CN104897645B - 一种基于金银纳米粒子二聚体拉曼信号检测叶酸的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于金银纳米粒子二聚体拉曼信号超灵敏检测叶酸的方法，属于材料化学技术领域。本发明包括金银纳米粒子的合成、金纳米粒子与叶酸抗体的修饰、银纳米粒子与叶酸抗原的修饰，以及金银纳米粒子二聚体的组装及TEM和拉曼信号的表征，基于金银纳米粒子二聚体拉曼信号的不同对叶酸进行检测。本发明通过抗原抗体的特异性结合进行金银纳米粒子二聚体的组装，并基于其较强的拉曼信号实现了叶酸的快速超灵敏检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于金银纳米粒子二聚体拉曼信号检测叶酸的方法，属于材料化学技术领域。
背景技术
纳米材料一般是指其结构单元的尺寸在1-100nm间的材料，由于自身尺寸大小，纳米结构材料具有独特的理化性质，成为当前材料研究最活跃的领域之一。拉曼光谱作为一种非弹性散射光谱，是通过对与入射光频率不同的散射光谱来分析分子的振动、转动，能够提供分子内部各种简正振动频率及有关振动能级方面的信息。传统的拉曼散射光谱信号较弱，作为信息读出手段往往缺乏高灵敏性。20世纪70年代中后期Au、Ag、Cu上表面增强拉曼散射（SERS）效应的发现与证实，给拉曼光谱的研究应用注入了新的活力。
本发明首先通过在不同粒径的金及银纳米粒子的表面分别修饰叶酸的抗体及抗原，进行二聚体组装，通过加入拉曼信标分子对其拉曼增强效应进行了研究和探讨。加入不同浓度的叶酸溶液，对金银纳米粒子二聚体的拉曼信号进行测试，以达到对叶酸的高灵敏检测目的，检测限可达到0.86pg/mL。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于金银纳米粒子二聚体拉曼信号超灵敏检测叶酸的方法。
本发明的技术方案，一种基于金银纳米粒子二聚体拉曼信号检测叶酸的方法，包括不同粒径大金及小银纳米粒子的合成、金纳米粒子与抗体的修饰、银纳米粒子与抗原的修饰，金银纳米粒子二聚体的组装及结构表征和拉曼信号测试，用金银纳米粒子二聚体检测叶酸。
具体步骤为：
（1）25nm金纳米粒子的合成：用柠檬酸钠还原合成法合成；在洁净的250mL的锥形瓶中加195mL超纯水，加5mL质量浓度0.4%的氯金酸溶液，搅拌并加热至沸腾，7-8min 后加3.2mL质量浓度1%的柠檬酸三钠溶液，至溶液从无色变为酒红色后，停止加热，继续搅拌，直至冷却至室温，即得到粒径为25nm的金纳米粒子。
（2）10nm银纳米粒子的合成：用硼氢化钠还原硝酸银法合成；
取20mL超纯水与5mL质量浓度为1%的聚乙烯吡咯烷酮混合于锥形瓶中，再加0.6mL0.1mol/L的硼氢化钠水溶液，并进行冰浴保护。然后，将5mL质量浓度为1%的聚乙烯吡咯烷酮水溶液和5mL质量浓度为0.17% 的硝酸银水溶液同时以30mL/h 的速度用注射泵加入到上述溶液中，注意边搅拌边加入，待加入结束后，放置于80℃水浴2h即得到黄色溶液，即10nm银纳米粒子。
（3）金纳米粒子与抗体的修饰：在25nm金纳米粒子表面可控修饰叶酸的抗体，取100µL浓缩五倍并重悬于10mM的PB缓冲液中的10nM 25nm金纳米粒子加入1.6µL、5mg/mL叶酸的抗体（购于无锡杰圣杰康生物科技有限公司）进行偶联，37℃培养1h，之后用2µL 5mg/mL的BSA封闭离子表面未偶联的区域，37℃反应40min。13000rpm离心10 min，弃上清，沉淀用100µL、10mM的PB缓冲液重悬，得金-抗体悬液。
（4）银纳米粒子与抗原的修饰：在10nm银纳米粒子表面可控修饰叶酸的抗原；取100µL浓缩两倍的并重悬于浓度为10mM的PB缓冲液中的10nM 10nm银纳米粒子加入0.8µL、4mg/mL的叶酸抗原（购于无锡杰圣杰康生物科技有限公司）进行偶联，37℃培养1h，之后用2µL 5mg/mL的BSA封闭离子表面未偶联的区域，37℃反应40min。13000rpm离心10 min，弃上清，沉淀用100µL、10mM的PB缓冲液重悬，得银-抗原悬液。
（5）金银纳米粒子二聚体的组装：分别向金-抗体及银-抗原悬液里加入拉曼信标分子4-氨基苯硫酚（4-ATP）进行偶联，使4-ATP终浓度为10µM，偶联2h，分别离心，各重悬于50µL 10mM PB缓冲液中；偶联后两者混合于一个离心管中，最终体系为100µL，37℃培养2h，通过抗原抗体结合形成金银纳米粒子二聚体。并用电子透射电镜TEM和拉曼光谱仪对其结构和拉曼信号进行表征和测试。
（6）叶酸的检测：将得到的金银纳米粒子二聚体组装体稀释5倍，分别取100µL的组装体向其加入不同浓度的叶酸，使叶酸终浓度分别为0.005ng/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL，反应1h，进行拉曼检测。得到金银纳米粒子二聚体组装结构进行叶酸检测的标准曲线。
本发明的有益效果：基于拉曼信号作为检测信号，不仅稳定而且检测限低。本发明组装了金银纳米粒子二聚体并显示较强的拉曼信号增强效果，基于强的拉曼信号进行叶酸的检测，可以大大提高检测的灵敏度。
附图说明
图1 金银纳米粒子二聚体组装结构的TEM 图。
图2 不同浓度叶酸下金银纳米粒子二聚体的拉曼信号。
图3 基于金银纳米粒子二聚体组装结构进行叶酸检测标准曲线。
具体实施方式
实施例1 基于金银纳米粒子二聚体拉曼信号的超灵敏检测叶酸的方法
（1）25nm金纳米粒子及10nm银纳米粒子的合成：
25nm金纳米粒子的合成：在洁净的250mL的锥形瓶中加195mL超纯水，加5mL质量浓度为0.4%的氯金酸溶液，搅拌并加热至沸腾，7-8min 后加3.2mL质量浓度为1%的柠檬酸三钠溶液，溶液从无色变为酒红色后，停止加热，继续搅拌，直至冷却至室温，即得到粒径为25nm的金纳米粒子。
10nm银纳米粒子的合成：取20mL超纯水与5mL质量浓度为1%的聚乙烯吡咯烷酮混合于锥形瓶中，再加0.6mL 0.1mol/L的硼氢化钠水溶液，并进行冰浴保护。然后，将5mL质量浓度为1%的聚乙烯吡咯烷酮水溶液和5mL质量浓度为0.17% 的硝酸银水溶液同时以30mL/h的速度用注射泵加入到上述溶液中，注意边搅拌边加入，待加入结束后，放置于80℃水浴2h得到黄色溶液，即10nm 银纳米粒子。
将合成好的1mL的25nm的金纳米粒子及1mL的10nm 的银纳米粒子分别13000rpm离心10min，弃上清，后分别用200µL及500µL的PB缓冲液分散沉淀，待用。
（2）金银纳米粒子二聚体的组装：分别取100µL已浓缩好的并重悬于PB缓冲液中的大金及小银，并向两个管中分别加入1.6µL、5mg/mL叶酸的抗体及0.8µL、4mg/mL的叶酸抗原进行偶联，37℃培养1h，之后用BSA封闭离子表面未偶联的区域，37℃反应40min。13000rpm离心10 min，弃上清，沉淀用PB缓冲液重悬，之后分别向金-抗体和银-抗原溶液里加入拉曼信标分子4-氨基苯硫酚（4-ATP）使其终浓度为10µM，修饰2h，分别离心，各重悬于50µL 10mMPB缓冲液中，混合于一个离心管中，最终体系为100µL，37℃培养2h得到金银纳米粒子二聚体。进行TEM 和拉曼表征。
（3）叶酸的检测：将得到的金银纳米粒子二聚体组装体稀释5倍，分别取100µL的组装体向其加入不同浓度的叶酸，使其终浓度分别为0.005ng/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL，反应1h，进行拉曼检测。得到金银纳米粒子二聚体组装结构进行叶酸检测的标准曲线。最低检测限为0.86pg/mL。
Claims (3)
1.一种基于金银纳米粒子二聚体拉曼信号检测叶酸的方法，其特征在于步骤为：
（1）25nm金纳米粒子的合成：25nm金纳米粒子用柠檬酸钠还原合成法合成；
（2）10nm银纳米粒子的合成：10nm银纳米粒子用硼氢化钠还原硝酸银法合成；
（3）金银纳米粒子二聚体的组装：分别在25nm金纳米粒子表面可控修饰叶酸的抗体，在10nm银纳米粒子表面可控修饰叶酸的抗原；分别向金-抗体及银-抗原悬液里加入拉曼信标分子4-氨基苯硫酚进行偶联；偶联后两者混合，通过抗原抗体结合形成金银纳米粒子二聚体，通过电子透射电镜TEM和拉曼光谱仪对其结构和拉曼信号进行表征和测试；
（4）叶酸的检测：将不同浓度的叶酸加入已组装好的金银纳米粒子二聚体中，反应1h，进行拉曼检测，得到金银纳米粒子二聚体组装结构进行叶酸检测的标准曲线。
2.根据权利要求1所述基于金银纳米粒子二聚体拉曼信号检测叶酸的方法，其特征在于步骤（3）具体如下：
a、金纳米粒子与抗体的修饰：取100µL浓缩五倍并重悬于10mM的PB缓冲液中的10nM25nm金纳米粒子加入1.6µL、5mg/mL叶酸的抗体进行偶联，37℃培养1h，之后用2µL 5mg/mL的BSA封闭离子表面未偶联的区域，37℃反应40min；13000rpm离心10min，弃上清，沉淀用100µL、10mM的PB缓冲液重悬，得金-抗体悬液；
b、银纳米粒子与抗原的修饰：取100µL浓缩两倍的并重悬于浓度为10mM的PB缓冲液中的10nM 10nm银纳米粒子加入0.8µL、4mg/mL的叶酸抗原进行偶联，37℃培养1h，之后用2µL5mg/mL的BSA封闭离子表面未偶联的区域，37℃反应40min；13000rpm离心10min，弃上清，沉淀用100µL、10mM的PB缓冲液重悬，得银-抗原悬液；
c、金银纳米粒子二聚体的组装：分别向金-抗体及银-抗原悬液里加入拉曼信标分子4-氨基苯硫酚进行偶联，使4-氨基苯硫酚终浓度为10µM，偶联2h，分别离心，各重悬于50µL10mM PB缓冲液中；偶联后两者混合于一个离心管中，最终体系为100µL，37℃培养2h，通过抗原抗体结合形成金银纳米粒子二聚体；并用电子透射电镜TEM和拉曼光谱仪对其结构和拉曼信号进行表征和测试。
3.根据权利要求1所述基于金银纳米粒子二聚体拉曼信号检测叶酸的方法，其特征在于步骤（4）具体如下：将步骤（3）所得金银纳米粒子二聚体组装体稀释5倍，分别取100µL的组装体向其加入不同浓度的叶酸，使叶酸终浓度分别为0.005ng/mL、0.01ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL，反应1h，进行拉曼检测，得到金银纳米粒子二聚体组装结构进行叶酸检测的标准曲线。
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