼信号是小的但是可检测到（图12a，n=1）。随着每探针的染料的数量增大（从n=1到n=100），整个光谱强度定量地增大。特征光谱峰（1504cm^-1和1645cm^-1）与每探针的ROX-改性的核苷酸的数量成比例，这表明，每个探针的ROX染料的数量与拉曼信号的强度成比例（图12b）.

从上述结果可以确定，由在核和壳之间的等离子体偶联引起的强电磁增强和SERS强度可以通过调整每探针的改性的染料的数量而定量调整。

实施例5：具有改变的壳厚度的纳米粒子的制备

已知可以通过改变纳米壳的结构来改变金属纳米粒子的等离子体特征。因此，为了确定根据核-纳米间隙-壳结构中的壳的厚度的SERS信号的变化，壳厚度为12nm、15nm、20nm、25nm、30nm和35nm的粒子被制备如下。为了在DNA改性的金纳米粒子核（ROX_间隙-改性的序列：3'-HS-（CH₂）₃-（ROX）-A₁₀-PEG₁₈-AAACTCTTTGCGCAC-5'，DNA负载数量=100）周围形成金壳，上述DNA-改性的纳米粒子（100μL，在0.3M的PBS中是1nM）与50μL的1%PVP溶液混合。得到的溶液分别与33.6μL、53μL、124.8μL、302μL或432μL的盐酸羟胺溶液（10mM）混合，并且分别与33.6μL、53μL、124.8μL、302μL或432μL的氯金酸溶液（5mM）混合。反应混合物在室温下被漩涡振荡30分钟。在离心分离之后，用超纯水（18MΩ）将浓度调整成0.5nM。

所制备的纳米粒子分别在1504cm^-1和1645cm^-1下进行分析。随着壳厚度从12nm增大到25nm，SERS信号强度急剧增大。然而，在壳厚度>25nm的情况下，SERS信号开始迅速减小，并且在壳厚度是35nm的情况下，SERS信号降低到几乎接近0（图12c）。

上述结果表明，较大的纳米粒子在一定程度的SERS中示出强的电磁增强，这与公知事实相符，并且在>25nm的壳厚度中的电磁增强的减小是由间隙中检测到的拉曼染料的拉曼发射信号的减小而引起的，这是因为这些信号需要通过金属壳而待检测到。重要地，根据壳的厚度的拉曼信号变化的总趋势（图12c的黑线和红线）遵循计算的区域增强结果的趋势（图12c的蓝线）。

实施例6：纳米粒子的复用能力的测量

为了确定根据本发明的NNP纳米粒子的复用能力（multiplexing capability），使用两种类型的拉曼染料（R6G-绿色和Cy3染料），所述染料在寡核苷酸上改性并且被置于纳米间隙中。

对于所有的上述粒子使用相同的壳厚度（约11nm），并且在与对于ROX染料探针的条件相同的条件（浓度、设备等）下进行分析。对于R6G-绿色和Cy3染料的探针的指纹峰被清晰地识别；对于这两种情况确认到一致的时间相关的光谱图案。在包括ROX染料的上述三种类型的染料中，在间隙（Au-NNP（Cy3）n探针（n=100））中具有Cy3染料的NNP显示出最强的SERS信号（图13）。

上述结果起源于与其他染料相比在纳米间隙中的Cy3染料的相对大的拉曼横截面、分子柔性和R6G-绿色的非共振效应（Abmax=504nm）。因为可以使用内部-纳米间隙的大表面，故在上述间隙上可以化学改性或物理改性更多的染料，这改善了灵敏度和复用能力（图14b）。

实施例7：根据纳米粒子浓度的拉曼信号的测量和与基于荧光的检测方法的比较

进行使用Au-NNP（Cy3）₁₀₀探针的实验，以识别粒子的浓度和SERS的强度之间的关系。首先，用超纯水（18MΩ）多次洗涤纳米粒子并且粒子的浓度(1.9pM-250pM)分布用650μW的激光功率分析并且在图14a中示出。1190cm^-1、1460cm^-1和1580cm^-1中的拉曼位移的结果示出粒子的浓度和SERS的强度之间的明显关系（R²=0.9862）（图14a）。溶液中的检测极限（1.9pM）可以通过使用较强的激光功率或增大在纳米间隙中的报道分子的数量而改善。与纳米粒子（受限数量的拉曼染料可以不规则地位于纳米粒子中）之间的外部连接区域上形成的常规热点不同，根据本发明的Au-NNP可以在化学上或物理上使拉曼染料分子饱和。为了通过在溶液中使用Au-NNP而实现较高的灵敏度，使用了非共振拉曼报道分子（4,4'-联吡啶）饱和的Au-NNP。为了制备通过4,4'-联吡啶饱和的Au-NNP，首先，寡核苷酸（3'-HS-（CH₂）₃-A₁₀-PEG₁₈-AAACTCTTTGCGCAC-5'）在AuNP核表面上被改性。在将DNA-AuNP（1.0nM的500μL）与100μL的4,4'-联吡啶溶液（0.1M，超纯水）混合后，得到的溶液在室温下温和振荡的同时培养3天。通过重复离心分离（15分钟，12,000rpm）和再分散在0.3M PBS中来去除过量的4,4'-联吡啶，以及成功地形成Au壳。4,4'-联吡啶分子在Au壳形成之前物理结合在AuNP的核的表面上并且饱和。由于与Cy3相比较小的分子尺寸和较高的涂层重量，因此可以提供较高的灵敏度（图10）。观测到探针浓度和拉曼强度之间的线性关系。作为非常重要的结果，在10fM的溶液中也测量到拉曼信号（4,4'-联吡啶的指纹峰在1292cm^-1、1230cm^-1和1022cm^-1处被清楚地识别）。结果表明，粒子呈现出稳定的SERS信号和非常高的灵敏度和定量的SERS光谱。

Claims (24)

1.一种纳米粒子，包括核、包围所述核的壳、和在所述核和所述壳之间形成的纳米间隙。

2.根据权利要求1所述的纳米粒子，其中，通过纳米桥连接所述核和所述壳。

3.根据权利要求1所述的纳米粒子，其中，所述核的直径是1nm到900nm。

4.根据权利要求1所述的纳米粒子，其中，所述纳米间隙是0.01nm到100nm。

5.根据权利要求1所述的纳米粒子，其中，所述壳的厚度是1nm到900nm。

6.根据权利要求1所述的纳米粒子，其中，所述核由示出表面等离子体共振的金属构成。

7.根据权利要求1所述的纳米粒子，其中，所述壳由示出表面等离子体共振的金属构成。

8.根据权利要求1所述的纳米粒子，其中，聚合物被附接到所述核的表面。

9.根据权利要求8所述的纳米粒子，其中，所述聚合物是寡核苷酸。

10.根据权利要求9所述的纳米粒子，其中，所述寡核苷酸通过静电吸引被附接到所述核的表面。

11.根据权利要求9所述的纳米粒子，其中，所述寡核苷酸的一个末端通过共价键被附接到所述核的表面，并且所述寡核苷酸的一部分被插入所述壳中。

12.根据权利要求9所述的纳米粒子，其中，光学活性分子通过静电吸引或共价键被附接到所述寡核苷酸。

13.根据权利要求12所述的纳米粒子，其中，所述光学活性分子由选自C、H、O、N、S和它们的组合的原子构成。

14.根据权利要求1所述的纳米粒子，其中，所述纳米粒子的直径是1nm到990nm。

15.根据权利要求1所述的纳米粒子，其中，选自有机分子、无机分子或生物分子的材料通过共价键或静电吸引被附接到所述壳的表面。

16.一种用于制备包括核、包围所述核的壳、和在所述核和所述壳之间形成的纳米间隙的纳米粒子的方法，所述方法包括：

通过寡核苷酸使所述核改性；和

在所述寡核苷酸改性的核上形成所述壳。

17.一种用于制备包括核、包围所述核的壳、和在所述核和所述壳之间形成的纳米间隙的纳米粒子的方法，所述方法包括：

用聚合物涂覆所述核；和

在所涂覆的核上形成所述壳。

18.一种用于制备包括核、包围所述核的壳、和在所述核和所述壳之间形成的纳米间隙的纳米粒子的方法，所述方法包括：

通过选自C、H、O、N、S和它们的组合的原子构成的分子使所述核改性；和

在所述分子改性的核上形成所述壳。

19.一种用于检测分析物的方法，包括：

合成根据权利要求1到14中任一项所述的纳米粒子；

利用能够检测分析物的生物分子使所述纳米粒子的所述壳的表面功能化；

使所述纳米粒子暴露于含有至少一种分析物的样品；和

通过激光激发和拉曼光谱检测和识别所述至少一种分析物。

20.根据权利要求19所述的方法，其中，所述拉曼光谱是表面增强拉曼散射SERS、表面增强共振拉曼散射SERRS、超拉曼和/或相干反斯托克斯拉曼光谱CARS。

21.一种用于检测分析物的试剂盒，包括根据权利要求1到15中任一项所述的纳米粒子。

22.一种分子诊断芯片或诊断成像组合物，包括根据权利要求1到15中任一项所述的纳米粒子。

23.根据权利要求1到15中任一项所述的纳米粒子，在所述纳米粒子的内部或外部还包括选自CT造影剂、MRI造影剂、光学造影剂和超声造影剂中的一种造影剂。

24.根据权利要求1到15中任一项所述的纳米粒子，还包括选自基因、抗体和药物中的一种。

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