KR101597894B1 - 금속증강형광용 코어-쉘 나노 복합체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 표면과 수직 방향으로 일정한 간격을 갖도록 위치한 형광체를 포함하는 코어-쉘 나노 복합체, 이의 제조방법 및 금속증강형광용 탐침으로서의 용도에 관한 것이다.

Description

금속증강형광용 코어-쉘 나노 복합체{Core-shell nanocomplex for metal-enhanced fluorescence}
본 발명은 표면과 수직 방향으로 일정한 간격을 갖도록 위치한 형광체를 포함하는 코어-쉘 나노 복합체, 이의 제조방법 및 금속증강형광용 탐침으로서의 용도에 관한 것이다.
형광은 고도로 민감한 기법임에도 불구하고, 단일분자가 검출될 수 있는 곳에서 감소된 검출한계에 대한 현저한 드라이브가 여전히 존재한다. 검출한계는 일반적으로 형광체의 양자수율, 시료의 자가형광 및 형광체의 광안정성에 의해 제한된다. 따라서, 형광체의 광학적 성질을 양호하게 개질하고 광물리적 제약(constraint)을 완화하기 위하여 금속성 나노구조물의 사용이 급증하고 있다. 형광체-금속 상호작용의 사용은 Geddes 박사에 의해 금속-증강 형광(metal-enhanced fluorescence; MEF)으로 이름붙여졌다. MEF의 사용은 증가된 형광체의 검출능 및 광안정성, 향상된 단백질, DNA/RNA 검출, 과 표지된 단백질의 자기-소광된 형광의 방출, 향상된 파장-비율성(wavelength-ratiometric) 감지(sensing) 및 증폭된 에세이 검출에 대한 금속성 표면의 적용을 포함한다. Geddes 박사 실험실은 또한 은 아일랜드, 은 콜로이드, 은 나노삼각형, 은 나노로드 및 프랙탈-유사(fractal-like) 은처리된 표면과 같은 금속-증강 형광을 위한 많은 나노구조화된 표면을 개발하였다. 광 및 전기화학적으로 유리, 플라스틱 상에 및 심지어 전극을 사용하는 은 침적(deposition)을 위한 몇가지 모드가 개발되었다. 예컨대, 형광체-단백질을 유리 표면 및 은 처리된 표면에 표지하고 상기 2가지 표면에 걸쳐 레이저 여기원(laser excitation source)을 동일하게 조사하고 형광을 관찰하면, 유리 표면에 비해 은 처리된 표면에서 향상된 형광을 관찰할 수 있다. 이때, 향상된 형광은 방출필터(emission filter)를 통해 촬영되는 사진과 같이 거울화된 표면으로부터 반사되는 광자에 기인하는 것이 아니라, 실제로는 플라즈몬-커플링과 증폭에 기인한다. 잠재적으로 수백만 배까지 형광신호를 증가시킬 수 있으며, 이러한 형광 신호 증폭 능력은 광자 흐름(photon flux) 및 검출가능성(detectability)이 주된 관심인 생물과학 및 현미경학에 적용하기에 적합하다.
플라즈몬성 나노구조물은 나노안테나(nanoantenna), 표면증강라만산란(surface-enhanced Raman scattering; SERS) 및 금속증강형광(metal-enhanced fluorescence; MEF)에 응용될 수 있는, 설계가능하고(designable) 유용한 광학적 성질로 인해 많은 관심을 받고 있다. 특히, 플라즈몬성 금속 나노구조물은 형광체가 표면 상에 적절하게 위치되었을 때 형광신호를 향상시킬 수 있으며, 더 높은 신호세기를 나타내는 형광체 탐침으로서 잠재력을 갖는다. MEF 나노탐침의 개발은, 대부분의 종래 검출 플랫폼이 형광을 기반으로 하므로, 생물학적 연구 및 의학을 포함한 많은 연구 및 응용분야에 즉시 유용하게 사용될 수 있다. 그러나, 이들 구조의 상용화를 위해서는 몇 가지 중요한 문제가 있다. MEF 기전에 대한 보다 깊고 정확한 이해를 필요로 하며, 보다 높은 구조적 재현성 및 합성수율을 갖는 보다 나은 MEF 나노구조물의 합성방법이 고안되어야 한다. 문헌적으로, 단일분자 측정에 의해 ~103까지의 MEF 증강인자가 보고되었다. 그러나, 단일 또는 수개 분자 측정에 기반한 결과는 벌크 시료를 이용한 실제 응용에 있어서 다소 오독(misleading)의 가능성이 있으며, 용액시료에서 정준평균(ensemble-average) MEF 증강인자는 단지 약 50배 수준에 그친다. 형광신호는 형광체와 금속표면 간의 거리에 따라 소광(quenched)되거나 증강(enhanced)될 수 있으므로 MEF 탐침으로부터 안정하고 정량적인 신호세기를 얻는 것 또한 중요하다. 또한, 이들 MEF 탐침은 다양한 여기 레이저 파장, 폭넓은 리간드 및 다양한 완충액 조건을 포함하는 다양한 조건 하에서 유용하게 사용될 수 있도록 안정적이어야 한다.
이에 본 발명자들은 우수한 금속증강형광 효과를 나타내면서도 안정적인 신호를 제공할 수 있는 신규한 구조의 탐침을 고안하고자 예의 연구노력한 결과, 제1 금속 나노로드의 표면에 일 말단에 형광체 표지된 일정한 길이의 폴리뉴클레오티드를 다른 말단으로부터 결합시키고, 상기 금속 나노로드 상에 제2금속 쉘을 도입하되, 상기 제2금속 쉘로부터 소정의 거리만큼 이격되어 형광체가 노출되도록 도입되는 제2금속 쉘의 두께를 조절하여 제조한 코어-쉘 구조의 나노 복합체가 금속증강형광에 의해 현저히 증가된 형광신호를 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 상기 나노 복합체에 실리카 쉘을 도입하여 노출된 형광체를 포매시켜 고정한 복합체는 신호의 변동이 현저히 감소하여 보다 재현성 높은 신호를 제공할 수 있으며, 상기 실리카 쉘이 추가로 형광체를 포함하는 경우 추가적인 형광세기 증가를 나타낼 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 표면과 수직 방향으로 일정한 간격을 갖도록 위치한 형광체를 포함하는 코어-쉘 나노 복합체에 있어서, 특정 형상비(aspect ratio)를 갖는 제1금속 나노로드; 일 말단을 통해 상기 제1금속 나노로드 상에 결합되고 타 말단에 형광체가 결합된 일정한 길이의 폴리뉴클레오티드; 및 상기 폴리뉴클레오티드가 결합된 제1금속 나노로드 상에 상기 형광체와 일정한 간격으로 이격되도록 두께를 조절하여 형성된 제2금속 쉘을 포함하는 코어-쉘 나노 복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 표면과 수직 방향으로 일정한 간격을 갖도록 위치한 형광체를 포함하는 코어-쉘 나노 복합체의 제조방법에 있어서, 제1금속 나노로드를 준비하는 제1단계; 상기 제1금속 나노로드 상에 일 말단에 형광체가 결합된 일정한 길이의 폴리뉴클레오티드를 결합시키는 제2단계; 및 상기 폴리뉴클레오티드가 결합된 제1금속 나노로드 상에 상기 형광체와 일정한 간격으로 이격되도록 두께를 조절하여 제2금속 쉘을 형성하는 제3단계를 포함하는 코어-쉘 나노 복합체의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 코어-쉘 나노 복합체를 함유한, 금속증강형광용 탐침을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 표면과 수직 방향으로 일정한 간격을 갖도록 위치한 형광체를 포함하는 코어-쉘 나노 복합체에 있어서, 제1금속 나노입자; 일 말단을 통해 상기 제1금속 나노입자 상에 결합되고 타 말단에 형광체가 결합된 일정한 길이의 링커; 및 상기 링커가 결합된 제1금속 나노입자 상에 상기 형광체와 일정한 간격으로 이격되도록 두께를 조절하여 형성된 제2금속 쉘을 포함하는 코어-쉘 나노 복합체를 제공한다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 표면과 수직 방향으로 일정한 간격을 갖도록 위치한 형광체를 포함하는 코어-쉘 나노 복합체의 제조방법에 있어서, 제1금속 나노입자를 준비하는 제1단계; 상기 제1금속 나노입자 상에 일 말단에 형광체가 결합된 일정한 길이의 링커를 결합시키는 제2단계; 및 상기 링커가 결합된 제1금속 나노입자 상에 상기 형광체와 일정한 간격으로 이격되도록 두께를 조절하여 제2금속 쉘을 형성하는 제3단계를 포함하는 코어-쉘 나노 복합체의 제조방법을 제공한다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 제1양태에 따른 코어-쉘 나노 복합체를 함유한, 금속증강형광용 탐침을 제공한다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명에 따른 코어-쉘 나노 복합체는 금속 표면과 수직 방향으로 일정한 간격을 갖도록 위치한 형광체를 포함하여 현저한 금속증강형광(metal-enhanced fluorescence) 효과를 나타낼 수 있는 것이 특징이다. 이때, 금속증강형광 효과가 극대화될 수 있도록 1) 도입되는 금속 쉘의 재질을 적절히 선택하고, 2) 상기 금속 쉘의 두께를 조절하여 금속 쉘을 도입하는 것이 중요하다. 상기 금속 쉘이 너무 두껍게 형성되어 형광체와 금속 표면이 접촉하거나 너무 가까운 경우, 여기 에너지가 공명에 의한 형광 증강을 유도하기보다 전도되어 버릴 수 있다.
"금속증강형광(metal-enhanced fluorescence; MEF)"은 형광체와 이에 근접하게 위치한 금속의 상호작용에 의해 형광체 자체에 의한 것에 비해 형광신호의 세기가 향상되는 현상을 지칭하는 것이다. 구체적으로, 금속증강형광 현상은 형광체의 여기상태와 금속 표면의 유도된 표면 플라즈몬 간의 상호작용의 결과로서 나타날 수 있다. 상기 금속증강형광은 일반적인 형광과 비교하여 1) 증가된 형광방출 효율성, 2) 증가된 검출 민감성, 3) 형광물질의 광표백현상(photobleaching) 방지 및 4) 내재 및 외재발색단(chromophore)을 비롯한 거의 모든 분자에 대한 적용 가능성 등의 장점을 갖는다. 일반적으로 금속증강형광에 적합한 금속은 높은 자유 전자 밀도를 갖는 금속들일 수 있다. 또한 연속적인 금속성 박막은 상기 박막 표면으로부터 100 nm 이내에 형광체가 위치할 때, 증강된 형광방출을 나타낼 수 있다.
바람직하게, 상기 제1금속 나노입자는 1.2 내지 10의 형상비(aspect ratio)를 갖는 나노로드일 수 있다. 상기 형상비가 1.2 미만인 경우, 금속 나노입자의 산란 효율이 감소하여 원하는 만큼의 금속증강형광 효과를 나타내지 못할 수 있으며, 10을 초과하는 경우에는 제2금속 쉘 형성을 제어하기 어려울 수 있다.
바람직하게, 상기 제1금속 및 제2금속은 각각 독립적으로 금, 은, 구리, 팔라듐 또는 백금일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 금속들은 당업계에 잘 알려진 금속증강형광 효과를 갖는 물질을 예시한 것으로서, 이외에도 금속증강형광 효과를 나타낼 수 있는 금속을 제한없이 사용할 수 있다. 바람직하게, 상기 제1금속 및 제2금속은 서로 동일 또는 유사한 격자변수(lattice parameter)를 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 제1금속 및 제2금속은 격자변수의 비가 1:1.4 내지 1.4:1인 것을 선택할 수 있다. 본 발명의 목적상 제2금속 쉘은 제1금속 코어 상에 균일하게 일정한 두께로 도입되어 형광체가 상기 제2금속 표면으로부터 소정의 거리로 이격되어 위치하도록 하는 것이 바람직하다. 따라서, 상기 제1금속 및 제2금속은 서로 동일 또는 유사한 격자변수를 갖는 것을 선택하여 제1금속 나노로드 상에 동일한 결정형태로 제2금속쉘이 일정한 두께로 도입되도록 할 수 있다. 예컨대, 현재 당업계에서 금속증강형광 연구에 가장 널리 사용되는 금속은 은이다. 따라서, 은을 금속증강형광을 나타내기 위한 제2금속 쉘로써 도입할 경우, 금을 제1금속 나노입자의 소재로 사용하는 것이 바람직하다. 금은 반응성이 뛰어난 금속이므로, 일 말단에 형광체가 결합된 일정한 길이의 폴리뉴클레오티드를 도입하기에도 적합하며, 은과 유사한 격자변수를 가지므로 균일하게 은 쉘을 도입할 수 있는 장점이 있다.
제1금속 나노로드로부터 일정한 거리에 형광체가 위치하도록 하기 위하여, 상기 링커로는 폴리뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 예로는 단일가닥 또는 이중가닥 DNA, 또는 RNA가 있다. 보다 바람직하게 상기 링커는 DNA일 수 있다. 상기 제1금속 나노로드로부터 일정한 거리에 형광체를 위치시키는 목적을 달성하기 위해 이론적으로는 일정한 길이를 갖는 한 고분자를 사용할 수도 있으나, 일반적으로 고분자는 일정한 평균 분자량을 갖는 서로 상이한 분자량 즉, 길이의 개별 고분자 가닥의 혼합물이므로 실제로 일정한 길이를 갖는 고분자 가닥을 순수하게 분리하는 것은 용이하지 않다. 한편, 폴리뉴클레오티드는 이를 구성하는 뉴클레오티드의 숫자를 조절하면서 합성함으로써 일정한 길이의 폴리뉴클레오티드를 용이하게 수득할 수 있다. 또한, DNA 및 RNA와 같은 폴리뉴클레오티드는 상보적인 결합을 갖는 또 다른 가닥과 결합하여 이중가닥을 형성할 수 있다. 이러한 경우 길이 제어가 보다 용이한 보다 강직한 골격을 제공할 수 있다. 한편, 수 내지 수십 뉴클레오티드로 구성된 폴리뉴클레오티드는 단일가닥이라 하더라도 임의로 구부러지거나 하지 않고 다소 경직한 막대형태로 존재할 수 있다. 특히, 비교적 쉽게 분해되므로 특별한 반응조건(RNase free)을 요구하는 RNA와 달리 DNA의 경우 일반적인 반응조건에서도 안정적이므로 상기 본 발명의 목적인 일정한 거리를 갖도록 형광체를 도입하는데에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
바람직하게, 상기 코어-쉘 나노 복합체의 외부를 추가적으로 실리카 쉘로 코팅함으로써, 제2금속 쉘 표면으로부터 일정한 거리만큼 이격되어 외부로 노출된 형광체를 포매시켜 고정함으로써 보다 안정한 형광신호를 얻을 수 있다. 또한 추가적인 형광신호의 증강효과를 나타내기 위해서는 상기 실리카 쉘은 형광체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 금 나노로드 상에 일 말단에는 형광체로서 알렉사 플루오르 546 표지되고 다른 말단은 티올화된 약 10 nm 길이의 DNA를 결합시킨 후 은 쉘을 일정한 두께로 도입한 코어-쉘 나노 복합체는 상기 형광체가 은 쉘 표면으로부터 소정의 거리에 위치함으로써 금속증강형광 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다(도 6 및 7). 나아가 상기 코어-쉘 나노 복합체 상에 추가적인 실리카 쉘을 도입하여 상기 노출된 형광체를 실리카 쉘 내에 포매시켜 해당 위치에 고정시킴으로써 보다 안정적인 즉, 신호의 변동이 적은 증강된 형광신호를 나타낼 수 있음을 확인하였다(도 8).
나아가 본 발명에 따른 코어-쉘 나노 복합체를 함유한, 금속증강형광용 탐침은 감도가 우수하여 단분자 검출도 가능하므로 표적물질 또는 표적물질에 특이적으로 결합하는 검출물질에 표지하여 표적 체외 질병 진단 바이오센서, 세포 내 생체 물질의 추적, 생체 내 이미징, 태양전지, 약물 스크리닝, 유전자 서열분석 등에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 표면과 수직 방향으로 일정한 간격을 갖도록 위치한 형광체를 포함하는 코어-쉘 나노 복합체는 금속증강형광을 극대화할 수 있도록 표면으로부터 일정한 거리만큼 이격된 위치에 형광체가 위치할 수 있도록 폴리뉴클레오티드를 이용하고, 균일한 두께로 쉘을 도입하고 도입되는 쉘의 두께를 서브 nm 수준에서 제어할 수 있는, 유사한 격자변수를 갖는 2종의 금속을 선택함으로써 우수한 금속증강형광 효과를 나타내면서도 안정적인 신호를 제공할 수 있는 신규한 구조의 탐침을 제공할 수 있고, 추가로 실리카 쉘을 도입함으로써 형광신호를 안정화할 수 있으므로, 형광을 이용한 분석에 검출 민감도를 현저히 향상시키기 위한 탐침으로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 금속-증강형광(metal-enhanced fluorescence; MEF) 응용을 위한 형광 표지된 DNA로 수식된 Au-Ag 코어-쉘 직사각 나노평행육면체(fluorescent DNA-modified Au-Ag core-shell rectangular nanoparallelepipes) (f-RNPs) (a) 및 그 표면이 추가로 실리카 코팅된 RNPs(Si-RNPs) (b)의 합성방법 및 금속-증강 형광 메커니즘을 개략적으로 나타낸 도이다.
도 2는 전-합성된(pre-synthesized) AuNR의 TEM 이미지 및 이의 계산된 물리적 및 광학적 성질을 나타낸 도이다. 규모(dimension) 및 광학적 특성을 충분히 측정하기 위하여 전-합성된 AuNR을 UV-visible 분광법, TEM 및 ICP-AES로 분석하였다.
도 3은 AuNR 표면 상에서 알렉사 플루오르™ 546 수식된 티올화된 올리고뉴클레오티드의 정량분석 결과를 나타낸 도이다. 평균적으로, 293.4개의 알렉사 플루오르™ 546 수식된 티올화된 올리고뉴클레오티드가 하나의 AuNR 표면 상에 결합되었다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 일련의 f-RNPs(f-RNP 1 내지 6)의 TEM 이미지 (a), UV-visible 스펙트럼 (c), TEM-기반 통계적 규모분석 (d), 및 f-RNP 5의 52°-기울어진(tilited) SEM 이미지 (b)를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 f-RNP 5의 원소맵핑 이미지(elemental mapping images) (a-d), 암시야(dark-field) TEM 이미지 (e) 및 HR-TEM 및 선택된 영역 전자 회절(selected area electron diffraction)(삽입도) 이미지 (f)를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 일련의 f-RNPs(f-RNP 1 내지 6)의 적분된(integrated) 형광세기 (a) 및 쉘 두께 및 PL 증강 (b)을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 일련의 f-RNPs(f-RNP 1 내지 6) 및 자유 알렉사 플루오르™ 546의 형광활성을 나타낸 도이다. f-RNPs의 농도는 0.0728 nM이다. 가장 높은 형광활성은 f-RNP 5에서 나타났다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 합성된 실리카 코팅된 f-RNPs의 TEM 이미지 (a) 및 f-RNP 5 및 실리카 코팅된 f-RNP 5(Si-f-RNP 5)의 적분된(integrated) 형광세기 (b)를 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 f-RNP의 표면 상에서의 실리카 코팅 과정을 개략적으로 나타낸 도이다. 형광 실리카 쉘은 각 f-RNP가 더 높은 형광체 적재율(fluorophore loading capacity)뿐만 아니라 고정된 형광체 위치(fixed fluorophore location) 및 향상된 안정성을 갖도록 한다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 형광 실리카로 코팅된 f-RNPs의 TEM 이미지를 나타낸 도이다. 실리카 코팅된 나노 로드의 총 크기는 약 150 nm이고 나노바의 형태 및 크기는 실리카 코팅 과정동안 유지되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<물질>
모든 화학시약(HAuCl4·3H2O, CTAB, NaBH4, L-아스코르브산(L-ascorbic acid), AgNO3, SDS(sodium-dodecyl sulfate), 염화나트륨(NaCl), 디티오트레이톨(dithiothreitol; DTT), CTAC, EtOH, MeOH, 3-아미노프로필트리에톡시실란(3-aminopropyltriethoxysilane; APTES), 디메틸아민(dimethylamine), 테트라에틸 오르소실리케이트(tetraethyl orthosilicate))은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며, 추가적인 정제없이 사용하였다. HPLC-정제된 염료-부호화된(coded) 티올화된(thiolated) 올리고뉴클레오티드를 IDT Inc.(Coralville, IA, USA)로부터 구입하였고 인산완충액(170 mM, pH = 8.0)에 녹인 디티오트레이톨(0.1M)을 사용하여 환원시켰다. 이후, 탈염 NAP-5 컬럼(desalting NAP-5 column, Sephadex G-25 medium, DNA grade)을 통해 환원된 올리고뉴클레오티드를 정제하였다. 밀리-정수시스템(Milli-Q water purification system)을 이용하여 정제한 NANOpure H2O(>18.0 MΩ)를 모든 실험에 사용하였다. 알렉사플루오르™ 카르복시산, 숙신이미딜 에스테르 형광체(alexa Fluor™ carboxylic acid, succinimidyl ester fluorophores)는 Molecular Probes(Eugene, Oregon, USA)로부터 구입하였다. 원소맵핑(elemental mapping) 및 격자분석(lattice analysis)을 위해 폼바/탄소 코팅된 구리 격자(formvar/carbon coated copper gird, Ted Pella, Inc. Redding, CA, USA) 및 에너지 분산 분광기(energy dispersive spectroscopy; EDS) 유닛(EDAX)을 구비한 HR-TEM(JEM ARM 200F, JEOL, Japan, 200 kV, FEI Company, Hillsboro, Oregon, USA)를 사용하였으며, 다른 TEM 이미지는 JEM-2100(JEOL, Japan, 200 kV)를 이용하여 획득하였다. 제조한 금 나노로드(gold nanorods; AuNRs)의 질량농도(mass concentration) 측정에는 유도결합플라즈마방출분광기(inductively coupled plasma emission spectrometer; ICP-ES, ICPS-7510, Shimadzu, Japan)를, 나노드롭 측정에는 나노드롭 3300 형광분광기(NanoDrop 3300 Fluorospectrometer)를 사용하였으며, 장방출주사전자현미경(field emission scanning electron microscope; FE-SEM, Helios 650, FEI, USA)을 이용하여 형성된 금 나노로드의 형태를 관찰하였다.
실시예 1: 금 나노로드(gold nanorods; AuNRs)의 제조
공지의 시드매개법(seed-mediated method)을 약간 변형하여 약 4.0의 형상비(aspect ratio) 값을 갖는 AuNRs를 제조하였다. 구체적으로, 시드는 0.5 mM HAuCl4·3H2O 용액 5 ㎖를 0.2 M CTAB 5 ㎖와 혼합하여 제조하고, 빙냉의 0.01 M NaBH4 용액 600 ㎕를 빠르게 첨가하였다. 시드용액은 상기 환원단계 2시간 후에 사용하였다. 0.5 mM HAuCl4·3H2O 용액 5 ㎖를 0.2 M CTAB 용액 5 ㎖와 혼합하고, AgNO3 용액 200 ㎕를 첨가한 후, 78 mM L-아스코르브산 70 ㎕를 첨가하였다. 조심스럽게 혼합한 후, 미리 준비한 시드용액 12 ㎕를 첨가하고 4시간 이상 인큐베이션하여 AuNRs를 수득하였다. 위와 같이 제조한 AuNRs를 TEM, UV-Vis 분광법 및 ICP-AES 분석법으로 확인하였다. 202개 AuNRs의 크기와 형상비를 이미지J 소프트웨어로 분석하였다. AuNRs의 크기는 50.32(±4.26) nm × 12.81(±0.94) nm이고, 형상비 값은 3.95(±0.42)였다. 이는 520 nm에서 계산된 몰흡광계수(mole extinction coefficient; ε)가 1.374 × 109이고, ICP-AES 분석 결과, 520 nm에서의 흡광도가 0.249이므로, 이로부터 제조된 AuNRs 용액의 금 농도가 69.5 μM임을 확인하였다. 가로 및 세로모드(ransverse and longitudinal modes)는 각각 510 및 765 nm에서 나타났다(도 2).
실시예 2: 염처리 공정( salting process )에 의한 형광 표지된 DNA 로 수식된 AuNRs의 제조
알렉사 플루오르™ 546-수식된 티올화된 올리고뉴클레오티드(DNA)를 상기 실시예 1에 따라 합성한 AuNR 표면에 결합시켰다. 먼저, 신선하게 환원시킨 알렉사 플루오르™ 546-수식된 티올화된 올리고뉴클레오티드 용액 1500 ㎕와 10% SDS 용액 67.8 ㎕를 1.16 nM의 AuNR 용액 4500 ㎕와 혼합하였다. 상기 혼합용액을 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이후 100 mM 인산 완충액으로 10 mM(pH 7.4)의 최종 인산 농도를 달성하도록 용액을 조정하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 끓는 물에 매 20분마다 2 M NaCl(10 mM PB, 0.1% SDS) 3 분액(aliquots)을 첨가함으로써 0.3 M NaCl 용액이 되도록 하였다. 최종 첨가로부터 1시간 후, 형성된 콜로이드용액을 2회 원심분리(9,500 rpm, 10 min)하고 침전을 탈이온수에 재분산시켰다. 은 쉘 성장 단계에 앞서, UV-vis 분광광도계로 520 nm에서 OD를 측정하여 DNA로 수식된 입자의 농도를 결정하였다.
실시예 3: 단일 AuNR 당 수식된 올리고뉴클레오티드의 정량
각각의 AuNR 입자 상에 로딩된 염료-표지된 올리고뉴클레오티드(dye-modified oligonucleotides)의 수를 결정하기 위하여, 각 시료에서 AuNR 나노입자의 농도 및 형광 올리고뉴클레오티드의 농도를 측정하였다. 각 부분표본(aliquot)에서 AuNR 용액의 농도를 결정하기 위하여, UV-가시광선 분광광도계를 사용하였다. AuNR의 농도는 람버트-비어의 법칙(Lambert-Beer’s law; A = εbc)을 통해 흡광도값과 직접 연관된다. 본 발명에 사용된 몰 흡광계수(mole extinction coefficient)는 520 nm에서 1.374 M-1cm-1이었다. 각 부분표본(aliquot)에서 형광 올리고뉴클레오티드의 농도를 결정하기 위하여, AuNR 용액 상에 수식된 올리고뉴클레오티드 100 ㎕를 같은 부피의 100 mM KCN 용액과 혼합하여 AuNR 결정구조를 파괴함으로써 AuNR 표면으로부터 올리고뉴클레오티드를 분리시켰다. 이 단계에서, 올리고뉴클레오티드의 농도를 2배로 희석시켰다. 인큐베이션하여 올리고뉴클레오티드를 용액 중으로 배출시키고, 상층액을 수득하여 형광세기를 측정하였다. 형광세기는 자유 알렉사 플루오르™ 546으로 수식한 티올화된 올리고뉴클레오티드-기반 표준곡선(free Alexa Fluor™ 546-modified thiolated oligonucleotides-based standard curve)과 비교하였으며, 3개 다른 배치를 측정하여 표준편차(standard deviation)를 얻었다(도 3). 형광측정을 위하여, 형광체를 510 nm에서 여기시키고 형광을 측정하였다. 그 결과, 평균적으로, 하나의 AuNR 입자 상에 293.4개 형광 올리고뉴클레오티드가 결합되어 있음을 확인하였다.
실시예 4: 형광 표지된 DNA 로 수식된 AuNRs 표면에서 은 쉘 형성
형광 표지된 DNA-수식된 AuNRs(DNA-AuNRs) 상에 Ag 쉘을 형성하고 점차적으로 Ag 쉘 두께를 증가시켰다. 상기 실시예 2에 따라 제조한 AuNR 용액을 희석시켜 520 nm에서 0.5 OD가 되도록 하였다. 희석한 AuNR 용액(100 ㎕)을 순차적으로 CTAC, AgNO3 및 0.1 M L-아스코르브산 용액과 혼합하고 60℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 첨가한 시약의 농도는 각각 차례로 2.5 mM(f-RNP 1), 5.0 mM(f-RNP 2), 7.5 mM(f-RNP 3), 10.0 mM(f-RNP 4), 15.0 mM(f-RNP 5) 및 20.0 mM(f-RNP 6) CTAC; 및 0.25, 0.50, 0.75, 1.0, 1.5 및 2.0 mM AgNO3이었다. 구체적으로 CTAC와 AgNO3 간의 몰비는 10으로 유지하면서 그 농도를 증가시켜 일련의 시료를 준비하였다. 인큐베이션 후, 수득한 용액을 7000 rpm(f-RNP 1 및 f-RNP 2), 6000 rpm(f-RNP 3 및 f-RNP 4) 또는 5000 rpm(f-RNP 5 및 f-RNP 6)에서 10분 동안 원심분리하고 탈이온수에 재분산시켰다. 상기 제조된 표면에 은 쉘을 형성한 형광 표지된 DNA로 수식된 AuNRs를 형광 DNA-기능화된 플라즈몬성 직사각 나노평행육면체(fluorescent DNA-functionalized plasmonic rectangular nanoparallelepipes)이라 명명하고 이하 f-RNP로 약칭하였다. 각 시료는 상기한 바와 같이 표기 뒤에 번호를 붙여 구분하였다.
실시예 5: f- RNPs 상의 형광 또는 비형광 실리카 쉘 코팅
3.5 ㎕의 0.2% 3-아미노프로필트리에톡시실란(APTES)(v/v, EtOH 용액)을 62.5 ㎕ DMF 및 8.4 ㎕의 0.8 mM 카르복실릭 숙신이미딜 에스테르-태그된 알렉사 플루오르™ 546(MeOH 용액)과 혼합하였다. 상기 혼합물을 실온에서 12시간 인큐베이션 후, 에탄올 700 ㎕와 디메틸아민 용액 53.3 ㎕를 첨가하였다. 4시간 후, 상기 용액 750 ㎕를 1.82 nM f-RNP 5(증류수 용액) 50 ㎕와 혼합하고 30분 동안 인큐베이션하였다. 이후, 10% 테트라에틸 오르소실리케이드(v/v, EtOH 용액) 2 ㎕를 첨가하고 추가적으로 2시간 반 동안 인큐베이션하였다. 용액을 2회 원심분리하여(5000 rpm, 15분) 세척하고, 탈이온수에 재분산시켰다.
실시예 6: f- RNPs 의 특성분석
UV-visible 분광기와 TEM을 이용하여 f-RNPs의 분광학적 및 형태적 특성을 분석하였다(도 4). 사용한 Ag 전구체(precursors)의 양이 증가함에 따라, 현저한 분광학적 변화가 관찰되었다. f-RNP 1로부터 f-RNP 3까지, AuNRs와 비교하여, 더 넓은 가로(transverse)(510 nm) 및 세로(longitudinal)(765 nm) 피크가 관찰되었으며, 사용한 Ag 전구체의 양이 증가함에 따라 상기 2개 피크의 세기 또한 증가하였다(도 4c). TEM 이미지(도 4a)로부터, 본 발명에 따른 일련의 f-RNP에서 세로 및 가로 방향 모두에 대한 Ag 쉘의 두께는 거의 유사함을 확인하였다. 3 내지 7의 형상비를 갖는 AuNRs는 [001] 세로 성장 방향; 및 {100} 및 {110} 면(facets)에 의해 둘러싸인(enclosed) 8각형 단면(octagonal cross section)을 가지며, 말단(end side)에서, {110} 및 {111} 면은 잘려진 부분(truncated region)에서 노출되는 것으로 알려져 있다. 초기에, AuNR의 말단 및 측부(lateral region)에서 열역학적으로 유도된 정각의 과성장(conformal overgrowth)이 발생하였다. CTAC 캡핑제에서 Ag 성장 단계가 진행될 때, AuNR의 {111} 및 {110} 면의 에피택셜 성장속도(epitaxial growth rates)는 {100} 면보다 더 빠르다.
Ag 쉘이 성장함에 따라, Au-Ag 코어-쉘 입자는 캡핑제, CTAC와 강하게 결합되는 점차 Ag의 {100} 면에 의해 둘러싸였다. f-RNP 3으로부터 f-RNP 6까지, Ag 쉘은 세로방향보다 가로방향으로 보다 두껍게 성장하였으며, f-RNPs의 가장자리는 상대적으로 뾰족하였다(도 4a). 또한, 52°-기울어짐을 이용한 장방출주사전자현미경 측정을 사용하여 f-RNP 5의 직사각 평행육면체화된 3-D 형태를 확인하였다(도 4b). 이로부터 코어-쉘 입자의 말단은 측부보다 더 빠르게 {100} 면에 의해 둘러싸임을 확인하였다. Ag 표면에서 강하게 결합된 CTAC는 쉘 성장을 차단하여 f-RNP 3 이후 코어-쉘 입자의 가로 및 세로방향 간의 쉘 성장속도 차이를 유도할 수 있다. UV-visible 스펙트럼에서, 280 nm, 390 nm, 440 nm 및 580 nm에서 4개의 구별되는 플라즈몬성 모드가 관찰되었다(도 4c). 특히, 280 및 390 nm에서의 플라즈몬성 모드는 2개의 구별되는 Ag 쉘 구성(formations)(세로 및 가로)의 형성을 나타내며, 440 및 580 nm에서의 플라즈몬성 모드는 f-RNPs의 가로 및 세로 모드를 설명할 수 있다.
또한, ImageJ 소프트웨어를 이용하여 구체적인 TEM 분석을 수행하였다(rsb.info.nih.gov/ij/; 도 4d). 각각의 f-RNP 구조에 대해, 100개 이상의 입자를 측정하였다. f-RNPs의 가로 및 세로 길이는 각각 12.8 nm로부터 36.1 nm로, 50.3 nm로부터 60.4 nm로 증가하였으며, 이는 Ag 쉘 두께가 주로 가로방향으로 증가됨을 나타낸다. 각 f-RNP의 측정된 치수로부터 AuNR 치수를 감하여 평균 가로 및 세로 쉘 두께를 계산하였다. 가로 및 세로 쉘 두께는 각각 11.6 및 5.0 nm였다. f-RNP 6의 가로 쉘 두께(11.6 nm)는 알렉사 플루오르™ 546-수식된 티올화된 올리고뉴클레오티드의 이론적인 길이와 유사한 한편, f-RNP 6의 세로 길이는 형광 올리고뉴클레오티드의 이론적 길이보다 훨씬 더 짧았다. f-RNPs의 형상비는 형성된 Ag 쉘의 두께가 증가할수록 점차 감소하였다(도 4d).
f-RNPs의 구조적 특성을 더 분석하기 위하여, f-RNP 5의 원소맵핑이미지 및 격자정보를 획득하였다(도 5). 그 결과는 전반적으로 AuNR 코어 및 Ag 쉘이 Au 및 Ag 원소들 간의 상호혼합(intermixing)이 거의 없이 잘 분리되었음을 나타내었다. 암시야 TEM 이미지로 고도로 잘-정의된 뾰족한 Ag 모서리를 갖는 직사각 평행육면체화된 구조를 추가로 확인하였다(도 5e). 도 5f에는 고해상도 TEM(HR-TEM) 이미지 및 선택영역 전자회절(selected area electron diffraction; SAED) 결과를 나타내었다. HR-TEM 이미지는 2.0 Å 간격의 [001] 격자 결정띠축(lattis zone axis)를 가지며 면심입방구조(face-centered cubic; fcc) Ag의 {200}으로 표지(index)될 수 있는 뚜렷하고(clear) 연속적인(continuous) 주변부(fringe)를 나타내었다. 상응하는 SAED 패턴은 정사각형의 대칭점(square symmetry spots)을 나타내었으며, 이로부터 Ag 쉘이 {100} 면에 의해 둘러싸인 단일결정임을 확인하였다. {100} 면에 의해 결합된 직사각형 단면을 나타내는 HR-TEM 이미지의 Ag 쉘 모서리 영역에서 뚜렷한 가장자리를 확인할 수 있었다.
다음으로, 나노드롭 3300 형광분광계를 이용하여 f-RNP 용액 2 ㎕로 형광신호증강(fluorescence signal enhancement)을 측정하였다(도 6 및 7). 적분된(integrated) 형광세기플롯은 f-RNP 3로부터 f-RNP 5까지 Ag 쉘이 성장하는 동안 형광신호의 세기가 선형적으로 비례하여 증가함을 나타내었다. 약 12 nm의 가로 Ag 쉘을 갖는 f-RNP 6에서, 형광신호는 형광체 염료(fluorophore dye) 및 Ag 쉘 간의 인접 또는 직접 접촉에 의해 감소하기 시작하였다. 이는 RNP 5와 RNP 6 간의 주된 차이가 가로 Ag 쉘 두께임을 고려할 때, 형광체 염료와 Ag 쉘이 적절한 거리를 유지하는 범위에서 Ag 쉘을 형성하는 것이 바람직함을 나타내는 것이다. 측정된 형광세기로부터 f-RNPs의 광발광(photoluminescence; PL) 증강인자를 계산하였다. f-RNPs의 형광신호를 자유 알렉사 플루오르™ 546-수식된 티올화된 올리고뉴클레오티드의 형광신호에 비교하여, 각각의 f-RNP 구조에 대한 광발광 증강인자를 획득하였다(도 6b). PL 증강인자는 아래와 같이 정의하였다:
Figure 112014047057361-pat00001
상기 IMEF 및 CMEF는 f-RNPs의 적분된 PL 세기 및 용액에서 알렉사 플루오르™ 546의 농도이다. IPL 및 CPL은 자유 알렉사 플루오르™ 546-수식된 티올화된 올리고뉴클레오티드의 적분된 PL 세기 및 농도이다. 상기 결과에 기초하여, 말단에 형광체가 표지된 약 15 bp 길이의 DNA가 결합된 금 나노로드 상에 9.64 nm 및 4.81 nm의 가로 및 세로 Ag 쉘 두께를 갖는 f-RNP 5는 MEF를 위한 적합한 나노탐침이며, 용액에서 상기 f-RNP 5 탐침에 대한 MEF 증강인자는 약 300임을 확인하였다.
나아가 상기 입자를 실리카 쉘로 코팅하여 f-RNPs의 입자 안정성과 생물학적 독성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 일반적으로 인산완충염용액(PBS) 또는 인간혈청에 노출된 Ag 표면은 입자 불안정성을 야기할 수 있다. 또한, 형광체 염료의 움직임으로 인해 상기 염료와 금속 표면 간의 거리가 고정적이지 가변적인 경우 측정되는 형광신호의 편차가 증가한다. MEF에 대한 최적의 Ag 쉘 두께를 탐색한 후, 단일 입자 내에서 및 입자로부터 입자까지 형광신호 변동(fluctuations)을 최소화하기 위하여 최적화된 f-RNPs의 형광체 위치에 상기 형광체가 고정되도록 실리카 쉘을 형성하여 포매시켰다(도 1b).
실리카 쉘 형성을 위한 대표적인 실험에서, 0.2 %(v/v, in EtOH) APTES 3.5 ㎕를 EtOH 762.5 ㎕ 및 디메틸아민 용액 53.3 ㎕와 혼합하였다. 실온에서 4시간 동안 방치한 후, 용액 750 ㎕를 증류수에 녹인 1.82 nM f-RNP 5 용액 50 ㎕와 혼합하고, 상기 혼합용액을 실온에서 30분 더 인큐베이션하였다. 이후, 10 %(v/v, in EtOH) 테트라에틸 오르소실리케이트 2 ㎕를 첨가하고, 실온에서 2.5시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 용액을 두 번 원심분리하고(5,000 rpm, 15분), 탈이온수에 재분산시켰다. TEM 이미지를 측정하여 f-RNPs 상에서 실리카 쉘의 형성을 확인하였다(도 8a). 그 결과, f-RNPs는 실리카 쉘로 완전히 둘러싸였으며, 거의 모든 실리카 쉘은 f-RNPs를 포함하였다. 이후 f-RNP 5와 실리카-코팅된 f-RNP 5(Si-f-RNP 5) 간의 형광신호세기 및 재현성 활성의 차이를 확인하였다. 그 결과, 실리카 코팅 전과 후 형광신호세기는 매우 유사하다. 그러나, Si-f-RNP 5의 형광신호세기의 표준편차(standard deviation)는 f-RNP 5에 비해 감소되었으며, 이는 실리카 쉘 형성을 통해, 신호 재현성을 보다 향상시킬 수 있음을 나타내는 것이다(표준 편차에 있어서 ~2-배 향상; 도 8b). 이때, 실리카 쉘 형성 과정에 있어서, 추가적인 형광분자를 실리카 쉘에 포매시켜 코팅하는 경우 각 입자의 형광세기를 보다 증가시킬 수 있다(도 9 및 10).
종합적으로, 본 발명자들은 길이를 조절할 수 있는 형광 표지된 DNA를 이용하고, 은 쉘 형성 화학을 정교하게 조절하여 형성되는 은 쉘의 두께를 조절하여 상기 DNA 상에 표지된 형광체와 은 쉘 표면 간의 거리를 조절하는 방식의, MEF를 위한 최적의 RNP 탐침을 찾기 위한 합성전략(synthetic strategy)을 개발하였다. 이를 위하여, f-RNP의 구조적 및 광학적 특성을 구체적으로 분석하였다. 최적화된 조건에서, 용액시료에 대해 약 300 PL 증강인자(enhancement factor)를 달성할 수 있음을 확인하였다. 나아가, 본 발명자들은 f-RNP 상에 실리카 쉘 형성을 통해 탐침 안정성 및 신호 재현성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 상기 Si-f-RNP 구조물은 MEF 탐침의 실용화(practical use)를 위한 유망한 플랫폼일 수 있다. 본 발명자들은 본 발명에 따른 전략 및 결과가 MEF 탐침에 대한 보다 나은 이해, MEF 탐침을 이용한 신뢰할만한 정량적 연구, 화학적 및 생물학적 검출 및 생물-이미지화 적용에 있어서 MEF 탐침의 사용에 대한 이점을 제공할 수 있을 것으로 기대한다.

Claims (15)

  1. 표면과 수직 방향으로 일정한 간격을 갖도록 위치한 형광체를 포함하는 코어-쉘 나노 복합체에 있어서,
    제1금속 나노입자; 일 말단을 통해 상기 제1금속 나노입자 상에 결합되고 타 말단에 형광체가 결합된 일정한 길이의 링커; 상기 링커가 결합된 제1금속 나노입자 상에 상기 형광체와 일정한 간격으로 이격되도록 두께를 조절하여 형성된 제2금속 쉘; 및 상기 제2금속 쉘 상에 추가로 코팅된 실리카 쉘을 포함하여, 상기 형광체가 제2금속 쉘 표면과 일정한 거리를 유지한 상태로 포매된 것인 코어-쉘 나노 복합체.
  2. 제1항에 있어서,
    금속증강형광(metal-enhanced fluorescence) 효과를 나타내는 것인 코어-쉘 나노 복합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 제1금속 나노입자는 1.2 내지 10의 형상비(aspect ratio)를 갖는 나노로드인 것인 코어-쉘 나노 복합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 제1금속 및 제2금속은 각각 독립적으로 금, 은, 구리, 팔라듐 또는 백금인 것인 코어-쉘 나노 복합체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제1금속 및 제2금속은 격자변수의 비가 1:1.4 내지 1.4:1인 것인 코어-쉘 나노 복합체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 링커는 단일가닥 또는 이중가닥 DNA, 또는 RNA인 것인 코어-쉘 나노 복합체.
  7. 삭제
  8. 제1항에 있어서,
    상기 실리카 쉘은 형광체를 추가로 포함하는 것인 코어-쉘 나노 복합체.
  9. 표면과 수직 방향으로 일정한 간격을 갖도록 위치한 형광체를 포함하는 코어-쉘 나노 복합체의 제조방법에 있어서,
    제1금속 나노입자를 준비하는 제1단계;
    상기 제1금속 나노입자 상에 일 말단에 형광체가 결합된 일정한 길이의 링커를 결합시키는 제2단계;
    상기 링커가 결합된 제1금속 나노입자 상에 상기 형광체와 일정한 간격으로 이격되도록 두께를 조절하여 제2금속 쉘을 형성하는 제3단계; 및
    형광체를 추가로 포함 또는 불포함하는 실리카 쉘로 코팅하는 제4단계를 포함하는 코어-쉘 나노 복합체의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 제1금속 나노입자는 1.2 내지 10의 형상비(aspect ratio)를 갖는 나노로드인 것인 제조방법.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 제1금속 및 제2금속은 각각 독립적으로 금, 은, 구리, 팔라듐 또는 백금인 것인 제조방법.
  12. 제9항에 있어서,
    상기 제1금속 및 제2금속은 격자변수의 비가 1:1.4 내지 1.4:1인 것인 제조방법.
  13. 제9항에 있어서,
    상기 링커는 단일가닥 또는 이중가닥 DNA, 또는 RNA인 것인 제조방법.
  14. 삭제
  15. 제1항 내지 제6항 및 제8항 중 어느 한 항에 기재된 코어-쉘 나노 복합체를 함유한, 금속증강형광용 탐침.
KR1020140060090A 2014-05-20 2014-05-20 금속증강형광용 코어-쉘 나노 복합체 KR101597894B1 (ko)

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