KR100813271B1 - 금 나노 로드를 이용한 세포 또는 바이러스의 파괴 및핵산의 증폭을 수행하는 방법 및 장치 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 또는 바이러스를 포함하는 용액에 금 나노 로드를 첨가하는 단계 및 상기 금 나노 로드에 레이저를 조사하여 세포 또는 바이러스를 파괴하는 단계를 포함하는 세포 또는 바이러스의 파괴 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 마이크로 챔버에 세포 또는 바이러스를 포함하는 용액 및 금 나노 로드를 주입하는 단계; 상기 금 나노 로드에 레이저를 조사하여 세포 또는 바이러스를 파괴하는 단계; 및 상기 마이크로 챔버에 PCR 혼합물을 첨가하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 세포 또는 바이러스의 파괴 및 핵산 증폭을 단일 마이크로 챔버에서 연속적으로 수행하는 방법 및 장치에 관한 것이다.

Description

금 나노 로드를 이용한 세포 또는 바이러스의 파괴 및 핵산의 증폭을 수행하는 방법 및 장치{Method and apparatus for disrupting cell or virus and amplifying nucleic acids using gold nanorod}
도 1은 종래기술에 공지되어 있는, 금 나노 로드의 횡단면의 직경 및 길이의 비율에 따라 흡수하는 광선의 파장이 달라지는 것을 나타내는 그래프이다.
도 2는 마이크로 자성 비드와 본 발명의 나노 물질의 크기를 비교 하여 모식적으로 나타낸 그림이다.
도 3은 본 발명에 이용된 실리카 코팅된 Fe2O3 및 금 나노 비드들을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조한 금 나노 로드의 TEM 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따라 제조한 금 나노 로드의 TEM 사진이다.
도 6은 도 4 및 도 5의 금 나노 로드의 파장 300 nm 내지 1400 nm 범위의 레이저에 대한 흡광도를 측정한 결과를 다른 나노 물질들과 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 마이크로 자성 비드 및 본 발명에 따른 금 나노 로드를 각각 포함하는 수용액에 808 nm의 레이저를 0 내지 90초 동안 조사하면서, 수용액의 온도를 측 정한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 순수 정제된 DNA를 재료로 사용하고 첨가된 비드가 실시간 PCR의 효율에 미치는 영향을 살펴 본 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 대장균을 재료로 사용하고 첨가된 비드의 종류에 따른 게놈 DNA 추출에 이은 실시간 PCR 효율을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 금 나노 로드를 이용한 세포 또는 바이러스의 파괴 및 핵산의 증폭을 수행하는 방법 및 장치에 관한 것이다.
금 나노 로드(gold nanorod)는 막대 형태의 금 나노입자로서, 가시광선 내지 근적외선 영역에서 광 흡수 특성이 우수한 것으로 알려져 있다. 금 나노 로드는 도 1에 나타낸 바와 같이 금 나노 로드의 횡단면의 직경(이하, 간단히 "직경"이라고 한다) 및 길이의 비율에 따라 흡수하는 광선의 파장이 달라진다는 내용이 공지되어 있다(M.B. Mohamed et al. Chemical Physics Letters 317: 517-523(2000)). 도 1은 금 나노 로드의 직경에 대한 길이의 비율이 각각 2.0, 2.6, 3.3, 4.3, 및 5.4인 금 나노 로드에 대한 흡수 스펙트럼 i, ii, iii, iv, 및 v를 나타낸다.
세포 용해는 통상적으로 기계적, 화학적, 열적, 전기적, 초음파 및 마이크로웨이브 방법으로 수행된다 (Michael T. Taylor 등, Anal. Chem., 73, 492-496 (2001)).
레이저는 세포를 파괴하는데 많은 장점을 가지며, LOC에 잘 적용될 수 있다 (Huaina Li 등, Anal Chem, 73, 4625-4631 (2001)).
미국 특허 공개공보 2003/96429 A1 에는 레이저 유도된 세포 용해 시스템이 기재되어 있다. 레이저만을 이용했을 때 세포를 효과적으로 용해하지 못하였다. 투명도가 높은 용액에 대장균을 넣고 실험한 결과, 레이저만을 조사한 경우에 낮은 세포 용해 효율을 보이고 있음을 확인하였는데, 150초 동안 레이저를 조사한 후의 DNA 농도는 3.77ng/㎕이었으나, 95℃에서 5분 동안 끓인 후의 DNA 농도는 6.15ng/ul 이었다. 이는 레이저 에너지가 효과적으로 세포에 전달되지 않았기 때문이다.
미국 특허 제6,685,730호에는 증가된 조직 복구를 위한 광학적으로 흡수하는 나노입자가 기재되어 있다. 이 방법은 하나 이상의 파장에서 빛을 흡수하는 1 내지 1000 나노미터 크기의 나노입자를 연결될 조직에 전달하고, 상기 나노입자를 나노입자에 의해 흡수된 하나 이상의 파장의 빛에 노출하는 것을 포함하는 조직을 연결하는 방법에 대한 것이다. 이 방법은 레이저와 나노입자를 이용하여 세포의 기능만 잃게 하는 세포를 파괴하는 방법이나, 세포와 금 나노 로드를 포함한 용액을 이용하여 세포를 파괴하는 방법에 대한 언급은 없다.
기존의 LIMBS(Laser-Irradiated Magnetic Beads System)에서는 마이크로 크기의 자성 비드를 이용하여 세포를 파괴하고 유전 물질을 얻었다. 그러나, 이 경우 자성 비드가 제거되어야만 그 이후의 프로세스가 가능하기 때문에 실제 LOC (Lab-on-a-Chip) 분야에서 사용되기 위해서는 이를 제거하기 위한 막이 사용되거나 또는 비드가 아닌 표면 구조물로 제작되어야 하며, 이 경우 추가 비용이 발생하는 것뿐만 아니라 그 효율도 낮은 문제점을 가지고 있었다. 또한, 자성 비드의 경우에는 SYBR Green 염료와 같은 실시간 PCR용 형광물질을 흡착하므로, 이러한 염료를 사용하는데 제한이 많았다.
　이에, 본 발명자들은 상기 종래 기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 마이크로 자성 비드를 금 나노 로드로 대체함으로써 표면적을 훨씬 증가시켜 효율을 높임과 동시에 소량으로도 동일한 세포 파괴 효과를 얻을 수 있었다. 특히, 도 8의 A에서 보여주는 바와 같이 금 나노 로드를 이용하는 경우에 용액의 광학적 성질에 큰 영향을 주지 않으므로 이들 물질을 사용한 후에 제거하는 공정이 생략되더라도 이후에 진행되는 실시간 PCR에 의한 유전 물질 검출이 가능하여 세포 또는 바이러스의 파괴 후에 금 나노 로드의 제거 없이 PCR을 연속적으로 수행할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 목적은 금 나노 로드를 이용하여 효율적으로 세포 또는 바이러스를 파괴하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 세포 또는 바이러스의 파괴 후에 금 나노 로드의 제거 없이 PCR을 수행할 수 있는 세포 또는 바이러스의 파괴 및 핵산 증폭을 단일 마이크로 챔버에서 연속적으로 수행하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 세포 또는 바이러스 파괴 챔버; 레이저 발생부; 및 가열부 및 냉각부를 포함하는, 세포 또는 바이러스의 파괴 및 핵산의 증폭을 단일 챔버에서 수행하는 장치에 관한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 또는 바이러스를 포함하는 용액에 금 나노 로드를 첨가하는 단계; 및
상기 금 나노 로드에 레이저를 조사하여 세포 또는 바이러스를 파괴하는 단계를 포함하는 세포 또는 바이러스의 파괴 방법을 제공한다.
본 발명은 기존에 마이크로 자성 비드를 이용하여 세포 또는 바이러스를 파괴하던 방법에서 마이크로 자성 비드 대신에 금 나노 로드를 이용하여 세포 또는 바이러스를 파괴하는 방법에 대한 것이다. 금 나노 로드에 레이저를 조사하면 하기 실시예에서 보는 바와 같이, 마이크로 자성 비드보다 수용액의 온도를 더 효과적으로 상승시킨다는 것을 알 수 있다. 수용액의 온도 상승으로 인해 세포 또는 바이러스는 효과적으로 파괴될 수 있다. 도 2는 마이크로 자성 비드와 본 발명의 나노 물질의 크기를 비교한 것을 모식적으로 나타낸 것이다. 도 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 나노 물질은 마이크로 자성 비드에 비해 그 크기가 현저하게 적음을 알 수 있다. 이러한 나노 물질의 크기가 현저하게 작음으로 인해, 용액의 광학적 성질에 큰 영향을 주지 않을 수 있으며, 적은 양을 넣어도 용액 내의 다른 물질과 접촉하는 표면적이 훨씬 증가하므로 레이저 조사에 의한 에너지 전달에 훨씬 유리하다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이크로 챔버에 세포 또는 바이러스를 포함하는 용액 및 금 나노 로드를 주입하는 단계;
상기 금 나노 로드에 레이저를 조사하여 세포 또는 바이러스를 파괴하는 단 계; 및
상기 마이크로 챔버에 PCR 혼합물을 첨가하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 세포 또는 바이러스의 파괴 및 핵산 증폭을 단일 마이크로 챔버에서 연속적으로 수행하는 방법을 제공한다.
본 발명은 자성 비드를 나노 물질로 대체함으로써 이들의 제거가 없이도 이후의 실시간 PCR 검출이 가능한 시스템을 만들었다. 본 발명에 이용된 나노 비드들의 모식도를 도 3에 나타내었다. 금 나노 물질이 함유된 용액에 레이저가 조사되면 용액의 온도가 효과적으로 상승함으로써, 용액 내의 병원균 또는 세포를 파괴하여 세포막 안에 존재하던 DNA, RNA와 같은 유전물질이 용액으로 방출된다. 금 나노 물질은 그 자체가 광학적으로 PCR 기기 또는 사용되는 형광 물질을 방해하지 않으므로, 레이저 조사 이전에 미리 시료와 혼합된 예비 혼합된(pre-mixed) PCR 반응 용액에 의해 바로 실시간 PCR의 수행이 가능하다. 또한, 실시간 PCR의 결과는 별도의 분석 챔버로 옮겨지지 않더라도 초기에 시료가 투여된 세포 파괴 및　PCR 칩을 동일하게 사용하여 병원균의 감염 여부를 바로 알 수 있다. 따라서, 단일 마이크로 챔버에서 세포 또는 바이러스의 파괴 및 핵산 증폭을 연속적으로 수행할 수 있는 것이다. 통상적인 절차에서는 세포 또는 바이러스 파괴 및 핵산 증폭이 별개의 마이크로 챔버에서 수행되어 유전자 분석에 시간 및 비용이 많이 소요되었으며, 시료 교차 오염의 가능성이 높았다. 본 발명에서는 세포 파괴 및 핵산 증폭을 통합하여 분석 절차를 단순화시키고, 교차 오염의 위험을 줄였다.
본 발명은 마이크로 챔버에 세포 또는 바이러스를 포함하는 용액 및 금 나노 로드를 주입하는 단계를 포함한다. 상기 세포 또는 바이러스를 포함하는 용액은 타액, 소변, 혈액, 혈청, 세포 배양액 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 용액은 동물세포, 식물세포, 박테리아, 바이러스, 박테리오파아지 등 핵산을 가지고 있는 것이면 가능하다. 바람직하게는, 마이크로 챔버에 세포 또는 바이러스를 포함하는 용액 및 금 나노 로드를 주입한 후에, 상기 혼합물을 진동시킴으로써 세포 또는 바이러스의 파괴 효율을 높일 수 있다.
본 발명은 또한 상기 금 나노 로드에 레이저를 조사하여 세포 또는 바이러스를 파괴하는 단계를 포함한다. 상기 금 나노 로드에 레이저를 조사하게 되면, 용액의 온도 상승으로 인해, 세포 또는 바이러스는 효율적으로 파괴될 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 금 나노 로드는 조사되는 특정 파장의 광선을 흡수할 수 있는 나노 로드이어야 한다. 금 나노 로드의 길이는 10 nm 내지 500 nm일 수 있으며, 금 나노 로드의 직경 및 길이의 비율은 바람직하게는 1:2 내지 1:50일 수 있다. 금 나노 로드는 원형 금 나노 비드에 비하여 특정 파장의 광선을 흡수하여 그 에너지를 열로 전환하는데 훨씬 효율적이다.
본 발명의 방법에서, 상기 레이저는 펄스 레이저 또는 연속파동 레이저를 포함할 수 있다. 너무 낮은 레이저 출력에서는 효율적으로 세포 또는 바이러스를 파괴할 수 없으며, 레이저 출력은 연속파동(CW)의 경우 10mW 이상, 펄스 레이저의 경우 1mJ/펄스 이상을 전달해 주어야 한다. 바람직하게는 상기 펄스 레이저가 3mJ/펄스 이상이고, 연속파동 레이저가 100mW 이상의 출력을 가진다. 이는 연속파동의 경우 10mW 미만이고, 펄스 레이저의 경우 1mJ/펄스 미만이면 세포를 파괴하는 충분한 에너지 전달이 되지 않는 문제가 발생하기 때문이다.
본 발명의 방법에서, 상기 레이저는 400nm 이상의 파장대에서 발생하는 것이 바람직하다. 이는 400nm 미만의 파장에서는 DNA의 변성 또는 손상의 문제가 발생하기 때문이다. 더욱 바람직하게는, 상기 레이저는 금 나노 로드가 흡수하는 특정 파장대에서 발생하는 것이어야 한다. 금 나노 로드는 하기 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 직경 및 길이의 비율에 따라 흡수하는 파장의 범위가 달라질 수 있다. 짧은(short) 금 나노 로드일 때, 직경 및 길이의 비율은 1:2 내지 1:5이며, 이 때 레이저는 700nm~900nm의 파장대에서 발생하는 것이 바람직하다. 긴(long) 금 나노 로드일 때, 직경 및 길이의 비율은 1:10 내지 1:50이며, 이 때 레이저는 800nm 이상의 파장대에서 발생하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 레이저는 하나 이상의 파장대에서 발생할 수 있다. 즉, 레이저는 상기 파장 범위 내의 하나의 파장일 수도 있고, 파장이 서로 상이한 2 이상의 파장일 수도 있다.
상기 금 나노 로드는 당해 기술분야에 공지되어 있는 금 나노 로드의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 예를 들어 전해법, 화학 환원법, 광환원법 등이 있다. 전해법은 양이온성 계면활성제를 함유하는 수용액을 정전류 전해하여, 양극의 금판 등으로부터 금 클러스터를 용탈(溶脫)시켜 금 나노 로드를 생성한다. 상기 계면활성제는 질소 원자에 4개의 소수성 치환기가 결합된 구조를 갖는 4급 암모늄이 사용되고, 또 자율적인 분자 집합체를 형성하지 않는 화합물, 예를 들어 테트라도데실암모늄브로마이드(TDAB) 등이 첨가되어 있다. 금의 공급원은 양극의 금판으로 부터 용탈되는 금 클러스터이고, 염화금산 등의 금염은 사용되고 있지 않다. 전해 중에는 초음파를 조사하여, 용액 중에 은판을 침지시켜 금 나노 로드의 성장을 촉진한다(Yu, Y. -Y. Yu, S. -S. Chang, C. -L. Lee, C. -L. Lee, C.R.C. Wang, J. Phys. Chem. B, 101, 6661(1997) 참조). 화학환원법은 NaBH4에 의해서 염화금산(HAuCl4)을 환원하여 금 나노 로드를 생성시키고, 이 금 나노 로드를 종(seed) 입자로 하여 용액 속에서 성장시킴으로써 그 나노 로드를 얻는다. 상기 종 입자와 성장 용액에 첨가하는 염화금산의 비 및 성장시간에 의해 생성되는 금 나노 로드의 길이가 결정된다(N.R.Jana, L. Gearheart, C.J.Murphy, J. Phys. Chem. B, 105, 4065(2001) 참조). 광환원법은 전해법과 거의 같은 용액에 염화금산을 첨가하여, 자외선 조사에 의해 염화금산을 환원한다. 조사에는 저압 수은 램프를 사용하고 있다. 광 환원법에서는 종 입자를 생성시키지 않고 금 나노 로드를 생성시킬 수 있다. 길이의 제어는 조사 시간에 의해 가능하다(F.Kim, J.H.Song, R. Yang, J. Am. Chem. Soc., 124, 14316(2002) 참조).
본 발명의 방법에서, 상기 금 나노 로드의 제거 없이 PCR을 수행할 수 있다. 즉, 금 나노 로드를 이용하여 세포 또는 바이러스를 파괴한 후에, 금 나노 로드를 제거하고 PCR을 수행할 수도 있지만, 굳이 금 나노 로드를 제거하지 않아도 금 나노 로드는 용액의 광학적 성질에 큰 영향을 주지 않으므로 실시간 PCR을 효율적으로 수행할 수 있는 것이다. 따라서, 마이크로 자성 비드를 이용한 경우에는 반드시 마이크로 자성 비드를 제거해야만 실시간 PCR을 수행할 수 있는 반면, 본 발명의 경우에는 금 나노 로드를 제거하지 않아도 되므로 랩온어칩을 수행하는데 더욱 적합하다는 것을 알 수 있다.
본 발명은 상기 마이크로 챔버에 PCR 혼합물을 첨가하여 PCR을 수행하는 단계를 포함한다. 금 나노 로드에 의해 파괴된 세포 또는 바이러스의 용해물(lysate)에 다른 추가적인 단계 없이 바로 일반적인 PCR 혼합물을 첨가하여 실시간 PCR을 수행하면 원하는 PCR 산물을 얻을 수 있는 것이다. PCR 수행시, SYBR Green 염료와 같은 형광 물질을 함께 첨가하면, PCR 산물을 효율적으로 검출할 수 있다.
"PCR"이란 중합효소 연쇄반응을 의미하는 것으로, 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 상기 PCR 외에도, 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 있다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시료 도입구가 형성되어 있어 상기 시료 도입구를 통해 세포 또는 바이러스를 포함하는 시료와 금 나노 로드를 수용하는 세포 또는 바이러스 파괴 챔버;
상기 챔버에 부착되어, 레이저를 공급하는 레이저 발생부; 및
상기 챔버를 가열 및 냉각시키는 가열부 및 냉각부를 포함하는, 세포 또는 바이러스의 파괴 및 핵산의 증폭을 단일 챔버에서 수행하는 장치를 제공한다.
본 발명의 세포 또는 바이러스의 파괴 및 핵산의 증폭 장치는 본질적으로 세포 또는 바이러스 파괴 챔버, 레이저 발생부, 및 가열부 및 냉각부로 이루어진다. 본 발명의 장치에서, 세포 또는 바이러스 파괴 챔버는 시료 도입구가 형성되어 있어 상기 시료 도입구를 통해 세포 또는 바이러스를 포함하는 시료와 금 나노 로드를 수용할 수 있다. 시료는 시료 도입구를 통해 투입된다. 시료는 금 나노 로드와 잘 혼합된다. 이 때 잘 혼합되게 하는 작용은 진동기를 통해서 이루어질 수 있다. 계속적으로 진동하면서 레이저를 조사한다. 세포 또는 바이러스 파괴 챔버는 레이저의 파장을 충분히 통과시킬 수 있는 재질이어야 한다.
레이저 발생부는 상기 챔버에 부착되어, 레이저를 공급하는 파트이다.
가열부 및 냉각부는 상기 마이크로 챔버를 가열 및 냉각시키는 파트로서, PCR 혼합물이 마이크로 챔버 내로 도입되면, PCR 조건에 따라 마이크로 챔버의 온도를 가열 및 냉각을 통해 조절하는 것이다.
본 발명의 장치는 상기 챔버와 마이크로채널을 통해 연통되며, 상기 챔버에 PCR 혼합물을 공급하는 PCR 혼합물 저장부를 추가로 구비할 수 있다. 세포 또는 바이러스가 파괴되어 핵산이 방출되면, PCR 혼합물 저장부에서 상기 챔버에 PCR 혼합물을 공급하게 되며, 공급된 PCR 혼합물과 방출된 핵산을 이용하여 핵산을 증폭하게 된다.
본 발명의 장치는 상기 챔버에 부착되어, 상기 챔버 내에서 시료와 금 나노 입자를 혼합하는 진동기(vibrator)를 추가로 구비할 수 있다. 상기 진동기는 초음파세척기, 전기장을 이용한 진동기, 기계적 진동기, 압전물질 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 또는 바이러스의 파괴 및 핵산 증폭 장치를 포함하는 랩온어칩(lab-on-a-chip)을 제공한다. 본 발명의 세포 또는 바이러스의 파괴 및 핵산 증폭 장치는 각 기능적 구성요소를 공지된 마이크로플루이딕스 기술 및 MEMS 디바이스를 이용하여 프로세스-온-어-칩(process-on-a-chip)으로 구현하는 것이 가능할 뿐만 아니라, 더 나아가서는 랩-온-어-칩(lab-on-a-chip)으로 구현될 수도 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 금 나노 로드 의 제조(1)
삼각 플라스크에 2.5×10-4 M HAuCl4 및 2.5x10-4 M 트리소듐 시트레이트를 함유하는 수용액 20 mL를 제조하였다. 그런 다음, 교반하면서 차가운 0.1M NaBH4 용액 0.6 mL를 한번에 부가하였다. 그 용액은 NaBH4 용액을 부가하자마자 즉시 분홍색으로 변화하였으며, 이는 입자의 형성을 나타낸다. 이 용액을 제조한지 2 내지 5 시 간 이내에 종(seed) 입자용액으로서 사용하였다.
깨끗한 시험관에, 2.5×10-4 M HAuCl4 및 0.1 M 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)를 함유하는 성장 용액 10 mL를 0.1 M 아스코르브산 용액 0.05 mL와 혼합하였다. 그런 다음, 상기 제조된 종 입자용액 0.025 ml를 부가하고 교반 또는 진탕을 전혀 수행하지 않았다. 40 분 동안 방치한 결과, 금 나노 로드를 획득하였다. 획득된 금 나노 로드의 TEM 사진을 도 4에 나타내었다. 획득된 금 나노 로드는 직경이 16.4 nm 이고 장축의 길이가 49±7nm이며, 직경 및 길이의 비율은 약 1:3의 비율로 나타났다.
실시예 2: 금 나노 로드 의 제조(2)
상기 실시예 1에 나타낸 금 나노 로드의 제조방법과 동일한 방법으로 수행하되, CTAB의 농도를 5 mM로 하고, 성장시간을 2시간으로 하여, 긴 금 나노 로드를 제조하였다. 획득된 금 나노 로드의 TEM 사진을 도 5에 나타내었다. 획득된 금 나노 로드는 직경은 15.4nm 이고 길이는 254±43 nm이고, 직경 및 길이의 비율은 1:13.7 내지 1:19.3으로 나타났다.
실시예 3: 금 나노 로드의 흡광도 측정
상기 실시예 1 및 2에서 제조한 금 나노 로드에 대해 300 nm 내지 1400 nm 범위의 레이저에 대한 흡광도를 측정하고 그 결과를 다른 나노 물질과 비교하였다. 측정 방법은 UV-Vis 스펙트로미터를 사용하여 1mg/ml 농도의 로드 수용액을 1cm3의 쿼츠 셀(quartz cell)에 넣고 이를 스펙트로미터에 장착하여 측정하였고 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 따르면, 실시예 1에서 제조된 직경 및 길이의 비율이 약 1:3인 금 나노 로드가 750 내지 910 nm 범위에서 높은 흡광도를 나타내었으며, 이에 반해 실시예 2에서 제조된 직경 및 길이의 비율이 1:13.7 ~ 1:19.3인 금 나노 로드는 910 nm 이상의 파장에서 높은 흡광도를 나타내었다. 도 6에서 보여주는 바와 같이, 길고 짧은 2가지 금 나노 로드 모두 다른 나노 비드에 비하여 808 nm 파장에서 높은 흡광도를 보이고 있으며, 이러한 결과로부터, 금 나노 로드의 직경 및 길이의 비율에 따라 레이저의 파장 범위를 적절하게 조절하여 효율적으로 세포 또는 바이러스를 파괴할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 4: 금 나노 로드의 수용액 온도 상승 효과 측정
실시예 2에서 제조된 금 나노 로드를 이용하여 수용액 내에서의 온도 상승 효과를 측정하였다. 실시예 2에서 제조된 금 나노 로드 8mg을 1 mL의 물에 부가하고, 파장 808 nm의 레이저를 0초 내지 120초 동안 조사하면서, 수용액의 온도를 측정하였다. 레이져 파워는 1.5W를 사용하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 대조군으로서, 비드 없는 증류수(DW) 및 마이크로 자성 비드 (Dynabeads
Figure 112006082108414-pat00001
M-270 Carboxylic Acid, DYNAL, 노르웨이)를 이용하였다.
도 7에서 알 수 있는 바와 같이, 금 나노 로드 및 마이크로 자성 비드의 경 우에 증류수보다 수용액 온도 상승 효과가 현저하였으며, 그 중에서도 금 나노 로드가 마이크로 자성 비드보다 수용액 온도 상승 효과가 현저함을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 금 나노 로드를 이용하면 효율적으로 세포 또는 바이러스를 파괴할 수 있음을 예상할 수 있는 것이다.
실시예 5: 금 나노 로드 의 PCR 저해 효과 측정
금 나노 로드의 PCR 저해 효과를 알아보았다. 금 나노 물질은 도 3에 기재된 20nm 금 구형 입자 및 실시예 2에서 제조된 금 나노 로드를 이용하였다. 대조군으로서, 비드 없는 증류수(DW) 및 마이크로 자성 비드 (Dynabeads
Figure 112006082108414-pat00002
M-270 Carboxylic Acid, DYNAL, 노르웨이)를 첨가하여 PCR을 수행하였다. PCR은 TMC1000(Samsung) 기기를 이용하여 실험하였다. TMC1000은 실리콘 기재 칩 상에서 정량 PCR을 하는 장비이다. 실험에 이용된 주형 DNA는 대장균(E. coli) BL21으로부터 정제된 게놈 DNA이다. PCR 프라이머는 정방향 프라이머(YCCAKACTCCTACGGGAGGC; 서열번호 1) 및 역방향 프라이머(GTATTACCGCRRCTGCTGGCAC; 서열번호 2)를 이용하였다. PCR 혼합물은 Roche사의 LightCycler
Figure 112006082108414-pat00003
FastStart DNA Master SYBR Green I을 사용하여 실시간 PCR을 관찰하였다. 이는 간단히 1× PCR 완충액, 5.0 mM MgCl2, 200μM dNTP, 각각 0.2μM 프라이머, 0.1 mg/ml BSA, FastStart Taq DNA 중합효소, SYBR Geen I 염료로 이루어진다. PCR 온도 조건은 94℃ 1분 1 사이클, 그리고 94℃ 5초, 62℃ 5초, 72℃ 20초를 40 사이클 동안 수행하였고, 생성된 PCR 산물은 TMC1000 (Samsung)을 이용하여 실시간으로 모니터링하였다.
도 8의 A에서 보이는 바와 같이 PCR 칩에 비드를 첨가했을 때, 불투명하게 보이는 마이크로 자성 비드와는 달리, 본 발명의 금 나노 로드는 투명하여 광학적으로 문제가 없음을 알 수 있었다.
도 8의 B는 첨가된 비드의 종류에 따른 실시간 PCR 효율을 나타내는 그래프이다. 청색 다이아몬드는 비드를 첨가하지 않은 경우이며, 녹색 삼각형은 실시예 1에서 제조된 짧은 금 나노 로드를 이용한 경우이며, 황색 사각형은 실시예 2에서 제조된 긴 금 나노 로드를 이용한 경우이며, 적색 원형은 마이크로 자성 비드를 이용한 경우이다. 도 8에서 보여주는 바와 같이, 마이크로 자성 비드의 경우에는 형광이 전혀 검출되지 않았으며, 본 발명의 금 나노 로드의 경우에는 가장 높은 형광을 관찰할 수 있었다. 자주색 사각형으로 표시된 20 nm 금 구형 입자의 경우에는 SYBR Green 염료의 형광 검출이 감소하는 것을 관찰할 수 있었으며, 보라색 X자로 표시된 실리카 코팅된 Fe2O3 는 PCR 저해 효과가 있었다.
따라서, 본 발명의 금 나노 로드는 SYBR Green 염료를 이용한 실시간 PCR에 전혀 저해 효과가 없으므로, 금 나노 로드의 제거 없이도 실시간 PCR을 직접 수행할 수 있다는 것을 알 수 있는 것이다.
실시예 6: 단일 챔버에서 DNA 추출에 이은 실시간 PCR
단일 챔버에서 대장균으로부터 게놈 DNA 추출에 이은 실시간 PCR이 연속적으 로 가능한지를 알아보았다. 상기 실시예 5에 기재된 대장균 및 PCR 조건을 이용하여 단일 챔버에서 대장균으로부터 게놈 DNA를 추출한 후, 바로 실시간 PCR을 수행하였다. 도 9는 첨가된 비드의 종류에 따른 게놈 DNA 추출에 이은 실시간 PCR 효율을 나타내는 그래프이다. 도 9에서, 청색 다이아몬드는 비드를 첨가하지 않은 경우이며, 황색 사각형은 실시예 2에서 제조된 긴 금 나노 로드를 이용한 경우이며, 녹색 삼각형은 실시예 1에서 제조된 짧은 금 나노 로드를 이용한 경우이며, 적색 원형은 마이크로 자성 비드를 이용한 경우이다. 상기 실시간 PCR 결과에 대한 Ct 값 및 Rn 값을 하기 표 1에 정리하였다. 형광 측정값인 Ct는 역치 사이클(threshold cycle) 수치로 이는 DNA가 실시간으로 증폭되는 과정에서 몇 사이클 후에 형광 신호가 검출될 수 있는 소정의 역치 (fixed threshold)를 넘어서는지를 나타냄으로써 초기 DNA 양을 계산하는 방법으로, 같은 조건에서 실험시 Ct 값이 적을수록 PCR의 효율이 높고, 3.5 사이클의 차이는 100배의 DNA 농도 차이를 나타내는 단위이다. Rn 값은 PCR 반응으로 증폭된 DNA로부터 발생되는 형광 신호의 세기를 의미하는 수치이다.
시료 Ct Rn
대장균 단독 26.84 0.208
대장균 + 긴 금 나노 로드 22.07 0.634
대장균 + 짧은 금 나노 로드 21.60 0.679
대장균 + 마이크로 자성 비드 N/A 0.001
PBS N/A 0.148
상기 도 9 및 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 마이크로 자성 비드를 이용한 경우에는 PCR 저해 효과로 인해 PCR 산물이 전혀 관찰되지 않은 반면, 본 발명의 길거나 짧은 금 나노 로드를 이용한 경우에는 비드를 가하지 않은 경우에 비하여 100배 정도 많은 양의 DNA를 대장균으로부터 추출하고, 그 결과를 PCR 저해 효과 없이 바로 실시간 PCR로 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 방법을 이용하면 세포 또는 바이러스의 파괴 효율의 증가는 물론, 파괴 후에 금 나노 로드의 제거 없이도 PCR을 효율적으로 수행하므로, 동일한 챔버에서 세포 또는 바이러스의 파괴 및 핵산의 증폭을 효율적으로 수행할 수 있는 것이다.
본 발명에 따르면, 금 나노 로드의 제거 공정이 필요 없으며, SYBR Green을 포함한 다양한 종류의 형광 물질을 함께 이용할 수 있으며, 또한 제조 원가가 저렴하며, 마이크로 자성 비드를 사용하는 것에 비하여 소량으로 동일한 효과를 얻을 수 있다. 특히 금 나노 물질들은 인체에 무해하며 친환경적으로 알려져 있어 여러 의약품 개발에도 많이 응용될 수 있다.
또한, PCR 이후의 DNA 정제 농축 과정에서도 특별히 나노 물질의 제거가 필요 없기 때문에 다른 효소를 사용한 분석, 증폭된 DNA를 이용한 염기서열 분석 등과 같은 PCR 후 과정에도 유용할 것으로 생각된다.
또한, 본 발명은 유전 물질을 빠른 시간에 분석하여 감염성 질병의 원인이 되는 병원균을 진단하거나 유전병 등을 손쉽게 진단할 수 있는 랩온어칩에 응용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (16)

  1. 세포 또는 바이러스를 포함하는 용액에 금 나노 로드를 첨가하는 단계; 및
    상기 금 나노 로드에 펄스 레이저 또는 연속파동 레이저를 조사하여 세포 또는 바이러스를 파괴하는 단계를 포함하는 세포 또는 바이러스의 파괴 방법.
  2. 마이크로 챔버에 세포 또는 바이러스를 포함하는 용액 및 금 나노 로드를 주입하는 단계;
    상기 금 나노 로드에 펄스 레이저 또는 연속파동 레이저를 조사하여 세포 또는 바이러스를 파괴하는 단계; 및
    상기 마이크로 챔버에 PCR 혼합물을 첨가하여 PCR을 수행하는 단계를 포함하는 세포 또는 바이러스의 파괴 및 핵산 증폭을 단일 마이크로 챔버에서 연속적으로 수행하는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 금 나노 로드의 직경 및 길이의 비율은 1:2 내지 1:50인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 금 나노 로드의 길이는 10 nm 내지 500 nm인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 펄스 레이저가 1mJ/펄스 이상이고, 연속파동 레이저가 10mW 이상의 출력을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 레이저는 400nm 이상의 파장대에서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 금 나노 로드의 직경 및 길이의 비율이 1:2 내지 1:5일 때, 상기 레이저는 700nm~900nm의 파장대에서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 금 나노 로드의 직경 및 길이의 비율이 1:10 내지 1:50일 때, 상기 레이저는 800nm 이상의 파장대에서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 2 항에 있어서, 상기 금 나노 로드의 제거 없이 PCR을 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 세포 또는 바이러스를 포함하는 용액이 타액, 소변, 혈액, 혈청 및 세포 배양액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 시료 도입구가 형성되어 있어 상기 시료 도입구를 통해 세포 또는 바이러스를 포함하는 시료와 금 나노 로드를 수용하는 세포 또는 바이러스 파괴 챔버;
    상기 챔버에 부착되어, 레이저를 공급하는 레이저 발생부; 및
    상기 챔버를 가열 및 냉각시키는 가열부 및 냉각부를 포함하는, 세포 또는 바이러스의 파괴 및 핵산의 증폭을 단일 챔버에서 수행하는 장치.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 챔버와 마이크로채널을 통해 연통되며, 상기 챔버에 PCR 혼합물을 공급하는 PCR 혼합물 저장부를 추가로 구비하는 것을 특징으로 하는 장치.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 챔버에 부착되어, 상기 챔버 내에서 시료와 금 나노 입자를 혼합하는 진동기(vibrator)를 추가로 구비하는 것을 특징으로 하는 장치.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 진동기는 초음파세척기, 전기장을 이용한 진동기, 기계적 진동기 및 압전물질로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장 치.
  16. 제 12 항의 장치를 포함하는 랩온어칩(lab-on-a-chip).
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