DE102013203655B4

DE102013203655B4 - Verfahren und Vorrichtung zur selektiven Lyse von zellulären Partikeln

Info

Publication number: DE102013203655B4
Application number: DE102013203655.8A
Authority: DE
Inventors: Yvonne Beyl; Thomas Brettschneider; Martina Reinhardt
Original assignee: Robert Bosch GmbH
Current assignee: Robert Bosch GmbH
Priority date: 2013-03-04
Filing date: 2013-03-04
Publication date: 2023-03-23
Anticipated expiration: 2033-03-05
Also published as: DE102013203655A1

Abstract

Verfahren zur selektiven Lyse von Erythrozyten in einer Blutprobe zur Anreicherung von Bakterien aus dieser Blutprobe, wobei die Erythrozyten mit elektromagnetischer Strahlung (17; 27) beaufschlagt werden, die in einem Wellenlängenbereich zwischen 300 nm und 500 nm liegt, sodass die Erythrozyten diese elektromagnetische Strahlung absorbieren und zerstört werden, während die bakteriellen Bestandteile der Blutprobe nicht zerstört werden und weiter selektiert und/oder angereichert werden können.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur selektiven Lyse von zellulären Partikeln in einem Gemisch, insbesondere zur selektiven Lyse von Blutzellen. Weiterhin umfasst die Erfindung eine Verwendung der Vorrichtung zur Akkumulation von Bakterien aus Blut.
Stand der Technik
In vielen Bereichen der Biologie und Biochemie und insbesondere auch in der medizinischen Diagnostik und Forschung wird eine Analyse von biologischem Zellmaterial durchgeführt, beispielsweise werden Proteine und andere Zellbestandteile untersucht und charakterisiert. Eine besondere Bedeutung kommt hierbei der Untersuchung des genetischen Materials der Zellen zu. So erfolgt beispielsweise in vielen Fällen ein Nachweis von bestimmten Erregern, beispielsweise Bakterien, anhand einer Analyse der DNA oder RNA. Hierfür kann die in den 80-Jahren entwickelte sogenannte Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Vervielfältigung des genetischen Materials durchgeführt werden, bevor ein erregerspezifischer Nachweis beispielsweise nach eine gelelektrophoretischen Auftrennung der Reaktionsprodukte erfolgt. Diese Methode ist zwar sehr sensitiv, dennoch ist in vielen Fällen die Anzahl der Krankheitserreger so gering, dass beispielsweise ein bestimmter Erreger im Blut im Fall einer Infektionskrankheit kaum nachgewiesen werden kann. Um eine Diagnose stellen zu können, ist es daher oftmals notwendig, Probenvorbereitungsverfahren mit hoher Sensitivität zu entwickeln, die es zunächst ermöglichen, den Erreger in der Probe zu selektieren und anzureichern, um ihn anschließend analysieren und identifizieren zu können.
Für die Selektion und Anreicherung beispielsweise eines bakteriellen Erregers müssen andere Bestandteile in der Probe, beispielsweise die zellulären Bestandteile des Bluts, abgetrennt werden. Dies kann beispielsweise mittels Anionenaustauschermaterialien erfolgen, insbesondere mit miniaturisierten Ansätzen. Dies ist allerdings sehr aufwendig und lässt sich schwer standardisieren.
Eine weitere Möglichkeit zur Anreicherung von Krankheitserregern ist eine Probenanreicherung und Prozessierung mittels einer Zelllyse. Hierbei kann eine enzymatische oder chemische Lyse eingesetzt werden, die allerdings zeitaufwendig und unter Umständen mit weiteren Problemen behaftet ist. Ein anderer Ansatz ist die elektrische Lyse, wobei Zellen in nur wenigen Sekunden zerstört werden können. Hierfür können beispielsweise Laserstrahlen eingesetzt werden. So beschreibt die US-Patentschrift US 6,815,209 B2 ein Verfahren, um geeignete Laserparameter für die Lyse von bakteriellen Zellen zu bestimmen, wobei der Laserstrahl mit einer Linse fokussiert wird.
Die WO 2012/1364000 A1 beschreibt ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Photolyse von bakteriellen Zellen, wobei die Zellen gefärbt werden, bevor sie mit Licht einer geeigneten Wellenlänge bestrahlt werden. In einem wissenschaftlichen Artikel von Rau et. al. (Biophysical Journal, Vol. 91, July 2006, 317-329) werden verschiedene Untersuchungen zu einer Laserstrahl-vermittelte Zelllyse beschrieben. Aus der US 7,531,138 B2 und der US 2006/0084165 A1 gehen Verfahren zur Lyse von Zellen oder Viren hervor, bei denen Laserstrahlung in Kombination mit magnetischen Kügelchen eingesetzt werden. Die US 6,815,209 B2 beschreibt ein Verfahren zur Optimierung von Laser-Parametern, um eine Lyse von Zellen verbessern zu können.
Offenbarung der Erfindung
Vorteile der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Lyse von zellulären Partikeln in einem Gemisch bereit, wobei eine selektive Lyse bestimmter zellulärer Partikel in dem Gemisch erreicht wird. Die Partikel werden hierbei mit elektromagnetischer Strahlung beaufschlagt, wobei erfindungsgemäß die Wellenlänge oder die Wellenlängen der elektromagnetischen Strahlung im Absorptionsbereich der zu lysierenden zellulären Partikel liegen. Erfindungsgemäß werden mit diesem Verfahren Erythrozyten in einer Blutprobe selektiv lysiert, wobei die Wellenlänge der elektromagnetischen Strahlung in einem Bereich zwischen etwa 300 nm und etwa 500 nm gewählt wird. Auf diese Weise wird eine selektive Lyse erreicht, sodass die Erythrozyten in einer Probe selektiv zerstört werden können. Durch die Zerstörung dieser Partikel in einem Gemisch können bakterielle Bestandteile in der Probe, beispielsweise bakterielle Krankheitserreger, selektiert und angereichert werden, sodass sie weiter analysiert werden können. Kern der Erfindung ist dabei, dass eine Frequenz im Absorptionsbereich der Zielzellen, die lysiert werden sollen, gewählt wird. Die Zielzellen absorbieren die elektromagnetische Strahlung und werden hierbei zerstört bzw. lysiert. Ein Aufheizen von weiteren Bestandteilen in der Probe wird vermieden, sodass übrige Bestandteile der Probe nicht zerstört werden und weiter selektiert und/oder angereichert werden können.
Mit besonderem Vorteil ist die elektromagnetische Strahlung, mit der die zu lysierenden Partikel beaufschlagt werden, defokussiert, also nicht fokussiert. Vorzugsweise wird also nicht im Fokus der elektromagnetischen Strahlung gearbeitet. Die für den Lyseprozess erforderliche Energie ist auch außerhalb des Fokus ausreichend, sodass mit dem defokussierten Strahl ein räumlich verhältnismäßig großer Bereich erreicht werden kann, um die Lyse der zellulären Partikel in dem Gemisch zu induzieren.
Erfindungsgemäß liegt die Wellenlänge der elektromagnetischen Strahlung in einem Bereich zwischen etwa 300 nm und etwa 500 nm, insbesondere zwischen etwa 300 nm und etwa 480 nm. Dieser Wellenlängenbereich eignet sich besonders für die selektive Lyse von Erythrozyten (rote Blutkörperchen). Das Absorptionsmaximum der Erythrozyten liegt durch das enthaltene Protein Hämoglobin bei etwa 420 nm, sodass in dem genannten Wellenlängenbereich eine Zerstörung der Erythrozyten induziert wird. Ein Aufheizen von weiteren Gemischbestandteilen, beispielsweise des Blutplasmas oder anderer Zellen, insbesondere von bakteriellen Zellen, erfolgt hierbei nicht. Die Lyse ist also sehr spezifisch. Eine besonders geeignete Leistungsdichte der elektromagnetischen Strahlung liegt im Bereich zwischen circa 10 mW/cm² und circa 1000 mW/cm².
In besonders zweckmäßiger Weise erfolgt die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem mikrofluidischen Chip. Vergleichbare Chips sind als mikrofluidische Kanalsysteme für verschiedene Anwendungen, beispielsweise auch in der medizinischen Diagnostik, bekannt. Der besondere Vorteil hierbei liegt darin, dass mit sehr kleinen Probenmengen gearbeitet werden kann. Auch eignen sich mikrofluidische Kanalsysteme in besonderer Weise für eine Standardisierung und für einen hohen Probendurchsatz, sodass mikrofluidische Kanalsysteme oder Chips für diagnostische Verfahren, die beispielsweise von einer Blutprobe ausgehen, große Vorteile bieten. Verschiedene Aufreinigungs- und Analysemethoden, beispielsweise auch eine PCR-Reaktion, können auf demselben Chip durchgeführt werden, man spricht auch von Lab-on-a-Chip-Systemen, oder mit dem Chip gekoppelt werden.
Die selektive Lyse gemäß der Erfindung wird mit einer weiteren Aufreinigung und/oder Anreicherung von Bestandteilen des Gemisches kombiniert. Insbesondere können geeignete Filtermaterialen eingesetzt werden, um eine Trennung von verschiedenen Bestandteilen, insbesondere anhand von deren Größe, zu erreichen. So können durch den Einsatz von Filtermaterialien mit geeigneter Porengröße beispielsweise die weißen Blutkörperchen aus einer Blutprobe zunächst abgetrennt werden. Nach einer erfindungsgemäßen selektiven Lyse der roten Blutkörperchen kann eine Bakterienakkumulation mit einem geeigneten Filter durchgeführt werden.
Der besondere Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, dass durch Wahl der geeigneten Wellenlänge ganz bestimmte Partikel in einem Gemisch selektiv lysiert werden können. Darüber hinaus können im Vergleich beispielsweise mit einer chemischen oder enzymatischen Lyse von Zellen, bei der lange Inkubationszeiten eingehalten werden müssen, die zellulären Partikel oder Bestandteile mithilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens deutlich schneller lysiert werden. Nachteilig bei der chemischen oder enzymatischen Lyse ist weiterhin, dass oftmals chemische Reagenzien und/oder Enzyme eingesetzt werden, welche nachfolgende biochemische Reaktionen, beispielsweise eine PCR-Reaktion, inhibieren können. Demgegenüber hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, dass keine weiteren Reagenzien eingesetzt werden, die nachfolgende Reaktionen beeinflussen könnten oder die zu einer Verdünnung der Probe führen würden. Durch die Realisierung in einem mikrofluidischen Kanalsystem oder Chip kann die selektive Lyse besonders schnell und effizient in einem Durchflussverfahren durchgeführt werden. Durch ein verhältnismäßig geringes Probenvolumen in einer Lysekammer des Chips können hierbei nahezu alle Zielzellen in der Probe erreicht werden. Das Verfahren lässt sich sehr gut automatisieren und kann sehr kostengünstig und reproduzierbar für standardisierte Verfahren genutzt werden.
In herkömmlichen Ansätzen zur Lyse mittels elektromagnetischer Strahlung konnte bisher nur in einem kleinen Bereich im Laserfokus gearbeitet werden, da nur in diesem fokussierten Bereich die Energie zur Zündung eines Plasmas ausreichend ist. In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur selektiven Lyse hingegen ist die Energie auch außerhalb des Fokus ausreichend, da die Energie „aktiv“ von den zu lysierenden Zellen absorbiert wird, wodurch die Lyse ausgelöst wird. Dadurch ist es möglich, einen verhältnismäßig großen Probenraum zu bearbeiten.
Weiterhin erlaubt die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens in einem mikrofluidischen Kanalsystem, also mit einem mikrofluidischen Chip, die Integration von Filtermaterialien in das fluidische System. Durch Filtermaterialien mit geeigneter Porengröße können beispielsweise nicht lysierte zelluläre Bestandteile zurückgehalten und gegebenenfalls aufkonzentriert werden.
Die Erfindung umfasst weiterhin eine Vorrichtung zur Durchführung einer selektiven Lyse von Erythrozyten in einem Gemisch, insbesondere in einer Blutprobe. Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfasst wenigstens einen mikrofluidischen Chip mit einem mehrschichtigen Aufbau und wenigstens eine Quelle für elektromagnetische Strahlung. Hierbei ist die Strahlungsquelle für die Erzeugung einer elektromagnetischen Strahlung mit einer Wellenlänge in einem Bereich zwischen etwa 300 nm und etwa 500 nm vorgesehen. In dem Chip ist wenigstens eine Lysekammer vorhanden, innerhalb derer die Lyse der zellulären Partikel in der Probe stattfindet. Auf wenigstens einer Seite der Lysekammer wird die Kammer von einem transparenten Material begrenzt. Hierbei ist unter transparentem Material ein Material zu verstehen, das für die eingesetzte elektromagnetische Strahlung durchlässig ist, also für eine Strahlung mit einer Wellenlänge von circa 300 bis circa 500 nm, insbesondere von circa 300 nm bis circa 480 nm. Geeignet sind beispielsweise Materialien, die auch für sichtbares Licht durchlässig sind, beispielsweise Glas- oder Polymermaterialien. Die Lysekammer ist zur Beaufschlagung mit der elektromagnetischen Strahlung vorgesehen, insbesondere mit einer defokussierten elektromagnetischen Strahlung. Die elektromagnetische Strahlung wird in die Lysekammer eingekoppelt, wobei insbesondere nicht im Fokus der Strahlung gearbeitet wird. Durch die Verwendung einer elektromagnetischen Strahlung mit einer Frequenz bzw. einer Wellenlänge im Absorptionsbereich der Erythrozyten absorbieren diese Zielzellen die Energie, was zur Lyse der Zellen führt. Andere Bestandteile in der Probe absorbieren durch ihr abweichendes Absorptionsverhalten die elektromagnetische Strahlung nicht und werden daher nicht zerstört oder aufgeheizt. So wird eine selektive Lyse von bestimmten zellulären Partikeln erreicht, die in sehr vorteilhafter Weise für die Anreicherung und/oder Aufreinigung von bestimmten Partikeln in einem Gemisch genutzt werden kann. Auf diese Weise lassen sich die Erythrozyten in einer Blutprobe selektiv lysieren. Hierfür ist in besonderer Weise die Wellenlänge von circa 300 bis circa 500 nm, insbesondere von circa 300 nm bis circa 480 nm, geeignet. Andere Bestandteile der Probe, beispielsweise die weißen Blutkörperchen und Bakterien bleiben hiervon unbeeinflusst. Für eine Lyse von anderen Partikeln in einem Gemisch kann die Wellenlänge in Abhängigkeit von dem Absorbtionsspektrum der jeweiligen Zielpartikel angepasst werden.
Erfindungsgemäß ist es vorgesehen, dass die Lysekammer auf wenigstens zwei Seiten von einem transparenten Material begrenzt ist, sodass die elektromagnetische Strahlung beidseitig eingestrahlt werden kann. Hierdurch kann eine Effizienzsteigerung der Lyse erreicht werden.
Der Einsatz eines mikrofluidischen Chips hat den besonderen Vorteil, dass ein oder mehrere Filtermaterialien zur mechanischen Selektion oder Abtrennung von Bestandteilen des Gemisches in den Chip bzw. in das Kanalsystem integriert werden können. Durch eine geeignete Porengröße des Filtermaterials können bestimmte Bestandteile von den übrigen Bestandteilen abgetrennt oder aufgereinigt werden. Beispielsweise können weiße Blutkörperchen (circa 7 bis circa 21 µm im Durchmesser) in einer Blutprobe durch einen Filter mit einer geeigneten Porengröße abgetrennt werden. Eine Akkumulation von Bakterien (circa 1 bis 3 µm im Durchmesser) kann beispielsweise durch Verwendung eines Filtermaterials mit einer kleineren Porengröße nach der selektiven Lyse vorgenommen werden. Durch die Verwendung von geeigneten Filtermaterialien in dem Chip lässt sich die erfindungsgemäße Vorrichtung also für den jeweiligen Zweck anpassen, beispielsweise können bestimmte Bestandteile aus der Probe entfernt werden oder bestimmte Bestandteile können angereichert werden. Weiterhin können auch andere Aufreinigungsmaterialien, beispielsweise lonenaustauschchromatographie- oder Größenausschlusschromatographiematerialien integriert werden. Weiterhin können auf dem Chip analytische Verfahren, beispielsweise PCR-Reaktionen und/oder elektrophoretische Verfahren, durchgeführt werden. Darüber hinaus können Aufreinigungs- oder Analyseverfahren auch außerhalb des Chips durchgeführt werden.
Der mikrofluidische Chip ist zweckmäßigerweise mit einem Aufbau aus wenigstens drei Schichten realisiert, wobei der Aufbau wenigstens eine Polymermembran und wenigstens zwei Polymer- und/oder Glasschichten umfasst. Bei wenigstens einer dieser Polymer- und/oder Glasschichten handelt es zumindest teilweise um eine Schicht aus einem transparenten Material, um die Einkopplung der elektromagnetischen Strahlung in die Lysekammer, die in den mehrschichtigen Aufbau integriert ist, zu realisieren. Die Schichten aus Polymer oder Glas grenzen beispielsweise an beide Seiten der Polymermembran an.
Bei dem dreischichtigen Aufbau können beide Polymer- und/oder Glasschichten aus einem transparenten Material bestehen. Es kann auch vorgesehen sein, dass beispielsweise nur eine der beiden Schichten transparent, also durchlässig für die elektromagnetische Strahlung ist. Weiterhin kann es vorgesehen sein, dass nur ein Teil oder Bereich der Schicht transparent ist, sodass die elektromagnetische Strahlung die Lysekammer erreichen kann.
Die Polymer- oder Glassubstrate sind so strukturiert, dass wenigstens ein Ein- und ein Auslasskanal ein innenliegendes Volumen, das als Lysekammer für die Durchführung der selektiven Lyse dient, verbinden. Die Höhe der beispielsweise als Kanal ausgebildeten Lysekammer kann dabei durch die Dicke der Polymermembran bestimmt werden. Vorzugsweise ist die Höhe der Lysekammer dabei so gewählt, dass nur wenige Schichten der zu lysierenden Partikel übereinander die Lysekammer bzw. den Kanal durchlaufen. Hierdurch wird sichergestellt, dass die elektromagnetische Strahlung im Wesentlichen alle zellulären Partikel erreicht und dass keine Beschattung der Partikel in der Probe untereinander stattfindet.
Durch eine Absenkung des Lysekammervolumens in wenigstens eine der Polymer- und/oder Glasschichten kann ein größeres Volumen der Lysekammer realisiert werden. Darüber hinaus hat diese Ausgestaltung den Vorteil, dass sich eine größere Designfreiheit für den Chip ergibt.
Je nach der geplanten Anwendung kann die Lysekammer in unterschiedlicher Weise ausgestaltet sein. Sie kann beispielsweise eine Höhe von circa 100 µm bis circa 4 mm aufweisen. Weiterhin kann sie einen Durchmesser von beispielsweise circa 1 mm bis circa 150 mm aufweisen. Die Ausgestaltung der Geometrie und der Abmessungen der Lysekammer hängt vom jeweiligen Anwendungsfall ab und ist im Prinzip sehr variabel.
Als Quelle für die elektromagnetische Strahlung kann eine monochromatische Laserquelle eingesetzt werden. Es ist jedoch auch möglich, eine polychromatische Laserquelle und/oder eine inkohärente Strahlungsquelle, beispielsweise eine thermische Strahlungsquelle, zu verwenden. Bei dem Einsatz einer inkohärenten Strahlungsquelle kann es je nach Anwendungsfall vorteilhaft sein, einen Filter mit einer spezifischen Bandbreite zu verwenden, um die Spezifität weiter zu erhöhen. Wichtig hierbei ist, dass durch die Art der elektromagnetischen Strahlung und insbesondere durch die verwendete Wellenlänge oder die verwendeten Wellenlängen eine Absorption durch die Zielpartikel erreicht wird, sodass die spezifische Lyse ausgelöst wird. Die Wahl der Wellenlänge und die Wahl der Quelle für die elektromagnetische Strahlung hängen also insbesondere von den zu lysierenden Partikeln ab. Die Wellenlänge wird dabei so gewählt, dass die Zielzellen, beispielsweise bestimmte Blutzellen, möglichst viel Energie absorbieren. Beispielsweise das umgebende Blutplasma sollte dabei im Wesentlichen keine Energie absorbieren. Dies hat den besonderen Vorteil, dass sich die Gesamttemperatur des Lysats während der Lyse nur wenig erhöht. Durch die Verwendung von verschiedenen Wellenlängen kann die Effizienz der Lyse erhöht werden, und es können beispielsweise auch mehrere unterschiedliche zelluläre Partikel zerstört werden. Beispielsweise können verschiedene Blutzellen lysiert werden, wenn Wellenlängen verwendet werden, die im jeweiligen Absorptionsbereich der verschiedenen Zellen liegen. Alternativ kann auch eine inkohärente Strahlquelle mit einem verhältnismäßig weiten Wellenlängenspektrum eingesetzt werden, um hierdurch eine verhältnismäßig große Bandbreite von Zielzellen zu erreichen.
Ein geeigneter Wellenlängenbereich für die Lyse von Erythrozyten ist ein Bereich zwischen etwa 300 nm und etwa 500 nm, insbesondere zwischen etwa 300 nm und etwa 480 nm. Eine geeignete Leistungsdichte liegt zwischen circa 10 mW/cm² und circa 1000 mW/cm².
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Lysekammer mit wenigstens einer spiegelnden und/oder einer streuenden Oberfläche ausgestattet. Eine spiegelnde Oberfläche bewirkt eine Reflexion der eingekoppelten Strahlung, sodass sich die Effizienz der Lyse hierdurch erhöhen lässt. Auch durch eine Streuung der eingestrahlten Wellen an einer unebenen Fläche innerhalb der Lysekammer lässt sich die Lyseeffizienz erhöhen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung wird mit besonderem Vorteil für eine Akkumulation oder Anreicherung von Bakterien in einer Blutprobe verwendet. Hierbei werden die Erythrozyten selektiv lysiert, bevor oder nachdem die Leukozyten mit einem geeigneten Filtermaterial herausgefiltert werden. Die in der Probe, also im Durchlauf, verbliebenen Bakterien können durch einen weiteren Filter mit entsprechend kleiner Porengröße zurückgehalten und angereichert werden. Die Bakterien können in einem nachfolgenden Analyseschritt, beispielsweise mit einem Nachweis entsprechender DNA in einem geeigneten PCR-Ansatz, ausgehend von dem Retentat auf dem Filter identifiziert werden. So können beispielsweise bestimmte Krankheitserreger im Blut nachgewiesen werden.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen. Hierbei können die einzelnen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.
Figurenliste
In den Zeichnungen zeigen:

1 schematische Schnittdarstellung eines erfindungsgemäßen mikrofluidischen Chips mit einseitiger Einkopplung elektromagnetischer Strahlung;
2 schematische Darstellung einer Aufsicht auf den mikrofluidischen Chip aus 1;
3 schematische Schnittdarstellung eines erfindungsgemäßen mikrofluidischen Chips mit beidseitiger Einkopplung von elektromagnetischer Strahlung;
4 schematische Schnittdarstellungen eines erfindungsgemäßen mikrofluidischen Chips mit speziellen Oberflächen innerhalb der Lysekammer und
5 und 6 schematische Darstellungen einer Aufsicht auf erfindungsgemäße mikrofluidische Chips mit Lysekammer und Integration von Filtermaterialien.

Beschreibung von Ausführungsbeispielen
Der in 1 im Schnitt dargestellte schematische Aufbau eines erfindungsgemäßen mikrofluidischen Chips 10 zur Durchführung der erfindungsgemäßen selektiven Lyse zeigt einen dreischichtigen Aufbau. Der Chip 10 umfasst eine Schicht 11, die von einer flexiblen Polymermembran gebildet wird. An diese Polymermembran 11 grenzen an beiden Seiten Schichten 12, 13 aus einem transparenten Material, beispielsweise aus einem Polymermaterial oder Glas, an. In die Glas- oder Polymerschichten 12 und 13 sind die für die Chipfunktionen erforderlichen Strukturen, insbesondere Kanäle und/oder Kammern eingebracht. Die Strukturen können beispielsweise durch Fräsen, Spritzguss, Heißprägen, Thermoformen, Stanzen und/oder Laserstrukturierungen hergestellt sein. Eine Strukturierung von Glas kann beispielsweise durch Ätzprozesse vorgenommen werden. Die hier gezeigte Strukturierung umfasst einen Einlasskanal 14 und einen Auslasskanal 15. Die Kanäle verbinden ein innenliegendes Volumen 16. Das innenliegende Volumen 16 bildet die Lysekammer, in der die selektive Lyse gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren stattfindet. Hierfür wird eine elektromagnetischen Strahlung 17, die in dieser Ausführungsform von unten durch das transparente Material der Schicht 13 eingestrahlt wird, in die Lysekammer 16 eingekoppelt. Die gewählte Wellenlänge der elektromagnetischen Strahlung 17 entspricht dem Absorptionsbereich der zu lysierenden zellulären Partikel in der Probe bzw. in dem Gemisch, das sich in der Lysekammer 16 befindet. Diese Zielpartikel absorbieren die elektromagnetische Strahlung, sodass es zur Zerstörung oder Lyse speziell dieser Partikel kommt. Andere Bestandteile in dem Gemisch, die ein anderes Absorptionsverhalten zeigen, werden durch die eingekoppelte elektromagnetische Strahlung 17 im Wesentlichen nicht beeinflusst.
In der hier gezeigten Ausgestaltung wird die Höhe des Kanals oder der Lysekammer 16 durch die Dicke der Polymermembran 11 bestimmt. Die Höhe des Kanals 16 kann dabei so ausgestaltet sein, dass nur wenige Schichten der Zielpartikel übereinander liegen, sodass die elektromagnetische Strahlung 17 den größten Teil der Zielpartikel erreicht, wodurch die Effizienz der Lyse sehr hoch ist. Durch die gewählte Höhe der Lysekammer 16 kann also sichergestellt werden, dass keine Abschattung der zellulären Partikel untereinander stattfindet. Alternativ kann die Lysekammer 16 beispielsweise in das Substrat 13 und/oder in das Substrat 12 abgesenkt bzw. erweitert sein, um die Höhe der Lysekammer 16 unabhängig von der Höhe der Polymermembran 11 einzustellen. Bei dieser Ausgestaltung des erfindungsgemäßen mikrofluidischen Chips ergibt sich insbesondere eine größere Designfreiheit für die Lysekammer.
Der mikrofluidische Chip bietet die Möglichkeit, die Lyse durchzuführen, wenn sich die Probe stationär in der Lysekammer 16 befindet. Andererseits kann die Lyse auch im Durchflussverfahren durchgeführt werden, wobei der Probendurchsatz noch größer sein kann.
2 zeigt eine schematische Aufsicht auf den mikrofluidischen Chip aus 1. Zu erkennen ist der Einlasskanal 14 und der Auslasskanal 15, die jeweils auf der Oberseite des mikrofluidischen Chips 10 münden. Mit der gestrichelten Linie ist der Bereich der Lysekammer 16 angedeutet. Die Lysekammer 16 befindet sich im Inneren des Chips 10 und ist direkt an die Ein- und Auslasskanäle 14 und 15 angeschlossen.
Neben einer einseitigen Einkopplung der elektromagnetischen Strahlung ist es auch möglich, eine beidseitige Bestrahlung der Lysekammer durchzuführen. Hierdurch kann eine Effizienzsteigerung erreicht werden. In 3 ist diese beidseitige Bestrahlung der Lysekammer 16 illustriert. Es wird im Prinzip der gleiche mikrofluidische Chip 10 verwendet, wie er bereits in 1 dargestellt ist. Wichtig ist, dass die Substratschichten 13 und 12 zumindest im Bereich der Lysekammer 16 aus einem transparenten Material bestehen, das für die elektromagnetische Strahlung 27 durchlässig ist. Die elektromagnetische Strahlung 27 kann somit von oben und unten eingekoppelt werden, um die selektive Lyse der Zielpartikel in der Lysekammer 16 zu induzieren.
Wesentlich für die Erfindung ist, dass die gewählte Wellenlänge oder die gewählten Wellenlängen der elektromagnetischen Strahlung in dem Absorptionsbereich der Zielpartikel liegen. Es kommen hierfür verschiedene Strahlungsquellen in Frage, beispielsweise eine monochromatische Laserstrahlung oder eine Laserquelle, die mehrere Wellenlängen aussendet. Auch eine inkohärente Strahlungsquelle mit einem verhältnismäßig weiten Wellenlängenspektrum kann eingesetzt werden, beispielsweise eine thermische Strahlungsquelle.
Bei der Bearbeitung einer Blutprobe, bei der beispielsweise bestimmte Krankheitserreger, insbesondere Bakterien, angereicht und nachgewiesen werden sollen, kann die erfindungsgemäße selektive Lyse beispielsweise auf die Lyse der Erythrozyten ausgerichtet werden. Das Absorptionsmaximum der Erythrozyten liegt durch das enthaltene Protein Hämoglobin bei etwa 420 nm. Die eingestrahlte Wellenlänge liegt daher zweckmäßigerweise im Bereich von circa 300 bis circa 500 nm, insbesondere von circa 300 bis circa 480 nm. Beispielsweise kann als Strahlungsquelle ein Nd:YAG-Laser (frequenzverdreifacht) mit einer Wellenlänge von 355 nm oder ein InGaN-Laser mit einer Wellenlänge zwischen 370 bis 493 nm oder ein Ti:Saphir-Laser (frequenzverdoppelt) mit einer Wellenlänge von 360 bis 460 nm oder ein He-Cd-Laser mit einer Wellenlänge von 442 nm eingesetzt werden. Eine geeignete Ladungsdichte liegt zwischen etwa 10 mW/cm² und 1000 mW/cm². Die Expositionszeit kann beispielsweise zwischen etwa 10 ms und etwa 20 min liegen. Das Absorptionsspektrum von Blutplasma zeigt beispielsweise oberhalb von 240 nm nur ein geringes Absorptionsvermögen, sodass bei den beschriebenen Wellenlängen das Aufheizen des Blutplasmas weitgehend vermieden wird. Auch Thrombozyten zeigen im Wesentlichen keine Absorption in dem genannten Wellenlängenbereich, sodass auch die Thrombozyten von der eingekoppelten elektromagnetischen Strahlung nicht weiter beeinflusst werden. Auch die im Blut enthaltenen Leukozyten absorbieren die elektromagnetische Strahlung nicht, sodass durch die zellspezifische Energieabsorption der Erythrozyten eine selektive Lyse allein der Erythrozyten erreicht wird. Die für den Prozess benötige Energie ist auch außerhalb des Fokus der Laserstrahlung ausreichend, sodass mit einem defokussierten Strahl ein breiter Bereich, insbesondere der gesamte Bereich der Lysekammer 16 bestrahlt werden kann, wobei die selektive Lyse mit großer Effizienz in der gesamte Lysekammer 16 stattfindet. Dies ist ein großer Vorteil im Vergleich mit herkömmlichen Ansätzen zur Lyse mittels elektromagnetischer Strahlung, da bisher nur ein sehr kleiner Bereich im Laserfokus zur Lyse verwendet werden konnte, da nur hier die Energie zur Zündung eines Plasmas ausreichend war. Im Gegensatz hierzu ist es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehen, nicht im Fokus zu arbeiten.
4 zeigt zwei besonders vorteilhafte Ausgestaltungen des mikrofluidischen Chips 10. Im unteren Teil der Abbildung ist jeweils die Lysekammer 16 als Ausschnitt gezeigt. Hierbei sind die Oberflächen der Lysekammern 16 mit speziellen Beschichtungen versehen, die die Effizienz der Lyse steigern. Auf der linken Seite der Abbildung ist die Lysekammer 16 auf der Seite der Substratschicht 12 mit einer spiegelnden Oberfläche 41 ausgestattet. Ein Großteil der elektromagnetischen Strahlung 17, die ohne die spiegelnde Oberfläche 41 transmittiert werden würde, wird durch die Reflexion an der spiegelnden Schicht 41 zurückgeworfen (angedeutet durch Pfeile 171). Die zurückgeworfene Strahlung 171 wird durch die zellulären Partikel mit entsprechendem Absorptionsbereich absorbiert, sodass die Lyseeffizienz gesteigert wird. Die Ausgestaltung der Lysekammer 16 auf der rechten Seite im unteren Teil der 4 weist eine streuende Oberfläche 42 auf der Seite der Substratschicht 12 auf. Die eingekoppelte elektromagnetische Strahlung 17 wird an der Oberfläche 42 gestreut (angedeutet durch die Pfeile 172). Auch die gestreute Strahlung 172 steht für eine Absorption durch die Zielpartikel zur Verfügung, sodass auch durch diese Maßnahme die Lyseeffizienz gesteigert werden kann. Entsprechende spiegelnde oder streuende Oberflächen können beispielsweise durch Sputtern, Aufdampfen, Einprägen, Schweißen oder Kleben aufgebracht werden.
Die 5 und 6 illustrieren die Integration von verschiedenen Filtermaterialien in einem mikrofluidischen Chip. In der 5 ist eine schematische Aufsicht auf einen mikrofluidischen Chip 50 gezeigt. Auf der dargestellten Oberfläche des Chips 50 münden der Einlasskanal 54 und der Auslasskanal 55 des fluidischen Systems. Mit einer gestrichelten Linie ist der Bereich 56 der Lysekammer angedeutet, die über Kanäle 57 an das fluidische System angeschlossen ist. Der Bereich 58 deutet einen integrierten Filter in dem fluidischen System an. In der Lysekammer 56 werden bei entsprechender Wahl der eingestrahlten Wellenlänge aufgrund der spezifischen Energieabsorption bestimmter zellulärer Partikel in der Probe beispielsweise die Erythrozyten in einer Blutprobe selektiv lysiert. Weitere Probenbestandteile, insbesondere andere Blutbestandteile und beispielsweise Bakterien verbleiben dabei als Ganzes in der Lösung. Im Fall einer Größendifferenz, wie es beispielsweise bei den weißen Blutkörperchen mit einem Durchmesser von circa 7 bis 21 µm gegeben ist, lassen sich diese weiteren zellulären Partikel über den nachgeschalteten Filter 58 mit einer entsprechenden Porengröße aus dem Lysat herausfiltern, wobei die Bakterien im Durchlauf verbleiben. Der Filterbereich 58 ist mit der Lysekammer 56 direkt durch einen im Polymerslide oder Glas eingearbeiteten Kanal 57 verbunden. Nach Durchlaufen der Lysekammer 56 und des Filters im Bereich 58 kann das Lysat weiter analysiert werden. Beispielsweise kann eine weitere Aufreinigung der Probe außerhalb des Chips durchgeführt werden, um in der Probe enthaltene Bakterien zu akkumulieren und beispielsweise als Krankheitserreger nachweisen zu können.
Der in 6 dargestellte mikrofluidische Chip 60 zeigt eine Kombination der Lysekammer 66 mit zwei Filtern 68 und 69. Beispielsweise nach der Lyse von Erythrozyten in der Lysekammer 66 und dem Herausfiltern größerer Bestandteile, z.B. der Leukozyten durch die Filtermembran 68, ist es möglich, eine direkte Bakterienakkumulation auf dem Chip zu realisieren. Dazu wird eine weitere Filtermembran im Filterbereich 69 mit geringer Porengröße nachgeschaltet, die die noch in dem Lysat enthaltenen Bakterien, die beispielsweise einen Durchmesser von 1 bis 3 µm aufweisen, zurückhält und hierdurch anreichert. Die angereicherten Bakterien können dann weiter analysiert werden und beispielsweise durch Analyse der DNA identifiziert werden.
Geeignete Materialien für die Polymerschichten des erfindungsgemäßen mikrofluidischen Chips sind neben Glas insbesondere glasklare thermoplastische Werkstoffe, beispielsweise auf der Basis von Polycarbonat, Polypropylen, Polyethylen, Polymethylmethacrylaten, Cyclo-Olefin-Polymeren oder Cyclo-Olefin-Copolymeren oder auch Silikon. Als Werkstoff für die Polymermembran 11 können beispielsweise Elastomere, insbesondere thermoplastische Elastomere, andere Thermoplaste oder Schmelzklebefolien eingesetzt werden. Als Spiegelschicht 41 eignen sich beispielsweise Glas oder Metalle. Als Filtermaterialien können übliche Silikatfilter oder Polymerfilter eingesetzt werden. Die Schichten 12 und 13 des mikrofluidischen Chips können beispielsweise eine Dicke von 0,5 mm bis 5 mm aufweisen. Die Polymermembran 11 kann eine Dicke von beispielsweise 5 µm bis 300 µm zeigen. Die Lysekammer 16, 56 oder 66 kann einen Durchmesser von beispielsweise 1 mm und 150 mm und eine Höhe von beispielsweise 100 µm bis 4 mm zeigen. Die Kanalbreite innerhalb der Schichten im Chip 10, 50 oder 60 kann beispielsweise 100 µm bis 3 mm betragen. Die Höhe der Kanäle kann beispielsweise 100 µm bis 4 mm sein. Der Durchmesser eines Filters, beispielsweise für die Filterbereiche 58, 68 oder 69, kann beispielsweise 1 mm bis 15 mm betragen. Die Filterdicke kann 30 µm bis 2 mm sein. Die lateralen Abmessungen eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen mikrofluidischen Chips können beispielsweise 10 × 10 mm² bis 200 × 200 mm² betragen. Diese Angaben sind nur beispielhaft zu verstehen.
Durch die Möglichkeit, verhältnismäßig große Kanal- und Kammerstrukturen in dem erfindungsgemäßen Chip zu realisieren, kann mit dem erfindungsgemäßen mikrofluidischen System ein verhältnismäßig hoher Probendurchsatz bei geringen Herstellungskosten realisiert werden.

Claims

Verfahren zur selektiven Lyse von Erythrozyten in einer Blutprobe zur Anreicherung von Bakterien aus dieser Blutprobe, wobei die Erythrozyten mit elektromagnetischer Strahlung (17; 27) beaufschlagt werden, die in einem Wellenlängenbereich zwischen 300 nm und 500 nm liegt, sodass die Erythrozyten diese elektromagnetische Strahlung absorbieren und zerstört werden, während die bakteriellen Bestandteile der Blutprobe nicht zerstört werden und weiter selektiert und/oder angereichert werden können.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die elektromagnetische Strahlung (17; 27) defokussiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Leistungsdichte der elektromagnetischen Strahlung (17; 27) in einem Bereich zwischen 10 mW/cm² und 1000 mW/cm² liegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren mit einem mikrofluidischen Chip (10; 50; 60) durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Aufreinigung und/oder Anreicherung von bakteriellen Bestandteilen der Blutprobe durchgeführt wird, indem Filtermaterialen (58; 68, 69) eingesetzt werden.
Vorrichtung zur selektiven Lyse von Erythrozyten in einer Blutprobe zur Anreicherung von Bakterien aus dieser Blutprobe mit: - einer Quelle für elektromagnetische Strahlung (17,27) in einem Wellenlängenbereich zwischen 300 nm und 500 nm, - einem mikrofluidischen Chip (10; 50; 60) mit einem mehrschichtigen Aufbau (11, 12, 13) und wenigstens einer Lysekammer (16; 56; 66), in deren Bereich die Substratschichten (12, 13) aus transparentem Material bestehen, wobei - die elektromagnetische Strahlung (17, 27) über die transparenten Substratschichten (12, 13) beidseitig in die in der Lysekammer (16) befindliche Blutprobe eingekoppelt wird, sodass die Erythrozyten diese elektromagnetische Strahlung absorbieren und dadurch zerstört werden, während die bakteriellen Bestandteile der Blutprobe nicht zerstört werden und weiter selektiert und/oder angereichert werden können.
Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die elektromagnetische Strahlung (17, 27) defokussiert ist.
Vorrichtung nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der mikrofluidische Chip (50; 60) wenigstens ein Filtermaterial (58; 68, 69) zur mechanischen Abtrennung von Bestandteilen der Blutprobe umfasst.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der mikrofluidische Chip (10; 50; 60) einen wenigstens dreischichtigen Aufbau mit wenigstens einer Polymermembran (11) und wenigstens zwei transparenten Polymer- und/oder Glasschichten (12, 13) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Höhe der Lysekammer (16) durch die Dicke der Polymermembran (11) bestimmt wird.
Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Lysekammer in wenigstens eine der transparenten Polymer- und/oder Glasschichten (12, 13) abgesenkt ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Lysekammer (16) eine Höhe von 100 µm bis 4 mm und/oder einen Durchmesser von 1 mm bis 150 mm aufweist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Quelle für die elektromagnetische Strahlung (17; 27) eine monochromatische Laserquelle und/oder eine polychromatische Laserquelle und/oder eine inkohärente Strahlungsquelle ist.
Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die inkohärente Strahlungsquelle eine thermische Strahlungsquelle ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Leistungsdichte der elektromagnetischen Strahlung (17; 27) in einem Bereich zwischen 10 mW/cm² und 1000 mW/cm² liegt.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass innerhalb der Lysekammer (16) wenigstens eine spiegelnde und/oder eine streuende Oberfläche (41; 42) vorgesehen ist.
Verwendung einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 6 bis 16 zur Akkumulation von Bakterien aus Blut, wobei Erythrozyten selektiv lysiert und Leukozyten herausgefiltert werden.