WO2013153181A1 - Verfahren und vorrichtung zur gezielten prozessführung in einem mikrofluidik-prozessor mit integrierten aktiven elementen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur gezielten prozessführung in einem mikrofluidik-prozessor mit integrierten aktiven elementen Download PDF

Info

Publication number
WO2013153181A1
WO2013153181A1 PCT/EP2013/057631 EP2013057631W WO2013153181A1 WO 2013153181 A1 WO2013153181 A1 WO 2013153181A1 EP 2013057631 W EP2013057631 W EP 2013057631W WO 2013153181 A1 WO2013153181 A1 WO 2013153181A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
microfluidic
liquid
reaction chamber
active
active elements
Prior art date
Application number
PCT/EP2013/057631
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Andreas Prof. Dr. RICHTER
Rinaldo Greiner
Merle ALLERDIßEN
Original Assignee
Technische Universität Dresden
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Technische Universität Dresden filed Critical Technische Universität Dresden
Priority to US14/387,315 priority Critical patent/US9272281B2/en
Priority to EP13717014.8A priority patent/EP2836302B8/de
Publication of WO2013153181A1 publication Critical patent/WO2013153181A1/de

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502738—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by integrated valves
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0621—Control of the sequence of chambers filled or emptied
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/04—Closures and closing means
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0864—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices comprising only one inlet and multiple receiving wells, e.g. for separation, splitting
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0867—Multiple inlets and one sample wells, e.g. mixing, dilution
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0874—Three dimensional network
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/06—Valves, specific forms thereof
    • B01L2400/0633—Valves, specific forms thereof with moving parts
    • B01L2400/0672—Swellable plugs
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/06—Valves, specific forms thereof
    • B01L2400/0677—Valves, specific forms thereof phase change valves; Meltable, freezing, dissolvable plugs; Destructible barriers
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/2575—Volumetric liquid transfer

Definitions

  • the invention relates to a microfluidic microchemomechanical system with integrated active elements and to a method for microfluidic process control in a microfluidic microchemomechanical system.
  • microfluidic processors are primarily used in biological, biochemical and chemical processes, with their focus primarily on their use as “labs on chips” (LOC), “chip labs” or “micro-total-analysis systems” (TAS) scientific developments.
  • LOC las on chips
  • TAS microwave-total-analysis systems
  • the LOC concept offers many advantages. Reducing fluid volumes allows for the analysis of minute sample volumes and economical handling of reagents and samples that are often valuable, rare, harmful or dangerous. This also higher throughputs are achievable, since due to the small quantities shortened provisioning, mixing and reaction times are required with minimal energy consumption. Due to lower system response times, process control can also be easier.
  • LOC setups enable significant process rationalization by dramatically reducing process time, increasing throughput and reducing the amount of media required (subjects, analytes, reagents, auxiliary media).
  • Microfluidic systems with active elements are known in the prior art.
  • active fluidic elements based on solid-state actuators, such as piezoactuators [US 5,224,843, US 2003/0143122] and shape memory actuators [US 5,659,171] are described. Although they are well miniaturized as individual elements, but have a complicated structure, are fixed to certain, usually not plastic-based materials and must therefore be made separately. A possible hybrid integration (eg sticking of the elements to the LOC) is generally uneconomical.
  • Transducer elements which are based on changes in the state of matter, can be integrated into the layout of the channel structure supports with sometimes minor interventions and are therefore usually compatible with the production process of the plastic molded parts of the channel structure support.
  • fuses R. Pal et al., Anal. Chem. 16 (2004) 13, pp 3740-3748
  • freezing elements US 6,536,476
  • thermal bubble generators US 6,283,718.
  • DE 101 57 317 A1 discloses a basic element of a microfluidic processor, which is electronically compatible by controlling the degree of swelling of swellable polymer networks with volume phase transition behavior, in particular hydrogels, via an electrically or electronically controllable interface size.
  • the controllable environmental variables or interface variables are preferably physical quantities which can be generated simply by electronic or electrical means and trigger volume phase transitions in swellable polymer networks.
  • a very easily generated electrical control variable is the temperature.
  • hydrogel-based active elements The disadvantage of these hydrogel-based active elements is, above all, the necessity of using electrically producible control variables for generating volume phase transitions, whereby an operation of such microfluidic systems is bound to electrical components. As a result, a self-sufficient use of microfluidic systems is excluded.
  • WO 2008/049413 discloses a microfluidic system with active elements, which can be controlled without auxiliary energy.
  • hydrogel-based active elements are disclosed above all, which enable a volume phase transition as a function of temperature or solvent.
  • the active elements cause an active function by means of a change in the degree of swelling or of the mechanical properties.
  • swelling agent barriers are disclosed which swell by absorption of the solvent and consequently cause a limitation of the swelling agent supply.
  • auxiliary energy-free active elements allows a largely self-sufficient use of microfluidic systems, especially in diagnostics, whereby the elimination of external electrical energy sources and the use of chemical energy sources would favor the establishment of disposable analysis systems.
  • the object of the present invention is therefore to specify a microfluidic microchemomechanical system which has active, energy-free operated elements, and is thus able to perform volumetrically defined mixing reactions in defined time sequences.
  • microfluidic microchemomechanical system according to claim 1.
  • Advantageous embodiments are specified in the dependent claims.
  • the microfluidic system comprises integrated active elements, which can be activated without energy-energy by influenceable environmental variables and effecting active functions by changing their swelling state or their mechanical properties.
  • the microfluidic microchemical system comprises at least one structural support with at least one first channel, which as a rule belongs to a first channel system with a first process medium.
  • it includes at least one cover which at least partially covers the structural support and at least one second duct of a second duct system, which is integrated either on the structural support, which already carries the first duct of a first duct system, or in the cover.
  • the first and second channels have reservoir spaces in a common overlay area.
  • the reservoir cavities are limited by active elements and are capable of forming a common reaction chamber.
  • auxiliary energy-free is understood to mean the renunciation of the supply of energy from an external electrical or thermal energy source to the active elements according to the invention.
  • microfluidic elements which can be activated by electrical and thermal energy, by way of example thermally or electrically switchable hydrogels may be mentioned here.
  • an overlapping area is understood to be the part between two connectable reservoir spaces which have a common wall.
  • this mixing zone the mixing of the first and second liquid, which flows into the reaction chamber takes place.
  • an active element or an active function means an active mechanical element or an active mechanical function.
  • the cover is designed as an upper structural support in an arrangement of at least two structural supports.
  • a membrane in the overlay region of the first and second channel systems, a membrane is disposed between the first and second channels, thereby dividing the common reaction chamber into a first reservoir space and a second reservoir space.
  • the second liquid could enter via the common reaction chamber in the first channel, whereby an undefined mixing of the first and second liquid would not be done as desired in the common reaction chamber, but already in the first channel.
  • the volumetrically undefined mixtures thus generated would be insufficient for analysis.
  • the membrane is designed as an active membrane.
  • the membrane between the first and second reaction space is made of a liquid-soluble material.
  • the membrane can be dissolved after filling the first and second reservoirs with the two liquids, whereby the reservoir cavities are connected to the common reaction chamber and can be done in this as intended, a mixing of the liquids.
  • This advantageously takes place when the further active elements, which delimit the reaction chamber and are designed as swellable swelling agent barriers, prevent a subsequent flow of the liquids out of the channels into the reaction chamber.
  • the membrane can be configured according to the needs of the application so that the time course of the resolution allows mixing of the liquids in the reaction chamber at the desired time.
  • the temporal dissolving behavior of the membrane in contact with liquid can be set constructively both by the choice of material and the thickness of the membrane. This is particularly advantageous because an undefined displacement of the liquids can thus be avoided when flow slow-downs occur in one of the two channels and an associated retarded inflow into the reaction chamber.
  • more than two Channel systems may be interconnected as described to perform mixing operations with more than two liquids.
  • the active element in the bottom region of the second reservoir space of the reaction chamber is designed as a delivery system of active substances and other substances.
  • active substances and / or other substances may be embedded or fixed in the active element, wherein a release of these active substances and / or other substances takes place through the activating environmental variable.
  • active substances and / or other substances such as enzymes, substrates, precursors, etc., can be immobilized in advance in the reaction chamber and mobilized in the presence of liquid, wherein the temporal release of the active and / or other substances are in turn adjusted according to user needs can.
  • a release after activation of the reaction chamber limiting active elements is possible, so that the active and / or other substances are released into the volume defined by the reaction chamber. It is also conceivable that the release takes place before the dissolution of the membrane.
  • the first case there would be a mixing of the first and second liquid in the reaction chamber, wherein the second liquid would already contain the active and / or other substances.
  • the release into the reaction chamber would take place only after mixing the first and second liquid. This would be advantageous if first the first and second liquid should perform a reaction and the addition of a substrate, etc. is possible only after completion of this reaction.
  • the targeted immobilization of the active substances and / or other substances opens up a broad possibility for the application of the microfluidic micromechanical system in analytics.
  • the delivery system of active and other substances is formed, for example, as a depot or storage, which is activated by fluid presence. That's why you can call it an active element.
  • Such a memory element could also be embodied as a polymer network. In the de-swelling process or dissolution process by liquid presence, it releases the swelling agent and the substances contained therein.
  • the active elements are made activatable by liquid presence as environment size.
  • both a change in the swelling state by liquid absorption and a resolution of the active element due to the liquid contact is conceivable.
  • the active elements are designed to define the time sequence and the time behavior of the mixing of the first and second liquid.
  • the active elements are controlled in their time behavior.
  • the time behavior can be influenced.
  • larger-sized active elements which experience an increase in volume due to the activating environmental variable, can achieve a faster suppression of the liquid flow than comparably smaller dimensioned active elements.
  • a slower resolution due to greater dimensioning of the active element can be specifically adjusted, for example, even with liquid-soluble active elements.
  • the time sequence can be controlled both material-dependent and dimension-dependent.
  • the active elements are designed as swelling agent barriers or liquid-soluble barriers.
  • an increase in volume of the active element would take place through a liquid absorption, whereby the channel containing the active element, is further narrowed until it due to complete filling of the channel cross-section to a stall in the channel and thus comes to a suppression of the flow.
  • the active element designed as a swelling agent barrier is introduced into the channel of the microfluidic micromechanical system in a dried state. After the increase in volume of the swelling agent barrier due to liquid absorption, the swelling agent barrier remains in the swollen state. This means that after volume increase no swelling occurs, whereby the swelling agent barrier experiences only a single activation by the fluid intake. This is particularly advantageous when the swelling agent barrier is designed as a closing element, for example, to foreclose the reaction chamber against inflowing liquids.
  • the active elements are designed as a liquid-soluble barrier, wetting of the barrier with the liquid in the channel achieves a dissolution of this barrier. As a result, as the dissolution of the barrier progresses, there is an increase in the flow through the channel cross-section and, as a result, the formation of a flow of the liquid through the channel.
  • the basis for considering a dissolving element as an active element lies in its functional principle.
  • the load-bearing capacity or mechanical compliance of a component can be changed by changing (a) the modulus of elasticity of the component material or (b) its cross-section.
  • (b) is used as the basis of the active function.
  • the resolvable active element fulfills the function of an opener valve as soon as the control signal "Liquid" is applied.
  • the swelling agent barriers or liquid-soluble barriers are designed as valves. Due to the time-definable swelling or dissolution of the barriers, the active elements can perform valve functions within the microfluidic microchemomechanical system. As a result, the valves can exert both opener (liquid-soluble barrier) and closing functions (swelling agent barriers). Due to the time-definable and auxiliary energy-free function exercise such valves are preferably suitable for use in autarkic microfluidic systems. In this case, all active components that fulfill the function of an opener valve are understood as opener elements. This can be done by (a) lowering the modulus of elasticity in crosslinked, swellable polymers and (b) dissolving in liquid-soluble materials. The dissolving membranes are also considered as ⁇ ffnermaschine.
  • the active elements consist of hydrogels which are chemically crosslinked and / or physically crosslinkable.
  • hydrogels are understood as meaning a water-containing, but water-insoluble polymer whose molecules are chemically, eg. By covalent bonds, or physically, e.g. B. by looping the polymer chains are linked to a three-dimensional network.
  • hydrophilic polymer components By incorporating hydrophilic polymer components, they swell in liquids with a considerable volume increase, but without losing their material cohesion. It is essential here that the hydrogels are formed so that they remain in the swollen state after contact with liquids.
  • the active elements are hydrogels selected from a group consisting of e.g. Polyacrylamides, polyvinyl alcohols, polyacrylates, hydroxycellulose, polyvinylpyridines or polyglycols (e.g., polyethylene glycol, polypropylene glycol) and derivatives thereof.
  • hydrogels selected from a group consisting of e.g. Polyacrylamides, polyvinyl alcohols, polyacrylates, hydroxycellulose, polyvinylpyridines or polyglycols (e.g., polyethylene glycol, polypropylene glycol) and derivatives thereof.
  • the active elements are made of uncrosslinked polymers, salts or organic natural substances such as saccharides.
  • the active elements are designed as liquid-soluble barriers.
  • all materials can be used which form a solid, sol-gel or the like in the dried state and go into solution on contact with a liquid.
  • the material base of the uncrosslinked polymers can in principle be the same as in the crosslinked polymers. While the polymers crosslinked into a three-dimensional network serve as swellable swelling agent barriers, the same polymers dissolve in the liquid when they are uncrosslinked because they are not together connected polymer chains can go into solution.
  • the present invention also provides a method for microfluidic process control in a microfluidic micromechanical system, wherein a first liquid is introduced into a first channel, a second liquid is introduced into a second channel and a mixing of the first and second liquid in a reaction chamber, which is formed in the overlay region of the first and second channels takes place, wherein the time sequence of the mixing of the first and second liquid in the reaction chamber is determined by active elements.
  • the above-described method steps are particularly advantageous for timing the mixing of two liquids in a microfluidic system.
  • the respectively desired temporal sequence of process steps such as mixing, dissolution of barriers, closure of desired channel sections by means of swelling agent barriers, release of active substances and / or other substances can thereby be achieved in a user-specific manner.
  • the temporal sequence of the mixing of the first and second liquid in the reaction chamber is determined by the active elements, which are liquid-soluble or designed as a swelling agent barrier.
  • the method further comprises dissolving a liquid-soluble membrane which divides the reaction chamber into a first reservoir space and a second reservoir space through the first and second liquids prior to mixing the first second liquid.
  • a liquid-soluble membrane which divides the reaction chamber into a first reservoir space and a second reservoir space through the first and second liquids prior to mixing the first second liquid.
  • microfluidic microchemomechanical system for carrying out processes based on antigen-antibody reactions, carrying out processes based on the culture method, control and / or detection of processes based on a polymerase chain reaction and detection of enzyme activity of a biochemical process. Further applications based on chemical or biochemical mixing reactions are conceivable.
  • the microfluidic microchemical system according to the invention is characterized by the fact that it mixes a first and a second energy-free Liquid in a reaction chamber with defined volume and in a time-controllable manner allows.
  • immobilized active substances and / or other substances can be released in a time-controlled manner and thus enable reactions in the reaction chamber.
  • FIG. 1 is a plan view of a microfluidic microchemomechanical system according to the invention, in FIG.
  • Fig. 2a is a plan view of a stage of the micro-mechanical system shown in Fig. 1, in
  • FIG. 2b is a cross-sectional view of the stage shown in Fig. 2a, in
  • FIG. 3a is a plan view of a stage of another microfluidic, microchemomechanical system according to the invention, in FIG.
  • FIG. 3b is a cross-sectional view of the stage shown in Fig. 3a, in
  • FIG. 4 shows a representation of a further microfluidic microchemical system according to the invention with a 48 ⁇ 48 mixture matrix, in FIG.
  • Fig. 5a is a plan view of a 2x2 cutout from the die of Fig. 4, in
  • FIG. 5b shows a cross-sectional view of a die cutout shown in FIG. 5a, in FIG.
  • 5c is a cross-sectional view of an alternative embodiment of a die cut-out shown in FIG. 5a, in FIG
  • FIG. 6a shows a diagram for depicting the dependence of the cooperative diffusion coefficient of swelling agent barriers based on sodium acrylate hydrogels as a function of their standardized crosslinker concentration
  • FIG Fig. 6b is a graph showing the dependencies of the closing time and the pressure resistance of swelling agent barriers based on sodium acrylate hydrogels depending on their normalized crosslinker concentration
  • 6c is a diagram showing the dependencies of the closing time of swelling agent barriers based on sodium acrylate hydrogels as a function of the ratio of the volume of the hydrogel actuator in the dry initial state to the volume of the valve chamber,
  • FIG. 7a is a diagram showing the dependence of the opening time of liquid-soluble barriers on the liquid-soluble material used and on the thickness of a barrier designed as a membrane,
  • 7b is a diagram showing the dependence of the opening time of liquid-soluble barriers in the form of a PEG 10,000 opener valve on the valve length for different flow rates of the process medium,
  • 7c is a graph showing the standard deviation of the opening time of liquid-soluble barriers in the form of a PEG 6000 opener valve from the valve length;
  • Figure 9a shows the fluorescence intensity in the case of detection of human serum albumin (HSA) as a triplet at 423 nm after mixing with a detection reagent over time.
  • HSA human serum albumin
  • 9b is a calibration line for determining the protein concentration of human serum albumin (HSA) in a sample
  • BSA bovine serum albumin
  • FIG. 1 shows a microfluidic microchemical system according to the invention, which is designed as a self-sufficient and automatically operating microfluidic processor for equidistant long-term examinations.
  • the microfluidic processor in Fig. 1 carries out long-term studies, which consist of identical analytical or other mixing reactions and which are repeated according to a defined schedule. Equidistant investigations are among the most common methods of science and technology. They are used inter alia to control critical parameters, eg. B. the monitoring of bioreactors, for enzyme analysis, the analysis of growth factors or the quality control of chemical and biological products.
  • the microprocessor in Fig. 1 is divided into 192 serially connected, identical stages 1 and comprises a total of 2096 active elements 7 and 384 Reservoirippo 9,10.
  • the operation of stage 1 ( Figure 2a) is as follows. The liquids 13 and 14 of the two channels 3 and 4 reach stage 1, so that the binary concentration switches from 0 to 1.
  • This chemical signal activates the integrated active elements 7 and stimulates them to deliver their stored chemical energy in the form of a defined fluidic function in a time sequence predefined by the fluidic interconnection.
  • the closing elements 7a for example consisting of the hydrogel sodium acrylate, close the inlets and outlets of Reservoirippo 9,10 and separate and dose so that Liquids 13,14.
  • the closing time of the closing elements 7a is selected so that the reservoir cavities 9,10 are most likely completely filled with the liquids 13,14. It can be, for example, 45 s (ratio of volume V ge i of the sodium acrylate actuator to the volume of the reaction chamber 6 VK 1: 5.6, see also FIG.
  • the membrane solves 7e (Fig. 2b), which separates the Reservoirsammlung 9,10, and connects 9,10 to the reaction chamber 6. Now, by mixing the liquids 13,14 the desired reaction occur.
  • the membrane 7e which is embodied for example as an active membrane, must be mechanically stable so that it is not significantly deflected when the reservoir cavities 9, 10 are flooded. In addition, their dissolution or opening time must not be too short to avoid unwanted, premature mixing.
  • a corresponding dimensional stability can be realized at an opening time of 7 min (see also Fig. 7a).
  • ⁇ ffnerieri 7b which consist for example of polyethylene glycol (PEG) 6000, closed in the chamber bypasses.
  • PEG polyethylene glycol
  • the opener elements 7b are essential elements for sequential circuits with many stages or cascades. Without them, the fluidic resistances of the bypass channels would have to be much higher than the fluidic resistances of the channels leading to the reservoir spaces. This would lead to the number of series-switchable stages being limited to 3 or 4 due to the bypass resistors accumulating through the series connection.
  • the opener element 7d defines the time until the activation of the next stage. After triggering the ⁇ ffnerimplantation 7d flood the liquids 13,14 the next stage. At this moment, the closing members 7c close the bypasses to the circulation channels 12 shown in Fig. 1. Also in the circuit combination of the elements 7c and 7d, it is possible to utilize the pressure rise across the opener member 7d due to the shutter of Fig. 7c to open 7d.
  • the microprocessor shown in Figure 1 is capable of self-contained and automatic mixing reactions at time intervals of 2min (NC elements 7d of polyethylene glycol 6000 and an element length of 400 ⁇ " ⁇ , see also Fig. 7c), but it can also be up to 16 days long operate in self-contained and automatic mixing reactions at two-hour intervals (opening elements 7d from PEG 35000 and 1, 2 mm in length).
  • the microfluidic microchemomechanical system in Fig. 1 has a two-level architecture (see Fig. 2b).
  • the upper structural support 2a which for example also functions as a cover, contains the channel structure of the channel 3 for the liquid 13, while the lower channel structural support 2b carries the channel structure of the channel 4 for the liquid 14.
  • both structural supports have a comparable design, which can essentially be mirrored.
  • the channels 3 and 4 are for the example shown in FIG. 1 800 ⁇ wide and 140 ⁇ high.
  • the bypass channels 8 are 400 ⁇ wide and 140 ⁇ high.
  • the square diamonds for the closing elements have a volume of 1000 ⁇ 1000 ⁇ 140 ⁇ 5 (7a) or 800 ⁇ 800 ⁇ 140 ⁇ 5 (7c).
  • the configuration of the active elements for the arrangements in Figures 1 and 2 is as follows: the thickness of the active membrane of uncrosslinked polyvinyl alcohol is 70 ⁇ .
  • the length of the NC elements 7b (PEG 6000) is 400 ⁇ , the length of the NC elements 7d (PEG 6000) is 800 ⁇ .
  • the microfluidic microchemical system shown in FIG. 1 is realized in FIG. 1 with only one structural support 2 and one unstructured cover 2 a. Both channel systems 3, 4 are located on the same structural support 2, d. h., in one plane. In the overlay region of the channels 3,4 is now a ⁇ ffnerelement, which is designed in principle as the ⁇ ffnerimplantation 7b, 7d, arranged between the reservoirs 9,10, which connects the two ReservoirLite 9,10 to the reaction chamber 6 after its dissolution.
  • the monolithic microchips of the microfluidic microchemomechanical systems consist entirely of polymers.
  • Structural supports 2 containing the channel networks are made, for example, of polydimethylsiloxane (PDMS) and were prepared by multilayer soft lithography [D.C. Duffy, J.C. McDonald, O.J.A. Schueller, G.M. Whitesides, anal. Chem. 70 (1998), 4974-4984] using a large-area replication technology with solid-state masters [A., Richter, G. Paschew, Adv. Mater. 21 (2009), 979-983].
  • the multilayer soft lithography under PDMS use is primarily suitable for research and demonstrator construction.
  • thermoplastic polymers which may include, for example, polystyrene, polycarbonate, olefins such as cycloolefin, polyester such as polyethylene terephthalate.
  • active elements 7 for example phase-variable polymers are used, which can be integrated into the microchip by simple microtechnical methods.
  • Polyethylene glycols are photolithographically microstructured with stencil printing, sodium acrylate actuators.
  • the active membranes of polyvinyl alcohol can be integrated, for example, with a pick-and-place technology.
  • the microstructuring of the sodium acrylate actuators takes place by a photolithographic polymerization.
  • An exemplary preparation procedure is based on a mixture of 2 g of sodium acrylate, 0.04 g of the crosslinker ⁇ /, ⁇ / '- methylenebisacrylamide (BIS), and 0.04 g of the photoinitiator 2-hydroxy-4' - (2-hydroxyethoxy) -2- Methylpropiophenone, all dissolved in 14 ml of distilled water. This solution is stirred under argon protective gas atmosphere for 24 h. For the discussion in FIGS. 6a and 6b, this stock solution is referred to as c 0 .
  • the photopolymerization is also carried out under argon inert gas atmosphere either directly in the channel structures or in a photopolymerization chamber.
  • the quality and networking properties of Sodium acrylate actuators depend on the polymerization time, the distance to the exposure source, the type of exposure source, and the height of the polymerization chamber.
  • fusible polyethylene glycol are used for the ⁇ ffnerieri 7b and 7d, which are structurable with a stencil printing technology.
  • a structured copper mask having a thickness of 20 ⁇ m was placed on the structural beams 2a, b such that their openings were located at the desired positions of the opening elements 7b, d.
  • the molten PEG is placed on the copper mask and distributed with a metal blade, so that in the mask openings, the ⁇ ffneretti 7b, 7d formed in the structural beams 2a, 2b.
  • the NC elements already produced have their geometric dimensions, but do not seal the channels.
  • Hermetically sealed opener valves are achieved in a final microchip manufacturing step by briefly heating the already fully attached microchip slightly above the melting temperature of the PEG. The PEG structures melt and seal the channels tightly.
  • a 5% polymer solution is poured into a mold and then dried.
  • the height of the membrane produced in this way can be determined by the filling quantity and thus height of the solution in the casting mold.
  • FIGS. 3a and 3b show the stage of another microprocessor, which also consists of sequentially connected stages.
  • the stages have the task to perform several mixing reactions with different ratios simultaneously.
  • the simultaneous performance of studies with different volume ratios of sample and analyte or simply two chemicals allows u.a. the determination of reaction kinetics, for example the determination of an enzyme activity.
  • the mode of operation of the stage illustrated in FIGS. 3a and 3b will be explained on the basis of the examination of an enzyme kinetics.
  • a liquid which contains the enzyme of interest, for example, laccase, a polyphenol oxidase of the fungus Trametes versicolor.
  • the enzyme of interest for example, laccase, a polyphenol oxidase of the fungus Trametes versicolor.
  • the first closed ⁇ ffnerelement 7d the medium is forced, the five parallel channel structures, which for example have a width of 400 mm, height 140 ⁇ , with Reservoir spaces 9 to flood.
  • the process medium flows via the bypass 8 in the direction of the circulation channel 12 acting as a drain. This takes place until the opening element 7d, which is made of PEG 6000 and has a length of, has opened and the medium can flow in the channel 3 to the next stage.
  • Each of the now hermetically sealed reaction chambers now contains a volume of enzyme-containing process medium corresponding to the size of the reservoir space 9.
  • each reservoir chamber 9 in the floor space has a depot 11, in which an analyte in the form of a dried, liquid-soluble active element 7f has already been introduced during the microchip position.
  • the analyte-containing active element 7f consists, for example, of dried, immobilized substrate 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) in a malonate buffer. The presence of the aqueous process medium causes the substrate to dissolve and start the mixing reactions.
  • the Reservoirs 9 and the depots 1 1 therein represent, for example, volume ratios of sample to analyte of 1: 3, 1: 2, 3: 1, 2: 1 and 1: 1.
  • FIG. 4 shows a microfluidic microchemical system according to the invention.
  • FIG. 1 shows a [48x48] matrix processor.
  • An example application scenario of such a [48x48] matrix processor is the parallel examination of 48 samples for 48 parameters, such as for screening purposes.
  • the advantage of such matrix processors is that all examinations are carried out at exactly the same conditions at the same time.
  • the massively parallel execution of the tests also brings the advantages of high integration to bear, so that series of tests, which typically take days or weeks, are feasible in hours.
  • the [48x48] matrix processor performs 2304 exams simultaneously and fully automatically. It has a total of 2401 closing elements 7a and 2304 active membranes 7e. Its operation is explained below with reference to FIGS. 5a and 5b for a [4 ⁇ 4] matrix detail and an example configuration.
  • liquids, in the line channels 15 and 16 and the column channels 17 and 18 are simultaneously and at the same flow rate liquids, in the line channels 15 and 16, for example, sample liquids, in the column channels 17 and 18, for example, analytes introduced.
  • the liquids of the row channels 15, 16 flood the Reservoirsammlung 9, the liquids of the column channels 17,18 flood simultaneously the Reservoirsammlung 10.
  • FIG. 5c it is illustrated in FIG. 5c that by inserting further fluidic levels in each matrix point, more than two liquids can be mixed with one another.
  • a further central structural support 2c is integrated into the overall structure, which has a similar configuration of active elements 7a, 7e as the two other structural supports 2a, 2b.
  • This simple stacking of three structural carriers makes it possible to combine three reservoir chambers 9, 10, 19, which are fed by different channels 16, 18, 21, into a reaction chamber 6 and thus to mix three liquids together in one matrix point.
  • FIGS. 6a, 6b and 6c show possibilities of predefining the parameters of the closing elements 7a, 7c, in particular the closing time and the pressure resistance, by choice of material and design parameters.
  • FIG. 6a clarifies that the closing time can be preset by the hydrophilicity or the cooperative diffusion coefficient of the selected material.
  • Two types of hydrogels can be distinguished, neutral hydrogels and polyelectrolytic hydrogels.
  • Neutral hydrogels such as cross-linked polyacrylamide, poly (/ V-isopropylacrylamide), polymethylvinylether, polyvinylalcohol or polyethylene glycol have cooperative diffusion coefficients D coop in the order of 10 "7 cm 2 s " 1 .
  • hydrogels are predestined as a material basis for relatively slow closing elements with closing times in the minute or hour range.
  • Polyelectrolyte hydrogels which ionizable groups, for example acid or base groups, which have, due to additional inter- and intra-molecular electrostatic interactions which act expansive, cooperative diffusion coefficient in the order of 10 "7 to 10" 5 cm 2 s' 1.
  • Polyelectrolyte hydrogels which are used as superabsorbent, have the largest D coop.This includes the hydrogel sodium acrylate.As shown in Fig.
  • D coop of sodium acrylate depends on the crosslinking conditions.
  • the more crosslinker ⁇ /, ⁇ / '- methylenebisacrylamide (BIS) used The larger the cooperative diffusion coefficient, the faster the hydrogel swells. From a normalized concentration of c / c 0 7, the influence of the crosslinker content decreases significantly.
  • Figure 6b illustrates that the closing time of a sodium acrylate closing element increases with increasing crosslinker concentration. This is not a contradiction to the statement of FIG. 6a.
  • the hydrogel is effectively slower despite higher co- op , since a higher crosslinker content results in a higher crosslinker density of the hydrogel.
  • the higher crosslinker density leads to more mechanically stable hydrogels, so that the compressive strength of the closure elements increases with increasing crosslinker content or increasing crosslinking density of the sodium acrylate actuators.
  • the closing time of the closing elements can also be adjusted by a constructive variable, namely the ratio of the dry volume of the sodium acrylate hydrogel actuator to the reaction chamber volume of the closing element seat (FIG. 6c).
  • the opening times of ⁇ ffnerijnn 7b, 7d and 7e can also be preset by the choice of material (Fig. 7a).
  • Of great importance for the opening time is a constructive parameter: the thickness of the active membranes (FIG. 7a) and the length of the opening elements (FIG. 7b).
  • For membranes are advantageous polymers with a high glass transition temperature. These polymers are mechanically stable and it is possible to produce thin, rigid membranes.
  • an enzymatic test for determining the uric acid content is described.
  • the uric acid content in serum or urine provides information about the degradation of purine bases and is used in, for example, Suspected gout, surveillance used in cell-destroying processes and stone suffering.
  • the recommended upper limit for men is 416 ⁇ / ⁇ .
  • the test is performed as a coupled enzyme assay where uric acid is oxidized by uricase. This produces hydrogen peroxide, which can be detected with a peroxidase (HRP).
  • HRP peroxidase
  • the substrate Amplex Red (5 mM in DMSO) with 99 times the volume of an enzyme solution (0.1 M Tris / HCl, pH 7.4, 0.2 U / ml uricase, 0.2 U / ml HRP) and introduced into a stage 1 of the microfluidic, microchemomechanical system.
  • the resulting reaction solution is then introduced via the second channel 4 into the second reservoir space, while the first reservoir space 9 is filled with the same volume of the sample to be investigated (contains 0-100 ⁇ uric acid) via the first channel 3.
  • the soluble membrane 7e which separates the two reservoirs 9, 10 from each other, dissolves due to the liquid contact, whereby the reaction chamber 6 is formed and the reactants are mixed.
  • a fluorescence at 590 nm can be detected after excitation with light (530 nm).
  • the concentration can be calculated by a corresponding calibration from the intensity of the fluorescence.
  • a protein detection with ortho-phthalaldehyde is described.
  • the protein is reacted with the detection reagent OPA with the participation of a thiol-containing component, such as mercaptoethanol.
  • a thiol-containing component such as mercaptoethanol.
  • Detection reagent (6 g / ml OPA, 0.1 M phosphate buffer, pH 7.4, 0.05% vol.
  • FIGS. 8a and 8b show the time-dependent course of the detected fluorescence intensity of four samples at a wavelength of 455 nm.
  • the corresponding protein concentration (FIG. 8a) can be determined from a calibration line (FIG. 8b) based on BSA as the reference protein.
  • the signal can be read out directly (GFP 475/530 nm) or the reaction solution (0.1 M Tris / HCl, pH 7.5, 10 ⁇ H 2 O 2 , 50 ⁇ Amplex Red) must now be added to obtain the read out the resulting signal (Amplex Red Ex: 530 nm Em: 590 nm).
  • the supply of the washing solution can take place via the first or second channel 3,4.
  • HSA human serum albumin
  • FIG. 9 a shows the time-dependent course of the detected fluorescence intensity of a triple determination of an HSA sample (0.3 mg / ml) at a wavelength of 423 nm.
  • the reaction reaches a stable intensity maximum at about 1500 after about 15 minutes corresponding protein concentration can be determined from a calibration line based on BSA as a reference protein.
  • Figure 9a shows the detected fluorescence intensity in the case of detection of HSA as a triplet at 423 nm after mixing with a detection reagent over time (gain: 178).
  • the corresponding protein concentration of the sample can be determined via a calibration line (FIG. 9b) (gain: 100).
  • Fluorescamine reacts with amino acids to form pyrolinone derivatives that can be excited at a wavelength of 395 nm, whereby a fluorescence maximum at 470 nm can be detected.
  • FIG. 10 shows the determined concentration-dependent fluorescence intensity of a triple determination of a BSA sample at an excitation wavelength of 395 nm.
  • the fluorescence intensity increases with increasing concentration of BSA.
  • the detection of bovine serum albumin (BSA) is carried out in triplicate at 470 nm after mixing with fluorescamine (gain: 80).

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physical Or Chemical Processes And Apparatus (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft ein mikrofluidische mikrochemomechanisches System mit integrierten aktiven Elementen (7) und ein Verfahren zur mikrofluidischen Prozessführung in einem mikrofluidischen mikromechanischen System. Erfindungsgemäß umfasst das mikrofluidische System integrierte aktive Elemente (7), welche hilfsenergiefrei durch beeinflussbare Umgebungsgrößen aktivierbar und durch die Änderung ihres Quellungszustandes oder ihrer mechanischen Eigenschaften aktive Funktionen bewirkend, ausgeführt sind. Das mikrofluidische mikrochemomechanische System umfasst dabei weiterhin zumindest einen Strukturträger (2) mit zumindest einem ersten (3) und zweiten (4) Kanal, wobei in einem Überlagerungsbereich (5) des ersten und zweiten Kanals eine Reaktionskammer (6) ausgebildet ist, welche durch aktive Elemente (7) begrenzt wird.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur gezielten Prozessführung in einem Mikrofluidik- Prozessor mit integrierten aktiven Elementen
Die Erfindung betrifft ein mikrofluidisches mikrochemomechanisches System mit integrierten aktiven Elementen und ein Verfahren zur mikrofluidischen Prozessführung in einem mikrofluidischen mikrochemomechanischen System.
Mikrofludische Prozessoren finden heute vor allem Anwendung in biologischen, biochemischen und chemischen Prozessen, wobei vor allem deren Verwendung als„Labs on Chips" (LOC), „Chip-Labore" bzw. „Micro-Total-Analysis Systems" ( TAS) im Fokus wissenschaftlicher Entwicklungen steht.
Das LOC-Konzept offeriert mannigfaltige Vorteile. Die Verringerung der Fluidvolumina ermöglicht das Analysieren kleinster Probenmengen und einen sparsamen Umgang mit Reagenzien und Proben, die oft wertvoll, selten, schädlich oder gefährlich sind. Dadurch sind auch höhere Durchsätze erreichbar, da aufgrund der geringen Mengen verkürzte Bereitstellungs-, Misch- und Reaktionszeiten bei minimiertem Energiebedarf benötigt werden. Aufgrund geringerer Systemantwortzeiten kann sich auch die Prozesskontrolle erleichtern.
Insgesamt ermöglichen LOC-Aufbauten bedeutende Prozessrationalisierungen, indem sie die Prozesszeit erheblich verkürzen und damit den möglichen Durchsatz erhöhen sowie die Mengen der benötigten Medien (Probanden, Analyte, Reagenzien, Hilfsmedien) reduzieren.
Stand der Technik
Im Stand der Technik sind mikrofluidische Systeme mit aktiven Elementen bekannt.
So sind aktive fluidische Elemente auf Basis von Festkörperaktoren, wie Piezoaktoren [US 5,224,843, US 2003/0143122] und Formgedächtnisaktoren [US 5,659, 171 ] beschrieben. Sie sind zwar als Einzelelemente gut miniaturisierbar, besitzen aber einen komplizierten Aufbau, sind auf bestimmte, meist nicht kunststoff basierte, Materialien festgelegt und müssen deshalb separat gefertigt werden. Eine mögliche Hybrid-Integration (z. B. Aufkleben der Elemente auf das LOC) ist im Regelfall unwirtschaftlich.
Wandlerelemente, die auf Änderungen des Aggregatzustandes beruhen, lassen sich mit zum Teil geringfügigen Eingriffen in das Layout der Kanalstrukturträger integrieren und sind deshalb meist zum Fertigungsprozess der Kunststoffformteile des Kanalstrukturträgers kompatibel. Es sind beispielsweise Schmelzelemente [R. Pal et al.', Anal. Chem. 16 (2004) 13, S. 3740-3748] und Gefrierelemente [US 6,536,476] sowie thermische Blasengeneratoren [US 6,283,718] bekannt.
Die DE 101 57 317 A1 offenbart ein Grundelement eines Mikrofluidik-Prozessors, welches durch die Steuerung des Quellungsgrades von quellfähigen Polymernetzwerken mit Volumenphasenübergangsverhalten, insbesondere Hydrogele, über eine elektrisch oder elektronisch steuerbare Schnittstellengröße elektronikkompatibel ist. Als steuerbare Umgebungsgrößen bzw. Schnittstellengrößen dienen dabei bevorzugt physikalische Größen, die einfach durch elektronische bzw. elektrische Mittel erzeugt werden können und Volumenphasenübergänge in quellfähigen Polymernetzwerken auslösen. Eine sehr einfach elektrisch erzeugbare Steuergröße ist die Temperatur.
Der Nachteil dieser hydrogelbasierten aktiven Elemente besteht vor allem in der Notwendigkeit, elektrisch erzeugbare Steuergrößen zur Erzeugung von Volumenphasenübergängen einzusetzen, wodurch ein Betrieb solcher mikrofluidischer Systeme zwingend an elektrische Komponenten gebunden ist. Dadurch ist eine autarke Verwendung mikrofluidischer Systeme ausgeschlossen.
Die WO 2008/049413 offenbart ein Mikrofluidiksystem mit aktiven Elementen, welche hilfsenergiefrei gesteuert werden können. Dabei werden vor allen hydrogelbasierte aktive Elemente offenbart, welche einen Volumenphasenübergang in Abhängigkeit von Temperatur oder Lösungsmittel ermöglichen. Dabei bewirken die aktiven Elemente mittels einer Änderung des Quellungsgrades oder der mechanischen Eigenschaften eine aktive Funktion. Zudem werden Quellmittelbarrieren offenbart, die durch Aufnahme des Lösungsmittels aufquellen und infolgedessen eine Limitation der Quellmittelzufuhr bewirken.
Die Verwendung hilfsenergiefreier aktiver Elemente erlaubt eine weitgehend autarke Verwendung mikrofluidischer Systeme insbesondere in der Diagnostik, wobei durch den Verzicht auf externe elektrische Energiequellen und die Nutzung chemischer Energiequellen die Etablierung von Einmal-Analyse-Systemen begünstigt würde.
Eine Weiterentwicklung derartiger mikrofluidischer mikrochemomechanischer Systeme wäre daher in hohem Maße wünschenswert.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, ein mikrofluidisches mikrochemomechanisches System anzugeben, welches aktive, hilfsenergiefrei betriebene Elemente aufweist, und dadurch befähigt ist, volumetrisch definierte Mischungsreaktionen in definierten Zeitabläufen durchzuführen. Beschreibung der Erfindung
Die Aufgabe wird durch ein mikrofluidisches mikrochemomechanisches System gemäß Anspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Die Aufgabe wird auch durch ein Verfahren gemäß Anspruch 14 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Erfindungsgemäß umfasst das mikrofluidische System integrierte aktive Elemente, welche hilfsenergiefrei durch beeinflussbare Umgebungsgrößen aktivierbar und durch die Änderung ihres Quellungszustandes oder ihrer mechanischen Eigenschaften aktive Funktionen bewirkend, ausgeführt sind. Das mikrofluidische mikrochemomechanische System umfasst dabei zumindest einen Strukturträger mit zumindest einem ersten Kanal, der im Regelfall zu einem ersten Kanalsystem mit einem ersten Prozessmedium gehört. Weiterhin beinhaltet es zumindest eine Abdeckung, welche den Strukturträger zumindest teilweise abdeckt sowie zumindest einen zweiten Kanal eines zweiten Kanalsystems, welcher entweder auf dem Strukturträger, welcher bereits den ersten Kanal eines ersten Kanalsystems trägt, oder in der Abdeckung integriert ist. Der erste und der zweite Kanal weisen Reservoirräume in einem gemeinsamen Überlagerungsbereich auf. Die Reservoirräume sind durch aktive Elemente begrenzt und sind befähigt, eine gemeinsame Reaktionskammer auszubilden.
Unter hilfsenergiefrei wird im Sinne der vorliegenden Erfindung der Verzicht auf die Zuführung von Energie aus einer externen elektrischen oder thermischen Energiequelle zu den erfindungsgemäßen aktiven Elementen verstanden. Im Stand der Technik sind mikrofluidische Elemente bekannt, die sich durch elektrische und thermische Energie aktivieren lassen, beispielhaft seien hier thermisch oder elektrisch schaltbare Hydrogele genannt.
Unter einem Überlagerungsbereich wird im Sinne der vorliegenden Erfindung der Teil zwischen zwei verbindungsfähigen Reservoirräumen, der über eine gemeinsame Wandung verfügen, verstanden. Innerhalb dieser Mischungszone erfolgt die Durchmischung der ersten und zweiten Flüssigkeit, die in die Reaktionskammer einströmt.
Unter einem aktiven Element bzw. einer aktive Funktion wird vorliegend ein aktives mechanisch Element bzw. eine aktive mechanische Funktion verstanden.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist die Abdeckung als oberer Strukturträger in einer Anordnung von zumindest zwei Strukturträgern ausgeführt. In einer Ausführungsform der Erfindung ist in dem Überlagerungsbereich des ersten und zweiten Kanalssystems eine Membran zwischen dem ersten und zweiten Kanal angeordnet, wodurch die gemeinsame Reaktionskammer in einen ersten Reservoirraum und in einen zweiten Reservoirraum unterteilt wird. Dadurch wird eine Separierung der Flüssigkeiten im ersten und zweiten Kanal bewirkt, weshalb eine ungewollte Flüssigkeitsverlagerung, z.B. infolge einer verzögerten Strömung einer Flüssigkeit, in einen der beiden Kanäle unterbunden wird. Durch eine verlangsamte Strömung, beispielsweise infolge einer Blockade, könnte die zweite Flüssigkeit über die gemeinsame Reaktionskammer in den ersten Kanal eintreten, wodurch eine Undefinierte Durchmischung der ersten und zweiten Flüssigkeit nicht wie gewünscht in der gemeinsamen Reaktionskammer, sondern bereits im ersten Kanal erfolgen würde. Infolgedessen wären die so erzeugten, volumetrisch Undefinierten Vermischungen für Analysezwecke ungenügend. Durch die Separierung der beiden Flüssigkeiten mittels einer Membran wird eine unerwünschte Verlagerung der Flüssigkeiten in den jeweils anderen Reservoirraum unterbunden.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Membran als aktive Membran ausgeführt.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Membran zwischen erstem und zweitem Reaktionsraum aus einem flüssigkeitslöslichen Material ausgeführt. Dadurch kann die Membran nach Befüllen der ersten und zweiten Reservoirräumen mit den beiden Flüssigkeiten aufgelöst werden, wodurch die Reservoirräume zur gemeinsamen Reaktionskammer verbunden werden und in dieser wie beabsichtigt eine Durchmischung der Flüssigkeiten erfolgen kann. Dies geschieht vorteilhaft dann, wenn die weiteren aktiven Elemente, welche die Reaktionskammer begrenzen und als quellbare Quellmittelbarrieren ausgeführt sind, ein Nachströmen der Flüssigkeiten aus den Kanälen in die Reaktionskammer unterbinden. Durch das Aufquellen der Quellmittelbarrieren wird eine hermetisch abgeschlossene Reaktionskammer realisiert, welche sich durch jeweils definierte Flüssigkeitsvolumina in den Reservoirräumen auszeichnet, die dann durch die zeitlich nachgelagerte Auflösung der Membran miteinander verbunden werden, so dass sich deren Inhalte miteinander vermischen können. Dabei ist die Membran entsprechend den Bedürfnissen der Anwendung so konfigurierbar, dass der zeitliche Verlauf der Auflösung eine Vermischung der Flüssigkeiten in der Reaktionskammer zum gewünschten Zeitpunkt ermöglicht. Das zeitliche Auflöseverhalten der Membran bei Kontakt mit Flüssigkeit kann dabei sowohl über die Auswahl des Materials als auch über die Dicke der Membran konstruktiv eingestellt werden. Dies ist insbesondere vorteilhaft, da damit bei Auftreten von Strömungsverlangsamungen in einem der beiden Kanäle und eines damit verbundenen retardierten Einströmen in die Reaktionskammer eine Undefinierte Verlagerung der Flüssigkeiten vermieden werden kann. Selbstverständlich können auch mehr als zwei Kanalsysteme wie beschrieben miteinander verbunden sein, um Mischungsvorgänge mit mehr als zwei Flüssigkeiten durchzuführen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das aktive Element im Bodenbereich des zweiten Reservoirraum der Reaktionskammer als Abgabesystem von Wirk- und anderen Stoffen ausgeführt. Dabei können Wirk- und/oder andere Stoffe im aktiven Element eingebettet oder fixiert sein, wobei eine Freisetzung dieser Wirk- und/oder anderen Stoffe durch die aktivierende Umgebungsgröße erfolgt. Dadurch können Wirk- und/oder andere Stoffe, wie etwa Enzyme, Substrate, Prekursoren, etc., vorab in der Reaktionskammer immobilisiert und bei Flüssigkeitsgegenwart mobilisiert werden, wobei die zeitliche Freisetzung der Wirk- und/oder anderen Stoffe wiederum den Anwenderbedürfnissen entsprechend angepasst werden können. So ist beispielsweise eine Freisetzung nach Aktivierung der die Reaktionskammer begrenzenden aktiven Elemente möglich, sodass die Wirk- und/oder anderen Stoffe in das durch die Reaktionskammer definierte Volumen freigesetzt werden. Auch ist es denkbar, dass die Freisetzung noch vor der Auflösung der Membran erfolgt. Im ersten Fall würde es zu einer Vermischung der ersten und zweiten Flüssigkeit in der Reaktionskammer kommen, wobei die zweite Flüssigkeit den Wirk- und/oder anderen Stoffe bereits enthalten würde. Denkbar wären solche Anwendungen etwa für gezielte Immobilisierungen verschiedener Substratkonzentrationen in unterschiedlichen Reaktionskammern. Im anderen Fall würde die Freisetzung in die Reaktionskammer erst nach Vermischen der ersten und zweiten Flüssigkeit erfolgen. Dies wäre vorteilhaft, wenn zunächst die erste und zweite Flüssigkeit eine Reaktion durchführen sollen und die Zugabe eines Substrats, etc. erst nach Abschluss dieser Reaktion möglich ist. Durch die gezielte Immobilisierung der Wirk- und/oder anderen Stoffe ist eine breite Möglichkeit der Anwendung des mikrofluidischen mikromechanischen Systems in der Analytik eröffnet. Das Abgabesystem von Wirk- und anderen Stoffen ist dabei beispielsweise als Depot oder Speicher ausgebildet, welcher durch Flüssigkeitsgegenwart aktiviert wird. Deshalb kann man es durchaus als aktives Element bezeichnen. Ein solches Speicherelement könnte auch als Polymernetzwerk ausgeführt sein. Beim Entquellprozess bzw. Auflösungsprozess durch Flüssigkeitsgegenwart setzt es das Quellmittel und die darin enthaltenen Substanzen frei.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die aktiven Elemente durch Flüssigkeitsgegenwart als Umgebungsgröße aktivierbar ausgeführt. Dabei ist sowohl eine Änderung des Quellungszustandes durch Flüssigkeitsaufnahme als auch eine Auflösung des aktiven Elements infolge des Flüssigkeitskontakts denkbar.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die aktiven Elemente die zeitliche Abfolge sowie das Zeitverhalten der Durchmischung der ersten und zweiten Flüssigkeit festlegend ausgeführt. Durch die Variation des Aufbaus der aktiven Elemente kann direkt Einfluss auf das Zeitverhalten der Durchmischung von erster und zweiter Flüssigkeit genommen werden. Dabei können beispielsweise durch geeignete Auswahl an Materialien die aktiven Elemente in ihrem Zeitverhalten gesteuert werden. Auch durch die Dimensionierung der aktiven Elemente kann das Zeitverhalten beeinflusst werden. So können beispielsweise größer dimensionierte aktive Elemente, welche durch die aktivierende Umgebungsgröße eine Volumenzunahme erfahren, eine schnellere Unterbindung der Flüssigkeitsströmung erzielen als vergleichbar kleiner dimensionierte aktive Elemente. Gleichfalls kann etwa auch bei flüssigkeitslöslichen aktiven Elementen eine verlangsamte Auflösung infolge größerer Dimensionierung des aktiven Elements gezielt eingestellt werden. Dadurch kann die zeitliche Abfolge sowohl materialabhängig als auch dimensionsabhängig gesteuert werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die aktiven Elemente als Quellmittelbarrieren oder flüssigkeitslösliche Barrieren ausgeführt. Im Falle der Ausbildung der aktiven Elemente als Quellmittelbarrieren würde durch eine Flüssigkeitsaufnahme eine Volumenzunahme des aktiven Elements erfolgen, wodurch der Kanal, welcher das aktive Element enthält, immer weiter verengt wird, bis es infolge einer vollständigen Ausfüllung des Kanalquerschnitts zu einem Strömungsabriss im Kanal und mithin zu einer Unterbindung der Strömung kommt. Das als Quellmittelbarriere ausgeführte aktive Element wird dabei in einem getrockneten Zustand in den Kanal des mikrofluidischen mikromechanischen Systems eingebracht. Nach erfolgter Volumenzunahme der Quellmittelbarriere durch Flüssigkeitsaufnahme verbleibt die Quellmittelbarriere im gequollenen Zustand. Das bedeutet, dass nach Volumenzunahme keine Entquellung stattfindet, wodurch die Quellmittelbarriere nur eine einmalige Aktivierung durch die Flüssigkeitsaufnahme erfährt. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn die Quellmittelbarriere als Schließelement ausgeführt ist, beispielsweise um die Reaktionskammer gegen nachfließende Flüssigkeiten abzuschotten.
Bei der Ausführung der aktiven Elemente als flüssigkeitslösliche Barriere wird durch die Benetzung der Barriere mit der Flüssigkeit im Kanal eine Auflösung dieser Barriere erzielt. Dadurch kommt es bei fortschreitender Auflösung der Barriere zu einem Ansteigen der Durchströmung des Kanalquerschnitts und infolgedessen zur Ausbildung einer Strömung der Flüssigkeit durch den Kanal. Die Grundlage dafür, dass ein sich auflösendes Element als aktives Element aufgefasst wird, liegt in seinem Funktionprinzip begründet. Die Tragfähigkeit bzw. mechanische Nachgiebigkeit eines Bauelementes kann durch Veränderung (a) des E- Moduls des Bauelementematerials oder (b) seines Querschnitts verändert werden. Im Fall der auflösenden Elemente wird (b) als Grundlage der aktiven Funktion genutzt. Hier erfüllt das auflösbare aktive Element die Funktion eines Öffnerventils, sobald das Steuersignal "Flüssigkeit" anliegt.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung sind die Quellmittelbarrieren oder flüssigkeitslöslichen Barrieren als Ventile ausgeführt. Durch die zeitlich definierbare Quellung oder Auflösung der Barrieren können die aktiven Elemente Ventilfunktionen innerhalb des mikrofluidischen mikrochemomechanischen Systems wahrnehmen. Dadurch können die Ventile sowohl Öffner- (flüssigkeitslösliche Barriere) als auch Schließfunktionen (Quellmittelbarrieren) ausüben. Aufgrund der zeitlich definierbaren und hilfsenergiefreien Funktionsausübung eignen sich derartige Ventil bevorzugt für den Einsatz in autarken mikrofluidischen Systemen. Dabei werden als Öffnerelemente alle aktiven Bauelemente aufgefasst, welche die Funktion eines Öffnerventils erfüllen. Dies kann geschehen durch (a) Erniedrigung des E-Moduls bei vernetzten, quellfähigen Polymeren und (b) Auflösen bei flüssigkeitslöslichen Materialien. Die sich auflösenden Membranen werden ebenfalls als Öffnerelemente aufgefasst.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung bestehen die aktiven Elemente aus Hydrogelen, die chemisch vernetzt und/oder physikalisch vernetzbar sind. Unter Hydrogelen wird im Sinne der Erfindung ein Wasser enthaltendes, aber wasserunlösliches Polymer verstanden, dessen Moleküle chemisch, z. B. durch kovalente Bindungen, oder physikalisch, z. B. durch Verschlaufen der Polymerketten, zu einem dreidimensionalen Netzwerk verknüpft sind. Durch eingebaute hydrophile Polymerkomponenten quellen sie in Flüssigkeiten unter beträchtlicher Volumenzunahme, ohne aber ihren stofflichen Zusammenhalt zu verlieren. Wesentlich hierbei ist, dass die Hydrogele so ausgebildet sind, dass diese nach Kontakt mit Flüssigkeiten im gequollenen Zustand verbleiben.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung bestehen die aktiven Elemente aus Hydrogelen, welche ausgewählt sind aus einer Gruppe, welche z.B. Polyacrylamide, Polyvinylalkohole, Polyacrylate, Hydroxycellulose, Polyvinylpyridine oder Polyglykole (z.B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol) und deren Derivate umfasst.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform der Erfindung sind die aktiven Elemente aus unvernetzten Polymeren, Salzen oder organischen Naturstoffen wie Sacchariden ausgeführt. Dies ist der Fall, wenn die aktiven Elemente als flüssigkeitslösliche Barrieren ausgeführt sind. Dabei können sämtliche Materialien eingesetzt werden, die im getrockneten Zustand einen Feststoff, Sol-Gel oder dergleichen bilden und bei Kontakt mit einer Flüssigkeit in Lösung gehen. Die Materialbasis der unvernetzten Polymere kann prinzipiell die gleiche wie bei den vernetzten Polymeren sein. Während die zu einem dreidimensionalen Netzwerk vernetzten Polymere als quellbare Quellmittelbarrieren dienen, lösen sich die gleichen Polymere in der Flüssigkeit auf, wenn sie unvernetzt sind, da die nicht miteinander verbundenen Polymerketten in Lösung gehen können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur mikrofluidischen Prozessführung in einem mikrofluidischen mikromechanischen System, wobei eine erste Flüssigkeit in einen ersten Kanal eingebracht wird, eine zweite Flüssigkeit in einen zweiten Kanal eingebracht wird und eine Vermischung der ersten und zweiten Flüssigkeit in einer Reaktionskammer, welche im Überlagerungsbereich des ersten und zweiten Kanals ausgebildet wird, erfolgt, wobei die zeitliche Abfolge der Vermischung der ersten und zweiten Flüssigkeit in der Reaktionskammer durch aktive Elemente bestimmt wird.
Die vorbeschriebenen Verfahrensschritte sind insbesondere vorteilhaft zur zeitlichen Steuerung der Vermischung von zwei Flüssigkeiten in einem mikrofluidischen System. Durch geeignete Wahl der Parameter kann dadurch anwenderspezifisch die jeweils gewünschte zeitliche Abfolge von Prozessschritten, wie Vermischung, Auflösung von Barrieren, Verschluss gewünschter Kanalabschnitte mittels Quellmittelbarrieren, Freisetzung von Wirk- und/oder anderen Stoffen erzielt werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die zeitliche Abfolge der Vermischung der ersten und zweiten Flüssigkeit in der Reaktionskammer durch die aktiven Elemente, welche flüssigkeitslöslich oder als Quellmittelbarriere ausgeführt sind, bestimmt. Dadurch kann sowohl ein Unterbinden der Strömung als auch eine Öffnung von Kanalabschnitten zur Durchströmung mit der ersten oder zweiten Flüssigkeit realisiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst das Verfahren weiterhin die Auflösung einer flüssigkeitslöslichen Membran, welche die Reaktionskammer in einen ersten Reservoirraum und in einen zweiten Reservoirraum unterteilt, durch die erste und zweite Flüssigkeit vor der Vermischung der ersten du zweiten Flüssigkeit. Durch die Auflösung der Membran wird die Unterteilung der Reaktionskammer in einen ersten und in einen zweiten Reaktionsraum aufgehoben, sodass eine Durchmischung der ersten und zweiten Flüssigkeit, welche im ersten und zweiten Reservoirraum vorhanden sind, erfolgt.
Erfindungsgemäß erfolgt die Verwendung des mikrofluidischen mikrochemomechanischen Systems zur Durchführung von Prozessen auf Basis von Antigen-Antikörper-Reaktionen, Durchführung von Prozessen auf Basis der Kulturmethode, Kontrolle und/oder Detektion von Prozessen auf Basis einer Polymerasekettenreaktion und Detektion von Enzymaktivität eines biochemischen Prozesses. Weitere Anwendungen auf Basis chemischer oder biochemischer Mischreaktionen sind denkbar.
Das erfindungsgemäße mikrofluidische mikrochemomechanische System zeichnet sich dadurch aus, dass es hilfsenergiefrei eine Durchmischung einer ersten und einer zweiten Flüssigkeit in einer Reaktionskammer mit definierten Volumen und in einer zeitlich steuerbaren Art und Weise ermöglicht. Zudem können immobilisierte Wirk- und /oder andere Stoffe zeitgesteuert freigesetzt werden und so Reaktionen in der Reaktionskammer ermöglichen.
Die vorbenannten erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind geeignet die Aufgabe zu lösen. Dabei sind auch Kombinationen der offenbarten Ausführungsformen zur Lösung der Aufgabe geeignet. Bevorzugte Weiterbildungen der Erfindung ergeben sich aus den Kombinationen der Ansprüche oder einzelner Merkmale davon.
Nachfolgend soll die Erfindung anhand einiger Ausführungsbeispiele und der zugehörigen Figuren eingehender erläutert werden. Die Ausführungsbeispiele sollen die Erfindung beschreiben ohne sich auf diese zu beschränken.
Es zeigen die
Fig. 1 eine Draufsicht auf ein erfindungsgemäßes mikrofluidisches mikrochemomechanisches System, in
Fig. 2a eine Draufsicht auf eine Stufe des in Fig. 1 dargestellten mikrochemomechanischen Systems, in
Fig. 2b eine Querschnittsansicht der in Fig. 2a dargestellten Stufe, in
Fig. 3a eine Draufsicht auf eine Stufe eines weiteren erfindungsgemäßen mikrofluidischen, mikrochemomechanischen Systems, in
Fig. 3b eine Querschnittsansicht der in Fig. 3a dargestellten Stufe, in
Fig. 4 eine Darstellung eines weiteren erfindungsgemäßen mikrofluidischen mikrochemomechanischen Systems mit einer 48x48-Mischungsmatrize, in
Fig. 5a eine Draufsicht auf einen 2x2-Ausschnitt aus der Matrize von Fig. 4, in
Fig. 5b eine Querschnittsansicht eines in Fig. 5a dargestellten Matrizenausschnitts, in
Fig. 5c eine Querschnittsansicht einer alternativen Ausgestaltung eines in Fig. 5a dargestellten Matrizenausschnitts, in
Fig. 6a ein Diagramm zur Darstellung der Abhängigkeit des kooperativen Diffusionskoeffizienten von Quellmittelbarrieren auf Basis von Natriumacrylat-Hydrogelen in Abhängigkeit von deren normierter Vernetzerkonzentration, in Fig. 6b ein Diagramm zur Darstellung der Abhängigkeiten der Schließzeit und der Druckbeständigkeit von Quellmittelbarrieren auf Basis von Natriumacrylat-Hydrogelen in Abhängigkeit von deren normierter Vernetzerkonzentration, in
Fig. 6c ein Diagramm zur Darstellung der Abhängigkeiten der Schließzeit von Quellmittelbarrieren auf Basis von Natriumacrylat-Hydrogelen in Abhängigkeit vom Verhältnis des Volumens des Hydrogelaktors im trockenen Ausgangszustand zum Volumen der Ventilkammer,
Fig. 7a ein Diagramm zur Darstellung der Abhängigkeit der Öffnungszeit von flüssigkeitslöslichen Barrieren vom verwendeten flüssigkeitslöslichen Material und von der Dicke einer als Membran ausgeführten Barriere,
Fig. 7b ein Diagramm zur Darstellung der Abhängigkeit der Öffnungszeitzeit von flüssigkeitslöslichen Barrieren in Form eines Öffnerventils aus PEG 10.000 von der Ventillänge für verschiedene Strömungsgeschwindigkeiten des Prozessmediums,
Fig. 7c ein Diagramm zur Darstellung der Standardabweichung der Öffnungszeitzeit von flüssigkeitslöslichen Barrieren in Form eines Öffnerventils aus PEG 6.000 von der Ventillänge,
Fig. 8a den Verlauf der Fluoreszenzintensität von vier unterschiedlichen Proteinproben bei 455 nm nach Mischung mit einem Nachweisreagenz über die Zeit,
Fig. 8b eine Kalibriergerade zur Bestimmung der Proteinkonzentration in einer Probe,
Fig. 9a die Fluoreszenzintensität im Falle des Nachweises von Human Serum Albumin (HSA) als Dreifachbestimmung bei 423 nm nach Mischung mit einem Nachweisreagenz über die Zeit.
Fig. 9b eine Kalibriergerade zur Bestimmung der Proteinkonzentration von Human Serum Albumin (HSA) in einer Probe,
Fig. 10 die ermittelte konzentrationsabhängige Fluoreszenzintensität im Falle des Nachweises von Rinderserumalbumin (BSA) als Dreifachbestimmung bei 470 nm nach Mischung mit Fluorescamin.
In einem ersten Ausführungsbeispiel ist in Fig. 1 ein erfindungsgemäßes mikrofluidisches mikrochemomechanisches System dargestellt, welches als autark und automatisch arbeitender Mikrofluidikprozessor für äquidistante Langzeituntersuchungen konzipiert ist. Der Mikrofluidikprozessor in Fig. 1 führt Langzeit-Untersuchungen aus, die aus identischen analytischen oder anderen Mischungsreaktionen bestehen und die entsprechend eines definierten Zeitplans wiederholt werden. Äquidistante Untersuchungen gehören zu den gebräuchlichsten Verfahren der Wissenschaft und Technik. Sie werden unter anderem zur Kontrolle kritischer Parameter, z. B. dem Monitoring von Bioreaktoren, für die Enzymanalytik, die Analyse von Wachstumsfaktoren oder die Qualitätskontrolle chemischer und biologischer Produkte eingesetzt. Der Mikroprozessor in Fig. 1 ist in 192 seriell verbundene, baugleiche Stufen 1 unterteilt und umfasst insgesamt 2096 aktive Elemente 7 und 384 Reservoirräume 9,10.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel führt eine Stufe 1 (Fig. 2a, 2b) des Mikrofluidikprozessors sämtliche Schritte der Probenentnahme, Probenpräparation und das einleiten der Mischungsreaktion komplett selbstständig und energieautark durch. Diese benötigt dazu keinerlei elektrische Hilfsenergie und prozessiert ausschließlich chemische Information in Form einer binären Konzentration c der Prozessmedien (c = 0: flüssiges Prozessmedium liegt nicht an; c = 1 : flüssiges Prozessmedium liegt an). Die Funktionsweise der Stufe 1 (Fig. 2a) ist wie folgt. Die Flüssigkeiten 13 und 14 der beiden Kanäle 3 und 4 erreichen die Stufe 1 , so dass die binäre Konzentration von 0 auf 1 schaltet. Dieses chemische Signal aktiviert die integrierten aktiven Elemente 7 und stimuliert diese zur Abgabe ihrer gespeicherten chemischen Energie in Form einer definierten fluidischen Funktion in einer durch die fluidische Zusammenschaltung vordefinierten zeitlichen Reihenfolge. Zunächst fluten die Flüssigkeiten die Bestandteile 9,10 der Reaktionskammer 6 im Überlagerungsbereich 5 der Kanäle 3 und 4. Die Schließelemente 7a, zum Beispiel bestehend aus dem Hydrogel Natriumacrylat, schließen die Ein- und Auslässe der Reservoirräume 9,10 und separieren sowie dosieren damit die Flüssigkeiten 13,14. Die Schließzeit der Schließelemente 7a ist so gewählt, dass die Reservoirräume 9,10 mit höchster Wahrscheinlichkeit vollständig mit den Flüssigkeiten 13,14 gefüllt sind. Sie kann beispielsweise 45 s betragen (Verhältnis Volumen Vgei des Natriumacrylataktors zum Volumen der Reaktionskammer 6 VK 1 : 5,6, siehe auch Fig. 6c). Nach dem hermetischen Verschluss der Reservoirräume 9,10 löst sich die Membran 7e (Fig. 2b), welche die Reservoirräume 9,10 trennt, auf und verbindet 9,10 zur Reaktionskammer 6. Nun kann durch Vermischung der Flüssigkeiten 13,14 die angestrebte Reaktion stattfinden. Die Membran 7e, welche beispielsweise als aktive Membran ausgeführt ist, muss mechanisch so stabil sein, dass diese bei Flutung der Reservoirräume 9,10 nicht signifikant ausgelenkt wird. Zudem darf ihre Auflöse- bzw. Öffnungszeit nicht zu kurz sein, um ungewolltes, verfrühtes Vermischen zu vermeiden. Durch Einsatz einer beispielsweise 70μηι dicken aktiven Membran 7e aus unvernetztem Polyvinylalkohol kann eine entsprechende Formstabilität bei einer Öffnungszeit von 7 min realisiert werden (siehe auch Fig. 7a). Während der Befüllung der Reservoirräume 9,10 sind die Öffnerelemente 7b, welche beispielsweise, aus Polyethylenglykol (PEG) 6000 bestehen, in den Kammer-Bypässen geschlossen. Sobald 9,10 durch die Schließelemente 7a verschlossen sind, führt der ansteigende Druck über die Öffnerelemente 7b zu deren Durchbruch. Anschließend lösen sich die Elemente 7b schnell vollständig auf. Die Öffnerelemente 7b sind essentielle Elemente für sequentielle Schaltungen mit vielen Stufen bzw. Kaskaden. Ohne diese müssten die fluidischen Widerstände der Bypasskanäle viel höher als die fluidischen Widerstände der zu den Reservoirräumen führenden Kanäle gewählt werden. Dies würde dazu führen, dass durch die sich durch die Reihenschaltung aufsummierenden Bypass- Widerstände die Anzahl seriell schaltbarer Stufen auf 3 oder 4 begrenzt wäre. Da sich die Öffnerelemente 7b vollständig auflösen, kann der Bypasswiderstand so gering gehalten werden, dass der die sequentielle Stufenanzahl praktisch nicht mehr limitiert. Das Öffnerelement 7d definiert die Zeit bis zur Aktivierung der nächsten Stufe. Nach Auslösen der Öffnerelemente 7d fluten die Flüssigkeiten 13,14 die nächste Stufe. In diesem Moment schließen die Schließelemente 7c die Bypässe zu den in Fig. 1 ersichtlichen Zirkulationskanälen 12. Auch bei der Schaltungskombination der Elemente 7c und 7d ist es möglich, den Druckanstieg über dem Öffnerelement 7d infolge des Verschlusses von 7c zum Öffnen von 7d auszunutzen. Der in Figur 1 dargestellte Mikroprozessor ist in der Lage, Mischungsreaktionen in Zeitintervallen von 2min (Öffnerelemente 7d aus Polyethylenglykol 6000 und einer Elementelänge von 400μη"ΐ, siehe auch Fig. 7c) autark und automatisch durchzuführen, er kann aber auch bis zu 16 Tage lang bei autarker und automatischer Durchführung von Mischungsreaktionen in zwei-Stunden-Intervallen arbeiten (Öffnerelemente 7d aus PEG 35000 und 1 ,2 mm Länge).
Das mikrofluidische mikrochemomechanische System in Fig. 1 besitzt eine zwei-Ebenen- Architektur (siehe Fig. 2b). Der obere Strukturträger 2a, welcher beispielsweise auch als Abdeckung fungiert, beinhaltet die Kanalstruktur des Kanals 3 für die Flüssigkeit 13, während der untere Kanalstrukturträger 2b die Kanalstruktur des Kanals 4 für die Flüssigkeit 14 trägt. Beide Strukturträger haben beispielsweise ein vergleichbares Design, welches im Wesentlichen gespiegelt sein kann. Die Kanäle 3 und 4 sind für das in Fig. 1 dargestellte Beispiel 800 μηη breit und 140 μηη hoch. Die Bypasskanäle 8 sind 400μηι breit und 140 μηη hoch. Die quadratischen Rauten für die Schließelemente besitzen eine Volumen von 1000 x 1000 x 140 μητ5 (7a) bzw. 800 x 800 x 140 μητ5 (7c). Die Konfiguration der aktiven Elemente für die Anordnungen in den Figuren 1 und 2 ist wie folgt: die Dicke der aktiven Membran aus unvernetztem Polyvinylalkohol ist 70 μηη. Die Länge der Öffnerelemente 7b (PEG 6000) ist 400 μπι, die Länge der Öffnerelemente 7d (PEG 6000) beträgt 800 μπι. Die Natriumacrylat-Aktoren der Schließelemente 7a besitzen das Trockenvolumen 500 x 500 x 100 μηη3 (Volumenverhältnis Vgei : VK = 1 : 5,6), die Natriumacrylat-Aktoren der Schließelemente 7c besitzen ein Volumen von 240 x 240 x 100 μηη3 (Volumenverhältnis
Figure imgf000015_0001
In einer alternativen Ausgestaltung des vorbeschriebenen Ausführungsbeispiels wird das in Fig.1 dargestellte mikrofluidische mikrochemomechanische System in Fig. 1 mit nur einem Strukturträger 2 und einer unstrukturierten Abdeckung 2a realisiert. Dabei befinden sich beide Kanalsysteme 3,4 auf demselben Strukturträger 2, d. h., in einer Ebene. Im Überlagerungsbereich der Kanäle 3,4 ist nun ein Öffnerelement, welches prinzipiell wie die Öffnerelemente 7b, 7d gestaltet ist, zwischen denn Reservoirräumen 9,10 angeordnet, welches nach seinem Auflösen die beiden Reservoirräume 9,10 zur Reaktionskammer 6 verbindet.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel bestehen die monolithischen Mikrochips der mikrofluidischen mikrochemomechanischen Systeme (Fig. 1 ) vollständig aus Polymeren. Die Strukturträger 2, welche die Kanalnetzwerke enthalten, bestehen beispielsweise aus Polydimethylsiloxan (PDMS) und wurden mit der Multilayer-Soft-Lithografie [D.C. Duffy, J.C. McDonald, O.J.A. Schueller, G.M. Whitesides, Anal. Chem. 70 (1998), 4974-4984] unter Nutzung einer large-area-Replikationstechnologie mit Mastern aus Festresisten [A., Richter, G. Paschew, Adv. Mater. 21 (2009), 979-983] gefertigt. Die Multilayer-Soft-Lithografie unter PDMS-Nutzung eignet sich vorrangig für die Forschung und den Demonstratorbau. Vor allem für die Serienfertigung von der Strukturträger eignen sich auch andere Herstellungsverfahren wie das Heißprägen und Spritzgießen von thermoplastischen Polymeren, welche beispielsweise Polystyrol, Polycarbonat, Olefine wie Cycloolefin, Polyester wie Polyethylenterephthalat umfassen können. Zur Realisierung der aktiven Elemente 7 werden beispielsweise phasenveränderliche Polymere verwendet, welche mit einfachen mikrotechnischen Methoden in den Mikrochip integrierbar sind. Polyethylenglykole werden mit Schablonendruck, Natriumacrylat-Aktoren fotolithografisch mikrostrukturiert. Die aktiven Membranen aus Polyvinylalkohol lassen sich beispielsweise mit einer Pick-and-Place- Technologie integrieren.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel erfolgt die Mikrostrukturierung der Natriumacrylat- Aktoren durch eine fotolithografische Polymerisation. Eine beispielhafte Herstellungsprozedur basiert auf einer Mischung aus 2 g Natriumacrylat, 0,04g des Vernetzers Λ/,Λ/'-Methylenbisacrylamid (BIS), und 0,04g des Fotoinitiators 2-Hydroxy-4'-(2- Hydroxyethoxy)-2-Methylpropiophenon, alles gelöst in 14 ml destilliertem Wasser. Diese Lösung wird unter Argon-Schutzgasatmosphäre 24 h gerührt. Für die Diskussion in den Figuren 6a und 6b wird diese Stammlösung mit c0 referiert. Die Fotopolymerisation erfolgt ebenfalls unter Argon-Schutzgasatmosphäre entweder direkt in den Kanalstrukturen oder in einer Fotopolymerisationskammer. Die Qualität und Vernetzungseigenschaften der Natriumacrylat-Aktoren hängen von der Polymerisationszeit, der Distanz zur Belichtungsquelle, vom Typ der Belichtungsquelle und von der Höhe der Polymerisationskammer ab.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel werden für die Öffnerelemente 7b und 7d schmelzfähiges Polyethylenglykol verwendet, welche mit einer Schablonendruck- Technologie strukturierbar sind. Für das Ausführungsbeispiel der Figuren 1 und 2 wurde eine strukturierte Kupfermaske einer Dicke von 20 μηη auf den Strukturträgern 2a, b so platziert, dass deren Öffnungen an den Sollpositionen der Öffnerelemente 7b, d lagen. Das geschmolzene PEG wird auf die Kupfermaske gegeben und mit einem Metallrakel verteilt, so dass in den Maskenöffnungen die Öffnerelemente 7b, 7d in den Strukturträgern 2a, 2b entstehen. Sobald das PEG die Strukturträger berührt, erkaltet es und härtet aus. Die erzeugten Öffnerelemente besitzen bereits ihre geometrischen Abmessungen, dichten die Kanäle aber noch nicht ab. Hermetisch dichte Öffnerventile werden in einem letzten Mikrochip-Fertigungsschritt erreicht, indem der bereits vollständig gefügte Mikrochip kurzzeitig geringfügig über die Schmelztemperatur des PEG erwärmt wird. Die PEG- Strukturen schmelzen und verschließen die Kanäle dicht.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird zur Herstellung der aktiven Membranen 7e aus Polyvinylalkohol eine 5%ige Polymerlösung in eine Form gegossen und anschließend getrocknet. Die Höhe der so erzeugte Membran lässt sich durch die Füllmenge und damit - höhe der Lösung in der Gießform festlegen.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist ein mikrofluidischen mikrochemomechanischen Systems in den Fig. 3a und 3b dargestellt. Diese zeigen die Stufe eines weiteren Mikroprozessors, der ebenfalls aus sequentiell geschalteten Stufen besteht. Hier besitzen die Stufen die Aufgabe, mehrere Mischungsreaktionen mit unterschiedlichen Verhältnissen gleichzeitig durchzuführen. Die simultane Durchführung von Untersuchungen mit verschiedenen Volumenverhältnissen von Probe und Analyt bzw. einfach zwei Chemikalien ermöglicht u.a. die Bestimmung von Reaktionskinetiken, beispielsweise die Bestimmung einer Enzymaktivität.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird die Funktionsweise der in den Figuren 3a und 3b dargestellten Stufe wird anhand der Untersuchung einer Enzymkinetik erläutert. Durch den Zuführungskanal 3, welcher beispielsweise 800 μηη breit und 140 μηη hoch ausgeführt ist, wird eine Flüssigkeit zugeleitet, welche das interessierende Enzym, beispielsweise Laccase, eine Polyphenoloxidase des Pilzes Trametes versicolor, enthält. Durch das zunächst geschlossene Öffnerelement 7d ist das Medium gezwungen, die fünf parallelen Kanalstrukturen, welche beispielsweise eine Breite 400 mm, Höhe 140 μηη aufweisen, mit Reservoirräumen 9 zu fluten. Nach Verschluss der Reservoirräume durch die Schließelemente 7a, welche beispielsweise für diequadratischen Ventilrauten Abmessungen von 700 x 700 x 140 μηη3 oder für die trockenen Natriumacrylataktoren Abmessungen von 300 x 300 x100 μηη3 aufweisen, bei einem Volumenverhältnis VGei : VK = 1 : 7,6 für eine Schließzeit von 1 min,) fließt zunächst das Prozessmedium über den Bypass 8 in Richtung des als Abfluss fungierenden Zirkulationskanal 12. Dies geschieht so lange, bis das Öffnerelement 7d, welches aus PEG 6000 ausgeführt ist und eine Länge von aufweist, geöffnet hat und das Medium im Kanal 3 zur nachfolgenden Stufe fließen kann. Jede der nunmehr hermetisch geschlossenen Reaktionskammern enthält nun ein der Größe des Reservoirraums 9 entsprechendes Volumen an enzymhaltigem Prozessmedium. Darüber hinaus verfügt jeder Reservoirraum 9 im Bodenraum über ein Depot 1 1 , in welchem bereits bei der Mikrochipherstellung ein Analyt in Form eines getrockneten, flüssigkeitslöslichen aktiven Elementes 7f eingebracht wurde. Das analythaltige aktive Element 7f besteht dabei beispielsweise aus getrocknetem, immobilisiertem Substrat 2,2'-Azino-bis(3- ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) in einem Malonatpuffer. Die Gegenwart des wässrigen Prozessmediums lässt das Substrat in Lösung gehen und die Mischungsreaktionen starten. Die Reservoirräume 9 und die darin befindlichen Depots 1 1 repräsentierten beispielsweise Volumenverhältnisse von Probe zu Analyt von 1 :3, 1 :2, 3:1 , 2:1 und 1 :1.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel ist in Fig. 4 ein erfindungsgemäßes mikrofluidisches mikrochemomechanisches System vorgestellt, welches als autark und automatisch arbeitender hochparalleler Mikrofluidik-[NxM]-Matrix-Prozessor jegliche mögliche Kombination von N in Zeilen organisierten mit M in Spalten organisierten Chemikalien realisiert. In Fig. 1 ist ein [48x48]-Matrix-Prozessor dargestellt. Ein beispielhaftes Anwendungsszenario eines solchen [48x48]Matrix-Prozessors ist das parallele Untersuchen von 48 Proben nach 48 Parametern, wie etwa zu Screening-Zwecken. Der Vorteil derartiger Matrix-Prozessoren besteht darin, dass alle Untersuchungen zum gleichen Zeitpunkt bei exakt gleichen Konditionen durchgeführt werden. Die massiv parallele Durchführung der Tests bringt zudem die Vorteile der Hochintegration zum Tragen, so dass Untersuchungsreihen, die typischerweise Tage oder Wochen dauern, in Stunden durchführbar sind. Der [48x48]-Matrix-Prozessor führt 2304 Untersuchungen gleichzeitig und vollautomatisch durch. Er verfügt insgesamt über 2401 Schließelemente 7a und 2304 aktive Membranen 7e. Seine Funktionsweise wird nachfolgend anhand der Figuren 5a und 5b für einen [4 x 4]-Matrixausschnitt und eine Beispielkonfiguration erklärt.
In die Zeilenkanäle 15 und 16 sowie die Spaltenkanäle 17 und 18 werden gleichzeitig und mit gleicher Flussrate Flüssigkeiten, in den Zeilenkanälen 15 und 16 beispielsweise Probenflüssigkeiten, in den Spaltenkanälen 17 und 18 beispielweise Analyte, eingebracht. Die Flüssigkeiten der Zeilenkanäle 15, 16 fluten die Reservoirräume 9, die Flüssigkeiten der Spaltenkanäle 17,18 fluten gleichzeitig die Reservoirräume 10. Die Schließelemente 7a verschließen nach ca. 1 min die Reservoirräume hermetisch, wobei die Abmessungen der quadratischen Ventilrauten 700 x 700 x 140 μηη3 und die Abmessungen der trockenen Natriumacrylataktoren 300 x 300 x100 μηη3 bei einem Volumenverhältnis VGei : VK = *\ : 7,6 ist. Bei der Dimensionierung der Schließventile 7a ist darauf zu achten, dass diese erst dann schließen, wenn alle Reservoirräume vollständig geflutet sind. Nach dem hermetischen Verschließen der Schließelemente 7a lösen sich die aktiven Membranen 7e innerhalb von ca. 3 min auf, wobei die Membranen beispielweise aus Polyvinylalkohol mit einer Dicke von 50 μηη ausgeführt sind,wobei die 2 x 2 = 4 möglichen Mischungsreaktionen gleichzeitig stattfinden .
In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird in Fig. 5c verdeutlicht, dass man durch Einfügen weiterer fluidischer Ebenen in jedem Matrixpunkt mehr als zwei Flüssigkeiten miteinander vermischen kann. Im dargestellten Beispiel wird ein weiterer mittlerer Strukturträger 2c in den Gesamtaufbau integriert, welcher über eine gleichartige Konfiguration aktiver Elemente 7a, 7e verfügt wie die beiden anderen Strukturträger 2a, 2b. Durch diese einfache Stapelung von drei Strukturträgern ist es möglich, drei Reservoirkammern 9,10,19, die durch verschiedene Kanäle 16,18,21 gespeist werden, zu einer Reaktionskammer 6 zu vereinen und so in einem Matrixpunkt drei Flüssigkeiten miteinander zu vermischen.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel zeigen die Figuren 6a, 6b und 6c Möglichkeiten auf, die Parameter der Schließelemente 7a, 7c, insbesondere die Schließzeit und die Druckresistenz, durch Materialwahl und konstruktive Parameter vorzudefinieren. Figur 6a verdeutlicht, dass die Schließzeit durch die Hydrophilie bzw. den kooperativen Diffusionskoeffizienten des ausgewählten Materials voreingestellt werden kann. Zwei Hydrogeltypen lassen sich unterscheiden, neutrale Hydrogele und polyelektrolytische Hydrogele. Neutrale Hydrogele wie vernetztes Polyacrylamid, Poly(/V-lsopropylacrylamid), Polymethylvinylether, Polyvinylalkohol oder Polyethylenglykol besitzen kooperative Diffusionskoeffizienten Dcoop in der Größenordnung von 10"7 cm2s"1. Diese Hydrogele sind prädestiniert als Materialbasis für relativ langsame Schließelemente mit Schließzeiten im Minuten- oder Stundenbereich. Polyelektrolytische Hydrogele, welche ionisierbare Gruppen, z.B. Säure- oder Basegruppen, enthalten, besitzen aufgrund zusätzlicher inter- und intramolekularer elektrostatischer Wechselwirkungen, welche expansiv wirken, kooperative Diffusionskoeffizienten in der Größenordnung von 10"7 bis 10"5 cm2s"1. Polyelektrolytische Hydrogele, welche als Superabsorber genutzt werden, besitzen den größten Dcoop. Zu ihnen zählt das Hydrogel Natriumacrylat. Wie Fig. 6a zeigt, hängt Dcoop von Natriumacrylat von den Vernetzungsbedingungen ab. Je mehr Vernetzer Λ/,Λ/'-Methylenbisacrylamid (BIS) verwendet wird, umso größer ist der kooperative Diffusionskoeffizient und umso schneller quillt das Hydrogel. Ab einer normierten Konzentration von c / c0 = 7 verringert sich der Einfluss des Vernetzergehalts signifikant. Figur 6b illustriert, dass die Schließzeit eines Natriumacrylat- Schließelements mit zunehmender Vernetzerkonzentration zunimmt. Dies ist kein Widerspruch zur Aussage von Fig. 6a. Das Hydrogel ist trotz höherem Dcoop effektiv langsamer, da ein höherer Vernetzergehalt zu einer höheren Vernetzerdichte des Hydrogels führt. Die höhere Vernetzerdichte führt andererseits zu mechanisch stabileren Hydrogelen, sodass die Druckfestigkeit der Schließelemente mit zunehmendem Vernetzergehalt bzw. zunehmender Vernetzungsdichte der Natriumacrylat-Aktoren zunimmt. Neben den chemischen Parametern lässt sich die Schließzeit der Schließelemente auch durch eine konstruktive Größe, nämlich das Verhältnis des Trockenvolumens des Natriumacrylathydrogel-Aktors zum Reaktionskammervolumen des Schließelementsitzes einstellen (Fig. 6c).
Die Öffnungszeiten von Öffnerelementen 7b, 7d und 7e lassen sich ebenfalls durch die Materialwahl voreinstellen (Fig. 7a). Es gilt, je hydrophiler das gewählte wasserlösliche Polymer, umso schneller löst sich das aktive Element auf. Von großer Bedeutung für die Öffnungszeit ist ein konstruktiver Parameter: die Dicke der aktiven Membranen (Fig. 7a) bzw. die Länge der Öffnerelemente (Fig. 7b). Für Membranen eignen sich vorteilhaft Polymere mit einer hohen Glastemperatur. Diese Polymere sind mechanisch stabil und es lassen sich dünne, biegesteife Membranen herstellen. Geeignete Kandidaten mit Glastemperaturen, welche erheblich höher als die Raumtemperatur liegen, sind z.B. Polyvinylalkohol (7g = 85 °C), Hydroxypropylcellulose (7g = 105 °C) und Polyacrylsäure (7g = 105°C. Für die Öffnerelemente 7b und 7d, welche nicht auf Durchbiegung beansprucht werden, können auch bedeutend weichere Materialien, z.B. Polyethylenglykol, verwendet werden. Im Gegensatz zu Schließelementen besitzt die Strömungsgeschwindigkeit der vorbei fließenden Flüssigkeit bedeutenden Einfluss auf die Öffnungszeit von Öffnerelementen. Wie Fig. 7b verdeutlicht, öffnen Öffnerelemente bei stagnierender Flüssigkeit sehr langsam. In diesem Fall können sich vor dem Öffnerelement Sättigungszonen aus gelöstem Polymer ausbilden, welche den weiteren Auflöseprozess des Polymers beeinträchtigen. Mit zunehmender Strömungsgeschwindigkeit werden diese Sättigungszonen zerstört und das Polymer löst sich schneller auf. Fig. 6c demonstriert am Beispiel eines PEG 6000 Öffnerelements, dass die Standardabweichung von aktiven Elementen 7 bereits mit einfachen mikrotechnischen Labor-Herstellungsmethoden sehr gering gehalten werden können.
In einem weiteren nicht näher dargestellten Ausführungsbeispiel wird ein enzymatischer Test zur Bestimmung des Harnsäuregehalts beschrieben. Der Harnsäuregehalt in Serum oder Urin gibt Rückschlüsse über den Abbau von Purinbasen und wird bei beispielsweise bei Verdacht auf Gicht, Überwachung bei zellzerstörenden Prozessen sowie Steinleiden eingesetzt. Die empfohlene Obergrenze für Männer liegt bei 416 μηηοΙ/Ι.
Der Test wird als gekoppelter Enzymtest durchgeführt, bei dem Harnsäure durch die Uricase oxidiert wird. Dabei entsteht Wasserstoffperoxid, welches mit einer Peroxidase (HRP) nachgewiesen werden kann.
Harnsäure + 02 + 2 H20 -> Allantoin + C02 + H202 Uricase
Substra d + H202 -> Substratoxd + H20 + h*v HRP
Im mikrofluidischen Chip wird zunächst das Substrat Amplex Red (5 mM in DMSO) mit dem 99 fachen Volumen einer Enzymlösung (0,1 M Tris/HCI, pH 7,4; 0,2 U/ml Uricase; 0,2 U/ml HRP) gemischt und in eine Stufe 1 des mikrofluidischen, mikrochemomechanischen Systems eingebracht. Die entstandene Reaktionslösung wird anschließend über den zweiten Kanal 4 in den zweiten Reservoirraum eingebracht, während der erste Reservoirraum 9 mit dem gleichen Volumen der zu untersuchenden Probe (enthält 0 - 100 μΜ Harnsäure) über den ersten Kanal 3 gefüllt wird. Die lösliche Membran 7e, die beide Reservoirräume 9,10 voneinander trennt, löst sich infolge des Flüssigkeitskontakts auf, wodurch die Reaktionskammer 6 ausgebildet wird und die Reaktionspartner vermischt werden. Bei einer Reaktionstemperatur von 37°C finden nun die enzymatischen Umsetzungen statt. Nach 5 min Reaktionszeit kann nach Anregung mit Licht (530 nm) eine Fluoreszenz bei 590 nm detektiert werden. Die Konzentration kann über eine entsprechende Kalibrierung aus der Intensität der Fluoreszenz berechnet werden.
In einem weiteren Ausführungsbeispiel wird ein Proteinnachweis mit ortho-Phthalaldehyd (OPA) beschrieben. Hierbei wird das Protein mit dem Nachweisreagenz OPA unter Beteiligung einer thiolhaltigen Komponente, wie beispielsweise -Mercaptoethanol, umgesetzt. Dabei entsteht ein Fluorophor, welches leicht nachgewiesen werden kann. orf/70-Phthalaldehyd + Protein + -Mercaptoethanol— > Fluorophor
Figure imgf000020_0001
o-phthaldialdehyde fluorophor
Zur Durchführung des Verfahrens in dem mikrofluidischen Chip werden 100 μ\ der
Nachweisreagenz (6 g/ml OPA; 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,4; 0,05 Vol% ß-
Mercaptoethanol) in den ersten Reservoirraum 9 gefüllt, während 100 μΙ der zu untersuchenden Probe, wie z.B. ein 5-fach verdünntes Serum, in den anderen Reservoirraum 10 geleitet wird. Beide Reservoirräume 9,10 weisen dabei das gleiche Volumen auf. Sobald sich die lösliche Membran 7e zwischen den beiden Reservoirräumen 9,10 infolge des Flüssigkeitskontakts aufgelöst hat und sich die Komponenten vermischt haben, kommt es zur Reaktion. Nach 2-3 Minuten kann das resultierende Signal aus der Reaktionskammer 6 ausgelesen werden. Dazu wird Licht mit einer Wellenlänge von 340 nm eingestrahlt und die ausgestrahlte Fluoreszenz bei 455 nm detektiert (JW. Viets, WM. Deen, JL. Troy and BM. Brenner, Analytical Biochemistry 88, 513-521 (1978). Zur Detektion wurde ein Microplate Reader Infinite M200 (TECAN Group Ltd., Schweiz) eingesetzt.
Die Fig. 8a und 8b zeigen den zeitabhängigen Verlauf der detektierten Fluoreszenzintensität von vier Proben bei einer Wellenlänge von 455 nm. Die entsprechende Proteinkonzentration (Fig. 8a) kann dabei aus einer Kalibriergeraden (Fig. 8b) auf Basis von BSA als Refernzprotein ermittelt werden.
In einem Ausführungsbeispiel (Fig. 9a und 9b) wird der Nachweis von Myoglobin in Blut beschrieben. Dabei werden Antikörper in der Reaktionskammer 6 immobilisiert. Danach wird die Probe in die mit einem Antikörper (Anti-Myoglobin) beschichtete Reaktionskammer 6 eingebracht und 1 Stunde bei RT (Raumtemperatur) inkubiert. Anschließend wird mit einer Waschlösung (137 mM Natriumchlorid, 2,7 mM Kaliumchlorid, 12 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, 0,05 % Tween 20) gewaschen. Danach wird die Antikörperlösung (Anti-myoglobin-HRP oder Anti-Myoglobin-GFP) zugegeben und 1 Stunde bei RT inkubiert. Anschließend wird wieder mit der Waschlösung gewaschen. Schließlich kann das Signal direkt ausgelesen werden (GFP 475/530 nm) oder es muss nun die Reaktionslösung (0,1 M Tris/HCI, pH7,5, 10 μΜ H202, 50 μΜ Amplex Red) zugegeben werden, um das entstehende Signal auszulesen (Amplex Red Ex: 530 nm Em: 590 nm). Die Zuführung der Waschlösung kann dabei über den ersten oder zweiten Kanal 3,4 erfolgen.
Zur Durchführung des Nachweises von Human Serum Albumin (HSA) in dem mikrofluidischen Chip werden 100 μΙ der Nachweisreagenz (2 μΜ ECR-Lösung; 0,02% (m/v) PVA; 20 mM Natriumacetatpuffer; PH 4,6) in den ersten Reservoirraum 9 gefüllt, während 100 μΙ der zu untersuchenden Serumprobe (1 :100 verdünnt) in den anderen Reservoirraum 10 geleitet wird. Beide Reservoirräume 9,10 weisen dabei das gleiche Volumen auf. Sobald sich die lösliche Membran 7e zwischen den beiden Reservoirräumen 9,10 infolge des Flüssigkeitskontakts aufgelöst hat und sich die Komponenten vermischt haben, kommt es zur Reaktion. Nach einer Inkubation von 10 Minuten kann das resultierende Signal aus der Reaktionskammer 6 ausgelesen werden. Dazu wird Licht mit einer Wellenlänge von 308 nm eingestrahlt und die ausgestrahlte Fluoreszenz bei 423 nm detektiert (Yun-Xiang Ci* and Lie Chen , Analyst (1988), Vol 1 13, pp. 679). Zur Detektion wurde ein Microplate Reader Infinite M200 (TECAN Group Ltd., Schweiz) eingesetzt.
Die Fig. 9a zeigt den zeitabhängigen Verlauf der detektierten Fluoreszenzintensität von einer Dreifachbestimmung einer HSA-Probe (0,3 mg/ml) bei einer Wellenlänge von 423 nm. Die Reaktion erreicht nach ca. 15 Minuten ein stabiles Intensitätsmaximum bei ca. 1500. Die entsprechende Proteinkonzentration kann dabei aus einer Kalibriergeraden auf Basis von BSA als Refernzprotein ermittelt werden. Die Fig. 9a zeigt die ermittelte Fluoreszenzintensität im Falle des Nachweises von HSA als Dreifachbestimmung bei 423 nm nach Mischung mit einem Nachweisreagenz über die Zeit (gain: 178). Die entsprechende Proteinkonzentration der Probe kann über eine Kalibriergerade (Fig. 9b) ermittelt werden (gain: 100).
In einem weiteren Ausführungsbeispiel der Erfindung wird ein Proteinnachweis am Beispiel von Rinderserumalbumin (BSA) mit Fluorescamin beschrieben.
Fluorescamin reagiert mit Aminosäuren zu Pyrolinonderivaten, die bei einer Wellenlänge von 395 nm angeregt werden können, wobei ein Fluoreszenzmaximum bei 470 nm detektiert werden kann.
Figure imgf000022_0001
Fluorescamin F luprescamin-Addokt
(farblos) (starK Fluoreszierend)
Zur Durchführung des Proteinnachweises mit Fluorescamin in dem mikrofluidischen Chip werden 40 μΙ Fluorescamin in DMSO in 100 μΙ Borsäurepuffer (0,05 M; pH 9,5) in den ersten Reservoirraum 9 gefüllt, während 10 μΙ der zu untersuchenden Serumprobe (1 :100 verdünnt) in den anderen Reservoirraum 10 geleitet wird. Beide Reservoirräume 9,10 weisen dabei ein unterschiedliches Volumen auf. Sobald sich die lösliche Membran 7e zwischen den beiden Reservoirräumen 9,10 infolge des Flüssigkeitskontakts aufgelöst hat und sich die Komponenten vermischt haben, kommt es zur Reaktion. Nach einer Inkubation von 2 bis 3 Minuten kann das Signal aus der Reaktionskammer 6 ausgelesen werden. Dazu wird Licht mit einer Wellenlänge von 395 nm eingestrahlt und die ausgestrahlte Fluoreszenz bei 470 nm detektiert. Zur Detektion wurde ein Microplate Reader Infinite M200 (TECAN Group Ltd., Schweiz) eingesetzt. Die Fig. 10 zeigt die ermittelte konzentrationsabhängige Fluoreszenzintensität von einer Dreifachbestimmung einer BSA-Probe bei einer Anregungswellenlänge von 395 nm. Die Fluoreszenzintensität steigt mit steigender Konzentration an BSA an. Der Nachweis von Rinderserumalbumin (BSA) erfolgt dabei als Dreifachbestimmung bei 470 nm nach Mischung mit Fluorescamin (gain: 80).
Bezugszeichenliste
1 Stufe eines mikrofluidischen, mikrochemomechanischen Systems
2 Strukturträger
2a Abdeckung/oberer Strukturträger
2b unterer Strukturträger
2c mittlerer Strukturträger
3 erster Kanal
4 zweiter Kanal
5 Überlagerungsbereich
6 Reaktionskammer
7 aktives Element
7a Schließelement
7b Öffnerelement
7c Schließelement
7d Öffnerelement
7e aktive Membran
7f aktives wirk- oder andere Stoffe abgebendes Element
8 Bypass
9 erster Reservoirraum
10 zweiter Reservoirraum
1 1 Depot
12 Zirkulationskanal
13 erste Flüssigkeit
14 zweite Flüssigkeit
15 Zeilenkanal 1
16 Zeilenkanal 2
17 Spaltenkanal 1
18 Spaltenkanal 2
19 dritter Reservoirraum
20 Spaltenkanal 3
21 Spaltenkanal 4

Claims

Patentansprüche
1 . Mikrofluidisches mikrochemomechanisches System mit integrierten aktiven Elementen (7), welche hilfsenergiefrei durch beeinflussbare Umgebungsgrößen aktivierbar und durch die Änderung ihres Quellungszustandes oder ihrer mechanischen Eigenschaften aktive Funktionen bewirkend, ausgeführt sind, umfassend
- zumindest einen Strukturträger (2) mit zumindest einem ersten Kanal (3),
- eine Abdeckung (2a), welche den Strukturträger (2) zumindest teilweise abdeckt und
- zumindest einen zweiten Kanal (4), wobei der zweite Kanal (4) auf dem Strukturträger (2) oder der Abdeckung (2a) angeordnet ist, wobei die Kanäle (3,4) jeweils durch aktive Elemente (7) begrenzte Reservoirräume (9,10,19) ausbilden, die so angeordnet sind, dass sie zueinander mindestens einen Überlagerungsbereich (5) aufweisen und zusammen eine Reaktionskammer (6) bilden.
2. Mikrofluidisches mikromechanisches System nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass im Überlagerungsbereich (5) des ersten und zweiten Kanals (3,4) eine Membran (7e) zwischen dem ersten und zweiten Kanal (3,4) angeordnet ist, wodurch die Reaktionskammer (6) in einen ersten Reservoirraum (9) und in einen zweiten Reservoirraum (10) unterteilt wird.
3. Mikrofluidisches mikromechanisches System nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass weitere Kanäle (16,18,21 ) vorgesehen sind, wobei in den Überlagerungsbereichen (5) von mehr als zwei Kanälen (16,18,21 ) Membranen (7e) zwischen den zu den Kanälen (16,18,21 ) gehörenden Reservoirräumen (9,10,19) angeordnet sind, welche die Reaktionskammer (6) bilden.
4. Mikrofluidisches mikromechanisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass im Überlagerungsbereich (5) des ersten und zweiten Kanals (3,4) ein Öffnerelement (7b, 7d) zwischen dem ersten und zweiten Kanal (3,4) angeordnet ist, wodurch die Reaktionskammer (6) in einen ersten Reservoirraum (9) und in einen zweiten Reservoirraum (10) unterteilt wird.
5. Mikrofluidisches mikromechanisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Membranen (7e) bzw. die Öffnerelemente (7b, 7d) zwischen erstem, zweitem und gegebenenfalls weiteren Reservoirräumen (9,10,19) aus einem flüssigkeitslöslichen Material ausgeführt sind.
6. Mikrofluidisches mikromechanisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Reaktionskammer (6), umfassend mindestens einen ersten Reservoirraum (9) und einen zweiten, als Depot (1 1 ) fungierenden Reservoirraum, wobei im Depot (1 1 ) ein aktives Element (7f) angeordnet ist.
7. Mikrofluidisches mikromechanisches System nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das aktive Element (7f) im Bodenbereich des Depots (1 1 ) als Abgabesystem von Wirk- und/oder anderen Stoffen ausgeführt ist.
8. Mikrofluidisches mikromechanisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die aktiven Elemente (7) durch Flüssigkeitsgegenwart als Umgebungsgröße aktivierbar ausgeführt sind.
9. Mikrofluidisches mikromechanisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die aktiven Elemente (7) die zeitliche Abfolge sowie das Zeitverhalten der Durchmischung verschiedener Flüssigkeiten (13,14) festlegend ausgeführt sind.
10. Mikrofluidisches mikromechanisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die aktiven Elemente (7) als Quellmittelbarrieren oder flüssigkeitslösliche Barrieren ausgeführt sind.
1 1 . Mikrofluidisches mikromechanisches System nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die aktiven Elemente (7) aus Hydrogelen bestehen, die chemisch vernetzt und/oder physikalisch vernetzbar sind.
12. Mikrofluidisches mikromechanisches System nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die aktiven Elemente (7) aus Hydrogelen bestehen, welche ausgewählt sind aus einer Gruppe vernetzter Polymere, bevorzugt Polyacrylamide, Polyvinylalkohole, Polyacrylate, Hydroxycellulose, Polyvinylpyridine oder Polyglykole, wie Polyethylenglycol, Polypropylenglycol und deren Derivate.
13. Mikrofluidisches mikromechanisches System nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die aktiven Elemente (7) aus unvernetzten Polymeren, Salzen oder organischen Naturstoffen wie Sacchariden ausgeführt sind.
14. Verfahren zur mikrofluidischen Prozessführung in einem mikrofluidischen mikromechanischen System nach einem der Ansprüche 1 bis 13 umfassend die Schritte:
Einbringen einer ersten Flüssigkeit (13) in einen ersten Kanal (3) und in einen ersten Reservoirraum (9),
Einbringen einer zweiten Flüssigkeit (14) in einen zweiten Kanal (4) und in einen zweiten Reservoirraum (10),
Verschließen und separieren der Reservoirräume (9,10) durch aktive Elemente (7a), welche als Quellmittelbarriere ausgeführt sind, und damit verbunden das Quantifizieren der Flüssigkeitsvolumina (13,14) in den Reservoirräumen (9,10)
Zusammenschaltung der Reservoirräume (9,10) zur Reaktionskammer (6) durch Öffnen des aktiven Elements (7e) im Überlagerungsbereich (5) des ersten und zweiten Kanals (3,4), darauf folgend die Vermischung einer ersten und einer zweiten Flüssigkeit (13,14) in der Reaktionskammer (6), welche im Überlagerungsbereich (5) des ersten und zweiten Kanals (3,5) ausgebildet wird, wobei die zeitliche Abfolge der Vermischung der ersten und zweiten Flüssigkeit (13,14) in der Reaktionskammer (6) durch die Eigenschaften des aktiven Elements (7e) bestimmt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die zeitliche Abfolge der Vermischung der ersten und zweiten Flüssigkeit (13,14) in der Reaktionskammer (6) durch die aktiven Elemente (7), welche flüssigkeitslöslich oder als Quellmittelbarriere ausgeführt sind, bestimmt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14, weiterhin umfassend:
Auflösung einer flüssigkeitslöslichen Membran (7e), welche die Reaktionskammer (6) in einen ersten Reservoirraum (9) und in einen zweiten Reservoirraum (10) unterteilt, durch die erste und zweite Flüssigkeit (13,14) vor der Vermischung der ersten und zweiten Flüssigkeit (13,14).
17. Verwendung eines mikrofluidischen mikromechanischen Systems nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Durchführung von Prozessen auf Basis von Antigen- Antikörper-Reaktionen, Durchführung von Prozessen auf Basis der Kulturmethode, Kontrolle und/oder Detektion von Prozessen auf Basis einer Polymerasekettenreaktion und Detektion von Enzymaktivität eines biochemischen Prozesses.
PCT/EP2013/057631 2012-04-13 2013-04-11 Verfahren und vorrichtung zur gezielten prozessführung in einem mikrofluidik-prozessor mit integrierten aktiven elementen WO2013153181A1 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/387,315 US9272281B2 (en) 2012-04-13 2013-04-11 Method and device for targeted process control in a microfluidic processor having integrated active elements
EP13717014.8A EP2836302B8 (de) 2012-04-13 2013-04-11 Verfahren und vorrichtung zur gezielten prozessführung in einem mikrofluidik-prozessor mit integrierten aktiven elementen

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102012206042.1 2012-04-13
DE102012206042A DE102012206042B4 (de) 2012-04-13 2012-04-13 Verfahren und Vorrichtung zur gezielten Prozessführung in einem Mikrofluidik-Prozessor mit integrierten aktiven Elementen

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2013153181A1 true WO2013153181A1 (de) 2013-10-17

Family

ID=48139927

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2013/057631 WO2013153181A1 (de) 2012-04-13 2013-04-11 Verfahren und vorrichtung zur gezielten prozessführung in einem mikrofluidik-prozessor mit integrierten aktiven elementen

Country Status (4)

Country Link
US (1) US9272281B2 (de)
EP (1) EP2836302B8 (de)
DE (1) DE102012206042B4 (de)
WO (1) WO2013153181A1 (de)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10981166B2 (en) 2015-06-11 2021-04-20 Neofluidics Llc Manual or electronic pipette driven well plate for nano-liter droplet storage and methods of using same
DE102016124059B4 (de) 2016-07-25 2019-12-19 Leibniz-Institut Für Festkörper- Und Werkstoffforschung Dresden E.V. Vorrichtung für die mikrofluidik
WO2018200896A1 (en) 2017-04-28 2018-11-01 Neofluidics, Llc Fluidic devices with reaction wells and uses thereof
US11745181B2 (en) 2017-08-09 2023-09-05 Unchained Labs Devices and methods for bioassay
US11305279B2 (en) 2017-11-10 2022-04-19 Neofluidics, Llc Integrated fluidic circuit and device for droplet manipulation and methods thereof
US11998885B2 (en) 2018-10-26 2024-06-04 Unchained Labs Fluidic devices with reaction wells and constriction channels and uses thereof
DE102022125010A1 (de) 2022-09-28 2024-03-28 Leibniz-Institut für Festkörper- und Werkstoffforschung Dresden e.V. (IFW Dresden e.V.) Mikrofluidisches Bauteil

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060169339A1 (en) * 2005-02-02 2006-08-03 Oh Kwang-Wook Microvalve device and apparatus adopting the same
US20080069729A1 (en) * 2005-02-16 2008-03-20 Mcneely Michael R Liquid Valving Using Reactive or Responsive Materials
US20100240022A1 (en) * 2006-06-23 2010-09-23 Mcneely Michael R Reagent preparation and valving design for liquid testing
US20110126913A1 (en) * 2004-10-18 2011-06-02 Life Technologies Corporation Device Including A Dissolvable Structure For Flow Control

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990015929A1 (fr) 1989-06-14 1990-12-27 Westonbridge International Limited Micropompe perfectionnee
US5798215A (en) * 1993-02-18 1998-08-25 Biocircuits Corporation Device for use in analyte detection assays
US5659171A (en) 1993-09-22 1997-08-19 Northrop Grumman Corporation Micro-miniature diaphragm pump for the low pressure pumping of gases
AU705351B2 (en) * 1994-11-10 1999-05-20 Orchid Biosciences, Inc. Liquid distribution system
US6030580A (en) * 1997-10-31 2000-02-29 Enerfab, Inc. Method of aseptically transporting bulk quantities of sterile products
US6283718B1 (en) 1999-01-28 2001-09-04 John Hopkins University Bubble based micropump
JP3548858B2 (ja) 2001-01-22 2004-07-28 独立行政法人産業技術総合研究所 流量の制御方法及びそれに用いるマイクロバルブ
DE10157317A1 (de) 2001-11-23 2003-06-05 Gesim Ges Fuer Silizium Mikros Grundelement eines Mikrofluidik-Prozessors
DE10202996A1 (de) 2002-01-26 2003-08-14 Eppendorf Ag Piezoelektrisch steuerbare Mikrofluidaktorik
JP4784508B2 (ja) * 2004-05-07 2011-10-05 コニカミノルタエムジー株式会社 検査用マイクロリアクタおよび検査装置ならびに検査方法
DE102006051535A1 (de) 2006-10-27 2008-12-18 Andreas Dr. Richter Automatischer Mikrofluidik-Prozessor
EP2583039A2 (de) * 2010-06-15 2013-04-24 Carlsberg Breweries A/S Selbstkühlender behälter und kühlvorrichtung

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110126913A1 (en) * 2004-10-18 2011-06-02 Life Technologies Corporation Device Including A Dissolvable Structure For Flow Control
US20060169339A1 (en) * 2005-02-02 2006-08-03 Oh Kwang-Wook Microvalve device and apparatus adopting the same
US20080069729A1 (en) * 2005-02-16 2008-03-20 Mcneely Michael R Liquid Valving Using Reactive or Responsive Materials
US20100240022A1 (en) * 2006-06-23 2010-09-23 Mcneely Michael R Reagent preparation and valving design for liquid testing

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONGSHIN KIM ET AL: "Hydrogel-based reconfigurable components for microfluidic devices", LAB ON A CHIP, vol. 7, no. 2, 1 February 2007 (2007-02-01), pages 193 - 198, XP055069263, ISSN: 1473-0197, DOI: 10.1039/b612995a *
GORKIN R ET AL: "Rotationally controlled centrifugo-pneumatic valving utilizing dissolvable films", 2011 16TH INTERNATIONAL SOLID-STATE SENSORS, ACTUATORS AND MICROSYSTEMS CONFERENCE (TRANSDUCERS 2011) : BEIJING, CHINA, 5 - 9 JUNE 2011, IEEE, PISCATAWAY, NJ, 5 June 2011 (2011-06-05), pages 1276 - 1279, XP031910787, ISBN: 978-1-4577-0157-3, [retrieved on 20110801], DOI: 10.1109/TRANSDUCERS.2011.5969448 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20150044688A1 (en) 2015-02-12
DE102012206042B4 (de) 2013-11-07
EP2836302B1 (de) 2021-12-08
EP2836302B8 (de) 2022-01-12
US9272281B2 (en) 2016-03-01
DE102012206042A1 (de) 2013-10-31
EP2836302A1 (de) 2015-02-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2836302B1 (de) Verfahren und vorrichtung zur gezielten prozessführung in einem mikrofluidik-prozessor mit integrierten aktiven elementen
EP1846160B1 (de) Neuartige mikrofluidische probenträger
DE60029582T2 (de) Patrone zum durchführen einer chemischen reaktion
EP1807208B1 (de) Anordnung zur integrierten und automatisierten dna- oder protein-analyse in einer einmal verwendbaren cartridge, herstellungsverfahren für eine solche cartridge und betriebsverfahren der dna- oder protein-analyse unter verwendung einer solchen cartridge
DE69009510T2 (de) Küvette für eine Polymerase-Reaktion und ihre Verwendung.
DE60035199T2 (de) Analysenkassette und flüssigkeitsförderkontroller
DE112007003160B4 (de) Automatischer Mikrofluidik-Prozessor
DE102007044889B4 (de) Diagnosetestsystem
EP1566215A2 (de) Mikrostrukturierte Plattform und Verfahren zum Handhaben einer Flüssigkeit
DE102005054923B3 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Aufbereitung einer Probe
EP2435741B1 (de) Ventil für lab-on-a-chip-systeme
JP2002505439A (ja) 経路に沿って流体の流量を変更させるための流量変更装置および流量変更方法
DE112018007590B3 (de) Anwendungsspezifisch ausgestaltbare mikrofluidik-einheit mit programmierbaren mikrofluidik-knoten
DE602004008077T2 (de) Elektrisch angetriebenes ventil mit einer mikroporösen membran
WO2015158818A1 (de) Mikrofluidik-modul und kassette für die immunologische und molekulare diagnostik in einem analyseautomaten
DE102007019695A1 (de) Küvette für die optische Analyse kleiner Volumina
DE19545130A1 (de) Verfahren und Vorrichtungen für ein modulares Mikrosystem für hochgenaue chemische Schnell-Analysen und Verfahren zur Herstellung
DE102006020716B4 (de) Mikrofluidik-Prozessor
DE102005049976A1 (de) Anordnung zur integrierten und automatisierten DNA- oder Protein-Analyse in einer einmal verwendbaren Cartridge, Herstellungsverfahren für eine solche Cartridge und Betriebsverfahren der DNA- oder Protein-Analyse unter Verwendung einer solchen Cartridge
EP2525225B1 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Untersuchung der Differenzierung von Zellen
EP2745936B1 (de) Fluidiksystem mit saugfähigem Material und schaltbarem Polymergel
DE102007009806A1 (de) Flüssigkeitshandhabungssystem
EP1510254A2 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung von Analyten in einer Flüssigkeit
Biswas Automatic processing of solutions for integrated microfluidic biosensing devices
DE202018006869U1 (de) Mikrofluidisches System für die digitale Polymerasekettenreaktion (dPCR) einer biologischen Probe

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13717014

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14387315

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2013717014

Country of ref document: EP