WO2012136400A1 - Verfahren, loc und analysevorrichtung zur lyse von zellen und pcr-amplifikation - Google Patents

Verfahren, loc und analysevorrichtung zur lyse von zellen und pcr-amplifikation Download PDF

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WO2012136400A1
WO2012136400A1 PCT/EP2012/052072 EP2012052072W WO2012136400A1 WO 2012136400 A1 WO2012136400 A1 WO 2012136400A1 EP 2012052072 W EP2012052072 W EP 2012052072W WO 2012136400 A1 WO2012136400 A1 WO 2012136400A1
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pcr
loc
lysis
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PCT/EP2012/052072
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Peter Rothacher
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Robert Bosch Gmbh
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    • B01L2300/0861—Configuration of multiple channels and/or chambers in a single devices
    • B01L2300/0877—Flow chambers

Definitions

  • the invention relates to a method, a LOC (Lab-on-a-Chip) and an analysis device for lysing cells and PCR amplification of the DNA of the cells.
  • LOC Lab-on-a-Chip
  • MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
  • pneumonia Sepsis
  • tuberculosis and fluoroquinolone resistance in Escherichia coli
  • PCR polymerase chain reaction
  • a temperature-stable DNA polymerase is added to the DNA to be amplified and a temperature cycle consisting of denaturation, i. Splitting DNA into single strands, at about 95 ° C;
  • the DNA-containing material is purified before the PCR, following an assay procedure protocol.
  • Gram-negative cells the PCR works even if cell material is used directly after a prolonged first high-temperature step without purification, as at temperatures near the boiling point the cells are destroyed and DNA is released.
  • this does not work with Gram-positive cells, which is a particular
  • a photolysis with a laser is described in EP 4342914 A1.
  • a cell-containing solution is first placed on a metal oxide carrier, wherein the metal oxide binds cells.
  • the metal oxide is irradiated with the laser, destroying the cell walls and releasing DNA. Subsequently, unbound cell components are washed out in a purification step.
  • the LOC and the analysis device can be compared with the prior art little effort cells, in particular
  • Lysing bacteria, fungi, viruses, blood cells and cell aggregates in a filter without enzymes is possibly also possible while avoiding purification after lysis.
  • the invention is easily transferred to the current biochemical assay and provides a fully integrated LOC.
  • the invention also makes it possible to amplify Gram-positive bacteria or other cells which are difficult to lyse, such as fungi or spores, which makes possible a platform with applications for urinary tract infections, MRSA, pneumonia, sepsis, mycoses, etc.
  • a laser scanner for scanning a sample can be conveniently realized with a micromirror in a very small construction and allows a compact analyzer.
  • the laser lysis can be realized compactly with standardized components for optics, scanners and lasers with a considerably lower outlay than lysis devices according to the prior art.
  • the invention makes possible an LOC as ⁇ (Micro Total Analysis System), since the sequence of the processing and amplification steps before detection is simplified compared to the prior art and a transferable into a biochip,
  • Fig. 1 shows a schematic representation of an LOC in an analysis apparatus for lysis of cells and PCR amplification, both according to one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 shows a schematic representation of an LOC in an analysis device for lysis of cells and PCR amplification, both in each case according to another
  • FIG. 3 shows a flowchart of the method for lysis of cells and PCR amplification according to an embodiment of the present invention without
  • FIG. 4 shows a flow chart of the method for lysis of cells and PCR amplification according to another embodiment of the present invention with purification step.
  • Fig. 1 shows an LOC 10 in a cell lysis and PCR amplification analyzer 30, both in accordance with an embodiment of the present invention for DNA evaluation with an array 18.
  • the LOC 10 has a rigid, flat substrate 1 1 fluidic network 12 in the substrate 1 1 on.
  • To the fluidic network 12 include microchannels 13 shown by way of example, valves 14 and chamber 15, and a multi-function chamber 19 with a filter 16, in which inter alia, a PCR takes place, and an array chamber 17 with the array 18.
  • the filter 16 contains here as a filter medium, a silica Pad and is a first external temperature control 43 under the substrate 1 1 tempered.
  • the filter 16 fills a flow-through cross section of the
  • Multifunction chamber 19 fully off.
  • the array chamber 17 is via a second
  • Elements of the fluidic network 12 can also run in the interior of the LOC 10 and are liquid-tight at the top with a membrane or film, not shown.
  • the actuators for the operation of the fluidic network 12 and a fluidic interface to the analyzer 30 are not shown.
  • the analyzer 30 includes a photolysis light source 31 for irradiating the filter 16 and a controller 32 for performing lysis by irradiating the filter.
  • the photolysis light source 31 in this embodiment has a laser 33, a beam expander 34, a micromirror 35 and a lens 36.
  • a light beam 37 leaving the laser 33 passes over the beam expander 34 to the micromirror 35 and is deflected there and continues to pass through the lens 36 to the filter 16.
  • the micromirror 35 is a controllable micromirror with which the laser light beam 37 can focus the filter 16 and scan in a raster shape according to the beam diameter.
  • the analyzer 30 further includes a camera 39 and an array illumination lightwave 40, each directed to the array 18.
  • the controller 32 is connected via electrical control lines 38 to the laser 33, the
  • Micro-mirror 35 the camera 39, the array illumination lightwave 40, the micromirror 35 and the tempering elements 43 and 44 connected.
  • the analysis device 30 further has a mechanical interface (not shown) with the LOC 10 with which the LOC 10 is positioned in the analysis device 30 in a defined manner. Due to the defined positioning of the filter 16 and the array 18 in the LOC, LOCs are interchangeable in the analyzer 30 without re-optical adjustment.
  • the photolysis light source 31 is directed to the position of the filter 16 and the camera 39 is directed to the position of the array 18, here in the array chamber 17.
  • the filter 16 is arranged above the first external tempering element 43, and the array chamber 17 is arranged above the second tempering 44.
  • tempering Peltier elements micro-hotplates or convective heating / cooling elements, optionally electrical resistors, can also be used in combination.
  • the mechanical interface allows a suitable heat transfer.
  • the controller 32 controls the flow of the assay protocol on the LOC 10.
  • the fluidic network 12 is controlled via the fluidic interface. Temperatures and temperature changes are controlled by the temperature control elements 43 and 44.
  • the detection is carried out with an array / biochip and by means of the fluorescence exciting an array illumination light wave 40 and the fluorescent light
  • the LOC 10 for lysis of cells and PCR amplification has a common, a
  • Filter 16 having multi-function chamber 19 for cell accumulation, staining of the cells, cell lysis and PCR.
  • FIG. 2 shows an LOC 46 in an analysis device 47 for lysing cells and PCR amplification, both in each case according to a further embodiment of the present invention for DNA evaluation.
  • the elements known from Fig. 1 again have the same reference numerals.
  • the detection takes place by means of real-time PCR in the same chamber as the lysis, in the multi-function chamber 19.
  • the fluorescent dyes used in real-time PCR by means of a
  • Fluorescence radiation possibly at different wavelengths observed.
  • an array chamber is not required.
  • FIG. 3 shows a flowchart 50 of the method for lysis of cells and PCR amplification of the DNA of the cells according to an embodiment of the present invention
  • the method comprises the method steps:
  • the DNA of the cells is present in sufficient quantity for DNA examinations.
  • the method is suitable for Gram-negative and Gram-positive cells.
  • g) Analysis of the amplified DNA This relates to the analysis by means of an array, corresponding to a device such as shown in Fig. 1.
  • method steps f) and g) and method step e) in this case real-time PCR, are omitted directly in the multifunctional chamber 19 in FIG. 2 instead of.
  • the individual process steps are followed by further explanations, optionally with reference to the analysis device 30 and the LOC 10 from FIG. 1 or 2.
  • a cell-containing liquid usually body fluid such as urine, sputum, is placed on the filter for positioning the cells. Serum, plasma, smears, BAL (bronchoalveolar lavage), etc.
  • a dye solution about 50 ⁇ , is added to the filter and incubated for about 30 s. It is then washed, e.g. first with 200 ⁇ ethanol and then with 200 ⁇ water.
  • dyeing agents can be used:
  • Periodic acid-Schiff reaction Fuchsinschwefelige acid for mushrooms, brilliant green, methyl green, ethyl green, brilliant blue, Coomassie purple, etc.
  • These dyes have an ammonium group, typically in a quinoid system with other alkyl / arylamino groups.
  • the dyes can also be stored as solids in depots on the LOC 10, for example lyophilized, and washed with water into the filter 16. The stained bacteria can be lysed with light of comparatively low intensities.
  • the filter is filled with the PCR treatment solution, the so-called master mix.
  • This PCR treatment solution consists of a mixture of DNTPs (deoxynucleotide triphosphates), primers, polymerase and buffer. Further, in the mixture, a substance for blocking the filter surface is contained, e.g. BSA (bovine serum albumin), PEG (polyethylene glycol), PPG
  • the photolysis of the cells in process step d) is preferably carried out by means of laser lysis. During photolysis, the DNA of the cells is released.
  • the stained cells are irradiated with a commercially available laser.
  • the laser beam is preferably focused and guided with a micromirror on the filter, wherein as far as possible the entire filter surface is swept over completely with the laser beam.
  • the filter can also be irradiated with high-energy LEDs, flash lamps or focused light sources with high energy density.
  • the decisive factor is that the bacteria absorb as much light as possible, whereas the matrix and the surrounding liquid should absorb as little energy as possible. This is achieved by having the light used for photolysis substantially in a wavelength range which is strongly absorbed by the colored cells but weakly absorbed by water.
  • the color of the stained cells is determined by the dye, but may be different from the color of the dye.
  • the wavelength or wavelengths of the photolysis light are matched to the color of the stained cells, so that the absorption coefficient of the stained cell is a multiple of the absorption coefficient of a fluid or a stationary phase of a buffer medium present around the cells, usually water.
  • a multiple may be, for example, at least the factor 2.5, for example 10.
  • a high energy intake of the fluid or the stationary phase would result in a strong, poorly controlled increase in temperature, which leads to
  • the photolysis light source advantageously has a Wavelength in the visible region which is complementary to the color of the stained cells is, for example, 532 nm in the case of red staining of the cells with methylene blue, so that the absorption by the stained bacteria is as high as possible.
  • the content of the filter 16 is pumped into the array chamber 17, in which then the hybridization and detection takes place.
  • the filter is subjected to the usual thermal cycles for the PCR. At these temperature cycles, the DNA is amplified as described above. Now the DNA of the cells is in sufficient quantity for DNA examinations.
  • the method is suitable for Gram-negative and Gram-positive cells.
  • the DNA can be eluted from the filter element. Thus, for example, from 10 ml of urine with 10 5 cells after 20 cycles, 10 11 DNA molecules are isolated in 50 ⁇ l.
  • other amplifications, including isotherms, are also possible, for example NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification).
  • the hybridization buffer can be
  • Buffer system and a salt to increase a salt concentration include.
  • the method according to the invention can be easily transferred both to the filter PCR and to a fully integrated LOC.
  • Fig. 4 shows a flow chart 60 of the method for lysis of cells and PCR amplification of the DNA of the cells according to an embodiment of the present invention with a purification step.
  • the method comprises the steps of: a) positioning the cells on a filter;
  • the DNA of the cells is present in sufficient quantity for DNA examinations.
  • the method is suitable for Gram-negative and Gram-positive cells.
  • the analysis includes hybridization and detection.
  • the method steps of the same name correspond to the method steps known from the description of FIG. 3, taking into account the following differences.
  • the DNA of the cells is then purified in process step d1). This purification can be accomplished by one or more washes in which cell components other than DNA are removed. Because of the liquid exchange associated with the cleaning, the PCR treatment solution is added only after the purification - process step c) thus takes place after process step d1).

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Abstract

Ein LOC (Lab-on-a-Chip) (10) zur Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation ist mit einem Substrat (11), einem fluidischen Netzwerk (12) in dem Substrat (11), einem extern temperierbaren Filter (16) auf dem Substrat (11), einer extern temperierbaren PCR-Kammer (17) auf dem Substrat (11), und optional einem Array (18) auf dem Substrat (11) ausgestattet, wobei der Filter (16), die PCR-Kammer (17) und das Array (43) mit dem fluidischen Netzwerk (12) verbunden sind. Ein Verfahren der Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation hat die Verfahrensschritte a) Positionierung der Zellen auf einem Filter (16); b) Färbung der Zellen; c) Zugeben einer PCR-Behandlungs-Lösung; d) Photolyse der Zellen; und e) Amplifikation von DNA der Zellen mittels PCR; wobei Verfahrensschritte a) und b) sowie c) und d) jeweils in beliebiger Reihenfolge erfolgen können.

Description

Beschreibung Titel
Verfahren, LOC und Analysevorrichtung zur Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation
Stand der Technik
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, ein LOC (Lab-on-a-Chip) und eine Analysevorrichtung zur Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation der DNA der Zellen.
In der Diagnostik von Infektionskrankheiten gewinnt der Nachweis von Antibiotika- Resistenzen aufgrund zunehmender Verbreitung dieser Resistenzen eine immer größere Bedeutung. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Lungenentzündung (Pneumonie), Sepsis, Tuberkulose, und Fluorchinolonresistenz bei Escherichia coli seien als einige Beispiele genannt. In der herkömmlichen Diagnostik werden diese Resistenzen meist zellkulturbasiert ermittelt. Die zellkulturbasierte Resistenzbestimmung ist jedoch ein relativ langwieriges Verfahren, da für die Kultur und Auswertung 2-3 Tage angesetzt werden müssen. Mittels DNA-Analyse der Bakterien-DNA lassen sich Resistenzen deutlich schneller bestimmen. Dabei muss jedoch die DNA der Zellen amplifiziert, d.h. vermehrt werden. Die Polymerase-Chain-Reaction (PCR, Polymerase-Kettenreaktion) wurde Mitte der 80-er
Jahre entdeckt und wird für die DNA-Amplifizierung heute flächendeckend in Diagnostik, Forschung und Forensik eingesetzt. Dabei wird eine temperaturstabile DNA-Polymerase zu der zu amplifizierenden DNA zugegeben und ein Temperaturzyklus bestehend aus Denaturierung, d.h. Aufspaltung DNA in Einzelstränge, bei ca. 95 °C;
- Primeranlagerung bei ca. 55 °C; und
Elongation. d.h. Synthese der neuen DNA, bei ca. 72 °C;
mehrfach - bis zu 40 x - wiederholt, wobei sich bei jedem Zyklus die DNA-Menge verdoppelt. Für die Verzehnfachung der DNA-Menge sind also im Schnitt 3,3 Zyklen notwendig. Generell wird dazu das DNA-haltige Material vor der PCR aufgereinigt, wobei nach einem Assay-Ablauf-Protokoll vorgegangen wird. Bei Gram-negativen Zellen funktioniert die PCR auch wenn nach einem verlängerten ersten Hochtemperaturschritt direkt ohne Reinigung Zellmaterial eingesetzt wird, da bei Temperaturen nahe dem Siedepunkt die Zellen zerstört werden und DNA freigesetzt wird. Dies funktioniert jedoch nicht bei Gram-positiven Zellen, die eine besonders
widerstandsfähige Zellmembran besitzen. Gram-positive Bakterien sterben zwar bei dieser Erhitzung ab, die in ihnen enthaltene DNA kann jedoch die Bakterienhülle nicht verlassen und entsprechend nicht vervielfältigt werden.
Für die Lyse Gram-positiver Zellen werden derzeit verschiedene Verfahren eingesetzt, darunter Enzymatische Lyse, Ultraschall-Lyse und Elektroporation. Eine Photolyse mit einem Laser beschreibt die EP 4342914 A1. Dort wird zunächst eine Zellen enthaltende Lösung auf einen Metalloxid-Träger gegeben, wobei das Metalloxid Zellen bindet.
Anschließend wird das Metalloxid mit dem Laser bestrahlt, wobei die Zellwände zerstört und DNA frei gesetzt werden. Anschließend werden in einem Aufreinigungsschritt nicht gebundene Zellbestandteile ausgewaschen.
Offenbarung der Erfindung
Vorteile der Erfindung
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, dem LOC und der Analysevorrichtung lassen sich mit im Vergleich zum Stand der Technik geringem Aufwand Zellen, insbesondere
Bakterien, Pilze, Viren, Blutzellen und Zellverbände in einem Filter ohne Enzyme lysieren. Dies ist gegebenenfalls auch unter Vermeidung einer Aufreinigung nach der Lyse möglich.
Die Erfindung lässt sich einfach auf den aktuellen biochemischen Assay übertragen und schafft einen voll integrierten LOC. Die Erfindung ermöglicht es, auch Gram-positive Keime oder andere schwer lysierbare Zellen wie Pilze oder Sporen zu amplifizieren, was erst eine Plattform mit Applikationen für Harnwegsinfekte, MRSA, Pneumonie, Sepsis, Mycosen, usw. ermöglicht.
Ein Laser-Scanner zum Abscannen einer Probe kann günstig mit einem Mikrospiegel in sehr kleiner Bauweise realisiert werden und ermöglicht ein kompaktes Analysegerät. Die Laserlyse lässt sich mit standardisierten Bauelementen für Optik, Scanner und Laser kompakt realisieren mit einem wesentlich geringeren Aufwand als Lyseeinrichtungen nach dem Stand der Technik.
Gegenüber enzymatischen / chemischen Lysen ist die deutliche Vereinfachung des Assays ausschlaggebend.
Gegenüber Ultraschalllysen ist neben dem Aufwand für den Generator die einfachere Auslegung und Abstimmung des Chips entscheidend.
Die Erfindung ermöglicht ein LOC als μΤΑβ (Micro Total Analysis System), da der Ablauf der Aufarbeitungs- und Amplifizierungsschritte vor der Detektion gegenüber dem Stand der Technik vereinfacht ist und eine in einen Biochip übertragbare,
automatisierungsfähige Vereinfachung des Protokolls geschaffen worden ist.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung eines LOC in einer Analysevorrichtung zur Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation, beide jeweils gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung eines LOC in einer Analysevorrichtung zur Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation, beide jeweils gemäß einer weiteren
Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Fig. 3 zeigt ein Flussdiagramm des Verfahrens zur Lyse von Zellen und PCR- Amplifikation gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ohne
Reinigungsschritt.
Fig. 4 zeigt ein Flussdiagramm des Verfahrens zur Lyse von Zellen und PCR- Amplifikation gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mit Reinigungsschritt.
Ausführungsformen der Erfindung
Fig. 1 zeigt ein LOC 10 in einer Analysevorrichtung 30 zur Lyse von Zellen und PCR- Amplifikation, beide jeweils gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur DNA-Auswertung mit einem Array 18. Das LOC 10 weist ein steifes, flaches Substrat 1 1 mit einem fluidischen Netzwerk 12 in dem Substrat 1 1 auf. Zum fluidischen Netzwerk 12 gehören beispielhaft gezeigte Mikrokanäle 13, Ventile 14 und Kammer 15, sowie eine Multifunktionskammer 19 mit einem Filter 16, in der unter anderem eine PCR stattfindet, und eine Array-Kammer 17 mit dem Array 18. Der Filter 16 enthält hier als Filtermedium ein Silica-Pad und ist über ein erstes externes Temperierelement 43 unter dem Substrat 1 1 temperierbar. Der Filter 16 füllt einen durchströmten Querschnitt der
Multifunktionskammer 19 voll aus. Die Array-Kammer 17 ist über ein zweites
Temperierelement 44 unter dem Substrat 11 temperierbar. Elemente des fluidischen Netzwerks 12 können auch im Inneren des LOC 10 verlaufen und sind an der Oberseite mit einer nicht gezeigten Membran bzw. Folie flüssigkeitsdicht abgeschlossen. Die Betätigungselemente für den Betrieb des fluidischen Netzwerks 12 und eine fluidische Schnittstelle zur Analysevorrichtung 30 sind nicht dargestellt.
Die Analysevorrichtung 30 weist eine Photolyse-Lichtquelle 31 zur Bestrahlung des Filters 16 und eine Steuerung 32 zur Durchführung der Lyse mittels Bestrahlung des Filters auf. Die Photolyse-Lichtquelle 31 weist in dieser Ausführungsform einen Laser 33, einen Strahlaufweiter 34, einen Mikrospiegel 35 und eine Linse 36 auf. Ein den Laser 33 verlassender Lichtstrahl 37 verläuft über den Strahlaufweiter 34 zum Mikrospiegel 35 und wird dort umgelenkt und verläuft weiter über die Linse 36 zum Filter 16. In dieser
Ausführungsform ist der Mikrospiegel 35 ein steuerbarer Mikrospiegel, mit dem der Laser- Lichtstrahl 37 den Filter 16 fokussiert und entsprechend dem Strahldurchmesser rasterförmig überstreichen kann. Die Analysevorrichtung 30 weist weiterhin eine Kamera 39 und eine Array-Beleuchtungs-Lichtwelle 40 auf, die jeweils auf das Array 18 gerichtet sind. Die Steuerung 32 ist über elektrische Steuerleitungen 38 mit dem Laser 33, dem
Mikrospiegel 35, der Kamera 39, der Array-Beleuchtungs-Lichtwelle 40, dem Mikrospiegel 35 und den Temperierelementen 43 und 44 verbunden.
Die Analysevorrichtung 30 weist weiterhin eine nicht gezeigte mechanische Schnittstelle mit dem LOC 10 auf, mit der das LOC 10 in der Analysevorrichtung 30 definiert positioniert wird. Aufgrund der definierten Positionierung des Filters 16 und des Arrays 18 im LOC sind LOCs austauschbar in der Analysevorrichtung 30 ohne eine erneute optische Justierung einsetzbar. Die Photolyse-Lichtquelle 31 ist bei eingelegtem LOC 10 auf die Position des Filters 16 gerichtet und die Kamera 39 ist auf die Position des Array 18, hier in der Array-Kammer 17 angeordnet, gerichtet. Bei eingelegtem LOC 10 ist der Filter 16 über dem ersten externen Temperierelement 43 angeordnet, und die Array-Kammer 17 ist über dem zweiten Temperierelement 44 angeordnet. Als Temperierelemente können Peltierelemente, Micro-Hotplates oder konvektive Heiz-/Kühl- Elemente, gegebenenfalls elektrische Widerstände, auch in Kombination verwendet werden. Die mechanische Schnittstelle ermöglicht einen geeigneten Wärmeübergang.
5
Im Betrieb steuert die Steuerung 32 den Ablauf des Assay-Protokolls auf dem LOC 10. Das fluidische Netzwerk 12 wird über die fluidische Schnittstelle gesteuert. Temperaturen und Temperaturänderungen werden über die Temperierelemente 43 und 44 gesteuert. Die Detektion erfolgt mit einem Array- / Biochip und wird mittels der eine Fluoreszenz0 anregenden eine Array-Beleuchtungs-Lichtwelle 40 und der ein Fluoreszenzlicht
beobachtenden Kamera 39, alternativ einem weiteren (nicht gezeigten) Photometer überprüft. Die Auswertung einer DNA-Analyse erfolgt durch die Beobachtung, an welchen Positionen auf einem Array 18 eine Fluoreszenz statt findet, mit der Kamera 39. 5 Das LOC 10 zur Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation hat eine gemeinsame, einen
Filter 16 aufweisende, Multifunktionskammer 19 für Akkumulation von Zellen, Färbung der Zellen, Zellen-Lyse und PCR.
Fig. 2 zeigt ein LOC 46 in einer Analysevorrichtung 47 zur Lyse von Zellen und PCR- o Amplifikation, beide jeweils gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur DNA-Auswertung. Die aus Fig. 1 bekannten Elemente haben wieder dieselben Bezugsziffern. In dieser Ausführungsform erfolgt die Detektion mittels Real- Time-PCR in derselben Kammer wie die Lyse, in der Multifunktionskammer 19. Dazu werden die in der Real-Time-PCR eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe mittels einer
5 Lichtquelle 41 angeregt und mit einem Detektor 42 wird die resultierende
Fluoreszenzstrahlung, ggf. bei verschiedenen Wellenlängen, beobachtet. In dieser Ausführungsform ist eine Arraykammer nicht erforderlich.
Fig. 3 zeigt ein Flussdiagramm 50 des Verfahrens zur Lyse von Zellen und PCR- o Amplifikation der DNA der Zellen gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung. Das Verfahren weist die Verfahrensschritte auf:
a) Positionierung der Zellen auf einem Filter;
b) Färbung der Zellen;
c) Zugeben einer PCR-Behandlungs-Lösung;
5 d) Photolyse der Zellen; und
e) Amplifikation von DNA der Zellen mittels PCR. Damit liegt die DNA der Zellen in hinreichender Menge für DNA-Untersuchungen vor. Das Verfahren ist für Gram-negative und Gram-positive Zellen geeignet.
Vorteilhaft folgt der weitere Verfahrenschritt
f) Mischung der amplifizierten DNA mit einem Hybridisation Buffer. Dies dient der Vorbereitung für den weiteren Verfahrenschritt
g) Analyse der amplifizierten DNA. Dies betrifft die Analyse mittels einem Array, entsprechend einer Vorrichtung wie zum Beispiel in Fig. 1 gezeigt. In einer alternativen Ausführungsform ohne Array, entsprechend einer Vorrichtung wie zum Beispiel in Fig. 2 gezeigt, entfallen Verfahrenschritte f) und g) und Verfahrenschritt e), in diesem Fall Real-Time-PCR, findet direkt in der Multifunktionskammer 19 in Fig. 2 statt. Zu den einzelnen Verfahrensschritten folgen weitere Erläuterungen, gegebenenfalls unter beispielhafter Bezugnahme auf die Analysevorrichtung 30 und das LOC 10 aus Fig. 1 oder 2. In Verfahrensschritt a) wird zur Positionierung der Zellen auf dem Filter eine zellhaltige Flüssigkeit, meist Körperflüssigkeit wie Urin, Sputum, Serum, Plasma, Abstriche, BAL (Broncheoalveoläre Lavage), etc. über ein Filtermedium, in Fig. 1 und 2 über das Silica-Faserpad des Filters 16, gepumpt. Dabei werden die Zellen abgeschieden und mit wenigen 100 μΙ Puffer gewaschen. Das Silica-Faserpad enthält Glasfasern mit Durchmesser d = 0,5 μηι -10 μηι.
Bezüglich der Reihenfolge der Verfahrensschritte a) und b) sind zwei alternative
Ausführungsformen möglich, nämlich die Zellen vor oder nach dem Aufbringen auf dem
Filter 16 zu färben.
Zur Färbung der Zellen in Verfahrensschritt b) wird eine Farbstofflösung, ca. 50 μΙ, auf den Filter gegeben und ca. 30 s inkubiert. Anschließend wird gewaschen, z.B. zuerst mit 200 μΙ Ethanol und danach mit 200 μΙ Wasser. Als Färbereagentien können verwendet werden:
1) Gram-Färbung - Kristallviolett-Lösung, waschen mit 200 μΙ Wasser, 2 min fixieren mit 50 μΙ Lugolscher Lösung (Lugol's Solution, Kl3 -Lösung);
2) Methylenblau-Lösung;
3) weitere Farbstoffe wie Malachitgrün, Safranin, Fuchsin (mit PAS-Reaktion,
Periodic acid-Schiff reaction), Fuchsinschwefelige Säure für Pilze, Brillant-Grün, Methyl- grün, Ethyl-Grün, Brillant-blau, Coomassie violett, etc.. Diese Farbstoffe weisen eine Ammoniumgruppe auf, typischerweise in einem Chinoiden System mit weiteren Alkyl- /Aryl-aminogruppen. Viele gehören zur Klasse der Triphenylmethan-Fabstoffe. Die Farbstoffe können auch als Feststoffe in Depots auf dem LOC 10, z.B. lyophilisiert, gelagert werden und mit Wasser in den Filter 16 geschwemmt werden. Die gefärbten Bakterien lassen sich mit Licht mit vergleichsweise geringen Intensitäten lysieren.
In Verfahrensschritt c) wird der Filter mit der PCR-Behandlungs-Lösung, dem so genannten Mastermix, befüllt. Diese PCR-Behandlungs-Lösung besteht aus einer Mischung aus DNTPs (deoxynucleotide triphosphate), Primern, Polymerase und Puffer. Ferner ist in der Mischung noch eine Substanz zur Blockierung der Filteroberfläche enthalten, z.B. BSA (Bovine serum albumin), PEG (Polyethylene glycol), PPG
(Polypropylene glycol). Es ist auch möglich, die erst in Verfahrensschritt e) benötigten Substanzen erst nach Verfahrensschritt d) zuzugeben.
Die Photolyse der Zellen in Verfahrensschritt d) erfolgt bevorzugt mittels Laserlyse. Bei der Photolyse wird die DNA der Zellen freigesetzt. Der Filter, auf dem sich die
angefärbten Zellen befinden, wird mit einem handelsüblichen Laser bestrahlt. Dabei wird vorzugsweise der Laserstrahl fokussiert und mit einem Mikrospiegel über den Filter geführt, wobei möglichst die gesamte Filterfläche lückenlos mit dem Laserstrahl überstrichen wird. Alternativ kann der Filter auch mit Hochenergie-LEDs, Blitzlampen oder fokussierten Lichtquellen mit hoher Energiedichte bestrahlt werden. Entscheidend ist dabei, dass die Bakterien möglichst viel Licht absorbieren, wohingegen die Matrix und die umgebende Flüssigkeit möglichst wenig Energie aufnehmen sollen. Dies wird erreicht, indem das zur Photolyse benutzte Licht im Wesentlichen in einem Wellenlängenbereich liegt, der von den gefärbten Zellen stark absorbiert wird, jedoch von Wasser schwach absorbiert wird. Die Farbe der gefärbten Zellen wird vom Farbstoff bestimmt, kann aber von der Farbe des Farbstoffs verschieden sein. Die Wellenlänge oder Wellenlängen des Photolyse-Lichts sind auf die Farbe der gefärbten Zellen abgestimmt, so dass der Absorptionskoeffizient der gefärbten Zelle ein Vielfaches des Absorptionskoeffizienten eines Fluids oder einer stationären Phase eines um die Zellen vorhanden Puffermediums, meist Wasser, beträgt. Ein Vielfaches kann beispielsweise mindestens der Faktor 2,5, zum Beispiel 10 sein. Eine hohe Energieaufnahme des Fluids oder der stationären Phase hätte eine starke schlecht kontrollierbare Temperaturerhöhung zur Folge, die zur
Inaktivierung der Polymerase, zum Verdampfen des flüssigen Mediums und zum Platzen der LOCs führen kann. Die Photolyse-Lichtquelle weist vorteilhafterweise eine Wellenlänge im sichtbaren Bereich, die komplementär zur Farbe der angefärbten Zellen ist auf, z.B. 532 nm bei Rotfärbung der Zellen mit Methylenblau, so dass die Absorption durch die gefärbten Bakterien möglichst hoch ist. Zwischen den Verfahrensschritten d) und e) findet in dieser Ausführungsform keine Aufreinigung statt. Die Verfahrensschritte a) bis d) finden alle im Filter 16 statt.
Anschließend wird der Inhalt des Filters 16 in die Array-Kammer 17 gepumpt, in der anschließend die Hybridisierung und Detektion stattfindet. Bei der PCR-Amplifikation der DNA in Verfahrensschritt e) wird der Filter den für die PCR üblichen thermischen Zyklen unterworfen. Bei diesen Temperaturzyklen wird die DNA wie bereits oben beschrieben vervielfältigt. Nun liegt die DNA der Zellen in hinreichender Menge für DNA-Untersuchungen vor. Das Verfahren ist für Gram-negative und Grampositive Zellen geeignet. Anschließend kann die DNA von dem Filterelement eluiert werden. So werden z.B. aus 10 ml Urin mit 105 Zellen nach 20 Zyklen 1011 DNA Moleküle in 50 μΙ isoliert. Alternativ kommen andere Amplifikationen, auch isotherme, ebenso in Frage, z.B. NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification).
Nach dem Zufügen eines so genannten Hybridisation Buffer in Verfahrensschritt f) und Aufbringen auf das DNA-Array 18 mittels des fluidischen Netzwerks 12 ist die DNA für die Detektion bzw. Analyse der amplifizierten DNA in Verfahrensschritt g), mittels DNA-Array, beispielsweise Array 18 in Fig. 1 , vorbereitet. Der Hybridisation Buffer kann ein
Puffersystem und ein Salz zur Erhöhung einer Salzkonzentration umfassen. Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich einfach sowohl auf die Filter-PCR als auch auf einen voll integrierten LOC übertragen.
Fig. 4 zeigt ein Flussdiagramm 60 des Verfahrens zur Lyse von Zellen und PCR- Amplifikation der DNA der Zellen gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mit einem Reinigungsschritt. Das Verfahren weist die Verfahrensschritte auf: a) Positionierung der Zellen auf einem Filter;
b) Färbung der Zellen;
d) Photolyse der Zellen;
d1) Reinigung von DNA der Zellen;
c) Zugeben einer PCR-Behandlungs-Lösung; und
e) Amplifikation der DNA der Zellen mittels PCR. Damit liegt die DNA der Zellen in hinreichender Menge für DNA-Untersuchungen vor. Das Verfahren ist für Gram-negative und Gram-positive Zellen geeignet.
Vorteilhaft folgt der weitere Verfahrenschritt
f) Mischung der amplifizierten DNA mit einem Hybridisation Buffer. Dies dient der Vorbereitung für den weiteren Verfahrenschritt
g) Analyse der amplifizierten DNA. Die Analyse umfasst die Hybridisierung und die Detektion.
In dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung entsprechen die gleichnamigen Verfahrensschritte den aus der Beschreibung von Fig. 3 bekannten Verfahrensschritten, unter Berücksichtigung der folgenden Unterschiede. Nach der Photolyse der Zellen in Verfahrensschritt d) erfolgt nun eine Reinigung von DNA der Zellen in Verfahrensschritt d1). Diese Reinigung kann durch einen oder mehrere Waschschritte erfolgen, in denen Zellbestandteile außer DNA entfernt werden. Wegen des mit der Reinigung einher gehenden Flüssigkeitsaustauschs wird die PCR-Behandlungs-Lösung erst nach der Reinigung zugegeben - Verfahrensschritt c) erfolgt also nach Verfahrensschritt d1).

Claims

Ansprüche
1. Verfahren der Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation mit den Verfahrensschritten a) Positionierung der Zellen in einer Kammer (19);
b) Färbung der Zellen;
c) Zugeben einer PCR-Behandlungs-Lösung;
d) Photolyse der Zellen; und
e) Amplifikation von DNA der Zellen mittels PCR;
wobei Verfahrensschritte a) und b) sowie c) und d) jeweils in beliebiger Reihenfolge erfolgen können.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch den weiteren Verfahrenschritt d1) Reinigung der DNA der Zellen nach Verfahrenschritt d).
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch den weiteren
Verfahrenschritt
f) Zuführung eines Hybridisation Buffer zu der amplifizierten DNA.
4. Verfahren nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch den weiteren Verfahrenschritt g) Analyse der amplifizierten DNA.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Verfahrensschritte a) bis d) in demselben Volumenelement eines Analysechips statt finden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen, Bakterien, insbesondere Gram-positive Bakterien, Pilze, Sporen oder Viren verwendet werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritt b) die Färbung der Zellen mit mindestens einem Farbstoff aus der Menge umfassend Kristallviolett-Lösung, Methylenblau-Lösung, und Farbstoffe, die mindestens eine Ammoniumgruppe und/oder eine Aminogruppe aufweisen.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritt c) die Behandlungs-Lösung eine Mischung aus DNTPs
(deoxynucleotide triphosphate), Primern, Polymerase und Puffer, sowie eine Substanz zur Blockierung der Filteroberfläche aufweist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass in Verfahrensschritt d) die Photolyse der Zellen mittels Laserstrahl, Hochenergie-LEDs, Blitzlampen oder Lichtquellen mit hoher Energiedichte erfolgt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das zur Photolyse benutzte Licht im Wesentlichen in einem Wellenlängenbereich liegt, der von den gefärbten Zellen stark absorbiert wird, jedoch von Wasser schwach absorbiert wird.
1 1. LOC (10, 46) zur Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation mit einer gemeinsamen Kammer (19), die einen Filter aufweist, für Akkumulation von Zellen, Färbung der Zellen,
Zellen-Lyse und PCR.
12. LOC nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das LOC (10) eine weitere Kammer (17) mit einem Array (18) aufweist.
13. Analysevorrichtung zur Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation für ein LOC mit einem Filter (16), wobei die Analysevorrichtung (30, 47) eine Photolyse-Lichtquelle (31) zur Bestrahlung des Filters (16) und eine Steuerung (38) zur Durchführung der Lyse mittels Bestrahlung des Filters (16) und der PCR-Amplifikation aufweist.
14. Analysevorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die
Analysevorrichtung (30, 47) eine Aufnahme für das LOC (10, 46) aufweist, so dass der Filter (16) an einer definierten Position auf der Analysevorrichtung (30, 47) angeordnet ist.
15. Analysevorrichtung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Analysevorrichtung (47) eine Analyse-Lichtquelle (41) zur Bestrahlung des Filters (16) und einen Detektor (42) zur Beobachtung des Filters für eine Real-Time-PCR aufweist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Wellenlängenbereich eines zur Photolyse benützten Lichts auf die Färbung der Zellen abgestimmt ist, dass ein Absorptionskoeffizient der gefärbten Zellen ein Vielfaches größer als ein Absorptionskoeffizient eines um die Zellen vorhandenen Puffermediums ist.
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