JP2014508916A - コア物質とシェル物質との間にナノギャップを有する単一ナノ粒子およびその調製方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図2a
Description
そこで、L.Brusら(JACS.2002)は、金属粒子二量体(dimer)の場合、2つ以上のナノ粒子の間に非常に強い電磁場のホットスポット(hot spotまたはinterstitial field)が形成され、SERS信号が増強されると報告し、電磁気的な理論計算によれば、前記ホットスポット(hot spot)によって1012程度のSERSの増強が予測される。
一方、DNAは、多様なナノ構造の合成および組立などについてつっ込んだ研究がなされてきたが、DNAの他の役割についてはほとんど研究されていない。そこで、本発明者は、DNAを用いて、2つ以上のナノ粒子を用いてナノギャップを形成する概念から脱し、コアとシェルとを含み、コアとシェルとの間にナノギャップが形成されている単一ナノ粒子を製造した。前記ナノ粒子は、特に、DNAをコアの表面に改質する場合には、コアとシェルとの間の一部分がナノブリッジを通して連結されており、コアとシェルとの間にナノギャップが形成するように調整することができ、DNAの塩基配列を調整してラマン活性分子の数、位置などを自由に調整することができ、合成が非常に簡単であり、特に、内部のナノギャップによるプラズモンカップリング(plasomonic coupling)による非常に高い信号増幅効果を示すだけでなく、高い再現性によって商品化の極めて重要な前提条件である信号の再現性と定量性の問題を克服できることを確認し、本発明に至った。
また、金ナノ粒子の表面と安定的な結合が可能な有機分子(高分子、一例として、正電荷性高分子のpoly−allyl amine、poly−L−lysineや、負電荷を有するpoly−styrene−sulfonateなどのlayer−by−layerに形成された高分子層)を形成し、追加的な金属シェルを形成することで、コアとシェルとの間にナノブリッジのないナノギャップを形成することも可能であることを確認した。
金ナノ粒子はTed Pella社(Redding、CA、USA)から購入した。すべての他の化学物質(HAuCl4・3H2O、Polyvinylpyrrolidone(K value:29−32)、NH2OH・HCl、Dithiothreitol、BSPP)はSigma−Aldrich社(St.Louis、MO、USA)から購入し、追加の精製なしに使用した。HPLCで精製された染料がコーティングされたチオール化オリゴヌクレオチドはIDT社(Coralville、IA、USA)から購入し、ホスフェートバッファー(0.17M、pH=8.0)でdithiothreitol(DTT、0.1M)を用いて還元した。還元したオリゴヌクレオチドは、desalting NAP−5 column(Sephadex G−25 medium、DNA grade)で精製した。超純水ウォーター(nanopure H2O;>18.0MO)は、Milli−Q water purificationシステムで精製し、すべての実験に使用した。TEM分析では、EDSユニット(Link oxford ISIS 310)を備えたformvar/carbonがコーティングされたcopper grid(Ted Pella社;Redding、CA、USA)およびHR−TEM(JEOL、Japan、300kV)を使用した。
Electromagnetic waveとブリッジされたAuコア−ギャップ−シェルの関連性を理解するために、所与の境界条件でtime−harmonic Maxwell equationを計算できる商業的に利用可能なFEM software COMSOLを用いて3D finite element modelを研究した。線形(x)偏光された偏波(λ=632nm)を、ブリッジされたAuコア−ギャップ−シェル粒子に入射させた。JohnsonおよびChristyの金の実験誘電定数(empirical dielectric constants)を補間法(interpolation)とともに用いた((1)P.B.Johnson、R.W.Christy、Phys.Rev.B.6、4370−4379(1972);(2)P.G.Etchegoin、E.C.Le Ru、M.Meyer、J.Chem.Phys.125、164705(2006))。
で計算した。水、空気、およびシリカの誘電定数は、それぞれewater=1.332、eair=1、eSiO2=1.462である。ギャップ部分内の空気とDNAとの混合物の有効誘電率(effective dielectric constant)は下記のMaxwell−Garnett式で決定した:
ラマンスペクトルは、反転した光学顕微鏡(inverted optical microscope)を備えたナノ−ラマン分光器(nano−Raman spectroscope;Axiovert 200、Zeiss)および独立に調整される圧電器x、yサンプルスキャナ(piezoelectric x、y sample scanner、Physik Instrumente)で測定した。514.5nmラインのアルゴンイオンレーザ(argon ion laser;Melles Griot、USA)、632.8nmラインのヘリウム−ネオンレーザ(He−Ne laser;JDSU、USA)、および785nmラインのダイオードレーザ(diode laser;B&W TEK INC.)を単一モードの光ファイバ(single−mode optical fiber)と結合された励起ソース(excitation source)として用いた。ダイクロイックミラー(dichroic mirror;Chroma Technology Corp.)で50nWから1mWの励起レーザビームを油浸顕微鏡対物レンズ(oil−immersion microscope objective(×100、1.3numerical aperture;×50、0.5numerical aperture;Zeiss)に反射させ、カバーガラススリップの上部面の回折限界スポット(diffraction−limited spot(<300nm、632.8nmのレーザ使用時×100、×50対物レンズのそれぞれに対して<3μm)に集中させた。Nanoscope IV controllerを備えたAFM(Bioscope、Digital Instruments、Veeco Metrology Group)をマイクロメカニカルステージ上に装着させた。背景ラマン信号は、液化窒素で冷凍された(−125℃)CCD(charge−coupled device)に収集した。閉鎖型(Closed−loop)piezoelectric flexure sample stage上のタッピングモード(tapping−mode)の閉鎖型(closed−loop)AFMスキャナをラマンまたはレイリースキャッタリング信号と<50nmのオーバーラップ正確度(overlap precision)を有するAFM表面形状イメージ(topographical image)およびサンプルイメージに関連付けるために使用した。レーザの焦点をAFM tipと一致させ、AFM tipに対して対称的に分散できるようにした。スキャッタリングスペクトル(scattering spectra)は、500〜2000cm−1の範囲で単一および10秒で測定した。すべてのデータは、Siからの背景信号を除去して訂正(baseline−correction)した。ラマン分析に用いられたすべての溶液は、384 well optical bottom plate(NuncTM、New York、USA)を用いた。AFM−correlated nanoRaman analysisでは、Ploy−L−lysineがコーティングされたカバーガラス(piranha−etched)を用いた。
非常に正確な位置調整能力を有するラマン染料改質プラットフォーム(Raman−dye modification platform)としてDNAストランド(strand)を用いて、内部ナノギャップを有する単一のNNPナノ粒子を下記の方法で製造した。また、下記の方法を図式的に図2aに示した。
表面改質されたオリゴヌクレオチドの役割を理解するために、下記のように比較例を製造した。
シトレート安定化された20nmの金ナノ粒子をシード(seeds)として用い、10mMのホスフェートバッファーまたは脱イオン化された水を使用することを除き、実施例1と同様の方法でナノ粒子を製造した。この場合、枝分かれした形態(branched)またはナノシェルが金コア上に形成されたが、内部ナノギャップは形成されなかった(図5)。
A10 spacerの代わりにT10 spacerを用いることを除き、実施例1と同様の方法でナノ粒子を製造した。この場合、単一核化(single−nucleated)ナノ構造(中間体1)は、少量の前駆体の存在下でほとんど観察されなかった(図8)。より多量の前駆体を用いる場合、多重核化(multiple nucleation sites)が金コアの表面に形成され、最終ナノ構造において内部ナノギャップは形成されなかった。
Au−NNPとEM波長(electromagnetic wave)の関連性を理解するために、FEM(3D finite−element−method)を計算に適用し(Wustholz、K.L.et al.Structure−activity relationships in gold nanoparticle dimers and trimers for surface−enhanced Raman spectroscopy.J.AM.Chem.Soc.132、10903−10910(2010))、前記結果を、silicaが取り囲むAu−Auコア−シェルナノ粒子と比較した(図9)。すべての計算では、4つの内部ナノブリッジがAuコアとAuシェルとの間に形成されたものとして設定した。コアの半径は20nmであり、ナノブリッジはシリンダ形態の2.5nm×1.2nm、ギャップの大きさまたはシリカの厚さは1.2nm、およびシェルの厚さは11nmである。X軸に入射した線形偏光された偏波(linearly polarized plane wave incident along the x−axis)がプラズモン励起(plasmon excitation)のために用いられた。EM強化に対する強度の結果は図9aに示した。前記結果は、EM強化がNNPの内部ギャップに集中的に位置することを示し、入射した光りより最大33倍程度効果が強化されていることを示す。反面、シリカで取り囲むAu−Auコア−シェルの構造では、同じ領域で単に3.2倍だけ強化されたことを確認することができた。NNPとシリカで取り囲む粒子のEF値はそれぞれ1.2×106、1.0×102であった。前記計算されたEF値(1.2×106)は、3つの100nmの金コアおよびシリカコーティングで構成された「L」形態のトリマーナノアンテナ構造(1.1×106)と比較できる(Wustholz、K.L.et al.Structure−activity relationships in gold nanoparticle dimers and trimers for surface−enhanced Raman spectroscopy.J.AM.Chem.Soc.132、10903−10910(2010))。前記計算では、表面の粗さと化学的強化(chemical enhancement)は考慮されておらず、前記2つの要素はSERS全体の強化を増加させることが予想される。前記結果は、NNPでの高いEM強化は、コアとシェルのナノギャップ(〜1.2nm)に起因するものであることを示す。重要なことに、内部ナノブリッジも強化要素に影響を及ぼす。ブリッジのないAu−ナノギャップ粒子に対する計算結果がNNPと比較された(図9cの黒色ライン)。計算結果は、このようなナノブリッジの追加が102倍以上の強化を誘導することを示す。Symmetry breaking could be a possible origin of this additional field enhancement41.(Sonnefraud、Y.et al.Experimental realization of subradiant、superradiant、and fano resonance in ring/disk plasmonic nanocavities.ACS Nano 4、1664−1670(2010))。NNP構造の入射波長に対する依存性を3つの種類の波長(514nm、632nm、および785nm;図9d)で調べた。ここで、632nmの入射波長は最も高い信号強度を示した。このような強い波長依存性は実験結果(図10a)とよく一致した。
DNAストランドを、内部ナノギャップの形成だけでなく、ラマン染料改質のためのプラットフォームの形成のために用いた。
内部ナノギャップ内のラマン染料の数を下記のような方法で調整し、これによる特性を確認し、全体的な過程を図式的に図11aに示した。
ポリA spacerが0.3MのPBS条件で用いられる場合、ナノ粒子の大きさおよびDNAspacerのDNA loading特性に応じて、20nmの金ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドのloading数が約100個となり得ることが知られている(S.J.Hurst、A.K.R.Lytton−Jean、C.A.Mirkin、Anal.Chem.78、8313(2006))。そこで、表面保護(surface protecting)配列およびROXgap−改質された配列混合物(表面保護配列:3’−HS−(CH2)3−A10−PEG18−AAACTCTTTGCGCAC−5’、ROXgap−改質された配列:3’−HS−(CH2)3−(ROX)−A10−PEG18−AAACTCTTTGCGCAC−5’)に対して、4つの種類の異なる割合(99:1(259μL、12.6μM:2.4μL、13.8μM)、90:10(235μL、12.6μM:24μL、13.8μM)、50:50(131μL、12.6μM:120μL、13.8μM)および0:100(0:760μL、4.3μM))でシトレート−金ナノ粒子(citrate−AuNPs;1ml、1.0nM)にそれぞれ接合させ、20分間、常温で反応させた。前記溶液を10mM(pH7.4)の最終ホスフェート濃度として得るために、100mMのホスフェートバッファー(99:1、90:10、50:50、0:100に対して、それぞれ126.1μL、125.9μL、125.1μL、176μL添加)でそれぞれ調整し、10%SDS溶液(99:1、90:10、50:50、0:100に対して、それぞれ1.3μL、1.3μL、1.3μL、1.9μL添加)で0.1%(wt/vol)SDSの最終濃度に調整した。前記溶液を20分間オービタルシェーカ(orbital shaker)でさらに反応させた後、20分ごとに2MのNaCl(10mM PB、0.1%SDS)溶液を4回に分けて添加(0.05M2回、0.1M2回)して0.3MのNaClに合わせた(99:1に対してそれぞれ34.7μL、34.7μL、69.4μL、69.4μL添加;90:10に対してそれぞれ34.6μL、34.6μL、69.3μL、69.3μL添加;50:50に対してそれぞれ34.4μL、34.4μL、68.8μL、68.8μL添加;0:100に対してそれぞれ48.5μL、48.5μL、97μL、97μL添加)。前記溶液(コロイド)を1日間常温でvortexした。
次に、前記溶液を遠心分離し(12,000rpm、15分)、上澄液を除去した後、沈殿物を再度10mMのPB溶液(pH7.4)に分散させ、この過程を2回繰り返した。最終的に、溶液を0.3MのPBS(1ml)に再分散させた後、粒子濃度を紫外線−可視光線分光計(ultraviolet visible spectrophotometer;Agilent 8453 spectrophotometer、USA)で測定した。1日間、0.1DTTによって放出された上澄液の蛍光光度を用いてDNA loading数を定量化した後(S.J.Hurst、A.K.R.Lytton−Jean、C.A.Mirkin、Anal.Chem.78、8313(2006))、その結果を図11bに示した。図11bに示されるように、意図したとおりに染料の量を調整できることを確認することができた。前記製造されたDNA−改質された金ナノ粒子を下記で用いた。
ナノシェルの構造を変化させると、金属ナノ粒子のプラズモン(plasmonic)特性を変化させ得ることが知られている。これにより、コア−ナノギャップ−シェル構造において、シェルの厚さに応じたSERS信号の変化を確認するために、12、15、20、25、30および35nmのシェルの厚さを有する粒子を次のように製造した。DNA−改質された金ナノ粒子コア(ROXgap−改質された配列:3’−HS−(CH2)3−(ROX)−A10−PEG18−AAACTCTTTGCGCAC−5’、DNA loading数=100)の周囲に金シェルを形成するために、前記DNA−改質された金ナノ粒子(100μL、0.3M PBSで1nM)を50μL of 1%PVP溶液と混合した。前記溶液を33.6μL、53μL、124.8μL、302μLまたは432μLのヒドロキシアミンヒドロクロリド(hydroxylamine hydrochloride)溶液(10mM)と混合させ、それぞれ33.6μL、53μL、124.8μL、302μLまたは432μLのクロロ金酸(chloroauric acid)溶液(5mM)と混合させた。前記反応混合物を30分間常温でvortexした。遠心分離後、濃度を超純水ウォーター(18MO)で0.5nmに調整した。
本発明にかかるNNPナノ構造の多重検知能力(multiplexing capability)を確認するために、2つの種類のラマン染料(R6G−greenおよびCy3dyes)を用い、オリゴヌクレオチドに前記染料を改質させて染料をナノギャップに位置させた。
粒子の濃度とSERS強度との関係を確認するために、Au−NNP(Cy3)100 probesを用いて下記の実験を行った。まず、ナノ粒子を超純水ウォーター(18MO)で複数回洗浄し、粒子濃度分布(1.9pM−250pM)を650μWのlaser powerで分析して図14aに示した。1190、1460および1580cm−1で現れたラマンシフトの結果は、粒子濃度とSERS強度との非常に優れた関連性(R2=0.9862)を示した(図14a)。溶液での前記検出限界(1.9pM)は、より強いlaser powerを用いるか、またはナノギャップに位置するレポーター分子の数を増加させることによって改善できる。従来制限されていた数のラマン染料が不規則的に位置し得るナノ粒子間の外部連結部分に形成されたホットスポットとは異なり、本発明にかかるAu−NNPは、化学的または物理的にラマン染料分子を飽和させることができる。溶液状態でAu−NNPを用いてより高い感度を達成するために、非共鳴ラマンレポーター分子(4,4’−ジピリジル)で飽和されたAu−NNPを用いた。4,4’−ジピリジルで飽和されたAu−NNPを製造するために、まず、オリゴヌクレオチド(3’−HS−(CH2)3−A10−PEG18−AAACTCTTTGCGCAC−5’)をAuNPコアの表面に改質させた。DNA−AuNPs(500μL of 1.0nM)を100μLの4,4□−ジピリジル溶液(0.1M、超純水ウォーター)と混合し、混合溶液を常温で徐々に振とうしながら(gentle shaking)、3日間インキュベーションした。4,4’−ジピリジルの超過分は繰り返し遠心分離(15分、12,000rpm)および0.3MのPBSに再分散によって除去し、Auシェルの形成に成功した。4,4’−ジピリジル分子がAuシェルの形成前に、AuNPのコアの表面に物理吸着して飽和された。Cy3より分子の大きさが小さく高い付着量に起因して、より高い感度を提供することができる(図10)。プローブの濃度とラマン強度との間の線形関係が観察された。極めて重要な結果として、10fMの溶液でもラマン信号が測定された(4,4’−ジピリジルの指紋ピークは1292cm−1、1230cm−1、および1022cm−1で明確に確認された)。このような結果から、前記粒子が安定的なSERS信号を示し、非常に高い感度および定量的なSERSスペクトルを示すことを確認することができる。
Claims (24)
- コア(core)および前記コアを取り囲むシェル(shell)を含み、前記コアとシェルとの間にナノギャップが形成された、ナノ粒子。
- 前記コアとシェルとがナノブリッジで連結されたことを特徴とする、請求項1記載のナノ粒子。
- 前記コアの直径は1nm〜900nmであることを特徴とする、請求項1記載のナノ粒子。
- 前記ナノギャップは0.01nm〜100nmであることを特徴とする、請求項1記載のナノ粒子。
- 前記シェルの厚さは1nm〜900nmであることを特徴とする、請求項1記載のナノ粒子。
- 前記コアは表面プラズモン共鳴を示す金属からなることを特徴とする、請求項1記載のナノ粒子。
- 前記シェルは表面プラズモン共鳴を示す金属からなることを特徴とする、請求項1記載のナノ粒子。
- 前記コアの表面に高分子が結合されたことを特徴とする、請求項1記載のナノ粒子。
- 前記高分子はオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項8記載のナノ粒子。
- 前記コアの表面にオリゴヌクレオチドが静電気的引力で付着したことを特徴とする、請求項9記載のナノ粒子。
- 前記コアの表面に前記オリゴヌクレオチドの一方の末端が共有結合で付着し、前記オリゴヌクレオチドの一部は前記シェルに挿入されたことを特徴とする、請求項9記載のナノ粒子。
- 前記オリゴヌクレオチドに光学活性分子が静電気的引力、共有結合で付着していることを特徴とする、請求項9記載のナノ粒子。
- 前記光学活性分子はC、H、O、N、Sおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される原子で構成された分子であることを特徴とする、請求項12記載のナノ粒子。
- 前記ナノ粒子の直径は1nm〜990nmであることを特徴とする、請求項1記載のナノ粒子。
- 前記シェルの表面に有機分子、無機分子または生体分子からなる物質が共有結合または静電気的引力で結合されたことを特徴とする、請求項1記載のナノ粒子。
- コアにオリゴヌクレオチドを改質させるステップと、
前記オリゴヌクレオチドが改質されたコアにシェルを形成するステップとを含む、コアとシェルとの間にナノギャップが形成されたナノ粒子の製造方法。 - コアに高分子をコーティングするステップと、
前記コーティングされたコアにシェルを形成するステップとを含む、コアとシェルとの間にナノギャップが形成されたナノ粒子の製造方法。 - コアにC、H、O、N、Sおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される原子で構成された分子を改質させるステップと、
前記分子が改質されたコアにシェルを形成するステップとを含む、コアとシェルとの間にナノギャップが形成されたナノ粒子の製造方法。 - 請求項1ないし14のいずれか1項記載のナノ粒子を製造するステップと、
前記ナノ粒子のシェルの表面に検出しようとする分析物を認識可能なバイオ分子を機能化するステップと、
前記ナノ粒子を1つ以上の分析物を含むサンプルに露出させるステップと、
レーザ励起(excitation)およびラマン分光法を利用して1つ以上の分析物を検出および確認するステップとを含む、分析物を検出する方法。 - 前記ラマン分光法が表面増強ラマン分光法(SERS)、表面増強共鳴ラマン分光法(SERRS)ハイパーラマンおよび/または非干渉性反ストークスラマン分光法(CARS)であることを特徴とする、請求項19記載の方法。
- 請求項1ないし15のいずれか1項記載のナノ粒子を含む、分析物検出用キット。
- 請求項1ないし15のいずれか1項記載のナノ粒子を含む、分子診断チップまたは映像診断用組成物。
- 請求項1ないし15のいずれか1項記載のナノ粒子と、前記ナノ粒子の内部または外部にCT造影剤、MRI造影剤、光学造影剤および超音波造影剤からなる群より選択されるいずれか1つとをさらに含む、ナノ粒子。
- 請求項1ないし15のいずれか1項記載のナノ粒子と、遺伝子、抗体および薬物からなる群より選択されるいずれか1つとをさらに含む、ナノ粒子。
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