CN102259834A - 一种具有手性信号的不对称四面体组装结构的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种具有手性信号的不对称四面体组装结构的制备方法，属于材料化学技术领域。本发明包括金纳米粒子的合成、金纳米粒子用保护剂钾盐包裹，金纳米粒子修饰DNA、银纳米粒子修饰DNA，CdTe量子点修饰DNA、25nm金纳米粒子和银纳米粒子组装成金-银二聚体，10nm金纳米粒子和CdTe量子点组装成金-量子点二聚体，异质二聚体组装成不对称四面体结构。本发明首次用金纳米粒子、银纳米粒子和量子点组装；用不同材料和尺寸组装的不对称四面体结构，有一定的手性，仪器表现为有一定的CD信号，用此信号检测DNA。在组装好的不对称四面体中，量子点被淬灭，其荧光消失，当内嵌一种大分子或量子点被释放出来，量子点的荧光会恢复，利用这个特点检测内嵌大分子或DNA。

Description

一种具有手性信号的不对称四面体组装结构的制备方法

技术领域

一种具有手性信号的不对称四面体组装结构的制备方法，属于材料化学技术领域。

背景技术

纳米材料是指物质结构在三维空间中至少有一维的尺度处于纳米量级( 1～ 100 nm) 或由纳米结构单元构成的材料。纳米材料具有特殊的结构，它是继物质的晶态、非晶态结构之后的一种新的物质结构形态——纳米态结构。由于组成纳米材料的超微粒尺度, 其界面原子数量比例极大（一般占总原子数50%左右），所以即使这种超微颗粒由晶态或非晶态物质组成, 其界面原子的结构既不同于晶体, 也不同于类气体、固体结构。因此,研究人员把纳米材料称之为晶态、非晶态之外的“第三态固体材料”。

构成纳米材料的基本单位尺度很小，且具有很大的表面积，这种特殊的结构层次使它具有表面效应、体积效应、量子尺寸效应等，并拥有一系列新颖的物理和化学特性，在众多领域特别是在光、电、磁、催化等方面具有非常重大的应用价值。利用这些纳米材料挖掘出来的奇特性能进行人工组装合成纳米复合材料是当今的研究热点。

纳米材料是一种迅速发展的新型材料，银纳米粒子因其独特的光学、电学、催化和化学反应性质，已引起了材料领域研究者的极大关注。银纳米粒子具有很高的比表面积和表面活性，可以广泛用作光电器件、 催化剂材料、 低温超导材料、防静电材料、电子浆料和生物传感器材料等。另外，由于金属银增强发光可以极大地改善发光分子的发射性能，使其在D N A无损检测、荧光共振能量转移免疫分析以及单分子检测等领域存在较大的应用前景。 

金纳米粒子是最为经典的一种金属纳米粒子，由于具有优良的稳定性和独特的光学、电学性质，在催化、传感器和生物分析检测等方面表现出很多潜在的应用价值，受到了物理、化学及生命科学等相关领域的广泛关注。它的高催化活性能通过自组装形成纳米结构的特点，使其在高级材料的制造上具有很大的应用前景。

量子点 ( quantum  dots ，QDs )又称半导体纳米微晶，是由II-VI 族或III-V族元素组成，经特定激发波激发后可发射荧光的纳米颗粒，且不同的激发波长可以发射不同颜色的荧光。量子点三个维度的尺寸都在 100 nm 以下，外观看似一个极小的点状物，其内部电子在各方向上的运动都受到局限。量子点的特殊结构导致其具有表面效应、介电限域效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应，从而展现出许多不同于宏观块体材料的物理化学性质和独特的发光特性。  

圆二色谱（CD谱）是一种特殊的吸收普，它对手性分子的构象十分敏感。手性是物质结构中的重要特征，它们是不能重叠的三维镜像对映异构体，虽然分子式完全相同，但其中原子或原子基团在空间的配置不同，互为镜像。凡手性分子都具有光学活性，即可使偏振光的振动面发生旋转。当单色左旋与右旋的圆偏振光通过某一种手性样品时，该样品对左、右旋圆偏振光的吸收不同，这叫做圆二色性。许多有机物和络合物都具有手性，它们的对映异构体物理化学性质(熔点、沸点、旋光度、溶解度、分子式等)几乎完全相同，但它们的旋光方向相反，生理作用大不相同。

圆二色光谱仪通过测量生物大分子的圆二色光谱从而得到生物大分子的二级结构，是简便、快捷的获得生物大分子结构的手段之一。目前主要应用于生物大分子的结构检测，如蛋白质折叠﹑蛋白质构象研究，DNA/RNA 反应，酶动力学，光学活性物质纯度测量，药物定量分析。近年来，随着纳米材料的快速发展，纳米材料组装体的手性研究已成为人们关注的热点。对纳米材料组装结构的手性研究，特别是对手性荧光纳米材料的研究，对构建新型手性纳米传感器有着重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有手性信号的不对称四面体组装结构的制备方法。本发明对纳米材料组装结构的手性研究，特别是对手性荧光纳米材料的研究，对构建新型手性纳米传感器有着重要的意义。

本发明的技术方案：一种具有手性信号的不对称四面体组装结构的制备方法，包括：金纳米粒子的合成、金纳米粒子用保护剂钾盐包裹，金纳米粒子修饰DNA、银纳米粒子修饰DNA，CdTe量子点修饰DNA、25nm金纳米粒子和银纳米粒子组装形成金-银二聚体，10nm 金纳米粒子和CdTe量子点组装形成金-量子点二聚体，异质二聚体组装形成不对称四面体结构；步骤为：

（1）25nm金纳米粒子合成

25nm金纳米粒子用柠檬酸三纳还原法合成；

（2）10nm金纳米粒子的合成

10nm金纳米粒子用单宁酸和柠檬酸三钠还原氯金酸合成；

（3）金纳米粒子用保护剂钾盐包裹

步骤（1）合成的25nm金纳米粒子及步骤（2）合成的10nm金纳米粒子分别用二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液进行包裹使得在NaCl溶液中稳定存在；

（4）金纳米粒子和DNA偶联

步骤（3）包裹的金纳米粒子和巯基修饰的DNA通过巯基-SH进行偶联形成金纳米粒子-DNA复合体；

（5）银纳米粒子和DNA 偶联

市售的银纳米粒子和巯基修饰的DNA通过巯基-SH进行偶联形成银纳米粒子-DNA复合体；

（6）CdTe量子点和DNA偶联

市售的CdTe量子点和DNA通过氨基-NH₃进行偶联形成CdTe-DNA复合体；

（7）25nm金纳米粒子和银纳米粒子组装形成金-银二聚体

将步骤（3）制备的25nm金纳米粒子和步骤（5）制备的银纳米粒子-DNA复合体进行组装，形成金-银二聚体结构，并对此结构进行表征；

（8）10nm 金纳米粒子和CdTe量子点组装形成金-量子点二聚体

将步骤（3）制备的10nm金纳米粒子和步骤（6）制备的CdTe-DNA复合体进行组装，形成金-量子点二聚体结构，并对此结构进行表征；

（9）异质二聚体组装形成不对称四面体结构

将步骤（7）制备的金-银二聚体和步骤（8）制备的金-量子点二聚体进行组装，形成不对称四面体结构，并对此结构进行表征。

所述的具有手性信号的不对称四面体组装结构的制备方法，步骤为：

（1）25nm 金纳米粒子的合成

25nm金纳米粒子的合成方案为：洁净的三口烧瓶中加入97.5mL超纯水，加入2.5mL 0.4%氯金酸溶液，搅拌并加热至沸腾，7-8min后加入1.6mL 1%柠檬酸三钠溶液，溶液从无色变为红色后，停止加热，继续搅拌15min；透射电镜显示25nm；

（2）10nm 金纳米粒子的合成

10nm金纳米粒子的合成方案为：洁净的三口烧瓶中加入79mL超纯水，1mL 1%氯金酸溶液作为A液；取一洁净的小瓶子，加入4mL 1%柠檬酸三钠溶液，0.1mL 1%单宁酸溶液，0.1mL 25mM碳酸钾溶液和15.8mL超纯水作为B液；A、B液均加热到60℃，然后在高速搅拌下把B液迅速加入A液中，最终反应液在60℃下继续搅拌30min形成深红色溶液，然后将溶液加热回流2min形成亮红色溶液，最后冷却到室温形成柠檬酸稳定的金纳米粒子，透射电镜显示10nm；

（3）钾盐包裹的金纳米粒子的制备

步骤（1）制备的25nm金纳米粒子及步骤（2）制备的10nm金纳米粒子各取5mL 100nM，分别各加入5μL 40mg/mL二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，室温震荡10h；各自用7000r/min及13000r/min，离心10min后去除上清液，加超纯水恢复到原体积；

（4）金纳米粒子偶联DNA

步骤（3）制备的钾盐包裹的两种金纳米粒子各取50μL分别置于PCR管中，各加入1μL 10μM的DNA，在25nm金纳米粒子的PCR管中加入DNA1及在10nm金纳米粒子的PCR管中加人DNA2，混匀后，依次向各体系中加入 5μL 5×tris-硼酸缓冲液和1.25μL 2M NaCl溶液，室温振摇反应2h；各自用7000r/min及13000r/min，离心10min，去除上清液，沉淀加超纯水稀释至原体积5倍；

（5）银纳米粒子偶联DNA

取30μL 20nM 银纳米粒子于PCR管中，加入1μL 10μM的DNA3混匀后，依次向体系中加入 5μL 5×tris-硼酸缓冲液和1.25μL 2M NaCl溶液，室温振摇反应12h，13000r/min，离心10min，去除上清液，加超纯水至原体积；

（6）CdTe量子点偶联DNA

取30μL 20nM CdTe量子点于PCR管中，加入0.3μL 20μM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC, 室温活化15min后，加入1.2μL 10μM DNA4，室温震荡3h；

（7）25nm金纳米粒子和银纳米粒子组装Au-Ag二聚体

步骤（3）制备的25nm金纳米粒子和步骤（5）制备的银纳米粒子-DNA复合体各自取40μL于PCR管中混合，90℃水浴5min，在水蒸气中缓慢降到室温，形成Au-Ag二聚体结构；

（8）10nm金纳米粒子和CdTe量子点组装Au-QD二聚体

步骤（3）制备的10nm金纳米粒子和步骤（6）制备的CdTe-DNA复合体各自取40μL于PCR管中混合，90℃水浴5min，在水蒸气中缓慢降到室温，形成Au-QD二聚体结构；

（9）异质二聚体组装形成不对称四面体结构

步骤（7）制备的Au-Ag二聚体和步骤（8）制备的Au-QD二聚体各取40μL混合于PCR管中，加入4μL 2M NaCl溶液，室温反应过夜，形成不对称四面体结构；

表1  DNA的编号、序列及长度

编号	序列(5’-3’)	长度
			DNA1	TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CGG GAC CAG TTC GCC	87
DNA2	TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG	87
			DNA3	TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC	87
DNA4	TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC	87

注：本发明所使用的DNA均购自中国上海生工生物工程有限公司，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。

本发明的有益效果：近年来，随着纳米材料的快速发展，纳米材料组装体的手性研究已成为人们关注的热点。对纳米材料组装结构的手性研究，特别是对手性荧光纳米材料的研究，对构建新型手性纳米传感器有着重要的意义。

本发明首次用金纳米粒子、银纳米粒子和量子点组装；用不同材料和尺寸组装的不对称四面体结构，有一定的手性，仪器表现为有一定的CD信号，用此信号检测DNA。在组装好的不对称四面体中，量子点被淬灭，其荧光消失，当内嵌一种大分子或量子点被释放出来，量子点的荧光会恢复，利用这个特点检测内嵌大分子或DNA。

附图说明

图1 典型的25nm金纳米粒子和银纳米粒子组装的金-银二聚体结构图。

图2 典型的10nm金纳米粒子和量子点组装的金-量子点二聚体结构图。

图3 四面体组装结构的透射电镜图。

图4 四面体组装结构的圆二色谱图。

具体实施方式

实施例1

（1）25nm 金纳米粒子的合成

25nm金纳米粒子的合成方案为：洁净的三口烧瓶中加入97.5mL超纯水，加入2.5mL 0.4%氯金酸溶液，搅拌并加热至沸腾，7-8min后加入1.6mL 1%柠檬酸三钠溶液，溶液从无色变为红色后，停止加热，继续搅拌15min。透射电镜显示25nm。

（2）10nm 金纳米粒子的合成

10nm金纳米粒子的合成方案为：洁净的三口烧瓶中加入79mL超纯水，1mL 1%氯金酸溶液作为A液；取一洁净的小瓶子，加入4mL 1%柠檬酸三钠溶液，0.1mL 1%单宁酸溶液，0.1mL 25mM碳酸钾溶液，15.8mL超纯水作为B液。A、B液均加热到60℃，然后在高速搅拌下把B液迅速加入A液中，最终反应液在60℃下继续搅拌30min形成深红色溶液。然后将溶液加热回流2min形成亮红色溶液。最后冷却到室温形成柠檬酸稳定的AuNPs，透射电镜显示10nm。

（3）钾盐包裹的金纳米粒子的制备

步骤（1）制备的25nm和步骤（2）制备的10nm金纳米粒子各取5mL 100nM，加入5μL 40mg/mL二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液（Bis(p-sulfonatophenyl)phenylphosphine dihydrate dipotassium salt），室温震荡10h。各自用7000r/min和13000r/min，离心10min后去除上清液，加超纯水恢复到原体积。

（4）金纳米粒子偶联DNA

步骤（3）制备的钾盐包裹的两种金纳米粒子各取50μL分别置于PCR管中，各加入1μL 10μM的DNA，在25nm金纳米粒子的PCR管中加入DNA 1及在10nm金纳米粒子的PCR管中加入DNA2，混匀后，依次向各体系中加入 5μL 5×tris-硼酸缓冲液和1.25μL 2M NaCl溶液，室温振摇反应2h。各自用7000r/min和13000r/min，离心10min，去除上清液，沉淀加超纯水稀释至原体积5倍。

（5）银纳米粒子偶联DNA

取30μL 20nM 银纳米粒子于PCR管中，加入1μL 10μM的DNA3混匀后，依次向体系中加入 5μL 5×tris-硼酸缓冲液和1.25μL 2M NaCl溶液，室温振摇反应12h。13000r/min，离心10mins，去除上清液，加超纯水至原体积。

（6）量子点偶联DNA

取30μL 20nM CdTe量子点于PCR管中，加入0.3μL 20μM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC), 室温活化15min后，加入1.2μL 10μM DNA4,室温震荡3h。

（7）25nm金纳米粒子和银纳米粒子组装Au-Ag二聚体

步骤（3）制备的25nm金纳米粒子和步骤（5）制备的银纳米粒子-DNA复合体各自取40μL于PCR管中混合，90℃水浴5min，在水蒸气中缓慢降到室温，形成Au-Ag二聚体结构。

（8）10nm金纳米粒子和量子点组装Au-QD二聚体

步骤（3）制备的10nm金纳米粒子和步骤（6）制备的CdTe-DNA复合体各自取40μL于PCR管中混合，90℃水浴5min，在水蒸气中缓慢降到室温，形成Au-QD二聚体结构。

（9）异质二聚体组装形成不对称四面体结构

步骤（7）制备的Au-Ag二聚体和步骤（8）制备的Au-QD二聚体各取40μL混合于PCR管中，加入4μL 2M NaCl溶液，室温（25℃）反应过夜，形成不对称四面体结构。

组装四面体结构的表征：

将上述组装好的产品进行5000r/min离心6min，弃上清，沉淀重分散到120μL的超纯水中，超纯水洗一次。电镜表征：7μL的上述处理过的样品滴加到碳膜支持的铜网上，在红外灯下进行干燥。投射电镜采用JEOL JEM-2100型号的电镜，其加速电压为200 kV，如图3所示。圆二色谱表征：取组装好的体系100μL于比色皿中，用超纯水做空白对照。圆二色谱仪采用法国Bio-Logic MOS-450+SMF-300，如图4所示。

本发明主要是一种方法的建立，因为没有人用金纳米粒子、银纳米粒子和量子点组装过。

其次，用不同材料和尺寸组装的不对称四面体结构，有一定的手性，仪器表现为有一定的CD信号，可以用此信号来检测DNA。

另外，在组装好的不对称四面体中，量子点被淬灭，其荧光消失，当内嵌一种大分子或量子点被释放出来，量子点的荧光会恢复。可以利用这个特点检测内嵌大分子或DNA。

序列表

DNA1：5’ -TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CGG GAC CAG TTC GCC -3’；

 

DNA2：5’- TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG -3’；

 

DNA3：5’- TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC -3’；

 

DNA4：5’ -TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC -3’。

Claims (2)

1.一种具有手性信号的不对称四面体组装结构的制备方法，其特征在于：金纳米粒子的合成、金纳米粒子用保护剂钾盐包裹，金纳米粒子修饰DNA、银纳米粒子修饰DNA，CdTe量子点修饰DNA、25nm金纳米粒子和银纳米粒子组装形成金-银二聚体，10nm 金纳米粒子和CdTe量子点组装形成金-量子点二聚体，异质二聚体组装形成不对称四面体结构；步骤为：

（1）25nm金纳米粒子合成

25nm金纳米粒子用柠檬酸三纳还原法合成；

（2）10nm金纳米粒子的合成

10nm金纳米粒子用单宁酸和柠檬酸三钠还原氯金酸合成；

（3）金纳米粒子用保护剂钾盐包裹

步骤（1）合成的25nm金纳米粒子及步骤（2）合成的10nm金纳米粒子分别用二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液进行包裹使得在NaCl溶液中稳定存在；

（4）金纳米粒子和DNA偶联

步骤（3）包裹的金纳米粒子和巯基修饰的DNA通过巯基-SH进行偶联形成金纳米粒子-DNA复合体；

（5）银纳米粒子和DNA 偶联

市售的银纳米粒子和巯基修饰的DNA通过巯基-SH进行偶联形成银纳米粒子-DNA复合体；

（6）CdTe量子点和DNA偶联

市售的CdTe量子点和DNA通过氨基-NH₃进行偶联形成CdTe-DNA复合体；

（7）25nm金纳米粒子和银纳米粒子组装形成金-银二聚体

将步骤（3）制备的25nm金纳米粒子和步骤（5）制备的银纳米粒子-DNA复合体进行组装，形成金-银二聚体结构，并对此结构进行表征；

（8）10nm 金纳米粒子和CdTe量子点组装形成金-量子点二聚体

将步骤（3）制备的10nm金纳米粒子和步骤（6）制备的CdTe-DNA复合体进行组装，形成金-量子点二聚体结构，并对此结构进行表征；

（9）异质二聚体组装形成不对称四面体结构

将步骤（7）制备的金-银二聚体和步骤（8）制备的金-量子点二聚体进行组装，形成不对称四面体结构，并对此结构进行表征。

2.根据权利要求1所述的具有手性信号的不对称四面体组装结构的制备方法，其特征在于：

（1）25nm 金纳米粒子的合成

25nm金纳米粒子的合成方案为：洁净的三口烧瓶中加入97.5mL超纯水，加入2.5mL 0.4%氯金酸溶液，搅拌并加热至沸腾，7-8min后加入1.6mL 1%柠檬酸三钠溶液，溶液从无色变为红色后，停止加热，继续搅拌15min；透射电镜显示25nm；

（2）10nm 金纳米粒子的合成

10nm金纳米粒子的合成方案为：洁净的三口烧瓶中加入79mL超纯水，1mL 1%氯金酸溶液作为A液；取一洁净的小瓶子，加入4mL 1%柠檬酸三钠溶液，0.1mL 1%单宁酸溶液，0.1mL 25mM碳酸钾溶液和15.8mL超纯水作为B液；A、B液均加热到60℃，然后在高速搅拌下把B液迅速加入A液中，最终反应液在60℃下继续搅拌30min形成深红色溶液，然后将溶液加热回流2min形成亮红色溶液，最后冷却到室温形成柠檬酸稳定的金纳米粒子，透射电镜显示10nm；

（3）钾盐包裹的金纳米粒子的制备

步骤（1）制备的25nm金纳米粒子及步骤（2）制备的10nm金纳米粒子各取5mL 100nM，分别各加入5μL 40mg/mL二水合双(对-磺酰苯基)苯基膦化二钾盐溶液，室温震荡10h；各自用7000r/min及13000r/min，离心10min后去除上清液，加超纯水恢复到原体积；

（4）金纳米粒子偶联DNA

步骤（3）制备的钾盐包裹的两种金纳米粒子各取50μL分别置于PCR管中，各加入1μL 10μM的DNA，在25nm金纳米粒子的PCR管中加入DNA1及在10nm金纳米粒子的PCR管中加人DNA2，混匀后，依次向各体系中加入 5μL 5×tris-硼酸缓冲液和1.25μL 2M NaCl溶液，室温振摇反应2h；各自用7000r/min及13000r/min，离心10min，去除上清液，沉淀加超纯水稀释至原体积5倍；

（5）银纳米粒子偶联DNA

取30μL 20nM 银纳米粒子于PCR管中，加入1μL 10μM的DNA3混匀后，依次向体系中加入 5μL 5×tris-硼酸缓冲液和1.25μL 2M NaCl溶液，室温振摇反应12h，13000r/min，离心10min，去除上清液，加超纯水至原体积；

（6）CdTe量子点偶联DNA

取30μL 20nM CdTe量子点于PCR管中，加入0.3μL 20μM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC, 室温活化15min后，加入1.2μL 10μM DNA4，室温震荡3h；

（7）25nm金纳米粒子和银纳米粒子组装Au-Ag二聚体

步骤（3）制备的25nm金纳米粒子和步骤（5）制备的银纳米粒子-DNA复合体各自取40μL于PCR管中混合，90℃水浴5min，在水蒸气中缓慢降到室温，形成Au-Ag二聚体结构；

（8）10nm金纳米粒子和CdTe量子点组装Au-QD二聚体

步骤（3）制备的10nm金纳米粒子和步骤（6）制备的CdTe-DNA复合体各自取40μL于PCR管中混合，90℃水浴5min，在水蒸气中缓慢降到室温，形成Au-QD二聚体结构；

（9）异质二聚体组装形成不对称四面体结构

步骤（7）制备的Au-Ag二聚体和步骤（8）制备的Au-QD二聚体各取40μL混合于PCR管中，加入4μL 2M NaCl溶液，室温反应过夜，形成不对称四面体结构；

DNA1：5’ -TTT GCC TGG AGA TAC ATG CAC ATT ACG GCT TTC CCT ATT AGA AGG TCT CAG GTG CGC GTT TCG GTA AGT AGA CGG GAC CAG TTC GCC -3’；

DNA2：5’- TTT CGC GCA CCT GAG ACC TTC TAA TAG GGT TTG CGA CAG TCG TTC AAC TAG AAT GCC CTT TGG GCT GTT CCG GGT GTG GCT CGT CGG -3’；

DNA3：5’- TTT GGC CGA GGA CTC CTG CTC CGC TGC GGT TTG GCG AAC TGG TCC CGT CTA CTT ACC GTT TCC GAC GAG CCA CAC CCG GAA CAG CCC -3’；

DNA4：5’ -TTT GCC GTA ATG TGC ATG TAT CTC CAG GCT TTC CGC AGC GGA GCA GGA GTC CTC GGC CTT TGG GCA TTC TAG TTG AAC GAC TGT CGC -3’。

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