CN103074327B - 三角银纳米片在分离单链dna中的应用 - Google Patents
三角银纳米片在分离单链dna中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了三角银纳米片在分离单链DNA中的应用，包括以下步骤：制备与待分离单链DNA互补的互补单链DNA，并溶于磷酸盐缓冲液中，加入三角银纳米片水溶液混匀，加氯化钠调节混合溶液中氯化钠浓度，即得互补单链DNA-三角银纳米片复合物溶液；将待分离单链DNA磷酸盐缓冲液与互补单链DNA-三角银纳米片复合物溶液混匀，升温至65-75°C杂交反应，后冷却至20-30°C，即得双链-三角银纳米片复合物溶液；3-10秒内调双链-三角银纳米片复合物溶液中氯化钠浓度至0.25-0.35M，过滤，即可将待分离单链DNA分离。本发明将三角银纳米片应用于分离单链DNA，操作简便、成本低廉、分离效率高、分离效果好。
Description
技术领域
本发明属于DNA纯化技术领域，特别涉及三角银纳米片在分离单链DNA中的应用方法。
背景技术
DNA修饰的金属纳米粒子由于其具有许多独特的性能，近年来备受人们的瞩目。通过表面修饰DNA分子，金属纳米粒子能够被赋予许多新奇的特性，例如：高水溶性、优异的生物兼容性、急剧变化的融化曲线、与DNA的特异结合性等。这些特性使其在药物运载、基因治疗、细胞成像、DNA分离提纯等方面展现出极其重要的应用价值和十分广阔的应用前景。三角银纳米片是一种各向异性的金属纳米晶体，相比于其他形状的纳米晶体结构，它具有许多独特、重要的性质。例如，在一定质量下，它具有较大的表面积，这使其在化学反应中能展现出更大的接触面而使反应变得更加充分、迅捷；其等离子共振吸收峰位能够通过调节纳米片的几何尺寸而进行精确调控，这使其具有优异的光学特性；三角银纳米片尖锐的顶角能够产生强局域等离子场，这使得其具有放大分子拉曼信号的能力而被广泛应用于表面增强拉曼散射的研究。
现有单链DNA的纯化主要依靠高效液相色谱法（HPLC），聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）等方法，他们通常需要借助于较为昂贵的仪器设备，操作方法繁琐复杂，且各有缺点。例如，HPLC有时易受色谱柱局限、柱效率不高、分辨率也较低；而PAGE电泳的流程繁琐，需要另外对DNA进行染色，可能造成二次污染，并影响其进一步的使用。
发明内容
为了解决现有单链DNA的纯化方法操作方法繁琐复杂、分离效率低、分离效果不佳等缺陷，本发明提供了三角银纳米片在分离单链DNA中的应用。
为了实现本发明的目的，本发明提供的三角银纳米片在分离单链DNA中的应用，包括以下步骤：
（1）制备与待分离单链DNA互补的互补单链DNA，并溶于磷酸盐缓冲液中，加入三角银纳米片水溶液混匀，加氯化钠缓慢调节混合溶液中氯化钠浓度至0.10-0.20M，即得互补单链DNA-三角银纳米片复合物溶液；
（2）将待分离单链DNA磷酸盐缓冲液与互补单链DNA-三角银纳米片复合物溶液混匀，升温至65-75°C杂交反应，后冷却至20-30°C，即得双链-三角银纳米片复合物溶液；（3）3-10秒内调双链-三角银纳米片复合物溶液中氯化钠浓度至0.25-0.35M，过滤，即可将待分离单链DNA分离。
作为优选，步骤（1）中，所述互补单链DNA的5'端修饰有双巯基。
作为另一种优选，步骤（1）中，所述磷酸盐缓冲液pH为7-9，优选地，pH为7.4。
作为另一种优选，步骤（1）中，互补单链DNA溶液中互补单链DNA浓度为5-20μM。
作为另一种优选，步骤（1）中，三角银纳米片边长为90-110nm；三角银纳米片水溶液中三角银纳米片浓度为0.01nM-1.0nM。
作为另一种优选，步骤（1）中，三角银纳米片溶液与互补单链DNA溶液的体积比为（5-15）:1。
作为另一种优选，步骤（1）中，混合溶液中氯化钠浓度为0.15M。
作为另一种优选，步骤（2）中，待分离单链DNA磷酸盐缓冲液中待分离单链DNA浓度为10-11-10-8M，pH为7-9，优选为7.4。
作为另一种优选，步骤（2）中，互补单链DNA-三角银纳米片复合物溶液与待分离单链DNA磷酸盐缓冲液的体积比为（1-5）：1。
作为另一种优选，步骤（3）中，5秒内调氯化钠浓度至0.27M。
本发明将三角银纳米片应用于分离单链DNA，操作简便、成本低廉、分离效率高、分离效果好。
具体而言，本发明相对于现有方法优势如下：
其一，三角银纳米片应用于分离单链DNA，操作简便，可重复性高，成本低廉，环境友好。三角银纳米片制备方法简单、成本低廉，已经被广泛应用于生物材料制备及相关领域；DNA修饰的三角银纳米片复合物生物兼容性高，无毒无污染；此外，本发明无需借助昂贵仪器，即可完成单链DNA的分离及提纯。
其二，三角银纳米片应用于分离单链DNA具有很高的灵敏性。分离提纯单链DNA的下限已经达到10pM量级。
其三，三角银纳米片应用于分离单链DNA具有较好的化学稳定性。制备好的互补单链DNA修饰的三角银纳米片复合物在常温下能够储存一周以上。同时该方法中涉及的物化反应单一，碱基序列间的特异性识别能力强，无副反应发生。
其四，三角银纳米片应用于分离单链DNA分离过程快捷。待分离单链DNA与互补单链DNA-三角银纳米片复合物杂交后，在数秒钟内，通过控制系统盐浓度，即能实施分离。
附图说明
图1为互补单链DNA-三角银纳米片复合物示意图；其中，101为双巯基修饰的互补单链DNA；102为三角银纳米片。
图2为分离过程示意图；其中，图2（a）为待分离样品溶液，201为单链DNA b，202为单链DNA a；图2（b）为加入互补单链DNA-三角银纳米片复合物溶液后，互补单链DNA-三角银纳米片复合物与单链DNA a杂交过程的示意图，203为氯化钠；图2（c）双链-三角银纳米片复合物沉淀示意图，204为双链-三角银纳米片复合物；图2（d）为检测示意图。
图3为分离后溶液的SERS光谱图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
以提取和分离30个碱基的单链DNA为例，说明本发明的具体实施方式，但本发明的内容并不限于所举的例子。
实施例1
待提取样品为pH7.4的磷酸盐缓冲液，其中包括三种单链DNA，序列分别为：
DNA a：5′-CCA AAT GAA GAT ACG TAG CAA ACG ACA GGT-3'；
DNA b：5'-ATC GGT CAG TAA TCT TCA CGA ATA ACA CAA-3'；
DNA c：5'-AGT GCT TAT ACA GCA AGA CCA CGA AGT TAC-3'。
其中浓度皆为10-8M。
采用三角银纳米片提取单链DNA a，步骤如下：（1）采用种子生长法制备三角银纳米片
制备银种子溶液：于5mL 2.5mM的柠檬酸钠水溶液中加入0.25mL 0.5mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠水溶液和0.3mL 10mM新配制的硼氢化钠水溶液，混匀；混合溶液中以2mL/min的速度均匀滴加5mL 0.5mM的硝酸银水溶液，搅拌20分钟，静置24小时，即得银种子溶液。
制备边长为100±10nm三角银纳米片：5mL去离子水中依次加入75μL 10mM的抗坏血酸水溶液和20μL银种子溶液，混匀；以1mL/min的速度均匀滴加3mL 0.5mM的硝酸银水溶液，搅拌；再加入0.5mL 25mM的柠檬酸钠水溶液，搅拌，即得三角银纳米片溶液，调三角银纳米片溶液浓度至1.0nM。。
（2）制备互补单链DNA溶液：
设计5'端修饰有双巯基的互补单链DNA ac：3'-GGT TTA CTT CTA TGC ATC GTT TGCTGT CCA-(SH)2-5'。
制备互补单链DNA ac-三角银纳米片复合物溶液：将DNA ac溶于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，得浓度为20μM的互补单链DNA ac溶液；取互补单链DNA ac溶液100μL，加入500μL 1.0nM的三角银纳米片溶液中，混匀；每4小时提升体系中氯化钠的浓度0.010M,直至体系中氯化钠的浓度达到0.10M，得互补单链DNA-三角银纳米片复合物溶液，低温避光储存备用。
（3）制备
互补单链DNA-三角银纳米片复合物溶液与待分离样品溶液按体积比为1:3的比例混合，将体系温度升高至65°C,恒温搅拌5分钟；随后以每分钟下降1°C的降温梯度冷却体系至20℃）；待分离样品中的单链DNA a即与互补单链DNA-三角银纳米片复合物中的DNA ac依靠沃森-克里克力结合，形成双链DNA，该溶液即为双链-三角银纳米片复合物溶液。
（4）分离
将双链-三角银纳米片复合物溶液中氯化钠的浓度在5秒钟内急剧升高至0.35M，双链-三角银纳米片复合物溶液在迅速升高的盐离子环境中不能稳定存在，会聚集成团簇而从溶液体系中沉淀分离出来，而单链DNA b,DNA c会继续存留于溶液中；从而，将单链DNA a与溶液分离开。
（5）提纯
将双链-三角银纳米片复合物沉淀离心清洗，重新分散于pH为7.4的磷酸缓冲液中，超声；升高体系温度至70℃，则双链-三角银纳米片复合物解杂交；保持温度，将体系内氯化钠的浓度在5秒钟内急剧升高至0.35M，则互补单链DNA-三角银纳米片迅速沉淀聚集，而单链DNA a会继续留在溶液中，从而达到提取单链DNA a的目标。
实施例2
待分离样品溶液为pH 7的磷酸盐缓冲液，其中包含两种单链DNA，序列分别为：
DNA a：5'-CCA AAT GAAGAT ACG TAGCAA ACG ACA GGT-3'；
DNA b：5'-ATC GGT CAG TAA TCT TCA CGA ATA ACA CAA-3'。
其中，浓度分别为DNA a 10-11M,DNA b 10-8M。
采用三角银纳米片分离去除单链DNA a，步骤如下：
（1）采用种子生长法制备三角银纳米片
制备银种子溶液：于5mL 2.5mM的柠檬酸钠水溶液中加入0.25mL 0.5mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠水溶液和0.3mL 10mM新配制的硼氢化钠水溶液，混匀；混合溶液中以2mL/min的速度均匀滴加5mL 0.5mM的硝酸银水溶液，搅拌20分钟，静置24小时，即得银种子溶液。
制备边长为100±10nm三角银纳米片：5mL去离子水中依次加入75μL 10mM的抗坏血酸水溶液和20μL银种子溶液，混匀；以1mL/min的速度均匀滴加3mL 0.5mM的硝酸银水溶液，搅拌；再加入0.5mL 25mM的柠檬酸钠水溶液，搅拌，即得三角银纳米片溶液，调三角银纳米片溶液浓度至1.0nM。。
（2）制备互补单链DNA溶液：
单链DNA b视为目标链，设计5'端修饰有双巯基的互补单链DNA ac：3'-GGT TTA CTTCTA TGC ATC GTT TGC TGT CCA-(SH)2-5'。
制备互补单链DNA ac-三角银纳米片复合物溶液：将DNA ac溶于pH 7.0的磷酸盐缓冲液中，得浓度为20μM的互补单链DNA ac溶液；取互补单链DNA ac溶液100μL，加入500μL 1.0nM的三角银纳米片溶液中，混匀；每4小时提升体系中氯化钠的浓度0.010M,直至体系中氯化钠的浓度达到0.10M，得互补单链DNA-三角银纳米片复合物溶液，低温避光储存备用。
（3）制备
互补单链DNA-三角银纳米片复合物溶液与待分离样品溶液按体积比为1:3的比例混合，将体系温度升高至65°C,恒温搅拌5分钟；随后以每分钟下降1°C的降温梯度冷却体系至20°C）；待分离样品中的单链DNA a即与互补单链DNA-三角银纳米片复合物中的DNA ac依靠沃森-克里克力结合，形成双链DNA，该溶液即为双链-三角银纳米片复合物溶液。
（4）分离
将双链-三角银纳米片复合物溶液中氯化钠的浓度在5秒钟内急剧升高至0.35M，双链-三角银纳米片复合物溶液在迅速升高的盐离子环境中不能稳定存在，会聚集成团簇而从溶液体系中沉淀分离出来，而单链DNA b会继续存留于溶液中；从而，将单链DNAa与单链DNA b分离。
实施例3
待分离样品溶液为pH 9的磷酸盐缓冲液，其中包含两种单链DNA，序列分别为：
DNA a：5′-CCA AAT GAA GAT ACG TAG CAA ACG ACA GGT-3'；
DNA b：5'-ATC GGT CAG TAA TCT TCA CGA ATA ACA CAA-3'。
其中，浓度分别为DNA a 10-10M，DNA b 10-8M。
采用三角银纳米片分离纯化单链DNA a，步骤如下：
（1）采用种子生长法制备三角银纳米片
制备银种子溶液：于5mL 2.5mM的柠檬酸钠水溶液中加入0.25mL 0.5mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠水溶液和0.3mL 10mM新配制的硼氢化钠水溶液，混匀；混合溶液中以2mL/min的速度均匀滴加5mL 0.5mM的硝酸银水溶液，搅拌20分钟，静置24小时，即得银种子溶液。
制备边长为100±10nm三角银纳米片：5mL去离子水中依次加入75μL 10mM的抗坏血酸水溶液和20μL银种子溶液，混匀；以1mL/min的速度均匀滴加3mL 0.5mM的硝酸银水溶液，搅拌；再加入0.5mL 25mM的柠檬酸钠水溶液，搅拌，即得三角银纳米片溶液，调三角银纳米片溶液浓度至0.01nM。
（2）制备互补单链DNA溶液：
单链DNA b视为目标链，设计5'端修饰有双巯基的互补单链DNA ac：3'-GGT TTA CTTCTA TGC ATC GTT TGC TGT CCA-(SH)2-5'。
制备互补单链DNA ac-三角银纳米片复合物溶液：将DNA ac溶于pH 9.0的磷酸盐缓冲液中，得浓度为5μM的互补单链DNA ac溶液；取互补单链DNA ac溶液100μL，加入1500μL 0.01nM的三角银纳米片溶液中，混匀；每4小时提升体系中氯化钠的浓度0.20M,直至体系中氯化钠的浓度达到0.20M，得互补单链DNA-三角银纳米片复合物溶液，低温避光储存备用。
（3）制备
互补单链DNA-三角银纳米片复合物溶液与待分离样品溶液按体积比为1:5的比例混合，将体系温度升高至75°C,恒温搅拌5分钟；随后以每分钟下降1°C的降温梯度冷却体系至室温30℃；待分离样品中的单链DNA a即与互补单链DNA-三角银纳米片复合物中的DNA ac依靠沃森-克里克力结合，形成双链DNA，该溶液即为双链-三角银纳米片复合物溶液。
（4）分离
将双链-三角银纳米片复合物溶液中氯化钠的浓度在5秒钟内急剧升高至0.25M，双链-三角银纳米片复合物溶液在迅速升高的盐离子环境中不能稳定存在，会聚集成团簇而从溶液体系中沉淀分离出来，而单链DNA b会继续存留于溶液中；从而，将单链DNAa与单链DNA b分离。
实施例4
待分离样品溶液为pH 8.0的磷酸盐缓冲液，其中包含两种单链DNA，序列分别为：
DNA a：5′-CCA AAT GAA GAT ACG TAG CAA ACG ACA GGT-3'；
DNA b：5'-ATC GGT CAG TAA TCT TCA CGA ATA ACA CAA-3'。
其中，浓度分别为DNA a 10-9M，DNA b 10-8M。
采用三角银纳米片分离纯化单链DNA a，步骤如下：
（1）采用种子生长法制备三角银纳米片
制备银种子溶液：于5mL 2.5mM的柠檬酸钠水溶液中加入0.25mL 0.5mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠水溶液和0.3mL 10mM新配制的硼氢化钠水溶液，混匀；混合溶液中以2mL/min的速度均匀滴加5mL 0.5mM的硝酸银水溶液，搅拌20分钟，静置24小时，即得银种子溶液。
制备边长为100±10nm三角银纳米片：5mL去离子水中依次加入75μL 10mM的抗坏血酸水溶液和20μL银种子溶液，混匀；以1mL/min的速度均匀滴加3mL 0.5mM的硝酸银水溶液，搅拌；再加入0.5mL 25mM的柠檬酸钠水溶液，搅拌，即得三角银纳米片水溶液，调三角银纳米片溶液浓度至0.5nM。。
（2）制备互补单链DNA溶液：
单链DNA b视为目标链，设计5'端修饰有双巯基的互补单链DNA ac：3'-GGT TTA CTTCTA TGC ATC GTT TGC TGT CCA-(SH)2-5'。
制备互补单链DNA ac-三角银纳米片复合物溶液：将DNA ac溶于pH 8.0的磷酸盐缓冲液中，得浓度为15μM的互补单链DNA ac溶液；取互补单链DNA ac溶液100μL，加入1000μL 0.5nM的三角银纳米片溶液中，混匀；每4小时提升体系中氯化钠的浓度0.015M,直至体系中氯化钠的浓度达到0.15M（0.10-0.20M），得互补单链DNA-三角银纳米片复合物溶液，低温避光储存备用。
（3）制备
互补单链DNA-三角银纳米片复合物溶液与待分离样品溶液按体积比为1:2的比例混合，将体系温度升高至70°C,恒温搅拌5分钟；随后以每分钟下降1°C的降温梯度冷却体系至25°C；待分离样品中的单链DNA a即与互补单链DNA-三角银纳米片复合物中的DNA ac依靠沃森-克里克力结合，形成双链DNA，该溶液即为双链-三角银纳米片复合物溶液。
（4）分离
将双链-三角银纳米片复合物溶液中氯化钠的浓度在5秒钟内急剧升高至0.27M，双链-三角银纳米片复合物溶液在迅速升高的盐离子环境中不能稳定存在，会聚集成团簇而从溶液体系中沉淀分离出来，而单链DNA b会继续存留于溶液中；从而，将单链DNAa与单链DNA b分离。
实施例5
待分离样品溶液为pH 7.4的磷酸盐缓冲液，其中包含两种单链DNA，浓度皆为10-8M，序列分别为：
DNA a：5'-CCA AAT GAA GAT ACG TAG CAA ACG ACA GGT-3'；
DNA b：5'-ATC GGT CAG TAA TCT TCA CGA ATA ACA CAA-3'。
采用三角银纳米片分离纯化单链DNA a，步骤如下：
（1）采用种子生长法制备三角银纳米片
制备银种子溶液：于5mL 2.5mM的柠檬酸钠溶中加入0.25mL 0.5mg/mL的聚苯乙烯磺酸钠溶液和0.3mL 10mM新配制的硼氢化钠溶液，混匀；混合溶液中以2mL/min的速度均匀滴加5mL 0.5mM的硝酸银溶液，搅拌20分钟，静置24小时，即得银种子溶液。
制备边长为100±10nm三角银纳米片：5mL去离子水中依次加入75μL 10mM的抗坏血酸溶液和20μL银种子溶液，混匀；以1mL/min的速度均匀滴加3mL 0.5mM的硝酸银溶液，搅拌；再加入0.5mL 25mM的柠檬酸钠溶液，搅拌，即得三角银纳米片溶液，调三角银纳米片溶液浓度至0.3nM。
（2）制备互补单链DNA溶液：
单链DNA b视为目标链，设计5'端修饰有双巯基的互补单链DNA ac：3'-GGT TTA CTTCTA TGC ATC GTT TGC TGT CCA-(SH)2-5'。
制备互补单链DNA ac-三角银纳米片复合物溶液：将DNA ac溶于pH 7.4的磷酸盐缓冲液中，得浓度为10μM的互补单链DNA ac溶液；取互补单链DNA ac溶液100μL，加入900μL 0.3nM的三角银纳米片溶液中，混匀；每4小时提升体系中氯化钠的浓度0.017M,直至体系中氯化钠的浓度达到0.17M（0.10-0.20M），得互补单链DNA-三角银纳米片复合物溶液，低温避光储存备用。
（3）制备
互补单链DNA-三角银纳米片复合物溶液与待分离样品溶液按体积比为1:1的比例混合，将体系温度升高至70°C,恒温搅拌5分钟；随后以每分钟下降1°C的降温梯度冷却体系至室温；待分离样品中的单链DNA a即与互补单链DNA-三角银纳米片复合物中的DNA ac依靠沃森-克里克力结合，形成双链DNA，该溶液即为双链-三角银纳米片复合物溶液。
（4）分离
将双链-三角银纳米片复合物溶液中氯化钠的浓度在5秒钟内急剧升高至0.30M，双链-三角银纳米片复合物溶液在迅速升高的盐离子环境中不能稳定存在，会聚集成团簇而从溶液体系中沉淀分离出来，而单链DNA b会继续存留于溶液中；从而，将单链DNAa与单链DNA b分离。
实施例6分离效果分析
将实施例1至4中存留DNA b的溶液透析清洗，利用标记了拉曼分子的金纳米球作为拉曼增强手段，对溶液中DNA a和DNA b的含量进行了检测，结果见图3。其中，线a、b、c、d分别对应于实施例1至4的分离后溶液检测结果。
图中，1080、1589cm-1处拉曼峰的强度对应DNA a的含量，1332cm-1处拉曼峰的强度对应DNA b的含量。除背景噪声外，溶液中1080,1589cm-1处拉曼峰的强度十分微弱，说明实施例2至5中的分离后溶液中均不含目标DNA a，即DNA a完全被分离出了溶液体系。
Claims (1)
1.三角银纳米片在分离单链DNA中的应用，其特征在于：包括以下步骤：
(1)制备与待分离单链DNA互补的互补单链DNA，并溶于磷酸盐缓冲液中，加入三角银纳米片水溶液混匀，加氯化钠调节混合溶液中氯化钠浓度至0.10-0.20M，即得互补单链DNA-三角银纳米片复合物溶液；三角银纳米片边长为90-110nm；三角银纳米片水溶液中三角银纳米片浓度为0.01nM-1.0nM；三角银纳米片溶液与互补单链DNA溶液的体积比为(5-15):1；互补单链DNA溶液中互补单链DNA浓度为5-20μM；所述互补单链DNA的5'端修饰有双巯基；所述磷酸盐缓冲液pH为7.4；
(2)将待分离单链DNA磷酸盐缓冲液与互补单链DNA-三角银纳米片复合物溶液混匀，升温至65-75℃杂交反应，后冷却至20-30℃，即得双链-三角银纳米片复合物溶液；待分离单链DNA磷酸盐缓冲液中待分离单链DNA浓度为10-11-10-8M，pH为7-9；互补单链DNA-三角银纳米片复合物溶液与待分离单链DNA磷酸盐缓冲液的体积比为(1-5)：1；
(3)5秒内调双链-三角银纳米片复合物溶液中氯化钠浓度至0.27M，过滤，即可将待分离单链DNA分离。
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2013
- 2013-01-11 CN CN201210516032.8A patent/CN103074327B/zh not_active Expired - Fee Related
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| 刘敏等.双巯基DNA修饰的银纳米棱镜的制备及其在痕量DNA检测与分离中的应用.《豫赣黑苏鲁五省光学(激光)学会联合学术2012年会论文摘要集》.2012, * |
| 刘敏等.双巯基DNA修饰的银纳米棱镜的制备及其在痕量DNA检测与分离中的应用.《豫赣黑苏鲁五省光学(激光)学会联合学术2012年会论文摘要集》.2012,第65页. * |
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