CN102811943B - 以位于粒子间的结合部的拉曼活性分子标记的二聚体核壳纳米结构、其用途及制备方法 - Google Patents

以位于粒子间的结合部的拉曼活性分子标记的二聚体核壳纳米结构、其用途及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种纳米粒子二聚体，在所述纳米粒子二聚体中拉曼活性分子位于所述纳米粒子二聚体的结合部，尤其涉及一种由核-壳纳米粒子组成的纳米粒子二聚体，所述核-壳纳米粒子包括：金核或银核，在所述金核或银核的表面上利用寡核苷酸结合；以及金壳或银壳，所述金壳或银壳包围所述核。此外，本发明涉及一种所述核壳纳米粒子二聚体、其制备方法及用途。

Description

以位于粒子间的结合部的拉曼活性分子标记的二聚体核壳纳米结构、其用途及制备方法
技术领域
本发明涉及一种纳米粒子二聚体，其制备成使得拉曼活性分子位于由纳米粒子构成的二聚体的结合部，更具体地，涉及一种核壳纳米粒子二聚体，在核表面结合寡核苷酸，并且由金壳或银壳（shell）包围所述核而形成。形成核的纳米粒子是金纳米粒子或银纳米粒子。本发明还涉及所述核壳纳米粒子二聚体、其制备方法及用途。
背景技术
对于来自生物样品和其他样品的单分子的高灵敏度的准确的检测可以广泛应用于医学诊断、病理学、毒理学、环境取样、化学分析及其他许多领域。为此，在过去的几年中，在生物-化学领域中利用特定物质标记的纳米粒子及化学物质广泛应用于研究少量的合成物质和生物分子的代谢、分布及结合等。代表性的方法包括，利用放射性同位素的方法、利用有机荧光物质的方法以及利用作为无机物的量子点（Quantum dots）的方法。
利用放射性同位素的方法中，生物体中广泛被发现的1H、12C、31P、32S和 127I等的放射性同位素3H、14C、32P、35S和125I作为放射性标记物质（Radioactiveisotope）被广泛使用。因为放射性同位素和非放射性同位素具有几乎相同的化学性质，所以可以任意替换；因为放射性同位素的放射能量比较大，所以甚至可以用于少量的检测，因此长期以来一直使用放射性同位素。但是，因为放射性同位素产生对人体有害的辐射，不易于处理。而且，虽然放射性同位素的发射能量高，但是半衰期短，因此不宜长时间的保存或实验。
作为放射性同位素的替代方案被广泛使用的就是有机荧光物质（Organicfluorescent dyes）。有机荧光物质若被特定波长激活，则发出具有固有波长的光。 尤其是，随着检测方法变得越来越简化，放射性物质也呈现出检测极限，从而需要长时间来检测。相反，由于在适当的条件下有机荧光物质的每个分子能够发射成千上万个光子，因此理论上甚至能实现单分子水平的检测。但是，荧光物质无法像放射性同位素那样直接替换活性配体的元素。相反，有机荧光物质只限于根据构效关系更改对活性无太大影响的部分并连接到该部分。此外，这种荧光标记物质随着时间的推移，其荧光强度变弱（photobleaching），因为用于激发的光的波长非常窄并且发射的光的波长非常宽，因此不同的荧光物质间存在干扰。而且，可以使用的荧光物质的数量非常有限。
半导体纳米物质的量子点由CdSe、CdS、ZnS和ZnSe等组成，根据大小和种类分别发射不同颜色的光。与有机荧光物质相比，因为具有更宽的激发波长和更窄的发射波长，因此发射更多不同颜色的光。因此，近年来量子点作为用于克服有机荧光物质的缺点的方法被广泛使用。但是，具有毒性强且难以大规模生产的缺点。此外，虽然理论上可用的量子点的种类多，但实际上被使用的数量极少。
为了解决这种问题，最近采用基于拉曼光谱和/或表面等离子共振的标记物质。
其中，表面增强拉曼散射（Surface Enhanced Raman Scattering,SERS）是利用在金、银等金属纳米结构的粗糙（roughened）表面吸附分子时拉曼散射的强度急剧增加106-108倍以上的现象的光谱法。当光穿过透明介质时，一小部分光子偏离固有方向，这种现象称为拉曼散射。随着光被吸收以及电子被激发到更高的能级，一部分散射光具有与原始激发光不同的频率，而且拉曼散射光谱的波长示出样品内的吸收光的分子的化学组成和结构特性，因此结合目前以非常快的速度发展的纳米技术，拉曼光谱法可以进一步发展为可以检测单分子的高灵敏度的技术，尤其是，非常期待用作医用传感器时起非常重要的作用。这种表面增强拉曼散射（SERS）效果与等离子共振现象相关。由于金属内传导电子的集体耦合，金属纳米粒子响应于入射电磁辐射，呈现出明显的光学共振。因此，金、银、铜及其他特定金属的纳米粒子本质上可以用作用于改善电磁辐射 的集中效果的纳米天线。这种位于粒子附近的分子对于拉曼光谱分析呈现出更高的灵敏度。
因此，除了高灵敏度DNA分析，正在积极地进行关于使用SERS传感器进行与各种疾病相关的基因、蛋白质（生物标记物）的早期诊断的研究。拉曼光谱法具有与其他分析法（红外光谱法）不同的多种优点。红外光谱法可以获得具有偶极矩变化的分子的强烈的信号，而拉曼光谱允许获得甚至具有诱导极化率变化的非极性分子的强烈的信号。因此，几乎所有的有机分子具有固有的拉曼位移（Raman Shift，cm-1）。此外，由于不受水分子干扰的影响，因此拉曼光谱更适用于检测包括蛋白质、基因等的生物分子（biomolecules）。然而，由于较低的信号强度，尽管研究经历了很长时间，但是尚未达到实用化水平。自从所述表面增强拉曼散射被发现后就被不断地研究，提出了可以检测吸附荧光分子的纳米粒子的无序的聚集体中单分子水平的信号的表面增强拉曼散射（Surface-Enhanced Raman Scattering,SERS）的报告（Science 1997,275(5303),1102;Phys rev lett 1997,78(9),1667）后，提出了针对利用各种纳米结构（纳米粒子、纳米壳、纳米线）的SERS增强现象的研究的报告。为了利用这种高灵敏度的SERS现象开发生物传感器，Mirkin研究小组最近成功实现了利用与DNA结合的金纳米例子的高灵敏度DNA分析，这种格式的检测极限为20fM（2002,science,297,1536）。然而，基于具有拉曼活性分子（例如，罗丹明6G）的银（Ag）纳米粒子的盐诱导聚集（salt-induced aggregation）的单分子SERS活性基质的制备方法在首次研究以后没有任何进展。据报告仅不均匀（heterogeneous）聚集的胶体的一部分（少于1%）具有单分子SERS活性（J Phys Chem B 2002,106(2),311）。像这样，随机不均匀（粗糙）的表面提供与SERS相关的许多有趣且必要的数据，但是因为即便是表面形态学上的一个小的变化也会导致显著的增强（enhancement）变化，因此这种策略本质上不可能再现。最近，Fang等提出了关于SERS中的增强部位的分布的定量测量的报告。最密集的部位（EF>109）是总1,000,000部位中的64部位，但是这些部位对总SERS强度贡献了24%（Science,2008,321,388）。如果可以确保再现这种SERS信号可以最大化的结 构体，则可以成为可靠性非常高的有用的超高灵敏度的生物分子分析法，并且除了体外诊断法以外，还会作为体内成像技术非常有用。
然而，传统的对各种分析物的检测方法通常采用在基板和/或支撑物上涂布的胶状的金属粒子，例如，聚集的银纳米粒子。这种布置通常允许以增强至大约106至108的灵敏度进行SERS检测，但是无法进行如核苷酸等小分析物的单分子检测。尽管SERS具有优点，但是，不仅由于SERS现象的机制尚未被完全理解，而且还由于准确定义的纳米结构的合成和控制上的困难，以及根据光谱测量时使用的光的波长和偏光方向的增强效率的变化等原因，面临很多从再现性和可靠性层面需要解决的问题。这些问题作为在包括纳米-生物传感器的开发和商业化的SERS现象的应用方面的巨大的课题依然存在。为了解决上述问题，目前迫切需要理解准确定义的纳米结构（well-defined nanostructure）的光学性质并基于该理解对SERS现象的精确的控制进行研究。
因此，Jeong、Proke、Schneider和Lee等提出了在金属粒子二聚体（dimer）中在两个以上的纳米粒子之间形成非常强的电磁场，即热点或填隙领域（hot spot 或interstitial field），从而SERS信号被增强的报告。根据基于电磁原理的理论计算，预测SERS由于所述热点（hot spot）增强至大约1012。因此，虽然拉曼检测的增强的灵敏度在胶体粒子聚集体内部显然并不均匀，但是随着是否存在热点而改变。然而，对于这种热点的物理结构、已实现灵敏度的增强的纳米粒子之间的距离范围及增强灵敏度的分析物和聚集体纳米粒子间的空间关系，尚未被提出。此外，聚集的纳米粒子在溶液中本质上是不稳定的，因此对单分子分析物检测的可再现性起到反作用。
此外，尽管已经尝试对金或银的二聚体结构的理论模拟和概念证明（proof-of-concept），尚未出现将单分子置于纳米粒子之间的结合部的实际制备的先例。将金或银纳米粒子合成为具有SERS的良好定义的可再现的结构仍然是具有挑战性的技术课题。
因此，本发明人致力于开发用于单个DNA检测的具有高灵敏度和再现性的纳米粒子结构物的结果，通过将单个拉曼活性分子置于核壳结构的二聚体纳米 粒子的结合部（junction），并且调节壳的厚度以将所述二聚体纳米粒子间的间隔距离调节至特定的范围，开发出拉曼活性分子位于两个纳米粒子结合部的、核壳结构的二聚体纳米粒子，验证了所述二聚体纳米粒子呈现出非常强的表面增强拉曼散射（Surface-Enhanced Raman Scattering,SERS）信号，并且所述二聚体纳米粒子为可再现性较高的热点纳米粒子，并且确认到所述纳米粒子的拉曼散射增强的SERS增强因子呈现出高达约2.7×1012，从而完成本发明。
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明的一个目的是提供一种具有位于纳米粒子二聚体的结合部的拉曼活性分子的、核壳结构的纳米粒子二聚体。
本发明的另一目的是提供一种上述纳米粒子二聚体的制备方法。
本发明的另一目的是提供一种利用所述纳米粒子二聚体检测分析物的方法。
本发明的另一目的是提供一种用于检测包括所述纳米粒子二聚体的分析物的工具包。
解决技术问题的技术手段
根据本发明的一方面，本发明涉及一种拉曼活性分子位于由表面结合寡核苷酸的金核或银核（core）及包围所述核的金壳或银壳（shell）所形成的两个核壳纳米粒子的结合部，并且具有所述两个纳米粒子通过寡核苷酸连接的结构的纳米粒子二聚体。
更具体地，本发明的纳米粒子二聚体由两个纳米粒子组成，各纳米粒子由核（金或银）及包围该核的壳（金或银）组成，寡核苷酸与各纳米粒子的核表面结合并且暴露在壳的外部，所述纳米粒子二聚体具有通过所述两个寡核苷酸间的杂交而连接的结构。此外，拉曼活性分子可以位于形成所述杂交的结合部。尤其是，在所述各纳米粒子中，寡核苷酸的一端结合在核的表面，并且所述寡核苷酸的一部分暴露在壳的外部，可以通过所暴露的部分的序列形成二聚体。 此时，暴露的两个寡核苷酸相互杂交，或者可以通过与暴露的两个寡核苷酸都可以杂交的寡核苷酸进行杂交。
本发明中术语“核”指的是在其表面上可以直接结合寡核苷酸的金属粒子，优选为金或银。而且，本发明中术语“壳”指的是包围所述核的金属涂布层，结合在核表面的寡核苷酸的一部分位于壳的内部。本发明中优选使用金壳或银壳。
因此，在本发明的优选实施例中，纳米粒子二聚体选自由i）由金核及银壳组成的两个核壳纳米粒子连接而成的纳米粒子二聚体；ii）由银核及金壳组成的两个核壳纳米粒子连接而成的纳米粒子二聚体；iii）由金核及金壳组成的两个核壳纳米粒子连接而成的纳米粒子二聚体；iv)由银核及银壳组成的两个核壳纳米粒子连接而成的纳米粒子二聚体；以及v)由金核及银壳组成的核壳纳米粒子和由银核及金壳组成的核壳纳米粒子连接而成的纳米粒子二聚体所构成的组。最优选地，本发明的纳米粒子二聚体为由金核及银壳组成的两个核壳纳米粒子连接而成的纳米粒子二聚体。
上述本发明的核壳结构的纳米粒子二聚体可以为同二聚体（homodimer）或异二聚体（heterodimer）。同二聚体指的是由尺寸和结构相同的两个纳米粒子连接而成的二聚体，异二聚体指的是由尺寸和结构不同的两个纳米粒子连接而成的二聚体。
形成根据本发明的表面增强拉曼散射纳米-标记粒子的中心的核粒子的直径优选为5nm至300nm，这是因为，如果核的直径小于5nm，则拉曼表面增强效应降低，如果核的直径超过300nm，则在生物学方面应用时受到很多限制。更优选地，核的直径为10nm至40nm。纳米粒子可以大致呈球形，但是可以使用任意形状和不规则形状的纳米粒子。
所述核粒子表面引入纳米壳，纳米壳为核粒子表面赋予增强的拉曼散射（Raman scattering）效应，有助于基于拉曼光谱法的分析。即，因为引入纳米壳的核粒子的表面增强散射效应（surface enhanced Raman scattering）非常强，因此具有可以获得任何化学物质的信号的优点。优选地，本发明的壳厚度为1nm至300nm，更优选为1nm至20nm。此外，壳的厚度随着核的尺寸和所使用的 DNA的长度的增加可以成比例地增加。
本发明的特征在于，一个以上的寡核苷酸被结合在核粒子的表面且被官能化。首先，在核A上，可以结合3’末端由硫醇被改性的一个以上的保护寡核苷酸及3’末端同样由硫醇被改性的一个目标捕获寡核苷酸。另外，在核B上，可以结合5’末端由硫醇被改性的一个以上的保护寡核苷酸及5’末端同样由硫醇被改性的一个目标捕获寡核苷酸。此外，本发明特征还在于，在所述核A表面上的被改性的目标捕获寡核苷酸及核B表面上的被改性的目标捕获寡核苷酸中的任意一个上具有被改性的拉曼活性分子。此外，通过核A上利用5’末端的结合、核B上利用3’末端的结合也可以完成本发明。
本发明中术语“保护寡核苷酸”指的是结合在核粒子的表面，并且起到在稳定核粒子使得目标捕获寡核苷酸可以很好地结合在核表面的同时保护表面的作用的寡核苷酸。
本发明中术语“目标捕获寡核苷酸”指的是具有与目标寡核苷酸互补的序列的寡核苷酸，核A的目标捕获寡核苷酸和核B的目标捕获寡核苷酸都与一个共同的目标寡核苷酸杂交（hybridization）以形成纳米粒子二聚体结构。
本发明中术语“目标寡核苷酸”指的是包括与核A的目标捕获寡核苷酸和核B的目标捕获寡核苷酸都互补的序列，通过与各目标捕获寡核苷酸杂交，起到连接两个目标捕获寡核苷酸以形成纳米粒子二聚体结构的桥梁作用的寡核苷酸，并且并非指利用本二聚体结构的最终目标分析物。
本发明的保护寡核苷酸和目标捕获寡核苷酸可以在3’末端或5’末端被具有表面结合官能团的化合物改性，通过表面结合官能团附着在核粒子的表面。
本发明中术语“具有表面结合官能团的化合物”指的是为了将寡核苷酸附着在核粒子表面而在各寡核苷酸的3’末端或5’末端上连接的化合物。只要可以生成在溶液中不沉淀的小聚集体的纳米粒子，具有表面结合官能团的化合物的类型不会受限制。通过表面结合官能团将纳米粒子交叉结合的方法在本领域内是公知的（参见Feldheim,The Electrochemical Society Interface,Fall,2001,pp.22-25）。具有表面结合官能团的化合物的一端保留连接到核粒子表面的表面结合 官能团，优选为例如硫醇基或巯基（sulfhydryl，HS）的含硫基。所述反应基作为乙醇或苯酚衍生物可以是具有由硫原子代替氧原子的化学式RSH的化合物。或者，所述反应基可以是分别具有化学式RSSR'或RSR'的硫酯（thiol ester）或二硫酯（dithiol ester）。或者，所述反应基可以是氨基（-NH2）。此外，具有所述表面结合官能团的化合物可以连接到例如-NH2、-COOH、-CHO、-NCO和环氧基等各种反应基，该反应基可以与DNA探针、抗体、寡核苷酸及氨基酸等生物分子反应。
此外，所述寡核苷酸在与具有表面结合官能团的化合物相反的末端可以包括间隔序列，间隔序列在防止在核表面引入的壳覆盖（covering）目标捕获寡核苷酸的目标识别序列的同时提供可以维持适当的壳厚度的空间。本发明中间隔序列的示例为A10-PEG。
本发明种术语“拉曼活性分子”指的是当本发明的纳米粒子二聚体附着在一个以上的分析物上时使得拉曼检测装置可以容易地检测及测量分析物的物质。本发明中的特征在于，在核A表面上的被改性的目标捕获寡核苷酸及核B表面上的被改性的目标捕获寡核苷酸中的任意一个上具有被改性的拉曼活性分子。因为拉曼活性分子可示出特征拉曼光谱，因此具有使得之后可以更有效地分析生物分子的优点。
拉曼光谱中可使用的拉曼活性分子包括有机分子或无机分子、原子、复合体或合成分子、染料、天然染料（藻红蛋白等）、C60等有机纳米结构、巴基球、碳纳米管、量子点、有机荧光分子等。具体地，作为拉曼活性分子的示例，包括FAM（羧基荧光素）、Dabcyl（4-二甲胺偶氮苯-4-羧酸）、TRITC（四甲基若丹明-5-异硫氰酸酯）、MGITC（异硫氰基-孔雀石绿）、XRITC（X-若丹明-5-异硫氰酸盐）、DTDC（3,3-二乙基硫二碳碘化氰）、TRIT（四甲基若丹明异硫氰酸盐）、NBD（7-硝基苯并-2-1,3-二唑）、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、对氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、异羟基洋地黄毒苷（digoxigenin）、5-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基、荧光素、5-羧基-2',4',5',7'-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、甲亚氨、青色素(Cy3、Cy3.5、 Cy5)、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、氨基吖啶、量子点、碳同素异形体、氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷和硫，但并不仅限于此。使用的拉曼活性分子需要呈现出清晰的拉曼光谱，尤其需要能够与不同类型的分析物结合或相关。优选为包括菁系列荧光分子的Cy3、Cy3.5、Cy5或FAM、Dabcyl、若丹明系列的荧光分子的有机荧光分子。有机荧光分子具有在拉曼分析时通过与使用的激发激光波长共振，可以检测更高的拉曼信号的优点。拉曼活性分子可以直接附着在分析物上，或可以通过各种链接化合物附着在分析物上。
本发明人确认到只有在拉曼活性分子位于纳米粒子二聚体的结合部（junction）的情况下才能检测SERS信号。具体地，因为核壳单体结构中没有热点而且只存在一个拉曼活性分子，因此没有检测到SERS信号（图3a-1、图3a-2）。
根据本发明的另一方面，本发明涉及一种利用所述拉曼活性分子标记的核壳结构的纳米粒子二聚体的制备方法。
更具体地，涉及一种包括下列步骤的纳米粒子二聚体的制备方法，
1）分别制备核A及核B，所述核A的表面上结合有保护寡核苷酸及目标捕获寡核苷酸，所述核B的表面上结合有保护寡核苷酸及在末端上结合有拉曼活性分子的目标捕获寡核苷酸；
2）通过使上述制得的核A及核B与目标寡核苷酸杂交形成二聚体；以及
3）在所述核A及核B的表面分别引入壳。
第一步骤是分别制备表面结合有保护寡核苷酸和目标捕获寡核苷酸的核A及核B。本发明的具体实施例中，为了通过调节使得一个目标捕获寡核苷酸序列结合在核粒子表面，利用3’末端被硫醇改性的一个以上的保护寡核苷酸及一个目标捕获寡核苷酸等两种寡核苷酸序列结合金核粒子A。金核粒子B也是由5’末端被硫醇改性的两种寡核苷酸结合。基于依赖于金核粒子表面的寡核苷酸的纳米粒子尺寸的承载（loading）能力，所述两种寡核苷酸序列的摩尔比在核A是99:1，在核B是199:1（图1a）。重要的是，在核B上结合的目标捕获寡核苷酸序列的末端结合有具有拉曼信号功能的Cy3、FAM或Dabcyl。
此外，为了去除未与目标捕获寡核苷酸序列（target capturing sequence）结合的单体粒子，净化寡核苷酸改性的核A及核B，可以使用磁性（magnetic）分离技术。甲苯磺酰（tosyl）基磁珠可以（直径1μm,Invitrogen）被分别与核A的目标捕获序列和核B的目标捕获序列互补的胺改性的目标寡核苷酸互补序列官能化。由于只有与目标捕获序列结合的核粒子进行与磁珠的互补的杂交结合，因此反应后可以在溶液中施加外部磁场，分离磁性纳米粒子后，升温至双链DNA碱序列的熔融点（Tm）以上，从而分离与磁性纳米粒子结合的核粒子。
此外，所述步骤1中，还可以包括下列工艺：分别制备核A和核B后，核A和核B的目标捕获寡核苷酸与具有互补序列的磁性微粒子进行杂交反应，从而仅分离核A和核B中已与目标捕获寡核苷酸结合的纳米粒子。
第二步骤是通过在上述制得的核A及核B中添加目标寡核苷酸进行杂交以形成二聚体的步骤。通过第一步骤中由磁珠分离及净化的核粒子A及核粒子B的溶液与例如，0.3M PBS内的充足量的目标寡核苷酸序列进行杂交结合，可以合成所需的纳米粒子二聚体。因此，根据本发明的二聚体合成方法可以以非常高的产率（70%~80%）合成二聚体。
在第三步骤中，在核粒子表面引入纳米壳粒子优选通过在溶剂中使例如金核粒子和银纳米粒子的前驱体在10℃~100℃下反应而引入。优选地，所述银纳米粒子的前驱体选自AgNO3或AgClO4。只要包括金离子，如HAuCl4，可以使用任何化合物作为金纳米粒子的前驱体。此外，将银离子或金离子转换为银纳米粒子或金纳米粒子所需的还原剂可以使用对苯二酚（hydroquinone）、硼氢化钠（NaBH4）、抗坏血酸钠（sodium ascorbate）等，但并不仅限于此。形成纳米壳的溶液优选为水溶液（即使存在纯净水或磷酸盐缓冲液也无妨）。此外，为了精确控制纳米壳的厚度，可以添加稳定剂（stabilizer）。因为如果上述反应温度小于10℃，则形成银纳米粒子需要消耗太长的时间，如果超过100℃，则形成的银纳米粒子不均匀，因此优选在所述范围的温度内进行反应。根据反应温度，上述反应时间可以调节至10小时~24小时。
根据本发明的具有位于两个纳米粒子的结合部的拉曼活性分子的、核壳结 构的纳米粒子二聚体通过在其表面或核的表面使得可以识别待检测的分析物的生物分子进行官能化，可以应用于各种生物体分子的检测。
例如，待检测的分析物可以为氨基酸、肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖类、碳水化合物、寡糖、多糖、脂肪酸、脂质、荷尔蒙、代谢物、细胞因子、趋化因子、受体、神经递质、抗原、过敏原、抗体、基质、辅助因子、抑制剂、药物、药学物质、营养物、朊病毒、毒素、有毒物质、爆炸性物质、杀虫剂、化学武器制剂、生物有毒制剂、放射性同位素、维生素、芳香杂环化合物、致癌剂、变异因子、麻醉剂、安非他明、巴比妥酸盐、致幻剂、废弃物或污染物。而且，分析物是核酸的情况下，所述核酸包括基因、病毒的RNA和DNA、细菌的DNA、真菌的DNA、哺乳动物的DNA、cDNA、mRNA、RNA和DNA片段、寡核苷酸、合成的寡核苷酸、改性的寡核苷酸、单双链核酸、天然或合成核酸。
此外，可以识别所述分析物且可以在纳米粒子二聚体等的表面结合的生物分子的非限制性示例可以为抗体、抗体片段、基因工程抗体、单链抗体、受体蛋白质、配体蛋白质、酶、抑制蛋白、凝集素、细胞粘附蛋白、寡核苷酸、多核苷酸、核酸或适配子。
而且，可以利用无机物涂布整个本发明的纳米粒子二聚体。因为若利用无机物整体涂布纳米粒子二聚体，则结构变型的可能性变小，因此可以稳定地维持纳米粒子二聚体的结构，更有利于保管和使用。只要可以维持纳米粒子二聚体的结构并且不影响拉曼信号，所述无机物不受限制，作为一个示例，可以使用二氧化硅。
根据本发明的另一方面，本发明提供一种利用本发明的所述纳米粒子二聚体的分析物的检测方法。
更具体地，涉及一种包括下列步骤的分析物的检测方法：
1）制备本发明的纳米粒子二聚体；
2）利用可以识别待检测的分析物的生物分子对纳米粒子二聚体的表面或核的表面进行官能化；
3）将所述纳米粒子二聚体暴露在包括一个以上分析物的样品中；以及
4）利用激光激发（excitation）及拉曼光谱法检测并确认一个以上的分析物。
优选地，可以使用任一已知的拉曼光谱法检测及确认本发明的分析物，优选可以使用表面增强拉曼散射法（SERS，Surface Enhanced Raman Scattering）、表面增强共振拉曼光谱法（SERRS，Surface Enhanced Resonance Raman Spectroscopy）、超拉曼和/或相干反斯托克斯拉曼光谱法（CARS，Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy）。
本发明中，术语“表面增强拉曼散射法（SERS）”指的是利用当分子被吸附在粗糙处理的特定金属表面或处于离表面几百纳米的距离内时发生的一种拉曼散射的强度与一般拉曼散射强度相比增加106-108以上的现象的光谱法。术语“表面增强共振拉曼光谱法（SERRS）”指的是利用对于SERS活性表面的吸附物的激光激发波长的共振现象的光谱法。术语“相干反斯托克斯拉曼光谱（CARS）”指的是使固定可变的两束激光入射到拉曼活性介质，并且测量通过其结合获得的反斯托克斯辐射的光谱的光谱法。
在更具体的实施方式中，本发明的所述分析物检测方法可以是包括下列步骤的核酸的检测方法：
1）制备本发明的纳米粒子二聚体；
2）利用与待检测的核酸互补的生物分子在所述纳米粒子二聚体的表面或核的表面进行官能化；
3）从样品中提取、净化及放大核酸；
4）将所述放大的核酸的特定序列与核壳纳米粒子二聚体进行杂交反应；以及
5）对与所述纳米粒子二聚体结合的核酸进行拉曼光谱。
此外，利用相同类型的方法可以检测例如样品中存在的一种以上的单核苷酸多态性（SNP）或其他基因突变形态等关于核酸的其它信息，进一步可以应用于DNA测序。
在这种实施方式中，拉曼活性基板可以与一个以上的拉曼检测单元装置可 操作地结合。基于拉曼光谱法检测分析物的几种方法在本领域内是公知的（例如，美国专利第6,002,471号、第6,040,191号、第6,149,868号、第6,174,677号、第6,313,914号）。在SERS及SERRS中，对于吸附在诸如银、金、铂、铜或铝等粗糙的金属表面上的分子，拉曼检测的灵敏度增强106倍以上。
在美国专利第6,002,471号中示出拉曼检测装置的非限制性示例。由波长为532nm的频率重叠的Nd:YAG激光器或波长为365nm的频率重叠的Ti:蓝宝石激光器生成激发光。可以使用脉冲激光束和连续激光束。激发光通过共焦光学器件及显微镜镜头，聚焦在含有一个以上的分析物的拉曼活性基板上。显微镜镜头及共焦光学器件收集从分析物发射的拉曼发射光，并且与单色器耦合以分离光谱。共焦光学器件包括双色向滤光镜（dichroic filters）、抑制滤光片、共焦针孔、物镜及镜子的组合，并且用于减小背景信号。除了共焦光学器件之外，还可以使用标准全场（full field）光学器件。由包括通过接口与对信号进行计数和数字化的计算机连接的雪崩光电二极管的拉曼检测器检测拉曼发射信号。
在美国专利第5,306,403号中示出检测装置的另一示例，其中可以使用安装有在单光子计数模式下操作的砷化镓光电倍增管（RCA Model C31034或Burle Industries Model C3103402）的Spex型号（Spex Model）1403的双光栅光谱仪。激发源包括来自SpectraPhysics型号166的514.5nm线氩离子激光器和647.1nm线的氪（krypton）离子激光器（Innova 70,相干性）。
其它激发源包括337nm的氮激光器（Laser Science Inc.（激光科学有限公司））、325nm的氦镉激光器（Liconox）（美国专利第6,174,677号）、发光二极管、Nd:YLF激光器和/或各种离子激光器和/或染料激光器。利用带通滤波器（Corion）将激发光净化成光谱，聚焦在利用6X物镜（Newport,Model L6X）的拉曼活性基板上。物镜可以用于利用全息分光镜（Kaiser Optical Systems,Inc.,Model HB647-26N18）激发分析物并且收集拉曼信号，使激发光及发射的拉曼信号成直角形状。全息带阻滤光片（Kaiser Optical Systems,Inc.）可以用于减小瑞利（Rayleigh）散射辐射。其他拉曼检测器包括安装有红色增强的高灵敏度电荷耦合器件（RE-ICCD）检测系统（Princeton Instruments）光谱仪（ISA,HR-320）。 可以使用其他类型的检测器，例如傅里叶变换光谱仪（基于迈克尔逊干涉仪）、带电注射装置、光电二极管阵列、InCaAs检测器、电子倍增电荷耦合器件（CCD）、高灵敏度CCD和/或光电晶体管阵列。
本领域中公知的任一适合的形式和结构的拉曼光谱法或相关方法可以用于检测分析物，这包括普通拉曼散射、共振拉曼散射、表面增强拉曼散射、表面增强共振拉曼散射、相干反斯托克斯拉曼光谱、刺激拉曼散射、逆拉曼光谱法、刺激增益拉曼光谱法、超拉曼散射、分子光学激光检验器（molecular optical laser examiner，MOLE）、拉曼微探针、拉曼显微镜法、共聚焦拉曼显微分光计、3-D或扫描拉曼、拉曼饱和光谱法、时间分辨共振拉曼、拉曼解离光谱法或紫外拉曼显微镜，但并不仅限于此。
根据本发明的特定实施方式，拉曼检测装置可以包括计算机。对于上述实施方式中使用的计算机的类型没有限制。示例的计算机可以包括交互信息的总线和用于信息处理的处理器。计算机还可以包括RAM或其他动态存储设备，ROM或其他静态存储设备，以及数据存储设备，如磁盘或光盘及相应的驱动。而且，计算机可以包括本领域内公知的外围设备，例如显示器（如阴极射线管或液晶显示器）、字母输入设备（如键盘）、光标指向装置（例如，鼠标、跟踪球或光标键）、通信装置（用于与例如调制解调器、网络接口卡或以太网、令牌环网或其他类型的网络结合的接口装置）。
根据本发明的特定实施方式，拉曼检测装置可以和计算机可操作地结合。来自检测装置的数据可以被处理器处理并且存储在主存储装置。标准分析物的发射曲线上的数据也可以存储在主存储装置或ROM。处理器可以比较来自拉曼活性基板的分析物的发射光谱，确认样品分析物的类型。处理器可以分析来自检测装置的数据，测量多种分析物的净化和/或浓度。不同设置的计算机可以用于不同的目的。因此，在本发明的不同实施方式中系统的结构可以不同。收集数据后，通常将数据传送到分析数据的装置。为了容易地进行数据分析，来自检测装置的数据通常使用上文所述的数字计算机来分析。计算机通常会被被适当地编程，使得不仅接收及存储来自检测装置的数据，而且还分析和报告收集 的数据。
根据本发明的另一方面，本发明涉及一种包括本发明的纳米粒子二聚体的用于检测分析物的工具包。
具体地，待检测的分析物是核酸的情况下，工具包可以包括进行逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）所需的要素，以放大样品中所包括的核酸。除了为待检测核酸特定的一对引物之外，RT-PCR工具包还可以包括试管或其他适当容器、反应缓冲液（各种pH值和镁浓度）、脱氧核苷酸（dNTPs）、酶（例如，Taq-聚合酶和逆转录酶）、脱氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的抑制剂、DEPC-水、无菌水等。而且，用作定量对照组的基因还可以包括特定的一对引物。此外，优选地，本发明的工具包可以是包括执行DNA芯片所需的必需要素的检测工具包。DNA芯片工具包还可以包括基板及试剂、配方及酶，在所述基板上布置有基因或与基因片段对应的互补脱氧核糖核酸（cDNA），而所述试剂、配方及酶用于制备荧光标记探针。此外，基板还包括与定量对照组基因或其片段对应的cDNA。
在本发明的另一实施方式中，待检测的分析物是蛋白质的情况下，为了抗体的免疫检测，工具包还包括基质，适当的缓冲液、利用本发明的纳米粒子二聚体标记的第二抗体及着色剂等。上述基质可以使用硝化纤维膜，聚乙烯树脂合成的96孔板，聚苯乙烯树脂合成的96孔板，聚苯乙烯树脂及玻璃形成的载玻片。
这种检测工具包包括本领域中通常使用的工具及试剂等。这种工具/试剂包括合适的载体、可以生成可检测信号的标记物质、溶剂、清洗剂、缓冲剂及稳定剂等，但并不仅限于此。在标记物质是酶的情况下，可以包括可以测量酶活性的基质及反应终止剂。合适的载体可以是可溶性载体，例如，本领域中公知的生理学上允许的诸如PBS的缓冲液；也可以是不溶性载体，例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、氟树脂、交联右旋糖酐、多糖、聚合物（例如磁珠，其中乳胶上镀有金属）、其他纸张、玻璃、金属、琼脂糖及其组合物，但并不仅限于此。
抗原-抗体复合物的形成方法包括，组织免疫染色、放射免疫分析法（RIA）、 酶联免疫吸附测定法（ELISA）、免疫印迹法（Western blotting）、免疫沉淀分析法（immunoprecipitation assay）、免疫扩散分析法（immunodiffusion assay）、补体结合试验法（complement fixation assay）、流式细胞术、蛋白质芯片（protein chip）等，但并不仅限于此。
有益效果
根据本发明的具有位于两个纳米粒子结合部的拉曼活性分子的核壳纳米粒子二聚体，由于拉曼活性分子准确位于两个纳米粒子的结合部并且拉曼活性分子和纳米粒子表面间的距离由银或金纳米粒子准确调节厚度，因此可以获得非常强的表面增强拉曼散射（SERS）信号。而且，即使只有一个拉曼活性分子，也可以获得强的拉曼信号。此外，合成所述核壳纳米粒子二聚体的方法等为可以以非常高的纯度合成二聚体的有用的方法，尤其是，可以通过适当调节核A、核B的合成时的寡核苷酸的量，并利用磁性纳米粒子净化核A、核B，以高纯度合成目标纳米结构。而且，可以以纳米级调节两个纳米粒子之间的间隙。因为该核壳纳米结构是在很大程度上放大拉曼信号的纳米结构，从而能够很好地适用于DNA和与特定疾病的发生和恶化相关的蛋白质（分子标记物）等分析物的检测、而且还可用于大规模的基因组序列分析、单核苷酸多态性（SNP）检测、序列比较、基因分类分析、疾病关系及药物开发。
附图说明
图1（a）及图1（b）示出通过磁净化、DNA杂交及银壳形成过程的金纳米粒子二聚体的合成过程的示意图。用于探针A的保护序列为3'-HS-(CH2)3-A 10 -PEG 18 -AAACTCTTTGCGCAC-5'，用于探针A的目标结合序列为3'-HS-(CH2)3-A 10 -PEG 18 -CTCCCTAATAACAAT-5',且用于MMP（基质金属蛋白酶）-A的改性的序列为3'-NH2-(CH2)3-A 10 -PEG 18 -ATTGTTATTAGGGAG-5'(Tm=38℃)。用于探针B的保护序列为5'-HS-(CH2)6-A 10 -PEG 18 -AAACTCTTTGCGCAC-3',用于探针B的目标捕获序列为5'-HS-(CH2)3-A 10 -PEG 18 -ATCCTTATCAATATTAAA-Cy3-3',且用于 MMP-B的改性的序列为5'-NH2-(CH2)3-A 10 -PEG 18 -TTTAATATTGATAAGGAT-3'(Tm=40℃)。具有下划线的序列是为了促进银壳形成而设计的间隔序列。目标DNA序列为5'-GAGGGATTATTGTTAAATATTGATAAGGAT-3'（炭疽菌序列）。图1（c）示出用于识别来自各二聚体纳米粒子的SERS热点结构的、利用校正的AFM、共焦拉曼光谱仪（激光焦点直径为250nm）的实验装置。
图2（a）示出形成金纳米粒子二聚体前和后的紫外-可见光谱及HR-TEM（高分辨率透射电镜）图像。图2（b）示出将银壳引入金纳米粒子二聚体前和后的紫外-可见光谱及HR-TEM图像。图2（c）示出纳米粒子的等离子共振（峰在约400nm处），该等离子共振根据银壳厚度变化。对应于金-银核壳二聚体结构的HR-TEM图像。图中示出的核壳纳米粒子的HR-TEM图像c.1a和c.1b分别表示银壳厚度为5nm和10nm的金-银核壳单体。c.2、c.3和c.4是银壳厚度分别为约3nm、约5nm和约10nm的金-银核壳异二聚体粒子。
图3（a）示出金-银核壳单体及异二聚体纳米粒子的AFM（原子力显微图，1μm×1μm）。图3（b）示出从金-银核壳纳米粒子的单体或二聚体获得的校准的SERS光谱。图3（c）示出从514.5nm激发激光器、1s累积（1s accumulation），样品100μW、激光焦点直径250nm中获得的所有光谱。拉曼光谱（红线）是从由NaCl溶液所聚集的银胶体中的Cy3改性的寡核苷酸获得的，并且拉曼光谱（黑线）是在相同的条件下从无Cy3的寡核苷酸中获得的。
图4示出各个所分析的金-银核壳二聚体纳米粒子呈现与具有单分子活性的Cy3对应的SERS信号。图4（a）示出金-银核壳二聚体的轻敲模式的AFM图像（5μm×5μm）（与图2（b）-2的银壳厚度约为5nm，间距为1nm以下的情况对应）。图4（b）示出从各二聚体结构中获得的Cy3的表面增强拉曼光谱。这些是在激光波长为514.5nm，激光功率约为80μW，激光焦点直径约250nm，露光时间（integration time）为1秒下测量的
图5（a）及图5（b）示出累积时间1s中从相同的粒子中获得的闪烁的SERS光谱，图5（c）示出从其它入射激光偏光中的金-银核壳异二聚体获得的SERS 光谱，图5（d）示出对于θ的1470cm-1及1580cm-1拉曼光谱带的综合SERS强度的极坐标系。这些是在激光波长为514.5nm，激光功率约为40μW，激光焦点直径约250nm，露光时间（integration time）为20秒下测量的
图6示出从利用由FAM和Dabcyl标记的寡核苷酸改性的纳米粒子二聚体获得的SERS光谱。图6（a）示出溶液中由FAM标记的寡核苷酸（1nm）及由Dabcyl标记的寡核苷酸(1nm)的拉曼光谱。图6（b）示出由FAM标记的金-银核壳纳米粒子二聚体（银壳5nm）及由Dabcyl标记的金-银核壳纳米粒子二聚体(银壳5nm)的拉曼光谱。
具体实施方式
下文，为了帮助理解本发明示出优选实施例。但是，下列实施例仅仅是为了更容易地理解本发明而提供的，并不限制本发明的内容。
实施例1：制备拉曼活性分子（Cy3）位于两个纳米粒子结合部的金-银核壳纳米粒子
基于将目标寡核苷酸结合至金纳米粒子且进一步根据银前驱体量调节形成银壳的DNA定向桥接方法合成（DNA-directed bridging method）拉曼活性金-银核壳二聚体（图1）。
首先，通过精确控制保护（protecting）寡核苷酸序列和目标捕获寡核苷酸序列的摩尔比并有效地净化的步骤，获得具有目标寡核苷酸的高度净化的金纳米粒子二聚体结构。由于金纳米粒子（AuNP）表面及Cy3分子间的最大间距（d；gap distance）仍保持7.5nm，因此为了获得放大的电磁性增强而需要减小间距。因为在SERS检测中银增强的效果是金的数倍，因此引入银纳米壳。
具体地，通过现有已知的改性方法（Chem.Comm.2008,J.Phys.Chem.B 2004,108,5882-5888）以纳米级调节银纳米壳，并且将银纳米壳涂布到金纳米粒子二聚体的表面以减小纳米粒子间的间距，进而放大SERS信号。在0.3MPBS溶液中存在作为稳定剂的100μL聚（乙烯）吡咯烷酮和作为还原剂的50μL的L-抗坏血酸钠[10-1M]的情况下，使250μM的金纳米粒子二聚体溶液与多种 量的AgNO3[10-3M]在常温下反应3小时。分别使用30μL、40μL、和70μL的AgNO3[10-3M]溶液合成具有约3nm、约5nm和约10nm的银壳厚度的金-银核壳异二聚体纳米粒子。以这种方法，以约3nm、约5nm和约10nm等纳米单位成功调节银壳厚度，可以获得与目标寡核苷酸结合的金-银核壳异二聚体结构。
根据传统的合成方法，为了通过调节使得一个目标捕获寡核苷酸在金纳米粒子表面进行改性，利用两种3’末端-硫醇-改性的寡核苷酸序列对用于探针A的金纳米粒子（15nm）进行官能化（functionalize）。而且，同样利用两种5’末端-硫醇-改性的寡核苷酸序列对用于探针B的金纳米粒子（30nm）进行官能化。基于金纳米粒子表面的寡核苷酸的依赖于纳米粒子大小的承载（loading）能力，两种序列（保护序列/目标捕获序列）的摩尔比调节成在探针A为99:1且在探针B为199:1（图1）。重要的是，对于探针B，在目标捕获寡核苷酸序列的末端结合作为拉曼标记的Cy3。此外，为了去除未与目标捕获序列（target capturing s equence）结合的单体粒子，利用磁性（magnetic）分离技术净化寡核苷酸改性的探针A及探针B。甲苯磺酰基改性的磁珠（直径1μm,Invitrogen）被分别与探针A的目标捕获序列和探针B的目标捕获序列互补的胺改性的目标寡核苷酸互补序列官能化。只有与目标捕获序列结合的金纳米粒子可以由磁珠分离。然后，净化的探针A和探针B的溶液与0.3M PBS中的足够量的目标寡核苷酸序列混合反应。
此外，通过与上述类似的方法，制备由拉曼活性分子FAM和Dabcyl分别标记的寡核苷酸改性的金-银核壳纳米粒子二聚体。
实施例2：紫外可见光谱法（UV-visible spectroscopy）和HR-TEM图像分析
通过紫外可见光谱（UV-visible spectroscopy）和高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）图像确认金纳米粒子二聚体的形成（Cy3用作拉曼活性分子）（图2）。紫外可见光谱在二聚体形成后示出一些红移，这与之前Oaul Alivisatos等（An gew chem.1999.38(12),1808）的报告结果一致。图2a示出金纳米粒子二聚体的典型的HR-TEM图像。最少200个粒子的分析结果发现25%的粒子为单体，6 5%的粒子为二聚体，10%以下的粒子为三聚体或四聚体或更高的多聚体。依据HR-TEM分析，金粒子间的粒子间距约为2~3nm。预计溶液状态（0.3PBS）中的纳米粒子间的间距实际上比干燥状态更长，约为15nm。而且，通过现有已知的改性方法（Chem.Comm.2008,J.Phys.Chem.B 2004,108,5882-5888）将银纳米粒子以纳米级调节的同时引入金纳米粒子二聚体的表面以减小纳米粒子间的间距，进而放大SERS信号（参照实施例1）。在类似的条件下还从净化的探针B溶液（30nm AuNP）合成具有约3nm~10nm的银壳厚度的金-银核壳单体（图2c的1a、1b）。各溶液的紫外可见光谱（图2b）根据银壳的厚度在约400nm的等离子共振峰值被分离。图2c示出各个金-银核壳异二聚体的HR-TEM图像，并且示出直径为26nm–36nm（图2c-2）、30nm–40nm（图2c-3）、40nm–50nm（图2c-3）的两个核壳纳米粒子球形及银壳厚度。两个纳米粒子间具有1nm以下的窄缝。图2c-1a、图2c-1b还示出各个金-银核壳单体的HR-TEM图像，并且示出直径为40nm（壳厚度=5nm，图2c-1a）、直径为50nm（壳厚度=10nm，图2c-1b）的各纳米粒子的球形及银壳厚度。
然后，测量核壳纳米粒子单体或异二聚体（Cy3用作拉曼活性分子）的SERS/AFM。传统的方法中，将由反复的离心分离（8000rpm,20分钟,三次）洗涤后的金-银核壳异二聚体溶液的一份（20μL）旋转涂布（spin coated）到以聚-L-赖氨酸涂布的玻璃表面上，并且利用超纯水（nanopure water）多次洗涤后，在空气中干燥。样品制备后立即用于AFM及SERS测量。由安装有倒置的光学显微镜（inverted optical microscope）（Axovert 200,Zeiss）的AFM相关的纳米拉曼显微镜记录SERS光谱，并且通过另外自制的扫描控制器调整压电（piezoe lectric）x-y样品扫描仪（Physik Instrument）。氩离子激光器（Melles Griot，US A）的514.5nm线用作与单模光纤耦合的激发源（excitation source）。彩色滤光片（分色镜）（520DCLP，Chroma Technology Corp.）设置成在50nW至1mW中将激发（excitation）激光束导向油浸显物镜（oil-immersion microscope objective显微镜）（×100,1.6NA,Zeiss），该油浸显物镜将激光束聚焦于盖玻片上表面的衍射极限点（250nm）。使用Nanoscope IV控制器将AFM（放映机,Digita l Instruments Inc.,Veeco Metrology Group）安装在微型机械台。光学显微镜台的顶端的轻敲模式AFM模块与100nm的重叠精度的AFM地形图像（topographical image）的拉曼信号相关。因为激光焦斑与AFM探针中心完全匹配，因此对于AFM探针末端对称地散射。在LN2冷却的（-125℃）电荷耦合器件中收集背景拉曼信号。在一次采集、一秒间累积（accumulation）、400μW、500cm-1-2000cm-1的范围中记录散射光谱。所有的数据是通过从Si减去背景信号而校正的基线。
实施例3：金-银核壳纳米粒子的AFM（原子力显微图）分析
图3a示出典型的核壳单体及异二聚体纳米结构（Cy3用作拉曼活性分子）的扩大的AMF（原子力显微图）图像（1μm×1μm）。其形状和直径与HR-TEM分析结果一致。图3b示出对图3a的单个粒子的AFM图像进行矫正的SERS光谱。因为核壳单体结构中没有热点而只存在一个Cy3分子，因此对于银壳厚度为5nm（图3a-1）或10nm（图3a-2）的金-银核壳单体未检测到SERS信号。对于没有银壳的金二聚体或具有1nm以下间距的金二聚体也未检测到SERS信号。这是因为在514.5nm激光激发条件下的电磁增强不充足。壳厚度较薄的（小于3nm）图3a-4的情况下，即使提高入射激光功率（约200μW）也未检测到信号。这种结果表明较薄的银层（layer）不能产生足够的电磁增强。相反，壳厚度约为5nm（图3a-5）的情况下，示出从位于纳米粒子结合部的Cy3标记的单个金-银核壳二聚体检测到相对较强的SERS信号。即使是低的强度（intensity），在514.5nm的激光激发（excitation）中的指纹图谱（fingerprint spectra）的1470cm-1及1580cm-1出现Cy3的特征峰值。与单分子SERS研究（Science 1997.275(5203),1102,Phys rev lett 1997,78(9),1667,Nano lett 2006,6(1)2173,N ano lett DOI:10.1021/ni803621x）中使用的功率强度（intensity）比较时，在比较低的激光功率（100μW）及热点部位内，低强度（intensity）仅影响一个分子。而且，测量来自与金纳米粒子上改性的寡核苷酸相同的其它种类的信号。图3c示出在聚集的银胶体中Cy3改性的寡核苷酸(5-HS-(CH2)6-A10-PEG18-ATCCTTATCAATATTAAA-Cy3-3',1nM,红线)的SERS光谱和无Cy3的寡核苷酸(5-HS-(CH 2)6-A10-PEG18-ATCCTTATCAATATTAAA-3',1nM,黑线)比较的结果。图3C（黑线）的SERS光谱示出：由于丰富的腺嘌呤碱（A10用作间隔序列），腺嘌呤模式(734cm-1,1320cm-1)具有优势，且其增强大于其它碱(JACS 2008,130(16),5523)。而且，重要的是对于其它的DNA碱目前为止报告的最低的检测极限是子微摩尔以下（sub-micromolar）范围(JACS,2006,128,15580)。但是，图3c的SERS光谱（红线）示出作为Cy3分子中发生的信号的1480cm-1、1580cm-1上的相对强的信号(Anal chem.2004,76,412-417)。然而，观察到光谱位置随着拉曼强度和时间变动（光谱位置随着时间波动）且各二聚体光谱不同(J.Phys.Chem.B 2002,106,8096)。因此，光谱图案与现有报告不是完全符合。确认到与银壳的厚度无关，在实验条件下没有金-银核壳单体中的可检测的SERS信号表明只有位于二聚体结构的结合部的Cy结构可以在1480cm-1、1580cm-1中诱导SERS峰值。如壳厚度约为10nm的核壳二聚体的拉曼光谱（图3a-6）所示，与1480cm-1的其它Cy3峰值一起在734cm-1、1320cm-1的腺嘌呤模式占优势。其它的纳米粒子的拉曼散射强度在每一个试验中不维持特定的形式。厚的银壳可以补偿激发不合适的电磁增强的Cy3分子。
实施例4：根据金-银核壳二聚体纳米粒子的入射激光的偏光的SERS光谱分析
如图4a，图4b所示，壳厚度约为5nm的大部分核壳二聚体纳米粒子（Cy3用作拉曼活性分子）示出来自单个粒子的可检测的SERS信号。考虑到入射激光（incident laser light）不完全偏振至二聚体的粒子间轴（图4a中的1、2、3、4、5），垂直偏振的各二聚体纳米粒子示出可检测的SERS信号。然而，图5c仅示出在1470cm-1的小的峰值，这是因为二聚体的产生（取向）几乎垂直于入射光。因此，发现具有优化的壳厚度的核壳二聚体纳米结构可以为非常适用于单个DNA检测的热点结构。
通过实验，已知在单分子检测中发现开关闪烁(blinking)(FIG.5a)(J.Phys.Chem.B2002,106,8096)。无拉曼强度持续10秒后，若恢复拉曼强度，则产生周期性的“打开”时间。从存在信号的强场（intense field）到最终永远消失的 期间，开关循环现象可以持续几分钟。而且，可以观察到：由于围绕热点的分子的运动，SERS强度以秒单位浮动（fluctuation）。这种闪烁和浮动现象与以前的文献是一致的。
图5c及图5d示出金-银核壳二聚体的拉曼信号对入射激光的偏光的依赖性。在514.5nm的激发激光（excitation laser）、20s的累积（accumulation）、样品40μW下检测到所有的光谱。当入射激光被偏振至与二聚体的纵轴（longitudinal a xis）平行时，Cy3峰值会被最大化。当激光从纵轴旋转20度及40度时，Cy3逐渐减小。最后，当激光偏振至于纵轴垂直（例如，90度及270度）时，Cy3峰值消失。根据下列公式测量二聚体结构中在热点的1580cm-1的增强因子(enha ncement factor,EF)。
EF=(Isers×Nbulk)/(Ibulk×Nmolecule)
Isers和Ibulk表示SERS及BULK光谱的相同的光谱带的强度，Nbulk表示对于bulk样品的bulk分子标记的数量，Nmolecule表示SERS光谱中Cy3分子标记的数量（Nmolecule=1）。由于在1580cm-1的带域中出现最强的光谱带，因此该光谱带用作Isers和Ibulk强度。以这种方式，热点的EF计算为2.7×1012。
另外，从由FAM和Dabcyl标记的寡核苷酸改性的纳米粒子二聚体测量SERS光谱的情况与Cy3相同，可以获得高灵敏度的拉曼光谱。因此，可以确认根据本发明的纳米粒子二聚体的结构及制备方法对一般拉曼活性分子有效。

Claims (24)

1.一种纳米粒子二聚体结构的表面增强拉曼散射SERS-标记物，包括纳米粒子A和纳米粒子B、以及拉曼活性分子，所述拉曼活性分子位于所述纳米粒子A和纳米粒子B之间的结合部；
纳米粒子A包括金核或银核A，寡核苷酸1a结合在所述核A的表面且金壳或银壳包围所述核A，使得所述寡核苷酸1a的一端通过表面结合官能团结合至所述核A的表面，且所述寡核苷酸1a部分地暴露到所述金壳或银壳的外部；
纳米粒子B包括金核或银核B，寡核苷酸1b结合在所述核B的表面且金壳或银壳包围所述核B，使得所述寡核苷酸1b的一端通过表面结合官能团结合至所述核B的表面，且所述寡核苷酸1b部分地暴露到所述金壳或银壳的外部；以及
通过所述寡核苷酸1a和寡核苷酸1b，以下列方式将纳米粒子A和纳米粒子B彼此连接：寡核苷酸1a和寡核苷酸1b在彼此互补时相互直接杂交、或者寡核苷酸1a和寡核苷酸1b通过具有与所暴露的寡核苷酸1a和寡核苷酸1b都互补的序列的寡核苷酸1c而间接杂交；
其中，在将壳引入至所述核A和所述核B中的每一核上之前，将所述拉曼活性分子连接至所暴露的寡核苷酸1a或寡核苷酸1b，所述核A和所述核B通过寡核苷酸1a和寡核苷酸1b彼此连接，从而使所述拉曼活性分子定位在纳米粒子A和纳米粒子B之间的结合部。
2.如权利要求1所述的SERS-标记物，其特征在于，纳米粒子A和纳米粒子B还包括寡核苷酸2a和寡核苷酸2b，所述寡核苷酸2a和寡核苷酸2b分别结合至所述核A和核B的表面且部分地暴露在所述壳的外部；以及
随后，所述寡核苷酸2a和寡核苷酸2b分别通过允许所述寡核苷酸1a和寡核苷酸1b很好地结合在核的表面且保护所述核的表面来稳定所述核A和核B。
3.如权利要求1所述的SERS-标记物，其特征在于，所述表面结合官能团选自硫醇基、氨基和醇基。
4.如权利要求1所述的SERS-标记物，其特征在于，所述SERS-标记物选自：
i)由金核及银壳组成的两个核壳纳米粒子连接而成的纳米粒子二聚体；
ii)由银核及金壳组成的两个核壳纳米粒子连接而成的纳米粒子二聚体；
iii)由金核及金壳组成的两个核壳纳米粒子连接而成的纳米粒子二聚体；
iv)由银核及银壳组成的两个核壳纳米粒子连接而成的纳米粒子二聚体；以及
v)由金核及银壳组成的核壳纳米粒子和由银核及金壳组成的核壳纳米粒子连接而成的纳米粒子二聚体。
5.如权利要求1所述的SERS-标记物，其特征在于，所述核A和核B的直径分别为5nm～300nm。
6.如权利要求5所述的SERS-标记物，其特征在于，所述核A和核B的直径分别为10nm～40nm。
7.如权利要求1所述的SERS-标记物，其特征在于，所述核A和核B的壳的厚度分别为1nm～300nm。
8.如权利要求7所述的SERS-标记物，其特征在于，所述核A和核B的壳的厚度分别为1nm～20nm。
9.如权利要求1所述的SERS-标记物，其特征在于，所述拉曼活性分子选自由FAM、Dabcyl、TRIT(四甲基若丹明异硫氰酸盐)、NBD(7-硝基苯并-2-1,3-二唑)、德州红(Texas Red)染料、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、焦油紫、甲酚蓝紫、亮(brilliant)甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、异羟基洋地黄毒苷(digoxigenin)、5-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基、荧光素、5-羧基-2',4',5',7'-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基若丹明、6-羧基若丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、甲亚氨、青色素、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、氨基吖啶、量子点、碳纳米管、碳同素异形体、氰化物、硫醇、氯、溴、甲基、磷、硫、菁染料(Cy3、Cy3.5、Cy5)及若丹明(Rhodamine)所构成的组。
10.如权利要求1所述的SERS-标记物，其特征在于，所述拉曼活性分子是有机荧光分子。
11.如权利要求1所述的SERS-标记物，其特征在于，将能够识别待检测的分析物的生物分子连接在SERS-标记物的表面或核的表面。
12.如权利要求11所述的SERS-标记物，其特征在于，待检测的所述分析物为氨基酸、肽、多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖类、碳水化合物、寡糖、多糖、脂肪酸、脂质、荷尔蒙、代谢物、细胞因子、趋化因子、受体、神经递质、抗原、过敏原、抗体、基质、辅助因子、抑制剂、药物、药学物质、营养物、朊病毒、毒素、有毒物质、爆炸性物质、杀虫剂、化学武器制剂、生物有毒制剂、放射性同位素、维生素、芳香杂环化合物、致癌剂、变异因子、麻醉剂、安非他明、巴比妥酸盐、致幻剂、废弃物及污染物。
13.如权利要求11所述的SERS-标记物，其特征在于，所述生物分子为抗体、抗体片段、受体蛋白质、配体蛋白质、酶、抑制蛋白、细胞粘附蛋白、寡核苷酸、多核苷酸、核酸或适配子。
14.如权利要求1所述的SERS-标记物，其特征在于，利用无机物整体涂布所述纳米粒子二聚体。
15.如权利要求14所述的SERS-标记物，其特征在于，所述无机物为二氧化硅。
16.一种如权利要求1所述的纳米粒子二聚体结构的表面增强拉曼散射SERS-标记物的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)分别制备核A及核B，
所述核A的表面上结合有寡核苷酸1a的一端，
所述核B的表面上结合有寡核苷酸1b的一端，以及
拉曼活性分子连接至暴露的寡核苷酸1a或寡核苷酸1b；
2)通过寡核苷酸1a和寡核苷酸1b以下列方式连接所述核A和核B：寡核苷酸1a和寡核苷酸1b在彼此互补时相互直接杂交，或者寡核苷酸1a和寡核苷酸1b通过具有与所暴露的寡核苷酸1a和寡核苷酸1b都互补的序列的寡核苷酸1c而间接杂交，从而形成二聚体结构且所述拉曼活性分子位于核A和核B之间；以及
3)将壳引入至所述核A和所述核B中的每一核上，从而形成彼此连接的纳米粒子A和纳米粒子B且所述拉曼活性分子位于纳米粒子A和纳米粒子B之间的结合部。
17.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，在步骤1)和步骤2)之间还包括下列步骤：
通过与磁性微粒子进行杂交反应，仅分离核A和核B，其中所述核A和核B分别结合至寡核苷酸1a和寡核苷酸1b，所述磁性微粒子具有与寡核苷酸1a或寡核苷酸1b互补的序列。
18.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述壳的引入是通过在还原剂和稳定剂存在的情况下使由核组成的二聚体和壳前驱体进行反应而实现的。
19.一种分析物的检测方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)制备如权利要求1至15中任一项所述的纳米粒子二聚体结构的表面增强拉曼散射SERS-标记物；
2)将能够检测所述分析物的生物分子连接至所述SERS-标记物的表面或所述SERS-标记物的核的表面；
3)将通过所述SERS-标记物所标记的所述生物分子暴露在包括一个以上分析物的样品中；以及
4)利用激光激发及拉曼光谱法检测并确认一个以上的分析物。
20.一种核酸的检测方法，其特征在于，包括下列步骤：
1)制备如权利要求1至15中任一项所述的纳米粒子二聚体结构的表面增强拉曼散射SERS-标记物；
2)将与待检测的核酸互补的生物分子连接在所述SERS-标记物的表面或所述SERS-标记物的核的表面；
3)从样品中提取、净化及放大核酸；
4)将所述放大的核酸的特定序列与所述SERS-标记物所标记的所述生物分子进行杂交；以及
5)利用拉曼光谱法检测并确认与通过所述SERS-标记物所标记的所述生物分子结合的核酸。
21.如权利要求20所述的核酸的检测方法，其特征在于，所述核酸的检测方法是单核苷酸多态性(SNP)的检测方法。
22.如权利要求19所述的分析物的检测方法，其特征在于，所述拉曼光谱是表面增强拉曼光谱(SERS)、表面增强共振拉曼光谱(SERRS)、超拉曼和/或相干反斯托克斯拉曼光谱(CARS)。
23.如权利要求19所述的分析物的检测方法，其特征在于，所述核酸包括基因、病毒的RNA和DNA、细菌的DNA、真菌的DNA、哺乳动物的DNA、cDNA、mRNA、RNA和DNA片段、寡核苷酸、合成的寡核苷酸、改性的寡核苷酸、单双链核酸、天然核酸及合成核酸。
24.一种用于检测分析物的工具包，其特征在于，所述工具包包括如权利要求1至15中任一项所述的纳米粒子二聚体结构的表面增强拉曼散射SERS-标记物。
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