JP4354447B2 - 細胞またはウイルスの破壊方法及び装置 - Google Patents

Description

本発明は、レーザ及びマイクロ磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの迅速な破壊方法及び装置に関する。

一般的に、特定病原菌の分子学的診断は四段階、すなわち細胞溶解、ＤＮＡ分離、ＤＮＡ増幅、及びＤＮＡ検出を含む。

細胞からのＤＮＡの効率的な抽出は、多くの適用で必要であり、分子学的診断、特に病原菌の同定及び定量化に必須である。分子学的診断は、一般的にＤＮＡ抽出ステップ後のＤＮＡ増幅により行われる。ＤＮＡ増幅には、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応、ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、核酸増幅、修復連鎖反応（ｒｅｐａｉｒ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、ヘリカーゼ連鎖反応、ＱＢ複製酵素増幅、及び転写活性化連結が含まれる。

細胞からのＤＮＡの分離方法は、ＤＮＡを結合する傾向を有する物質を利用して行われる。ＤＮＡの分離のための物質の例は、シリカ、ガラスファイバ、陰イオン交換樹脂、及び磁性ビーズである（非特許文献１、非特許文献２参照）。手作業段階を避け、作業者の誤りを取り除くために、いくつかの自動化機械が大量ＤＮＡ抽出のために開発されている。

細胞溶解は、一般的に機械的、化学的、熱的、電気的、超音波またはマイクロウェーブ方法で行われる（非特許文献３参照）。

化学的方法は、細胞を破壊してＤＮＡを放出するために溶解剤の使用を含む。カオトロピック試薬を用いた細胞抽出物の付加的な処理ステップが、蛋白質を変性させるために必要である。化学的溶解方法の短所は、細胞を破壊するために強い化学物質を用いるということである。それらは、その後のＰＣＲ反応を妨害しうるため、ＰＣＲ反応前にＤＮＡを精製することが不可避である。前記化学的方法は、労働集約的であり、時間を必要とし、高価な消耗品を必要とし、時折ＤＮＡ収率が低いという問題点がある。熱的方法は、凍結／融解サイクルを必要とするが、時折細胞内の多くの構造物を破壊できないという短所がある。

加熱は、細胞壁または細胞膜を破壊する代替的な方法である。簡単な加熱の短所は、放出されたＤＮＡに付着しうる蛋白質を変性させるということである。それらは、ＤＮＡ増幅を妨害しうる。物理的な方法は、大きくて、高価な圧力装置を利用するが、それはＬＯＣ（Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−Ｃｈｉｐ）への適用に適さない。

超音波処理は、代替的な物理的方法であり、細胞溶液または懸濁液を超音波水槽内に設置されたチャンバ内に収納させる。超音波破壊は、細胞溶解で多くの短所を有する。第一に、超音波のエネルギー分布は、均一でない。超音波エネルギーの不均一な分布は、また一貫性のない結果を招く。第二に、超音波水槽内のエネルギー発散のため、完全に細胞を破壊させるために、時折数分かかってしまう。最後に、超音波方法は、人間の耳に不快な音を感じさせる。

レーザは、細胞を破壊するのに多くの長所を有し、ＬＯＣに容易に適用できる（非特許文献４参照）。

特許文献１には、レーザ誘導された細胞溶解システムが開示されている。レーザだけを利用したとき、細胞を効果的に溶解できない。透明度の高い溶液に大腸菌を入れて実験した結果、レーザだけを照射した場合に、低い細胞溶解効率しか得られないことが確認されている。レーザエネルギーが効果的に細胞に伝達されていないため、１５０秒間レーザを照射した後のＤＮＡ濃度は、３．７７ｎｇ／μｌであった。従来の加熱方法を用いて、９５℃で５分間煮沸した後のＤＮＡ濃度は、６．１５ｎｇ／μｌであった。

特許文献２には、増加した組織復旧のための光学的に吸収するナノ粒子が開示されている。この発明は、一つ以上の波長で光を吸収する１ｎｍから１，０００ｎｍのサイズのナノ粒子を連結された組織に伝達し、前記ナノ粒子を、ナノ粒子により吸収された一つ以上の波長の光に曝露させることを含む、組織を連結する方法を含む。この方法は、レーザ及びナノ粒子を利用することによって、細胞の機能だけを失わせることだけを引き起こす方法であるが、細胞及び粒子が含まれた溶液を振動させて細胞を破壊する方法についての記述は、特許文献２にはない。
米国特許公開第２００３／９６４２９Ａ１号公報 米国特許第６，６８５，７３０号明細書 Ｒｕｄｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｒｅｓ ２２，ｐｐ．５０６〜５１１（１９９７） Ｄｅｇｇｅｒｄａｌ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｒｅｓ ２２，ｐｐ．５５４〜５５７（１９９７） Ｍｉｃｈａｅｌ Ｔ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７３，ｐｐ．４９２〜４９６（２００１） Ｈｕａｉｎ ａＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，７３，ｐｐ．４６２５〜４６３１（２００１）

本発明者らは、前記従来技術の問題点を解決するために鋭意研究を積み重ねた結果、レーザ及びマイクロ磁性ビーズを共に使用して振動させた場合、細胞またはウイルスを速やかに破壊できることを見出し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の目的は、レーザ及びマイクロ磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの迅速な破壊方法及び装置を提供することにある。

本発明の目的を達成するために、本発明の第一は、細胞またはウイルスを含む溶液に磁性ビーズを注入するステップと、前記磁性ビーズを振動させるステップと、前記磁性ビーズにレーザを照射して細胞またはウイルスを破壊するステップとを含む、細胞またはウイルスの破壊方法を提供する。

本発明の第二は、試料導入口が形成されており、前記試料導入口を介して試料及び磁性ビーズを収容する細胞溶解チャンバと、前記細胞溶解チャンバに装着され、前記細胞溶解チャンバ内で試料及び磁性ビーズを混合する振動器と、前記細胞溶解チャンバに装着され、レーザを供給するレーザ発生部とを備える細胞またはウイルスの破壊装置である。

本発明の第三は、試料導入口が形成されており、前記試料導入口を介して試料及び磁性ビーズを収容する細胞溶解チップと、前記細胞溶解チップに振動伝達部を介して連結され、前記細胞溶解チップ内で試料及び磁性ビーズを混合する振動器と、前記細胞溶解チップに装着され、前記振動器により発生した振動を前記細胞溶解チップに伝達する振動伝達部と、前記細胞溶解チップに装着され、レーザを供給するレーザ発生部と、前記細胞溶解チップに装着され、試料の蒸発を抑制する蒸発抑制部とを備える細胞またはウイルスの破壊装置である。

本発明の第四は、上面と下面とが開放されており、反応チャンバ、試料導入口及び試料導出口が形成されているチップ本体部と、前記チップ本体部の上面に装着され、前記反応チャンバの上面部を密閉させ、前記チップ内にレーザを通過させる、試料導入口及び試料導出口があるチップカバー部と、チップ装着部を介して前記チップ本体部の下面に装着され、反応チャンバ、試料導入口、及び試料導出口の下部を密閉させるチップ底部とを備える、前記細胞またはウイルスの破壊装置に用いるための細胞溶解チップである。

本発明の方法は、磁性ビーズが含まれた溶液にレーザを照射し、磁性ビーズがレーザエネルギーによりアブレーション現象を起こし、衝撃波、蒸気圧、及び熱を細胞表面に伝達する。このとき、物理的衝撃も細胞表面に加えられる。レーザにより加熱された磁性ビーズは、水溶液の温度を上げ、熱くなった磁性ビーズが細胞を直接破壊する。溶液中の磁性ビーズは、単純な熱伝導体としての役割を果たすだけではなく、熱的、機械的、物理学的衝撃を細胞表面に伝達し、これにより細胞表面を効果的に破壊する。

レーザ及び磁性ビーズを利用した迅速な細胞溶解は、液体培地で加熱及びレーザアブレーションにより行われる。マイクロ磁性ビーズと共にレーザは、供給熱を非常に加熱された磁性ビーズの物理的、機械的衝撃に転換させることによって細胞溶解を改善させることができる。最近、小サイズの高出力レーザダイオードが急速に開発されており、これを利用した非常に小さな細胞溶解装置がＬＯＣ上に装着されうる。その上、レーザは、光ファイバ、鏡、レンズを用いて、または直接的に、出力及びエネルギーをチップ上の特定の領域に集中できる。

磁性ビーズの最も優れた長所は、レーザ及びマイクロ磁性ビーズを用いた細胞溶解が蛋白質変性を招くため、ＤＮＡ分離ステップを減らせることである。変性された蛋白質及び細胞の残骸は、重力または磁力により除去される磁性ビーズに付着する。結果として、検出限界を低くし、ＤＮＡの抽出工程の一段階が減るためＤＮＡの抽出時間を大幅に節減し、信号振幅が増加するためＰＣＲ分析の結果を顕著に改善する。レーザ及びマイクロ磁性ビーズを利用して細胞を破壊するのに要求される総時間はわずか４０秒である。

レーザアブレーションとは、レーザビームに曝露された素材に発生する現象を総称する。レーザアブレーションにより、素材表面の温度は、数百℃から数千℃まで急速に上昇する。素材表面の温度が蒸発点以上に上昇すれば、液体状態の材料の蒸発に従って、表面での飽和蒸気圧も急速に上昇する。飽和蒸気圧は、クラウジウス・クラペイロン式により温度の関数で表され、高出力パルスレーザ加工の場合、普通数十気圧以上まで上昇する。蒸気の噴出と共に蒸気により素材表面に作用する圧力を「反発圧力」といい、反発圧力の大きさは、蒸気圧をＰ_ｓａｔと表すと、０．５６Ｐ_ｓａｔほどとなる。

衝撃波は、主にパルスレーザのように、瞬間強度が非常に大きいレーザを用いた工程において発生する。数ナノ秒または数十ナノ秒間の短い時間の間に、温度が蒸発点以上に加熱された材料表面から発生した蒸気は、圧力が数気圧から数十気圧まで上昇し、周辺の大気中に膨脹しながら衝撃波を形成する。非常に大きい圧力のため、膨脹する蒸気は、素材に対して０．５６Ｐ_ｓほど（ここで、Ｐ_ｓは表面での飽和蒸気圧を表す）の圧力を加える。

本発明の一実施形態において、前記レーザは、パルスレーザまたは連続波動（ＣＷ）レーザを含むことができる。

低すぎるレーザ出力では、効率的にレーザアブレーション現象を起こせない。レーザ出力は、連続波動（ＣＷ）レーザの場合１０ｍＷ以上、パルスレーザの場合、１ｍＪ／パルス以上である。望ましくは、前記パルスレーザが３ｍＪ／パルス以上であり、連続波動レーザが１００ｍＷ以上の出力を有する。これは、連続波動レーザが１０ｍＷ未満、及びパルスレーザが、１ｍＪ／パルス未満ならば、細胞を破壊する十分なエネルギー伝達がなされないためである。

本発明の一実施形態において、前記レーザは、磁性ビーズが吸収する特定波長帯で発生するものでなければならない。前記レーザは、４００ｎｍ以上の波長帯で発生することが望ましく、さらに望ましくは７５０ｎｍから１，３００ｎｍの波長帯である。これは、４００ｎｍ未満の波長では、ＤＮＡが変性されるかまたは損傷されるためである。また、前記レーザは、一つ以上の波長帯で発生しうる。すなわち、レーザは、前記波長範囲内の１つの波長または相異なる２以上の波長を有しうる。

本発明の一実施形態において、前記磁性ビーズの大きさは５０ｎｍから１，０００μｍであることが望ましく、さらに望ましくは１μｍから５０μｍである。磁性ビーズの大きさが５０ｎｍ未満ならば物理的、機械的衝撃が細胞破壊を起こすのに不十分であり、１，０００μｍを超えれば、ＬＯＣに適さない。また、前記磁性ビーズは、二種以上の大きさを有するビーズの混合物でありうる。すなわち、前記磁性ビーズは、互いに同じ大きさである場合もあり、相異なる大きさの混合物である場合もありうる。

本発明の一実施形態において、前記磁性ビーズは磁性を帯びたいかなる物質でも可能である。特に、強磁性を帯びるＦｅ、Ｎｉ、Ｃｒの金属及びそれらの酸化物からなる群より選択される少なくとも１つの物質を含むことが望ましい。

本発明の一実施形態において、前記磁性ビーズが強磁性を帯びる金属でコーティングされた重合体、有機物質、ケイ素、またはガラスでありうる。

本発明の一実施形態において、前記磁性ビーズの表面は、ＤＮＡが付着していない構造で、負電荷を帯びていることが望ましい。これは、ＤＮＡが負電荷を帯びており、磁性ビーズの表面が負電荷を帯びれば、反発力によりＤＮＡが付着しないためである。磁性ビーズの表面にＤＮＡが付着すれば、細胞が破壊された後の磁性ビーズからのＤＮＡの分離が困難となり、ＤＮＡの精製を困難にする。

本発明の一実施形態において、前記磁性ビーズの表面官能基は親水性であり、磁性ビーズを含んだ溶液のｐＨは６ないし９でありうる。磁性ビーズ表面の官能基、及び磁性ビーズを含んだ溶液のｐＨに依存して、溶解された細胞から得られたＤＮＡの増幅効率は、変わりうる。磁性ビーズ表面の官能基が親水性であるほど、細胞溶解後のＤＮＡの増幅効率は向上する。望ましくは、官能基は負電荷を帯びているカルボキシル基またはその誘導体である。前記誘導体は、イミノジ酢酸（ＩＤＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、ポリカルボン酸などを含む。磁性ビーズを含んだ溶液のｐＨは６から９が望ましい。溶液のｐＨが前記範囲を外れれば、細胞溶解後のＤＮＡの増幅効率は低下する。

本発明の一実施形態において、前記溶液が唾液、尿、血液、血清、及び細胞培養液からなる群より選択されうる。前記溶液は、動物細胞、植物細胞、バクテリア、ウイルス、ファージなど、核酸を有するあらゆる溶液でありうる。

本発明の他の実施形態による細胞またはウイルスの迅速な破壊のための装置は、試料導入口が形成されており、前記試料導入口を介して試料及び磁性ビーズを収容する細胞溶解チャンバと、前記細胞溶解チャンバに装着され、前記細胞溶解チャンバ内で試料及び磁性ビーズを混合する振動器と、前記細胞溶解チャンバに装着され、レーザを供給するレーザ発生部を備える。

本発明の方法によれば、速い細胞溶解が可能であり、細胞またはウイルスの破壊装置は、レーザダイオードを利用した小型化が可能であり、細胞またはウイルスの破壊後直ちにＤＮＡの精製ステップが実行でき、細胞の残骸及び後続反応の阻害剤が付着した磁性ビーズは電磁石により除去され、ＤＮＡを含む溶液が次のステップに進むことができる。また、本発明の細胞溶解チップにより蒸発の問題が解決し、振動が磁性ビーズによって細胞に効率的に伝達でき、チップ内部の表面の疎水性処理により粗い表面上のマイクロ流体工学の問題が解決し、細胞溶解チップはＬＯＣへの適用が可能になる。

以下、添付した図面を参照しながら、本発明の望ましい実施形態について詳細に説明する。

図１は、レーザ及びマイクロ磁性ビーズを用いた細胞溶解に使われるシステムの一実施形態を表す模式図である。試料は試料導入口を介して投入される。試料は、磁性ビーズとよく混合される。このとき、試料と磁性ビーズの十分な混合は、振動器を介してなされる。振動の間レーザが照射される。細胞溶解チャンバウィンドーは、レーザの波長を十分に通過させることができる材質を含んでいなければならない。レーザに曝された磁性ビーズは、光を熱に変化させる、すなわちレーザアブレーション現象を起こす。継続的な振動により、効果的な熱伝逹及び磁性ビーズと細胞との衝突のため、熱、振動、衝撃波、蒸気圧などが効率的に伝えられる。レーザにより細胞溶解チャンバの温度が上昇する間、パラフィンバルブが開くが、これはパラフィンバルブの厚さで調節されうる。細胞が十分に破壊された後レーザを消し、電磁石により残留したマイクロ磁性ビーズが除去される。パラフィンバルブが熱により除去されると、精製されたＤＮＡが増幅されるＰＣＲチャンバに、得られた溶液が移動する。

本発明の一実施形態において、前記振動器は、超音波洗浄器、磁場を利用した振動器、電場を利用した振動器、ボルテックスなどの機械的振動器、または圧電物質を含むことができる。振動器は、細胞溶解チャンバに装着されており、細胞及びマイクロ磁性ビーズの混合溶液を振動させることができる、いかなる装置でも使用しうる。

本発明の一実施形態において、迅速な細胞またはウイルスの破壊装置は、前記細胞溶解チャンバに装着され、細胞溶解が完全に終了した後に前記細胞溶解チャンバ内の磁性ビーズを除去する電磁石をさらに備えることができる。前記電磁石は、前記細胞溶解チャンバに装着され、ＬＯＣの実施のため、細胞溶解が終了した後で、磁性ビーズの分離作業がなくても、破壊された細胞溶液が直ちにＰＣＲチャンバに移動できるように、電磁石により磁性ビーズは除去される。電磁石により除去できるために、ビーズは磁性を有していなければならない。

本発明の一実施形態において、さらに精製されたＤＮＡが求められるならば、迅速な細胞またはウイルスの破壊装置は、ＰＣＲチャンバ前に流路を介して前記細胞溶解チャンバと連結されるＤＮＡ精製チャンバをさらに備えることができる。細胞が溶解された後に、パラフィンバルブまたは磁場、電場を利用したＭＥＭＳ構造のバルブが開けばＤＮＡを精製できるように、ＤＮＡ精製チャンバを細胞溶解チャンバに装着させる。

本発明の一実施形態において、迅速な細胞またはウイルスの破壊装置は、前記細胞溶解チャンバと連結される流路内に位置し、細胞溶解時間によって厚さが調節されるパラフィンバルブをさらに備えることができる。レーザにより細胞溶解チャンバの温度が上昇する間、パラフィンバルブは開くが、これはパラフィンバルブの厚さで調節されうる。

本発明の一実施形態において、迅速な細胞またはウイルスの破壊装置は、流路を介して前記細胞溶解チャンバと連結されたＤＮＡ増幅チャンバをさらに備えることができる。上述のように、マイクロ磁性ビーズにより精製効果が発生するので、ＤＮＡ増幅チャンバは細胞溶解チャンバに直接装着されうる。

本発明の一実施形態において、迅速な細胞またはウイルスの破壊装置は、流路を介して前記ＤＮＡ精製チャンバと連結されたＤＮＡ増幅チャンバをさらに備えることができる。ＬＯＣの実施のため、精製されたＤＮＡを増幅するシステムが必要である。精製されたＤＮＡは、分光光度計を利用する方法、マイクロ磁性ビーズを利用する方法、電気化学的方法、電気化学発光法、放射線及び蛍光標識を利用する方法、リアルタイムＰＣＲ法などを用いて検出されうる。所望のＤＮＡを十分に増幅するためには、ＰＣＲ法が最も適している。その他のＤＮＡ増幅法も適用でき、リアルタイムＰＣＲ法などを介した直接検出も可能である。

本発明の他の実施形態による細胞またはウイルスの破壊のための装置は、試料導入口が形成されており、前記試料導入口を介して試料及び磁性ビーズを収容する細胞溶解チップと、前記細胞溶解チップに振動伝達部を介して連結され、前記細胞溶解チップ内で試料及び磁性ビーズを混合する振動器と、前記細胞溶解チップに装着され、前記振動器により発生した振動を前記細胞溶解チップに伝達する振動伝達部と、前記細胞溶解チップに装着され、レーザを供給するレーザ発生部と、前記細胞溶解チップに装着され、試料の蒸発を抑制する蒸発抑制部と、を備える細胞またはウイルスの破壊装置を備える。

図２Ａは、マイクロチップ上でレーザ及びマイクロ磁性ビーズを用いた細胞溶解に利用されるシステムの一実施形態を表す模式図であり、図２Ｂは、図２Ａに図示されているシステムの設計図である。細胞溶解チップは、試料導入口を介して導入された試料及び磁性ビーズを用いて細胞またはウイルスを溶解する装置である。前記細胞溶解チップは、チップカバー部、チップ本体部、チップ装着部、及びチップ底部を含む。前記細胞溶解チップの構成要素の詳細な説明は、後述する。細胞溶解チップは、細胞またはウイルスが溶解される反応チャンバの役割を果たす。

前記振動器は、前記細胞溶解チップに振動伝達部を介して連結され、前記細胞溶解チップ内で試料及び磁性ビーズを混合する。振動器の振動方向は、垂直方向でありうる。前記振動器は、超音波洗浄器、磁場を利用した振動器、電場を利用した振動器、ボルテックスなどの機械的振動器、または圧電物質を含むことができる。振動器は、細胞及びマイクロ磁性ビーズの混合溶液を振動させることができる、いかなる装置でも使用しうる。前記振動器は、携帯電話に利用される振動モータを利用できる。

前記振動伝達部は、前記振動器により発生した振動を、細胞溶解チップの底部を通してチャンバ部分に伝達する。振動伝達部は、アルミニウムなどの金属を含みうる。

前記レーザ発生部は、前記細胞溶解チップに装着され、前記細胞溶解チップにレーザを供給する装置である。

前記蒸発抑制部は、前記細胞溶解チップに装着され、試料の蒸発を抑制する装置である。レーザを利用して細胞を溶解させると、温度上昇により蒸発が起こる。したがって、蒸発を減らすために、蒸発抑制部が必要である。前記蒸発抑制部は、１０ｐｓｉ（６．８９×１０^４Ｐａ）以上の圧力に耐えることができる構造を有していなければならない。前記蒸発抑制部は、セプタ（隔壁）を含みうる。光テープが試料導入口及び試料導出口に装着可能であり、そのときセプタは細胞溶解チップに固定される。図３は、細胞溶解装置のセプタ部分を示す写真である。前記セプタは、バルブ、重合体構造物、金属構造物などであり得、蒸発を抑制できるものであれば、特別に制限されるものではない。

本発明の一実施形態において、前記レーザは、パルスレーザまたは連続波動（ＣＷ）レーザを含みうる。

低すぎるレーザ出力では、レーザアブレーション現象は効率的に起こることができない。レーザ出力は連続波動（ＣＷ）レーザの場合、１０ｍＷ以上、パルスレーザの場合、１ｍＪ／パルス以上である。連続波動の場合、１０ｍＷ未満であり、パルスレーザの場合、１ｍＪ／パルス未満ならば、細胞を破壊する十分なエネルギーが伝達されない。

本発明の一実施形態において、前記レーザは、磁性ビーズがレーザエネルギーを吸収する特定の波長帯で発生するものでなければならない。前記レーザは、４００ｎｍ以上の波長帯で発生することが望ましく、さらに望ましくは、７５０ｎｍから１，３００ｎｍの波長帯である。これは、４００ｎｍ未満の波長では、ＤＮＡの変性または損傷が発生するためである。また、前記レーザは、一つ以上の波長帯で発生しうる。すなわち、レーザは、前記波長範囲内の１つの波長である場合か、または相異なる２以上の波長でありうる。

本発明の一実施形態において、前記磁性ビーズの大きさは５０ｎｍから１，０００μｍであることが望ましく、さらに望ましくは１μｍから５０μｍである。磁性ビーズの大きさが５０ｎｍ未満ならば物理的及び機械的衝撃が細胞を溶解させるのに不十分である。１，０００μｍを超えればＬＯＣに適さない。前記磁性ビーズは、二種以上の大きさを有するビーズの混合物でありうる。すなわち、前記磁性ビーズは、互いに同じ大きさを有しうるか、または相異なる大きさの混合物でありうる。

本発明の一実施形態において、前記磁性ビーズが磁性を帯びるものならば、いかなるものでもありうる。特に、強磁性を帯びるＦｅ、Ｎｉ、Ｃｒ、及びそれらの酸化物からなる群より選択される１以上の物質を含むことが望ましい。

本発明の一実施形態において、前記磁性ビーズは、強磁性を帯びる金属でコーティングされた重合体、有機物質、ケイ素、またはガラスでありうる。

本発明の一実施形態において、前記磁性ビーズの表面は、ＤＮＡが付着していない負電荷を帯びる構造であることが望ましい。これは、ＤＮＡが負電荷を帯びており、磁性ビーズの表面が負電荷を帯びれば、反発力によりＤＮＡが付着しないためである。また、磁性ビーズの表面にＤＮＡが付着すれば、細胞が破壊された後の、磁性ビーズからＤＮＡを分離することが困難となり、ＤＮＡの精製を困難にする。

本発明の一実施形態において、前記試料は唾液、尿、血液、血清及び細胞培養液からなる群より選択されうる。前記試料は、動物細胞、植物細胞、バクテリア、ウイルス、ファージなど核酸を有するいかなるものでもよい。

本発明の他の実施形態による、細胞またはウイルスの破壊のための装置の細胞溶解チップは、上面及び下面が開放されており、反応チャンバ、試料導入口及び試料導出口を含むチップ本体部と、前記チップ本体部の上面に装着され、前記反応チャンバの上面部を密閉させ、前記チップ内にレーザを通過させることができ、試料導入口及び試料導出口があるチップカバー部と、チップ装着部を介して前記チップ本体部の下面に装着され、反応チャンバ、試料導入口、及び試料導出口の下部を密閉させるチップ底部とを備える。

図４は、レーザ及びマイクロ磁性ビーズを用いた細胞破壊装置に用いられるマイクロチップの一実施形態を表す模式図である。図４で分かるように、前記チップ本体部は、上面及び下面が開放されており、反応チャンバ、試料導入口及び試料導出口を含む。前記チップ本体部は、１００℃以上の温度に耐えることができるシリコンウェハでありうる。チップ本体部の材質は、ガラス、重合体、またはシリコーンなどを含むことができる。前記ガラスは、Ｐｙｒｅｘ ７７４０が望ましい。チップ本体部は、上面にチップカバー部が装着され、下面は、チップ装着部が装着されうる。チップ本体部の内部の表面は、気泡発生を抑制するために、疎水性処理されうる。例えば、チップ本体の内部の表面はＳｉｇｍａｃｏａｔ（登録商標）でコーティングされうる。

前記チップカバー部は、前記チップ本体部の上面に装着され、前記反応チャンバの上部を密閉する。チップカバー部はレーザを通過させ、導入口及び導出口を有する。チップカバー部の材質は、ガラス、重合体、インジウム錫酸化物（ＩＴＯ）ガラスなどを含むことができる。前記ガラスは、Ｐｙｒｅｘ ７７４０が望ましい。チップカバー部の材質は、高温に耐え、９０％以上の透過率を有することが望ましい。レーザの透過率を上昇させるために、前記チップカバー部は反射防止コーティングを有しうる。反射防止コーティングは、当業界に公知の技術を利用して行うことができる。したがって、チップカバー部は、反射防止コーティングされたＰｙｒｅｘ ７７４０を用いて製作されうる。

前記チップ底部は、チップ装着部を介して前記チップ本体部の下面に装着され、反応チャンバ、試料導入口及び試料導出口の下部を密閉させる。チップ底部の材質は、重合体、シリコン、ガラス、インジウム錫酸化物（ＩＴＯ）ガラスなどを含むことができる。前記チップ底部の材質は、高温に耐え、柔軟性があることが望ましい。前記チップ底部は、例えばポリカーボネートフィルムなどの、振動器により発生した振動をチップ本体部に効率的に伝達できる物質を含むことが望ましい。

前記チップ装着部は、前記チップ本体部にチップ底部を装着させ、試料を収容する反応チャンバの補助の役割を果たす。装着は、接着テープ及び接着剤からなる群より選択される接着物によりなされる。前記チップ本体部及び前記チップ底部だけを用いて反応チャンバを形成することも可能であるが、反応液の流出が生じる危険性がある。前記チップ装着部は反応溶液の流出を防ぐことができる。図５は、本発明の一実施形態によるマイクロチップの写真である。

以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、ただ本発明を例示するためだけのものであり、本発明の範囲がこれら実施例により制限されると解釈されてはならない。

調製例１：細胞溶解システム
図１に示したように、下記のように製造されたバクテリア細胞（９０μｌ）及びマイクロ磁性ビーズ（３０μｌ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） Ｍ−２７０ Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ、ノルウェー、ＤＹＮＡＬ社製）をバイアルガイド（韓国、ＡＭＩＴＥＣＨ社製）内に位置したガラス瓶内で混合した。ガラス瓶をボルテックスで撹拌しつつ、各実験で指定された時間の間に細胞を破壊するために、８０８ｎｍ、１３．８Ｗ（ＨＬＵ２５Ｆ１００−８０８、ドイツ、ＬＩＭＯ社製）の高出力レーザビームを照射させた（図１参照）。

調製例２：バクテリア菌株及びバクテリア細胞の生存能の測定
大腸菌株ＢＬ２１及びストレプトコッカスムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ、ＡＴＣＣ＃３５６６８）をブレインハートインフージョン（ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ：ＢＨＩ）培地で活発なエアレーションの下、３７℃にて対数期まで（ＯＤ_６００＝０．５〜１．０）培養した。バクテリア細胞を遠心分離で収穫し、３ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）溶液で２回洗浄した。細胞をＰＢＳに再懸濁させた（細胞密度：１×１０^５細胞／μｌ）。生存細胞の数を、コロニーを形成する単一細胞の能力で測定した。レーザビーム照射後の大腸菌細胞（１×１０^３）のアリコートをＢＨＩプレート上に広げた。プレートを３７℃で一晩中培養し、コロニーの数を計算した。

スタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、ＡＴＣＣ＃１４９９０→１２２２８）を寒天（ＮＡ）培地で活発なエアレーションの下、３７℃で対数期まで（ＯＤ_６００＝０．５から１．０）培養した。バクテリア細胞を遠心分離で収穫し、３ｍｌのＰＢＳ溶液で２回洗浄した。細胞をＰＢＳに再懸濁させた（細胞密度：１×１０^５細胞／μｌ）。生存細胞の数を、コロニーを形成する単一細胞の能力で測定した。レーザビーム照射後のスタフィロコッカスエピデルミディス細胞（１×１０^３）のアリコートをＮＡプレート上に広げた。プレートを３７℃で一晩中培養し、コロニーの数を計算した。

調製例３：バクテリアゲノムＤＮＡの抽出
レーザ法によるＤＮＡ放出の効率と、その他の公知の一般的な方法の効率とを比較するために、９５℃で５分間の煮沸法を利用し、大腸菌ゲノムＤＮＡ（各レーザ溶解に使われた細胞数と同等な０．９×１０^５個の細胞から）を製造した。

調製例４：バクテリアからのＤＮＡ放出の定量
細胞溶解をモニタリングし、溶解した細胞から放出されたＤＮＡの量を定量するために、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒに続いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅を用いた。ＰＣＲには下記の対のプライマーを使用した：プライマーＡ（配列番号１）；及びプライマーＢ（配列番号２）。このプライマー対は、１６ＳリボゾームＲＮＡをコーディングする遺伝子の各末端に相補的であり、ＰＣＲの間、全体コーディング部位の増幅を可能にする。

大腸菌ＰＣＲ増幅は、Ｔａｑ重合酵素（韓国、Ｓｏｌｇｅｎｔ社製）を利用し、２５サイクル（９５℃で１分間予備変性、９５℃で５秒間変性、６０℃で１３秒間アニーリング、及び７２℃で１５秒間伸張、及び７２℃で１分間追加的な伸張）行われた。グラム陽性バクテリア細胞であるストレプトコッカスムタンス及びスタフィロコッカスエピデルミディスのＰＣＲ増幅は、Ｔａｑ重合酵素（韓国、Ｓｏｌｇｅｎｔ社製）を利用し、３０サイクル（９５℃で１分間予備変性、９５℃で５秒間変性、６０℃で１３秒間アニーリング、及び７２℃で１５秒間伸張、及び７２℃で１分間追加的な伸張）の間行われた。増幅サイクルが終了した後、溶融曲線を、６０℃から９０℃で試料をゆっくり加熱（０．１℃／秒）することにより取得した。ＰＣＲをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（米国インディアナ州、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）により１Ｘ ＦａｓｔＳｔａｒｔ ＤＮＡ Ｍａｓｔｅｒ ＳＹＢＲ（米国インディアナ州、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）、０．２５ｍＭの正及び逆のプライマー（韓国、Ｇｅｎｏｔｅｃｈ社製）、４ｍＭのＭｇＣｌ_２（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）、Ｄ．Ｗ（ＰＣＲグレード、米国インディアナ州、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を含む総体積２０μｌの反応混合物を用いて行った。増幅されたＤＮＡを市販されているＤＮＡ５００アッセイサイジングの試薬セットを利用し、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００（カリフォルニア州パロアルト、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で分析した。

調製例５：本発明の細胞溶解チップの製造
１０μｌ試料体積のための７．５ｍｍ×１５ｍｍのチップサイズを有するマイクロチップをシリコン、ガラス、ポリカーボネートフィルム、及び両面テープ（米国ミネソタ州、３Ｍ社製、９４９５ＭＰ）を用いて製造した。図４に示したように、レーザ誘導された試料の製造のために、製造工程は、二種のフォトリソグラフィのステップ、及びポリカーボネートフィルムとの両面テープによる結合ステップから構成された。直径が６インチであり、厚さが５００μｍであるガラスウェハを洗浄し、ＢＦ４１０フィルムフォトレジストでラミネートした。フォトレジストをフォトリソグラフィによりパターニングし、試料導入口及び試料導出口のための直径が１．５ｍｍである孔を形成した。孔をサンドブラスト技術によりガラスウェハ上に形成した。シリコンウェハは、直径が６インチであり、厚さが６８０μｍである両面研磨されたシリコン基板であった。チャンバは、コストの懸念のためサンドブラスト技術によりシリコンウェハ上に形成させた。試料のローディングの最適化のために、Ｓｉｇｍａｃｏａｔ（登録商標）（米国ミズーリ州、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製）をシリコンウェハのサンドブラストされた表面上にコーティングした。次に、厚さが１００μｍであるポリカーボネートフィルムを、厚さが１５０μｍである両面テープを用いてシリコンウェハに接着させた。

調製例６：レーザ誘導されたオンチップ試料調製システム
図２Ａに示したように、バクテリア細胞溶解のために、下記のように調製されたバクテリア細胞（１μｌ）及びマイクロ磁性ビーズ（９μｌ、約９×１０^６ビーズ／μｌ、ノルウェー、ＤＹＮＡＬ社製、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標） ＭｙＯｎｅ（商標） Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ）をチップガイドモジュール（韓国、ＡＭＩＴＥＣＨ社製）に位置させたマイクロチップ（韓国、ＳＡＩＴ社製）内で混合した。磁性ビーズ及びビーズ物質の表面電荷の効果のため、シリカビーズ（３．０μｍ、米国インディアナ州、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、アミン末端のポリスチレン磁性ビーズ（１．５μｍ、米国インディアナ州、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、ポリスチレンビーズ（４．１６μｍ、米国インディアナ州、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）、及びカルボン酸末端のポリスチレン磁性ビーズを別途準備した。

各実験で指定された異なる時間の間に細胞を破壊するために、マイクロチップをアルミニウム振動バーを用いたコイン状振動モータ（ＤＭＪＢＲＫ２０Ｘ、韓国、Ｓａｍｓｕｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏ−ｍｅｃｈａｎｉｃｓ社製）により振動しつつ、開口数が０．２２であるファイバ一体型レーザシステム（ＨＬＵ２５Ｆ１００−８０８、ドイツ、ＬＩＭＯ社製）を用いて、８０８ｎｍ（１Ｗ）の高出力レーザビームを照射させた。レーザ照射出力を３０Ｗ Ｂｒｏａｄｂａｎｄ Ｐｏｗｅｒ／Ｅｎｅｒｇｙ Ｍｅｔｅｒ（米国、ＭＥＬＬＥＳ ＧＲＩＯＴ社製）で測定した。レーザ波長は、水中での波長の吸収係数により選択した。水中で０．０２１７７３（ｃｍ^−１）の吸収係数を有する８０８ｎｍのレーザビームのほとんどは、水を透過し、マイクロ磁性ビーズに達する。本発明の目的上、可視光線レーザビームも適用可能であるが、高出力レーザダイオードは、携帯用装置として開発されておらず、コストが高い。その上、水中でのＩＲ波長の吸収係数は非常に高く、ＩＲレーザエネルギーのほとんどは、水に吸収されて本発明の用途に適さない。ＵＶレーザビームは、細胞溶解及びＤＮＡ精製に好ましくないが、それは、ＵＶ照射がＤＮＡ損傷を引き起こすことが知られているためである。ＵＶで照射されたＤＮＡは、主要な光生成物としてチミンダイマーを蓄積する。そのため、８０８ｎｍスペクトルを有する連続レーザダイオードを用いた。

アルミニウム（韓国、ＡＭＩＴＥＣＨ社製）を有する携帯電話（ＤＭＪＢＲＫ２０Ｘ、韓国、Ｓａｍｓｕｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏ−ｍｅｃｈａｎｉｃｓ社製）にほとんど用いられている振動モータを用いたオンチップ試料調製試験モジュールの振動システムを、１２，０００ｒｐｍで、マイクロチップの試料チャンバ領域のみの柔軟なポリカーボネートフィルムを振動させるためにデザインした。振動モータの振動出力を電源供給装置（Ｅ３６２０Ａ、米国カリフォルニア州、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）により調節した。マイクロチップのチャンバ内の試料温度を、データ取得システム（３４９７０Ａ、米国カリフォルニア州、Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を有する熱電対（Ｋｔｙｐｅ、Ｏｍｅｇａ社製）で測定した。図３に示したように、導入口及び導出口の両方を、磁性ビーズを含む試料溶液をローディングした後で、光学的に透明な接着テープ（米国カリフォルニア州、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で密封した。レーザ照射の間に漏れが発生しないことを確認するために、入口及び出口の両方を、オンチップ試料製造試験モジュールの上部カバー上に設置した２つのエラストマー（ｔｈｅｒｍｏｇｒｅｅｎ ＬＢ−２、米国ミズーリ州、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）で圧着した。

調製例７：磁性ビーズを有する生存細胞及び死滅細胞の写真
レーザ照射後試料溶液中に残存する生存細胞及び死滅細胞を観察するために、供給者により推薦された手順により、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ（登録商標）ＢａｃＬｉｇｈｔ（商標）Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｋｉｔ（Ｌ７０１２、米国オレゴン州、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社製）を用いて染色した。画像は顕微鏡（Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ ３００、日本、ニコン社製）で撮影した。

調製例８：レーザ照射後のＤＮＡ分析
ゲノム及びプラスミドＤＮＡを、様々な方法を用いて、ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）プラスミドを含む同じ数のＢＬ２１細胞から分離した。レーザ溶解のために、細胞を磁性ビーズと混合し、４０秒間レーザを照射し、ＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール洗浄後に、０．３Ｍの酢酸ナトリウムを用いたエタノール沈殿により精製した。煮沸溶解のために、細胞を９５℃で５分間加熱し、ＤＮＡをレーザ溶解しながら精製した。Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）ミニプレップキットを用いてプラスミドを分離した。Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキットを用いて、ＢＬ２１のゲノムＤＮＡを分離した。ＤＮＡを、１ｋｂマーカを含む０．７％アガロースゲルを用いて電気泳動させた。

実施例１：磁性ビーズの存在下での細胞生存に対するレーザ照射の効果
磁性ビーズの存在下、細胞生存に対するレーザ照射の効果を調べた。図６は、レーザ照射後の細胞生存能の測定結果を示している。細胞（３×１０^３）に指定された時間の間マイクロ磁性ビーズの存在下（Ａ及びＢ）、または不在の下（Ｃ）、レーザを照射させた後、ＬＢプレート上に広げた。プレートを３７℃で一晩中培養し、生成したコロニーの数を計算した（Ａ：指定された時間の間マイクロ磁性ビーズの存在下で、レーザを照射した後の懸濁液中の細胞；Ｂ：レーザ照射後に磁性ビーズを洗浄することにより回収された細胞；Ｃ：マイクロ磁性ビーズの不在下でレーザ照射されたこと以外は、Ａの細胞と同じ条件下の細胞；細胞は、長期間レーザビームで照射されたものであることに留意する；Ｄ：レーザ照射されていない陽性コントロール）。

図６に示したように、バクテリア細胞はレーザ照射により生存能を喪失する。生存能の喪失は、磁性ビーズの添加で急激に増加した。３秒のレーザ照射後、初期の細胞のうちの５％（３，０００個の細胞のうちの１５３個）が磁性ビーズの存在下で生存し、１０秒照射後にいずれの細胞も生存できなかった（図６Ａ参照）。対照的に、磁性ビーズの不在下では、レーザを３０秒間照射しても、細胞の約２／３（約２，０００個）が生存していた（図６Ｃ参照）。細胞が非特異的にビーズに結合したということを確認するために、ビーズを高濃度の塩緩衝溶液（ＰＢＳに０．３ＭのＮａＣｌを加えたもの）で洗浄し、洗浄液も生存細胞について調べた（図６Ｂ参照）。少数の生存細胞が回収され、生存速度は、懸濁液で回収された細胞と同一であるということを観察したが、これは、ビーズ由来の細胞がビーズ間の溶液で捕捉されている細胞と同様であるということを表した。前記結果は、レーザ照射が磁性ビーズの存在下で細胞の迅速な溶解を引き起こせるので、生存する細胞に存在するゲノム、エピゾーム、またはウイルスＤＮＡのような、あらゆる類型のＤＮＡを放出するために使われうるということを示唆している。

実施例２：細胞からのＤＮＡ放出に対するレーザ照射の効果
上記で観察された生存能の喪失は、細胞からＤＮＡを放出するために必要な細胞溶解と必ずしも関連するものではないため、前述のＰＣＲを用いて１６Ｓ ｒＤＮＡを増幅することにより、溶液中にＤＮＡが存在しているか否かを調べた。図７は、レーザ照射が、磁性ビーズの存在下でのみバクテリアＤＮＡを効率的に放出させるということを示している。縦軸は、増幅されたＤＮＡの濃度（ｎｇ／μｌ）を表す。ＰＣＲ生成物の量は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて定量化された。エラーバーは、平均の標準偏差を表す。

図７に示したように、１６Ｓ ｒＤＮＡは、テンプレートＤＮＡ供給源として溶液を使用する場合に、最も効率的に増幅された。その上、ＰＣＲ生成物の量は、照射時間に比例し、磁性ビーズは、ＰＣＲ効率を急激に（２０倍以上）向上させた。これらの結果は、細胞生存能と一致する。すなわち、これらの結果は、細胞生存能の喪失が細胞溶解のない細胞の熱的不活性化に起因するのではなく、細胞の物理的な破壊に起因するということを証明している。

実施例３：マイクロ磁性ビーズを用いたレーザアブレーション細胞溶解法と化学的細胞溶解法とのＤＮＡ放出の効率の比較
本発明によるレーザアブレーション細胞溶解法のＤＮＡ放出の効率を、一般的な化学的細胞溶解のものと直接比較するために、細胞溶解及び放出されたＤＮＡの精製のためのＱｉａｇｅｎキットのＤＮｅａｓｙを用いた。図８は、レーザアブレーションにより放出されたＤＮＡが、一般的な方法で調製されたＤＮＡよりも、Ｔａｑ重合酵素によってさらに効率的に増幅されるということを示している。あらゆる実験について、同数の細胞を使用してＤＮＡを調製した。縦軸は、増幅されたＤＮＡの濃度（ｎｇ／μｌ）を表す。ＰＣＲ生成物の量は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて定量化された。エラーバーは、平均の標準偏差を表す。

図８に示したように、１６Ｓ ｒＤＮＡは、磁性ビーズの存在下でレーザ照射後に得られたＤＮＡでさらに効率的に増幅された。少ない細胞数（＜１×１０^９）を含む試料に対して、Ｑｉａｇｅｎキットが最適ではないということを考慮すれば、Ｑｉａｇｅｎキットを用いて回収されたＤＮＡの量は、予想より少ないということはありうる。それにもかかわらず、磁性ビーズを併用するレーザによる細胞溶解は、この技術をＬＯＣに統合する容易さのため、応用においてさらに大きな多様性を提供できる。その上、レーザアブレーションによるＤＮＡ放出を用いたＰＣＲ増幅の効率は、Ｑｉａｇｅｎキットまたは煮沸法で得られるＤＮＡより大きいということが観察された。これは、レーザ照射が他の二種の一般的な方法より、少なくとも同一であるか、またはさらに多くの量のＤＮＡを放出するということを示している。同じ量のＤＮＡが放出されるならば、レーザアブレーション由来のＤＮＡを用いたさらに効率的なＰＣＲ増幅が、妨害物質の放出がレーザアブレーションにより最小化されるということを示している。

実施例４：細胞溶解効率に対する磁性ビーズの大きさの効果
細胞からのＤＮＡの放出に対する磁性ビーズ大きさの効果を調べた。図９は、磁性ビーズの大きさの効果を示している。縦軸は、増幅されたＤＮＡの濃度（ｎｇ／μｌ）を表す。ＰＣＲ生成物の量は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて定量化された。エラーバーは、平均の標準偏差を表す。

図９に示したように、直径が２．７μｍである磁性ビーズは、直径が５ｎｍの金粒子（Ｇ１４０２、米国ミズーリ州、Ｓｉｇｍａ社製）よりも細胞溶解においてはるかに効率的であった。

実施例５：チップカバー部に対するレーザ透過率試験
レーザ発生部で発生したレーザが、チップカバー部を効率的に透過できるか否かを知るために、Ｐｙｒｅｘ ７７４０及び反射防止コーティングされたＰｙｒｅｘ ７７４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）をチップカバー部として用いた。レーザ透過率は、レーザ出力が１Ｗ、２Ｗ、３Ｗ、及び４Ｗのときの透過率を、測定装置として３０Ｗ Ｂｒｏａｄｂａｎｄ Ｐｏｗｅｒ／Ｅｎｅｒｇｙｍｅｔｅｒ（米国、ＭＥＬＬＥＳ ＧＲＩＯＴ社製）を用いて測定した。図１０は、Ｐｙｒｅｘ ７７４０及び反射防止コーティングされたＰｙｒｅｘ ７７４０に対するレーザの透過率を示す。図１０から分かるように、反射防止コーティングされたＰｙｒｅｘ ７７４０は、反射防止コーティングされていないＰｙｒｅｘ ７７４０に比べ、レーザ透過率が１．７５％ほど高いということが分かった。したがって、細胞溶解チップ内にレーザを効率的に提供するためには、反射防止コーティングされたＰｙｒｅｘ ７７４０が適している。

実施例６：細胞溶解チップに対する蒸発抑制試験
本発明の細胞溶解チップが、レーザにより発生した蒸気圧のために蒸発を引き起こしているか否かを知るために、蒸発試験を行った。前記で製造された細胞溶解チップを用い、１Ｗ、２Ｗ、３Ｗ、及び４Ｗのレーザ出力で、少なくとも２００回同じ実験を繰り返した。図１１は、レーザを照射した後の本発明の細胞溶解チップの写真である。レーザ出力が２Ｗ以下では、試料溶液内の温度が上昇して蒸気圧は増加するが、細胞溶解チップ内部で蒸発は起こらない。

実施例７：細胞溶解効率に対する磁性ビーズの濃度の効果
細胞溶解効率に対する磁性ビーズの濃度の効果、すなわち放出されたＤＮＡの量を調べた。異なる濃度のビーズを試料溶液に添加し（０ビーズ／μｌから９×１０^６ビーズ／μｌ）、光線出力が１Ｗであるレーザを８０８ｎｍで４０秒間照射した。図１２は、磁性ビーズ濃度を変化させたときの、大腸菌細胞から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果を表すグラフである。Ｃｐ（Ｃｒｏｓｓ ｐｏｉｎｔ）は、リアルタイムＰＣＲ反応において、検出可能な蛍光信号が最初に現れるサイクル数をいう。すなわち、初期のＤＮＡの濃度が高いほど、Ｃｐ値は低い。。Ｃｐは、またＤＮＡ精製とも関連がある。ＤＮＡの純度が高いほど、Ｃｐ値は低い。したがって、Ｃｐが低いほど、溶液中のＤＮＡはさらに精製された形態である。

図１２に示すように、磁性ビーズの濃度が高くなるほど、放出されたＤＮＡの量は増加する。５×１０^６ビーズ／μｌ以上の磁性ビーズの濃度では、効率的な細胞溶解及びＤＮＡ放出に対する良好な効率を示した。また、開始時の標的コピー数の正確な測定のために、公知のリアルタイムＰＣＲ装置として、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）（米国インディアナ州、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）により、大腸菌ＤＮＡ増幅のＣｐ値を調べた。図１２に示すように、Ｃｐ値は、磁性ビーズの濃度の上昇によって減少した。この結果は、磁性ビーズの濃度が高くなるほど、開始時の標的コピー数が増加するということを示唆している。

実施例８：細胞溶解効率に対する振動の強さの効果
細胞溶解効率に対する振動の強さの効果を調べるために、０Ｖから４Ｖの振動器の電圧を用いた。細胞は、反応当たり１×１０^５細胞／μｌのグラム陰性細菌である大腸菌を用いた。１０μｌの試料に対して、出力が０．５Ｗのレーザを、８０８ｎｍで４０秒間照射した。細胞溶解チップと光ファイバとの間の距離は、１ｍｍであった。試料内の磁性ビーズ濃度は、５×１０^６ビーズ／μｌであり、試験を３回繰り返した。図１３は、振動器の電圧を変化させたときの、大腸菌細胞から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果を表すグラフである。図１３において、陽性コントロールである煮沸は、大腸菌細胞を９５℃で５分間煮沸した後に放出されたＤＮＡに対してＰＣＲを実施した場合であり、陰性コントロールは、ＤＮＡなしに蒸留水だけを用いてＰＣＲを実施した場合であった。縦軸は、増幅されたＤＮＡの濃度（ｎｇ／μｌ）を表す。ＰＣＲ生成物の量は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて定量化された。エラーバーは、平均の標準偏差を表す。増幅されたＤＮＡの量が増加するほど、溶解した細胞の数が増加したが、これは細胞溶解効率が向上するということを表している。

図１３に示したように、振動器の電圧が大きくなるほど、細胞溶解効率が向上する。３Ｖを超える振動器の電圧では、煮沸法よりも高い細胞溶解効率を示した。また、振動器の電圧が大きくなるほど、細胞溶解効率が高くなるため、放出されたＤＮＡが増加し、これによってＣｐは減少する。

したがって、細胞またはウイルス及び磁性ビーズの混合後に振動をすることによって細胞溶解効率が向上する。

実施例９：グラム陽性細菌の溶解効率に対するレーザ出力の効果
グラム陽性細菌の溶解効率に対するレーザ出力を調べるために、０．５Ｗから３Ｗのレーザ出力を用いた。細胞として、１×１０^５細胞／μｌのグラム陽性細菌であるスタフィロコッカスエピデルミディスを用い、細胞溶解チップと光ファイバとの間の距離は３ｍｍであり、磁性ビーズ濃度は、９×１０^６ビーズ／μｌであったことを除いては、前記実施例８と同様の実験を行った。図１４は、レーザの出力を変化させたときの、スタフィロコッカスエピデルミディス細胞（１×１０^５細胞／μｌ）から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果を表すグラフである。図１４において、コントロールは、スタフィロコッカスエピデルミディス細胞を１３，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後に得られた上澄み液に対してＰＣＲを実施した場合であり、陽性コントロールである煮沸は、スタフィロコッカスエピデルミディス細胞を９５℃で５分間煮沸した後に放出されたＤＮＡに対してＰＣＲを実施した場合であり、陰性コントロールは、ＤＮＡなしに蒸留水だけに対してＰＣＲを実施した場合であった。縦軸は、増幅されたＤＮＡの濃度（ｎｇ／μｌ）を表す。ＰＣＲ生成物の量は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて定量化された。エラーバーは、平均の標準偏差を表す。図１４に示したように、レーザ出力が高まるほど細胞溶解効率が向上する。１Ｗを超える振動器の電圧では、煮沸法と同等かまたはより高い細胞溶解効率を示した。したがって、本発明のマイクロチップを用いて細胞またはウイルスを溶解するときには、レーザ出力をかなり下げることができる。

細胞溶解効率に対する細胞の濃度の効果を調べるために、１×１０^２細胞／μｌの濃度のグラム陽性細菌であるスタフィロコッカスエピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を用いたことを除いては、上述と同様の実験を行った。

図１５は、レーザの出力を変化させたときの、スタフィロコッカスエピデルミディス細胞（１×１０^２細胞／μｌ）から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果を表すグラフである。図１５において、コントロールは、スタフィロコッカスエピデルミディス細胞を１３，２００ｒｐｍで５分間遠心分離後に上澄み液に対してＰＣＲを実施した場合であり、陽性コントロールである煮沸は、スタフィロコッカスエピデルミディス細胞を９５℃で５分間煮沸した後に放出されたＤＮＡに対してＰＣＲを実施した場合であり、陰性コントロールは、ＤＮＡなしに蒸留水だけに対してＰＣＲを実施した場合であった。縦軸は、増幅されたＤＮＡの濃度（ｎｇ／μｌ）を表す。ＰＣＲ生成物の量は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて定量化された。エラーバーは、平均の標準偏差を表す。図１５に示したように、レーザ出力が高まるほど細胞溶解効率が向上する。、特にレーザ出力が３Ｗの場合、煮沸法に比べて顕著に細胞溶解効率が高くなった。したがって、細胞濃度に関係なく、本発明の方法を利用すれば、グラム陽性細菌を効率的に溶解できる。

また、本発明の細胞溶解チップを用いて、他のグラム陽性細菌であるストレプトコッカスムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）細胞を効率的に溶解できるか否かを調べるために、スタフィロコッカスエピデルミディス細胞及びストレプトコッカスムタンス細胞を用いて、１Ｗのレーザ出力を４０秒間用いたことを除いては、前記と同様に実験を行った。

図１６は、スタフィロコッカスエピデルミディス細胞及びストレプトコッカスムタンス細胞から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果を表すグラフである。図１６において、試料１は、スタフィロコッカスエピデルミディス細胞から放出されたＤＮＡに対してＰＣＲを実施したものであり、試料２は、スタフィロコッカスエピデルミディス細胞を９５℃で５分間煮沸した後に放出されたＤＮＡに対してＰＣＲを実施したものであり、試料３は、ストレプトコッカスムタンス細胞から放出されたＤＮＡに対してＰＣＲを実施したものであり、試料４は、ストレプトコッカスムタンス細胞を９５℃で５分間煮沸した後に放出されたＤＮＡに対してＰＣＲを実施したものであり、試料５は、ＤＮＡなしに蒸留水だけに対してＰＣＲを実施したものであった。縦軸は、増幅されたＤＮＡの濃度（ｎｇ／μｌ）を表す。ＰＣＲ生成物の量は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて定量化された。エラーバーは、平均の標準偏差を表す。図１６に示したように、本発明の細胞溶解方法は、グラム陽性細菌であるスタフィロコッカスエピデルミディス細胞及びストレプトコッカスムタンス細胞の両方に関して、煮沸法に比べて高い細胞溶解効率を有する。

実施例１０：グラム陰性細菌の溶解効率に対するレーザ出力の効果
グラム陰性細菌の細胞溶解効率に対するレーザ出力の効果を調べるために、０Ｗから３Ｗのレーザ出力を用いた。細胞として、１×１０^５細胞／μｌのグラム陰性細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いたことを除いては、前記実施例９と同様の実験を行った。図１７は、レーザの出力を変化させたときの、大腸菌細胞（１×１０^５細胞／μｌ）から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果を表すグラフである。図１７において、陽性コントロールである煮沸は、大腸菌細胞を９５℃で５分間煮沸した後で放出されたＤＮＡに対してＰＣＲを実施したものであり、陰性コントロールは、ＤＮＡなしに蒸留水だけに対してＰＣＲを実施したものである。縦軸は、増幅されたＤＮＡの濃度（ｎｇ／μｌ）を表す。ＰＣＲ生成物の量は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて定量化された。エラーバーは、平均の標準偏差を表す。図１７に示したように、レーザ出力が高まるほど細胞溶解効率が向上する。特に１Ｗを超えるレーザ出力では、煮沸法に比べて細胞溶解効率が高くなった。また、Ｃｐはレーザ出力が高まるほど減少したので、放出されたＤＮＡ量が増加したということを示している。しかし、２Ｗを超えるレーザ出力では、細胞溶解効率が飽和状態になった。この結果は、あらゆる細胞が溶解するまでレーザ出力を高めるほど開始時の標的コピー数が増加したということを示唆している。

したがって、本発明のマイクロチップを用い、細胞またはウイルスを溶解するときには、レーザ出力をかなり下げることができる。

細胞溶解効率に対する細胞の濃度の効果を調べるために、１×１０^２細胞／μｌの濃度のグラム陰性細菌である大腸菌を用いたことを除いては、上述と同様の実験を行った。

図１８は、レーザの出力を変化させたときの、大腸菌細胞（１×１０^２細胞／μｌ）から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果を表すグラフである。図１８において、コントロールは、大腸菌細胞を１３，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液を取ってＰＣＲをした場合であり、陽性コントロールである煮沸は、大腸菌細胞を９５℃で５分間煮沸した後に放出されたＤＮＡに対してＰＣＲを実施した場合であり、陰性コントロールは、ＤＮＡなしに蒸留水だけに対してＰＣＲを実施した場合である。縦軸は、増幅されたＤＮＡの濃度（ｎｇ／μｌ）を表す。ＰＣＲ生成物の量は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて定量化された。エラーバーは、平均の標準偏差を表す。図１８に示したように、レーザ出力が高まるほど細胞溶解効率が向上する。特にレーザ出力が０．５Ｗを超えると煮沸法に比べて細胞溶解効率が高くなり、３Ｗでは、煮沸法に比べて細胞溶解効率が顕著に高い。したがって、本発明のマイクロチップを利用し、細胞またはウイルスを溶解するときには、レーザ出力をかなり下げることができる。

したがって、細胞濃度に関係なく、本発明の方法を利用すれば、グラム陰性細菌を効率的に溶解できる。

実施例１１：大腸菌試料の温度に対するレーザ出力の効果
大腸菌試料の温度に対するレーザ出力の効果を調べるために、０．５Ｗ、１Ｗ、及び２Ｗのレーザ出力を用いた。細胞として、１×１０^５細胞／μｌのグラム陰性細菌である大腸菌を用いたことを除いては、実施例１０と同様の実験を行った。図１９は、レーザの出力を変化させたときの大腸菌試料の温度変化を表すグラフである。図１９に示したように、レーザ出力が高まるほど試料温度は上昇する。特に数秒間１Ｗを超えるレーザの照射後に、試料温度は急激に上昇し、６５℃を超えた。

実施例１２：磁性ビーズ及びビーズ物質の表面電荷の効果
細胞溶解効率に対する磁性ビーズ及びビーズ物質の表面電荷の効果を調べるために、四種の異なるタイプのビーズを用いた。ビーズ濃度が０．５％であることを除いては、実施例１０と同様の実験を行った。図２０は、磁性ビーズ及びビーズ物質の表面電荷を変化させたときの、大腸菌細胞（１×１０^５細胞／μｌ）から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果を表すグラフである。図２０において、試料１はアミン末端のポリスチレン磁性ビーズ、試料２はシリカビーズ、試料３はポリスチレンビーズ、試料４はカルボン酸末端のポリスチレン磁性ビーズをそれぞれ用いて、放出されたＤＮＡに対してＰＣＲを実施したものである。試料５は陽性コントロールであり、大腸菌細胞を９５℃で５分間煮沸した後で放出されたＤＮＡに対してＰＣＲを実施したものであり、試料６は陰性コントロールであり、ＤＮＡなしに蒸留水だけに対してＰＣＲを実施したものである。縦軸は、増幅されたＤＮＡの濃度（ｎｇ／μｌ）を表す。ＰＣＲ生成物の量は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ２１００を用いて定量化された。エラーバーは、平均の標準偏差を表す。図２０に示したように、レーザ照射は、カルボン酸末端のポリスチレン磁性ビーズの存在下でのみ大腸菌ＤＮＡを効率的に放出させた。

また、四種のビーズに対して試料溶液の温度を調べた（データは提示せず）。シリカビーズを利用した試料溶液の温度は、非常にゆっくりと増加したが、これは、シリカビーズが１Ｗのレーザ出力に対して、十分にレーザビームを吸収しなかったためである。アミン末端のポリスチレンビーズの試料溶液の温度は、カルボン酸末端のポリスチレン磁性ビーズのように増加したが、放出されたＤＮＡは、ビーズの表面のアミン官能基の正電荷による静電気的相互作用のため、磁性ビーズに結合した。ポリスチレンビーズの試料溶液の温度は、マイクロビーズの熱容量のため、シリカビーズと磁性ビーズの中間の速度で上昇した。

カルボン酸末端のポリスチレン磁性ビーズの最も大きい利点は、ＤＮＡ分離ステップを減らすことができるということであるが、これはレーザ及びマイクロ磁性ビーズを用いた細胞溶解が蛋白質の変性及び除去を招くためである。変性された蛋白質及び細胞の残骸は、吸着により磁性ビーズのポリスチレン表面に付着するが、これは、重力または磁場による容易な除去を促進させる。ＤＮＡは、ビーズのカルボン酸の負電荷による斥力のため、ビーズに結合しない。これは、検出限界を下げ、ＤＮＡの抽出時間を縮め、信号振幅を増加させることによってＰＣＲ収率を顕著に改善する。

実施例１３：細胞溶解効率に対する磁性ビーズ表面の官能基の効果
細胞溶解効率に対する磁性ビーズ表面の官能基の効果を調べるために、細胞溶解から放出されたＤＮＡ増幅効率を調べた。まず、磁性ビーズ表面に多様な官能基を合成させた。図２１は、イミノジ酢酸（ＩＤＡ）、Ｃｕ−ＩＤＡ、ピレン、及びチオール官能基を磁性ビーズ表面に合成させる一実施形態を表したものである。磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））にそれぞれの官能基を合成させる工程は下記のようであった。

（１）ＩＤＡ−ビーズ
アミン官能基を有した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０ Ａｍｉｎｅ、３０ｍｇ／ｍｌ）５００μｌを取り出し、磁石を用いて溶液を除去した。ここに、ＮＭＰ（１−メチル−２−ピロリドン）５００μｌを入れてビーズとよく混合した後、溶液を除去した。この工程を３回繰り返した。ブロモ酢酸エチル６μｌ、及びトリエチルアミン１０μｌをＮＭＰ５００μｌに溶かした溶液をビーズと十分に混合して４５℃で一日間放置した。反応が終わった後、ビーズをＮＭＰ５００μｌで３回、エタノール５００μｌで３回洗浄した。溶液を、磁石を用いて除去した後、ここに１ＮＮａＯＨとエタノールとを１：１（体積比）で混ぜた溶液５００μｌを加え、常温で１時間放置した。反応が終わった後、ビーズをエタノール５００μｌで３回、三次蒸留水５００μｌで３回洗浄した。その後溶液を除去して所望の緩衝溶液５００μｌを入れ、冷蔵保管した。

（２）Ｃｕ−ＩＤＡ−ビーズ
ＩＤＡビーズにＣｕ（ＮＯ_３）_２１００ｍｇ、及びトリエタノールアミン（ＴＥＡ）１００μｌを５００μｌのＮＭＰに溶かした溶液を加えた後で一日間放置した。反応が終わった後、ビーズをＮＭＰ５００μｌで３回、エタノール５００μｌで３回、三次蒸留水５００μｌで３回洗浄した。その後溶液を除去して所望の緩衝溶液５００μｌを入れ、冷蔵保管した。

（３）ピレン−ビーズ
アミン官能基を有した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０ Ａｍｉｎｅ、３０ｍｇ／ｍｌ）５００μｌを取り出し、磁石を用いて溶液を除去した。ここに、ＮＭＰ５００μｌを入れてよく混合した後、溶液を除去した。この工程を３回繰り返した。１−ピレン酪酸１５ｍｇ、ＨＢＴＵ（ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）２２ｍｇ、及びＴＥＡ（トリエチルアミン）７μｌをＮＭＰ５００μｌに溶かした溶液を、このビーズに加えた後でよく混合し、常温で一日間放置した。反応が終わった後、ビーズをＮＭＰ５００μｌで３回、エタノール５００μｌで３回、三次蒸留水５００μｌで３回洗浄した。その後溶液を除去して所望の緩衝溶液５００μｌを入れ、冷蔵保管した。

（４）チオール−ビーズ
アミン官能基を有した磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０ Ａｍｉｎｅ、３０ｍｇ／ｍｌ）５００μｌを取り出し、磁石を用いて溶液を除去した。ここに、ＮＭＰ５００μｌを入れてよく混合した後、溶液を除去した。この工程を３回繰り返した。３−メルカプトプロピオン酸１０μｌ、ＨＢＴＵ２２ｍｇ、及びＴＥＡ７μｌをＮＭＰ５００μｌに溶かした溶液をこのビーズに加えた後でよく混合し、常温で一日間放置した。反応が終わった後、ビーズをＮＭＰ５００μｌで３回、エタノール５００μｌで３回洗浄した。溶液を、磁石を用いて除去した後、ここに１ＮＮａＯＨとエタノールとを１：１（体積比）で混合した溶液５００μｌを加え、常温で１時間放置した。反応が終わった後、ビーズをエタノール５００μｌで３回、三次蒸留水５００μｌで３回洗浄した。その後溶液を除去して所望の緩衝溶液５００μｌを入れ、冷蔵保管した。

それぞれの官能基が合成された磁性ビーズを用いて、ＤＮＡ増幅効率を調べた。細胞として大腸菌（１×１０^７細胞／μｌ）を用いたことを除いては、実施例１２と同様に実験を行った。図２２は、磁性ビーズ表面の官能基に関して、大腸菌細胞から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果をＣｐで表したグラフである。図２２において、カルボキシルビーズは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ（ノルウェー、ＤＹＮＡＬ社製）を用いて細胞を溶解した後ＰＣＲを実施したものであり、陽性コントロールである煮沸は、大腸菌細胞を９５℃で５分間煮沸した後に放出されたＤＮＡに対してＰＣＲを実施した場合であり、コントロールは、大腸菌細胞を１３，２００ｒｐｍで５分間遠心分離した後で上澄み液に対してＰＣＲを実施した場合であり、陰性コントロールは、ＤＮＡなしに蒸留水だけに対してＰＣＲを実施した場合である。図２２に示したように、官能基の中のＩＤＡが最も低いＣｐ値を有し、チオールのＣｐ値は、Ｃｕ−ＩＤＡのＣｐ値よりも小さかった。さらに、官能基の親水性が増すほどＣｐ値が減少した。すなわちＩＤＡはチオールより低いＣｐ値を有した。前記結果から、親水性官能基であるカルボキシル官能基を有するビーズは、最も高い細胞溶解効率を有し、ブロックされた官能基を有するＣｕ−ＩＤＡビーズは、低い細胞溶解効率を有するということが分かる。

実施例１４：ＤＮＡ増幅効率に対する磁性ビーズを含む溶液のｐＨの効果
ＤＮＡ増幅効率に対する磁性ビーズを含む溶液のｐＨの効果を調べるために、三種のビーズ、すなわちカルボキシル基を有する磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））、ＩＤＡを有する磁性ビーズ、及びポリカルボキシ磁性ビーズを用いた。前記の実験結果で、カルボキシル官能基を有するビーズの細胞溶解効率が最も高かったので、多くのカルボキシル官能基を有するポリカルボキシビーズを合成した。図２３は、ポリカルボキシル官能基を磁性ビーズ表面に合成させる一実施形態を表したものである。磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））に前記官能基を合成させる工程は下記の通りであった。

アミン官能基を有する磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−２７０ Ａｍｉｎｅ、３０ｍｇ／ｍｌ）５００μｌを取り出し、磁石を用いて溶液を除去した。ここに、ＮＭＰ５００μｌを入れてよく混合した後、溶液を除去した。この工程を３回繰り返した。エチレン−無水マレイン酸交互共重合体１００ｍｇ、及びトリエチルアミン１０μｌをＮＭＰ５００μｌに溶かした溶液をこのビーズに添加した後、よく混合して常温で一日間放置した。反応が終わった後、ビーズをＮＭＰ５００μｌで３回、エタノール５００μｌで３回洗浄した。溶液を、磁石を用いて除去した後、ここに１００ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）５００μｌを加え、常温で１時間放置した。反応が終わった後、ビーズをエタノール５００μｌで３回、三次蒸留水５００μｌで３回洗浄した。その後溶液を除去して所望の緩衝液５００μｌを入れた後、冷蔵保管した。

前記三種のビーズ溶液のｐＨを５、７、及び９に調節したことを除いては、実施例１３と同様に実験を行った。図２４は、磁性ビーズ表面の官能基及びビーズ溶液のｐＨを変化させたときの、大腸菌細胞から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果をＣｐで表したグラフである。図２４において、コントロールは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ（ノルウェー、ＤＹＮＡＬ社製）を用いて細胞を溶解した後、ＰＣＲを実施したものである。図２４に示したように、ｐＨが増加するほどＣｐ値が減少する。これから、磁性ビーズを含む溶液のｐＨが増加するほど、細胞溶解効率が向上するということが分かる。しかし、同一ｐＨでは、細胞溶解効率は官能基によってそれほど変わらない。

実施例１５：阻害剤存在下のＰＣＲ効率の比較
前記実施例１３及び１４で、純粋な大腸菌細胞を用いた場合、細胞溶解効率は磁性ビーズを含む溶液のｐＨに依存した。表面官能基がカルボキシル基である場合、その構造によって細胞溶解効率はそれほど変わらない。これは、純粋な大腸菌細胞だけを使用する場合、細胞の残骸によるＰＣＲの阻害効果が不十分なためである。それゆえ、前記実施例１４で、ＰＣＲ阻害剤の除去に対するビーズ表面の官能基の効果を調べるために、阻害剤の存在下で磁性ビーズの種類及びｐＨを変えたときの細胞溶解効率を比較した。

まず、阻害剤として１０％血清を添加し、磁性ビーズを含む溶液のｐＨを７及び９としたことを除いては、実施例１４と同様に実験を行った。図２５は、１０％血清存在下での磁性ビーズ表面官能基を変化させたときの、大腸菌細胞から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果をＣｐで表したグラフである。図２５において、コントロールは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ（ノルウェー、ＤＹＮＡＬ社製）を用い、１０％血清の存在下で細胞を溶解した後ＰＣＲを実施した場合であり、ＰＴＣ（陽性コントロール）は、大腸菌から放出されたＤＮＡに１０％血清を添加した後ＰＣＲを実施した場合である。図２５に示したように、同じ官能基を有する磁性ビーズのＣｐ値は、ｐＨによって変化した。すなわち、カルボキシル基及びＩＤＡの場合には、ｐＨ９のときよりもｐＨ７のときのＣｐ値が低くなり、ポリカルボキシルの場合には、ｐＨ７のときよりもｐＨ９のときのＣｐ値が低くなった。したがって、カルボキシル官能基、及び磁性ビーズを含んだ溶液のｐＨを適切に組み合わせれば、阻害剤のＰＣＲ阻害効果を顕著に減少させることができる。

次に、大腸菌の代わりにＢ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ、ＨＢＶ）を用い、ｐＨを７に調節したことを除いては、前記と同様に実験を行った。下記の対のプライマーをＰＣＲに用いた：正のプライマー（配列番号３）；及び逆のプライマー（配列番号４）。このプライマー対は、ＨＢＶゲノムのコア領域に該当する部位である。図２６は、１０％血清の存在下で磁性ビーズ表面の官能基を変化させたときの、ＨＢＶから放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果を、ＰＣＲ生成物の濃度で表したグラフである。図２６において、コントロールは、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＭｙＯｎｅ（商標）Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ Ａｃｉｄ（ノルウェー、ＤＹＮＡＬ社製）を用い、１０％血清の存在下でＨＢＶを溶解した後でＰＣＲを実施した場合であり、ＰＴＣ（陽性コントロール）は、ＨＢＶから放出されたＤＮＡに対して、１０％血清を添加せずにＰＣＲを行なった場合である。図２６に示したように、１０％血清の存在下でもＰＣＲ生成物が生成された。したがって、カルボキシル官能基、及び磁性ビーズを含んだ溶液のｐＨを適切に組み合わせれば、阻害剤のＰＣＲ阻害効果を顕著に減少させることができる。

実施例１６：レーザ照射による細胞の生存能調査
レーザ照射によって試料溶液中に存在する生存細胞及び死滅細胞を観察するために、大腸菌細胞を用いた。図２７は、レーザ照射を行うか否かによる大腸菌細胞の生存能を表す写真である。図２７において、パネル（Ａ）は、レーザ照射前のマイクロ磁性ビーズの不在下での大腸菌細胞の画像であり、パネル（Ｂ）は、０．５Ｗのレーザ出力を有するレーザを、８０８ｎｍで４０秒間照射した後の、マイクロ磁性ビーズ存在下での大腸菌細胞の画像であり、パネル（Ｃ）は、１Ｗのレーザ出力を有するレーザを、８０８ｎｍで４０秒間照射した後の、マイクロ磁性ビーズ存在下での大腸菌細胞の画像である。ソラマメ色に染色された細胞（明るく見える細胞）は、生存している細胞であり、赤色に染色されている細胞（暗く見える細胞）は、死滅細胞を示す。図２７に示したように、レーザ照射をする前には、細胞のほとんどが生存しているが、レーザ出力が高まるほど死滅細胞の比率が高まる。

実施例１７：ゲノムＤＮＡの損傷に対するレーザ照射の効果
レーザ照射によりゲノムＤＮＡが損傷されているか否かを調べるために、分離されたＤＮＡがレーザで４０秒照射後に切断されているか否かを調べた。図２８は、ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）プラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１細胞にレーザを照射した後でＤＮＡを分析した写真である。レーン１は、本発明の方法を用いてＤＮＡを分離したものであり、レーン２は、９５℃で５分間煮沸した後で分離されたＤＮＡであり、レーン３は、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）ミニプレップキットを用いてプラスミドＤＮＡを分離したものであり、レーン４は、Ｑｉａｇｅｎ ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキットを用いて、ＢＬ２１のゲノムＤＮＡを分離したものであり、レーン５は、プラスミドのない大腸菌ＢＬ２１細胞からＱｉａｇｅｎ ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキットを用い、ＢＬ２１のゲノムＤＮＡを分離したものである。レーン５は、ゲノムＤＮＡに対する正しいバンドを確認するために用いた。図２８に示されるように、ＤＮＡに対する損傷はなかった。予想した通り、プラスミドを分離するためのＱｉａｇｅｎ ＱＩＡｐｒｅｐ（登録商標）ミニプレップキットを用いると、ゲノムＤＮＡへの汚染がほとんどなかった（レーン３参照）。興味深いことに、本発明の方法を用いると、ゲノムＤＮＡはプラスミドＤＮＡへの汚染がはるかに少ない状態で特異的に分離された。対照的に、バクテリアに対する蛋白質分解酵素Ｋの処理後に、シリカゲル膜技術を利用するゲノムＤＮＡ分離のためのＱｉａｇｅｎ ＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡミニキットを用いると、多くのプラスミドＤＮＡ汚染があった（レーン４）。このことは、Ｑｉａｇｅｎキットによる分離されたＤＮＡより、本発明の方法により分離されたＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅する場合に、さらに良好な収率が得られるという理由を説明できる。

本発明において、レーザ及びマイクロ磁性ビーズを組み合わせることにより、効率的な細胞溶解の新規な方法が開発され、細胞懸濁液中に存在するマイクロ磁性ビーズは、レーザビームを試料に適用したときに迅速な細胞溶解を引き起こし、数秒内にバクテリア細胞を破壊することができた。最も重要なことは、本発明の方法で破壊された細胞から放出されたＤＮＡは、他の二種の一般的な方法により溶解された細胞から放出されたＤＮＡより、さらに効率的にＰＣＲにより増幅されたことであり、これは、細胞溶解の間のＤＮＡの増幅を妨害する物質の放出が、他の方法に比べて最小であるということを表す。容易性、効率的な細胞溶解及びＤＮＡの放出によって、本発明の新しい細胞溶解の方法は、ＬＯＣ適用への統合に適するようになる。

本発明のレーザ及びマイクロ磁性ビーズを用いた細胞またはウイルスの迅速な破壊方法及び装置は、例えば細胞またはウイルス処理関連の技術分野に効果的に適用可能である。

レーザ及びマイクロ磁性ビーズを用いた細胞溶解に使われるシステムの模式図である。 マイクロチップ上でレーザ及びマイクロ磁性ビーズを用いた細胞溶解に利用されるシステムの一実施形態を表す模式図である。 図２Ａに図示したシステムの設計図である。 細胞溶解装置のセプタ部分を表す写真である。 レーザ及びマイクロ磁性ビーズを用いた細胞破壊装置に利用されるマイクロチップの一実施形態を表す模式図である。 本発明の一実施形態によるマイクロチップの写真である。 レーザ照射後の細胞生存能の測定結果を示す写真である。 レーザ照射が磁性ビーズの存在下でのみバクテリアＤＮＡを効率的に放出させることを示すグラフである。 レーザアブレーションにより放出されたＤＮＡが、一般的な方法で製造されたＤＮＡよりも、Ｔａｑ重合酵素によりさらに効率的に増幅されることを示すグラフである。 磁性ビーズの大きさの効果を示すグラフである。 Ｐｙｒｅｘ ７７４０及び反射防止コーティングされたＰｙｒｅｘ ７７４０に対するレーザの透過率を示すグラフである。 本発明の細胞溶解チップにレーザを照射した後の写真である。 磁性ビーズ濃度を変化させたときの、大腸菌細胞から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果を表すグラフである。 振動器の電圧を変化させたときの、大腸菌細胞から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果を表すグラフである。 レーザの出力を変化させたときの、スタフィロコッカスエピデルミディス細胞（１×１０^５細胞／μｌ）から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果を表すグラフである。 レーザの出力を変化させたときの、スタフィロコッカスエピデルミディス細胞（１×１０^２細胞／μｌ）から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果を表すグラフである。 スタフィロコッカスエピデルミディス細胞及びストレプトコッカスムタンス細胞から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果を表すグラフである。 レーザの出力を変化させたときの、大腸菌細胞（１×１０^５細胞／μｌ）から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果を表すグラフである。 レーザの出力を変化させたときの、大腸菌細胞（１×１０^２細胞／μｌ）から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果を表すグラフである。 レーザの出力を変化させたときの、大腸菌試料の温度変化を表すグラフである。 磁性ビーズ及びビーズ物質の表面電荷を変化させたときの、大腸菌細胞（１×１０^５細胞／μｌ）から放出されたＤＮＡのＰＣＲ結果を表すグラフである。 ＩＤＡ、Ｃｕ−ＩＤＡ、ピレン、及びチオール作用基を磁性ビーズ表面に合成させる一実施形態を表した図面である。 磁性ビーズ表面作用基を変化させたときの、大腸菌細胞から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果をＣｐで表したグラフである。 ポリカルボキシル官能基を磁性ビーズ表面に合成させる一実施形態を表した図面である。 磁性ビーズ表面官能基及びビーズ溶液のｐＨを変化させたときの、大腸菌細胞から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果をＣｐで表したグラフである。 １０％血清の存在下で磁性ビーズ表面官能基を変化させたときの、大腸菌細胞から放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果をＣｐで表したグラフである。 １０％血清の存在下で磁性ビーズ表面官能基を変化させたときの、ＨＢＶから放出されたＤＮＡのＰＣＲの結果をＰＣＲ生成物の濃度で表したグラフである。 レーザ照射の有無による大腸菌細胞の生存能の違いを表す写真である。 ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ−ＴＯＰＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）プラスミドを含む大腸菌ＢＬ２１細胞に、レーザを照射した後でＤＮＡを分析した写真である。

Claims (38)

1. 細胞またはウイルスを含む溶液に磁性ビーズを注入するステップと、
   前記磁性ビーズを振動させるステップと、
   前記磁性ビーズを含む溶液に、４００ｎｍ以上の波長帯で発生しアブレーション現象を引き起こす出力のレーザを照射して、前記レーザにより加熱された磁性ビーズがレーザエネルギーによりアブレーション現象を起こすことによって細胞またはウイルスを破壊するステップと、
   を含み、
   前記磁性ビーズの表面官能基は、親水性であり、負電荷を帯びていることを特徴とする、細胞またはウイルスの破壊方法。
2. 前記レーザがパルスレーザまたは連続波動レーザを含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記レーザは、７５０ｎｍから１，３００ｎｍの波長帯で発生することを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. 前記レーザは、一つ以上の波長帯で発生することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記磁性ビーズの大きさが５０ｎｍから１，０００μｍであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記磁性ビーズの大きさが１μｍから５０μｍであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. 前記磁性ビーズが二種以上の大きさを有するビーズの混合物であることを特徴とする、請求項５または請求項６に記載の方法。
8. 前記磁性ビーズが強磁性を帯びるＦｅ、Ｎｉ、Ｃｒ、及びそれらの酸化物からなる群より選択される１以上の物質を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記磁性ビーズが強磁性を帯びる金属でコーティングされている重合体、有機物質、ケイ素、またはガラスであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記磁性ビーズの表面官能基は、カルボキシル基またはその誘導体であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記磁性ビーズを含んだ溶液のｐＨが６ないし９であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 前記溶液が唾液、尿、血液、血清、及び細胞培養液からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
13. 試料導入口が形成されており、前記試料導入口を介して試料及び磁性ビーズを収容する細胞溶解チャンバと、
    前記細胞溶解チャンバに装着され、前記細胞溶解チャンバ内で試料及び磁性ビーズを混合する振動器と、
    前記細胞溶解チャンバに装着され、４００ｎｍ以上の波長帯で発生しアブレーション現象を引き起こす出力のレーザを供給するレーザ発生部と、
    を備える細胞またはウイルスの破壊装置であって、
    前記レーザにより加熱された磁性ビーズがレーザエネルギーによりアブレーション現象を起こし、衝撃波、蒸気圧、及び熱を細胞表面に伝達され、物理的衝撃が細胞表面に加えられる機構を有し、
    前記磁性ビーズの表面官能基は、親水性であり、負電荷を帯びていることを特徴とする、細胞またはウイルスの破壊装置。
14. 前記振動器は、超音波洗浄器、磁場を利用した振動器、電場を利用した振動器、機械的振動器、及び圧電物質からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
15. 前記細胞溶解チャンバに装着され、細胞溶解の終了後に前記細胞溶解チャンバ内の磁性ビーズを除去する電磁石をさらに備えることを特徴とする、請求項１３または請求項１４に記載の装置。
16. 流路を介して前記細胞溶解チャンバと連結されたＤＮＡ精製チャンバをさらに備えることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の装置。
17. 流路を介して前記細胞溶解チャンバと連結されたＤＮＡ増幅チャンバをさらに備えることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の装置。
18. 流路を介して前記ＤＮＡ精製チャンバと連結されたＤＮＡ増幅チャンバをさらに備えることを特徴とする、請求項１６または１７に記載の装置。
19. 前記磁性ビーズの表面官能基は、カルボキシル基またはその誘導体であることを特徴とする、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の装置。
20. 試料導入口が形成されており、前記試料導入口を介して試料及び磁性ビーズを収容する細胞溶解チップと、
    前記細胞溶解チップに振動伝達部を介して連結され、前記細胞溶解チップ内で試料及び磁性ビーズを混合する振動器と、
    前記細胞溶解チップに装着され、前記振動器により発生した振動を前記細胞溶解チップに伝達する振動伝達部と、
    前記細胞溶解チップに装着され、４００ｎｍ以上の波長帯で発生しアブレーション現象を引き起こす出力のレーザを供給するレーザ発生部と、
    前記細胞溶解チップに装着され、試料の蒸発を抑制する蒸発抑制部と、
    を備える細胞またはウイルスの破壊装置であって、
    前記レーザにより加熱された磁性ビーズがレーザエネルギーによりアブレーション現象を起こし、衝撃波、蒸気圧、及び熱を細胞表面に伝達され、物理的衝撃が細胞表面に加えられる機構を有し、
    前記磁性ビーズの表面官能基は、親水性であり、負電荷を帯びていることを特徴とする、細胞またはウイルスの破壊装置。
21. 前記振動器は、磁場を利用した振動器、電場を利用した振動器、機械的振動器、及び圧電物質からなる群より選択されることを特徴とする、請求項２０に記載の装置。
22. 前記振動器は、振動伝達部を介して細胞溶解チップ底部に振動を伝達することを特徴とする、請求項２０または２１に記載の装置。
23. 前記蒸発抑制部は、セプタから構成されることを特徴とする、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の装置。
24. 前記セプタは、バルブ、重合体構造物、及び金属構造物からなる群より選択されることを特徴とする、請求項２３に記載の装置。
25. 前記磁性ビーズの表面官能基は、カルボキシル基またはその誘導体であることを特徴とする、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の装置。
26. 上面と下面とが開放されており、反応チャンバ、試料導入口及び試料導出口が形成されているチップ本体部と、
    前記チップ本体部の上面に装着され、前記反応チャンバの上面部を密閉させ、前記チップ内にレーザを通過させる、試料導入口及び試料導出口のあるチップカバー部と、
    チップ装着部を介して前記チップ本体部の下面に装着され、反応チャンバ、試料導入口、及び試料導出口の下部を密閉させるチップ底部と、
    を備える、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の細胞またはウイルスの破壊装置に利用するための細胞溶解チップ。
27. 前記チップカバー部の材質は、ガラス、重合体、及びインジウム錫酸化物（ＩＴＯ）ガラスからなる群より選択されることを特徴とする、請求項２６に記載のチップ。
28. 前記チップカバー部がレーザ反射防止コーティングされていることを特徴とする、請求項２６または２７に記載のチップ。
29. 前記チップ本体部の材質は、ガラス、重合体、シリコン、及び両面接着テープからなる群より選択されることを特徴とする、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のチップ。
30. 前記チップ底部の材質は、重合体、シリコン、ガラス、及びＩＴＯガラスからなる群より選択されることを特徴とする、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載のチップ。
31. 前記チップ装着部は、接着テープ及び接着剤からなる群より選択される接着物により、前記チップ本体部とチップ底部とを連結することを特徴とする、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載のチップ。
32. 前記レーザがパルスレーザまたは連続波動レーザを含むことを特徴とする、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の装置。
33. 前記レーザは、一つ以上の波長帯で発生することを特徴とする、請求項１９〜２４、３１及び３２のいずれか１項に記載の装置。
34. 前記磁性ビーズの大きさが５０ｎｍから１，０００μｍであることを特徴とする、請求項１９〜２４、３１〜３３のいずれか１項に記載の装置。
35. 前記磁性ビーズが二種以上の大きさを有するビーズの混合物であることを特徴とする、請求項３４に記載の装置。
36. 前記磁性ビーズが強磁性を帯びるＦｅ、Ｎｉ、Ｃｒ及びそれらの酸化物からなる群より選択される１以上の物質を含むことを特徴とする、請求項１９〜２４、３１〜３５のいずれか１項に記載の装置。
37. 前記磁性ビーズが強磁性を帯びる金属でコーティングされている重合体、有機物質、ケイ素、またはガラスであることを特徴とする、請求項１９〜２４、３１〜３６のいずれか１項に記載の装置。
38. 前記試料が唾液、尿、血液、血清、及び細胞培養液からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１９〜２４、３１〜３７のいずれか１項に記載の装置。