DE102017123919A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Lyse von Mikroorganismen - Google Patents

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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Lyse von Mikroorganismen (14), umfassend ein Bereitstellen der Mikroorganismen (14) und einer Mehrzahl von Nanopartikeln (16) in einer Reaktionslösung (12) derart, dass die Mikroorganismen (14) und/oder die Nanopartikel (16) in der Reaktionslösung (12) im Wesentlichen frei beweglich sind. Ferner umfasst das Verfahren ein Einstrahlen eines Lichtstrahls (18) von zeitlich kontinuierlichem Licht in die Reaktionslösung (12) derart, dass ein Teilvolumen der Reaktionslösung (12) von dem Lichtstrahl (18) erfasst wird. Zudem umfasst das Verfahren ein Bereitstellen einer gerichteten Relativbewegung des Lichtstrahls (18) und der Reaktionslösung (12) derart, dass zeitlich nacheinander mehrere unterschiedliche Teilvolumina der Reaktionslösung (12) von dem Lichtstrahl (18) erfasst werden. Dabei weisen die Nanopartikel (16) ein Absorptionsspektrum auf, welches zumindest teilweise mit dem Spektrum des eingestrahlten Lichtstrahls (18) überlappt, so dass die Nanopartikel (16) den eingestrahlten Lichtstrahl (18) zumindest teilweise absorbieren, wobei ein durch das Absorbieren hervorgerufenes Erhitzen zumindest eines Teils der Nanopartikel (16) die Mikroorgansimen (14) zumindest teilweise lysiert. Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zur Lyse von Mikroorganismen (14).

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Lyse bzw. zum Aufbrechen von Mikroorganismen, insbesondere von Zellen, Bakterien, mikroskopischen Lebewesen und/oder Viren. Die Erfindung liegt dabei insbesondere auf dem Gebiet der Extraktion einer Nukleinsäure aus Mikroorganismen. Insbesondere kann die Erfindung vorzugsweise dazu dienen, eine oder mehrere Nukleinsäuren von Mikroorganismen in einer Reaktionslösung freizusetzen und/oder zumindest soweit zugänglich zu machen, dass diese sodann mittels geeigneter Verfahren nachgewiesen werden kann bzw. können.
  • Stand der Technik
  • Um eine Nukleinsäure eines Mikroorganismus amplifizieren und/oder nachweisen zu können, muss diese häufig erst aus dem Mikroorganismus extrahiert werden bzw. von diesem freigesetzt werden. Dazu muss oftmals der Mikroorganismus zunächst lysiert werden, d.h. dass insbesondere eine gegebenenfalls vorhandene, schützende Membran und/oder Zellwand und/oder Virushülle und/oder Proteinhülle des Mikroorganismus aufgeschlossen und/oder aufgelöst und/oder aufgebrochen und/oder zumindest teilweise zerstört werden muss. Die Anforderungen an das Verfahren zur Lyse des Mikroorganismus können dabei für unterschiedliche Arten von Mikroorganismen variieren. Beispielsweise können sich die Anforderungen stark unterscheiden, wenn beispielsweise die Mikroorganismen als gramnegative Bakterien oder als grampositive Bakterien vorliegen, welche sich im Aufbau ihrer Zellmembran stark voneinander unterscheiden. Im Gegensatz zu gramnegativen Bakterien weisen grampositive beispielsweise eine dickere, mehrschichtige Zellwand aus Murein auf und sind daher häufig schwerer zu lysieren als gramnegative Bakterien.
  • Diverse Verfahren zum Aufschluss bzw. zur Lyse von Mikroorganismen sind aus dem Stand der Technik bekannt. Dabei gibt es unterschiedliche Methoden bzw. Verfahren, die sich in mechanische und nicht-mechanische Verfahren unterteilen lassen.
  • Es sind Verfahren zur Lyse von Mikroorganismen mittels eines mechanischen Einwirkens auf die Mikroorganismen bekannt, beispielsweise mittels stark beschleunigter Mikropartikel, was auch unter dem Namen „Bead Beating" bekannt ist und beispielsweise in der Veröffentlichung Hwang et al.: Lab on a Chip 11, 3649-3655 (2011) beschrieben ist. Derartige Verfahren weisen häufig den Nachteil auf, dass mechanische Erschütterungen auftreten können, welche beispielsweise Schäden an sensiblen Messgeräten für eine anschließende Detektion der freizusetzenden Nukleinsäuren hervorrufen können und/oder zu einer Verfälschung von Messergebnissen führen können. Auch haftet mechanischen Lyse-Verfahren oftmals der Nachteil an, dass die Nukleinsäure während des mechanischen Lyse-Verfahrens beschädigt und/oder zerstört werden kann, was eine Freisetzung der Nukleinsäuren in intaktem Zustand verhindern kann. Bei mechanischen Lyse-Verfahren zur Freisetzung von Nukleinsäuren werden häufig Kräfte genutzt, wie etwa Kavitation und/oder Scher- und/oder Normalkräfte, um Mikroorganismen bzw. eine schützende Membran um eine Nukleinsäure der jeweiligen Mikroorganismen mechanisch zu zerstören. Beispielsweise umfassen manche mechanische Lyse-Verfahren bzw. Lyse-Vorrichtungen die Verwendung von Ultraschall und/oder Druck, wie beispielsweise Vorrichtungen, die als French-Press oder als Hochdruckhomogenisator bekannt sind. Auch ein Vermahlen in Kugel- oder Perlmühlen, sowie der Gebrauch von Vibrationsmühlen, welche durch stark geschüttelte Glas-Beads Membrane bzw. Mikroorganismen zerstören können, sind weitere Beispiele für solche Verfahren.
  • Zu den nicht-mechanischen Aufschlussverfahren zählen insbesondere enzymatische, chemische und thermische Verfahren. In enzymatischen Verfahren werden häufig, je nach zu lysierendem Mikroorganismus, spezifische Enzyme verwendet, welche den Abbau von biologischen Strukturen, wie zum Beispiel der (Zell-) Membran und/oder der Virushülle des Mikroorganismus katalysieren bzw. begünstigen. Dies geschieht beispielsweise dadurch, dass die Enzyme die Aktivierungsenergie der biochemischen Reaktionen herabsetzen. Obwohl diese Methoden oftmals weniger schädigend für die Nukleinsäuren der Mikroorganismen sind als mechanische Verfahren, sind sie in der Regel an Heizschritte gekoppelt und benötigen meist mehrere Stunden, bis die Lyse erfolgreich abgeschlossen ist. Außerdem werden je nach Art der zu lysierenden Mikroorganismen spezifische, oftmals sehr teure, Enzyme benötigt, wodurch der Aufschluss häufig jeweils nur gezielt für eine Art von Mikroorganismen erfolgen kann und typischerweise nicht mehrere verschiedene Arten von Mikroorganismen simultan aufgeschlossen werden können.
  • Beispielsweise werden in chemischen Verfahren zur Lyse von Mikroorganismen häufig chemische Zusätze verwendet, welche eine Auflösung von Membranschichten begünstigen. Derartige chemische Zusätze können jedoch unter Umständen eine gegebenenfalls nachfolgende Detektion der freigesetzten Nukleinsäure erschweren oder verhindern. Für chemische Verfahren werden typischerweise Säuren, Laugen und/oder Detergenzien, wie zum Beispiel Triton X-100, und/oder Lösungsmittel, wie zum Beispiel Toluol, verwendet. Wie bereits erwähnt, können jedoch einer optional nachfolgenden Detektion der bei der Lyse freigesetzten Nukleinsäure inhibitorische Effekte der verwendeten Chemikalien auftreten. So sind gegebenenfalls zusätzliche Arbeitsschritte, wie zum Beispiel ein Nachstellen des pH-Wertes und/oder die Entfernung von den chemischen Reagenzien, notwendig, bevor unter Umständen die freigesetzten Nukleinsäuren detektiert werden können. Außerdem können ggf. erforderliche, chemische Zusätze, wie etwa Toluol, unter Umständen gesundheitsschädlich für den Benutzer sein.
  • Bei thermischen Verfahren werden die aufzuschließenden bzw. zu lysierenden Mikroorganismen häufig mehrmals hintereinander unterschiedlichen Temperaturen ausgesetzt. So werden zum Beispiel als Zellen vorliegende Mikroorganismen durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen zerstört. Dabei wirken Scherkräfte, welche die schützenden Membranen von Zellen aufbrechen. Da diese Methode ein wiederholtes Aufheizen und Abkühlen erfordert, ist meist ein großer Zeitaufwand erforderlich und führt auch zu einer niedrigen Effizienz, insbesondere bei schwer zu lysierenden Mikroorganismen, wie zum Beispiel bei grampositiven Bakterien.
  • Chemische, thermische sowie mechanische Lyse-Verfahren weisen somit häufig den Nachteil auf, dass diese langsam sind und somit für die Lyse der Mikroorganismen eine lange Zeitdauer benötigt wird. Ferner besteht bei vielen Lyse-Verfahren die Gefahr, dass die Nukleinsäuren der Mikroorganismen beschädigt werden.
  • Ferner offenbart die EP1263447B1 ein Verfahren zur Herbeiführung einer Hyperthermie in Zellen oder in Gewebe unter Verwendung von Nanomaterialien, wobei schalenförmige Nanopartikel, d.h. Nanoschalen, in die Zellen bzw. in das Gewebe eingebracht oder daran angebracht werden und sodann einer Salve von hochintensiven Pulsen aus infraroter Strahlung ausgesetzt werden, wodurch die Nanoschalen intensiv und lokal Wärme emittieren und dadurch kollektiv einen makroskopischen Bereich des umliegenden Gewebes global erhitzen und dadurch schädigen.
  • Aus der US7972819B2 ist ferner ein Verfahren bekannt, bei welchem Gold-Nanorods, d.h. stäbchenförmige Goldnanopartikel, zum Aufbrechen von Zellen verwendet werden, wozu die Gold-Nanorods einer gepulsten Laserstrahlung mit einer Leistung von vorzugsweise 100 mW bzw. einer Pulsenergie von etwa 3 mJ ausgesetzt werden, um die gesamte wässrige Lösung effizient zu heizen und deren Temperatur zu erhöhen.
  • Ferner ist aus der EP1836698A1 ein Verfahren zur Lyse von Zellen in einer Flüssigkeit durch Erzeugung einer pulsierenden Ultraschalldruckwelle und durch Kavitation bekannt. Dabei wird mit einer Wiederholrate von zumindest 12 kHz ein Teil der Flüssigkeit mit einem Laserstrahl derart geheizt, dass eine Dampfblase entsteht, welche mittels Kavitation biologische Zellen in der Flüssigkeit lysiert.
  • Außerdem ist aus der DE102011007035A1 ein Verfahren zur Lyse von Zellen und zur PCR Amplifikation bekannt. Dabei wird mittels eines Lasers in Verbindung mit einem steuerbaren Mikrospiegel ein Laserstrahl auf einen Filter fokussiert und der Filter mit dem Laserstrahl überstrichen. Auf dem Filter sind dabei mit Farbstoffen versehene Bakterien immobilisiert, welche sodann durch den auf den Filter fokussierten Laserstrahl lysiert werden.
  • Zudem ist aus der Veröffentlichung „Nano-Photothermolyse: Eine effiziente Methode zur selektiven Elimination von Zellen in vitro mittels Laser aktivierter Nanogoldpartikel“ von F. Levold eine Verfahren zur Photothermolyse bekannt. Bei diesem Verfahren werden Goldnanopartikel mittels spezifischer Antikörper an die Oberflächen von Zellen gebunden und sodann mit Nanosekunden-Laserpulsen angeregt.
  • Ferner offenbart die US 2008/0014122 A1 ein Verfahren zur Lyse von Zellen, bei welchem mittels einer Pumpe ein Teil einer Reaktionslösung in einen bestimmten Abschnitt eines Schlauchs gepumpt wird und dort versiegelt wird. In dem versiegelten Bereich werden sodann mittels eines Lasers und magnetischen Nanopartikeln durch thermische, physikalische und mechanische Effekte Zellen aufgebrochen.
  • Diesen genannten Verfahren haftet dabei der Nachteil an, dass typischerweise leistungsstarke Laser-Strahlungsquellen erforderlich sind, um die Verfahren zur Lyse von Zellen oder Gewebe durchzuführen. Derartige Strahlungsquellen sind häufig teuer, sehr groß hinsichtlich ihrer räumlichen Abmessungen, aufwendig in der Installation bzw. im Betrieb, weisen einen hohen Leistungsbedarf auf und sind daher typischerweise nicht in ein kompaktes System integrierbar.
  • Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Lyse von Mikroorganismen bereitzustellen, welches die Nachteile der aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zumindest teilweise überkommt.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Erfindungsgemäß werden ein Verfahren und eine Vorrichtung mit den Merkmalen der jeweiligen unabhängigen Patentansprüche vorgeschlagen. Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der Unteransprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung.
  • In einem ersten Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Lyse von Mikroorganismen, umfassend die Schritte:
    1. a) Bereitstellen der Mikroorganismen und einer Mehrzahl von Nanopartikeln in einer Reaktionslösung derart, dass die Mikroorganismen und/oder die Nanopartikel in der Reaktionslösung im Wesentlichen frei beweglich sind;
    2. b) Einstrahlen eines Lichtstrahls von zeitlich kontinuierlichem Licht in die Reaktionslösung derart, dass ein Teilvolumen der Reaktionslösung von dem Lichtstrahl erfasst wird; und
    3. c) Bereitstellen einer gerichteten Relativbewegung des Lichtstrahls und der Reaktionslösung derart, dass zeitlich nacheinander mehrere unterschiedliche Teilvolumina der Reaktionslösung von dem Lichtstrahl erfasst werden.
  • Dabei weisen die Nanopartikel ein Absorptionsspektrum auf, welches zumindest teilweise mit dem Spektrum des eingestrahlten Lichtstrahls überlappt, so dass die Nanopartikel den eingestrahlten Lichtstrahl zumindest teilweise absorbieren, wobei ein durch das Absorbieren hervorgerufenes Erhitzen zumindest eines Teils der Nanopartikel die Mikroorgansimen zumindest teilweise lysiert.
  • In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Lyse von Mikroorganismen, aufweisend einen Probenhalter für ein Reaktionsgefäß mit einer Reaktionslösung mit Mikroorganismen und einer Mehrzahl von Nanopartikeln, wobei die Mikroorganismen und/oder die Nanopartikel in der Reaktionslösung im Wesentlichen frei beweglich sind. Ferner weist die Vorrichtung eine Lichtquelle auf, welche dazu eingerichtet ist, einen Lichtstrahl von zeitlich kontinuierlichem Licht in die Reaktionslösung derart einzustrahlen, dass ein Teilvolumen der Reaktionslösung in dem Reaktionsgefäß von dem Lichtstrahl erfasst wird; sowie eine Ablenkvorrichtung zum Ablenken des Lichtstrahls und/oder eine Reaktionslösungsbewegungsvorrichtung, wobei die Ablenkvorrichtung und/oder die Reaktionslösungsbewegungsvorrichtung dazu eingerichtet sind, eine gerichtete Relativbewegung des Lichtstrahls und der Reaktionslösung derart zu bewirken, dass zeitlich nacheinander mehrere unterschiedliche Teilvolumina der Reaktionslösung von dem Lichtstrahl erfasst werden. Dabei ist die Lichtquelle derart ausgestaltet, dass der eingestrahlte Lichtstrahl ein Spektrum aufweist, welches mit einem Absorptionsspektrum der Nanopartikel zumindest teilweise überlappt, sodass die Nanopartikel den eingestrahlten Lichtstrahl zumindest teilweise absorbieren und ein durch das Absorbieren hervorgerufenes Erhitzen zumindest eines Teils der Nanopartikel die Mikroorgansimen zumindest teilweise lysiert.
  • Die Mikroorganismen können dabei insbesondere als Lebewesen und/oder Bakterien und/oder Viren und/oder Zellen vorliegen. Bevorzugt weisen die Mikroorganismen jeweils zumindest eine Nukleinsäure auf. Ferner können die Mikroorganismen eine Membran und/oder eine Zellwand und/oder eine Virushülle und/oder eine Proteinhülle aufweisen, welche vorzugsweise derart ausgebildet ist, dass diese die zumindest eine Nukleinsäure des jeweiligen Mikroorganismus von dem den jeweiligen Mikroorganismus umgebenden Medium abgrenzt und/oder schützt. Vorzugsweise beinhalten die Mikroorganismen zumindest teilweise eine Nukleinsäure, wobei die Nukleinsäure der durch das Verfahren lysierten Mikroorganismen vorzugsweise zumindest teilweise aus den Mikroorganismen in die Reaktionslösung freigesetzt wird.
  • Die Lyse bzw. das Lysieren von Mikroorganismen kann dabei vorzugsweise ein Aufschließen und/oder Aufbrechen der Mikroorganismen umfassen. Insbesondere kann die Lyse bzw. das Lysieren der Mikroorganismen ein Aufbrechen und/oder Aufschließen und/oder Beschädigen und/oder Entfernen der Membran und/oder der Zellwand und/oder Virushülle und/oder der Proteinhülle des jeweiligen Mikroorganismus aufweisen. Besonders bevorzugt erfolgt die Lyse bzw. das Lysieren der Mikroorganismen derart, dass die zumindest eine Nukleinsäure des lysierten Mikroorganismus zumindest nicht vollständig beschädigt oder zerstört, besonders bevorzugt auch nicht teilweise beschädigt oder zerstört, wird, sondern die zumindest eine Nukleinsäure des lysierten Mikroorganismus in vorzugsweise teilweise oder besonders bevorzugt vollständig unbeschädigtem Zustand in das den Mikroorganismus umgebende Medium, insbesondere in die Reaktionslösung, gelangt bzw. freigesetzt wird.
  • Die Reaktionslösung kann vorzugsweise als eine wässrige Lösung vorliegen. Beispielsweise kann die Reaktionslösung im Wesentlichen aus reinem Wasser, den Nanopartikeln und den Mikroorganismen bestehen. Alternativ kann die Reaktionslösung dazu eingerichtet sein, das Durchführen einer Amplifikationsreaktion zur Amplifikation bzw. Vervielfältigung einer Nukleinsäure, beispielsweise mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in der Reaktionslösung zu ermöglichen. Insbesondere kann die Reaktionslösung als eine Pufferlösung vorliegen und/oder alle notwendigen Komponenten für das Durchführen einer Amplifikationsreaktion beinhalten. Beispielsweise kann die Lösung einen Citrat-Puffer und/oder einen Na2B4O7-Puffer bzw. Borat-Puffer und/oder eine oder mehrere andere für die Stabilisierung von Nanopartikeln, insbesondere von Goldnanopartikeln, geeignete Puffer aufweisen, in welchem die Nanopartikel und die Mikroorganismen bereitgestellt werden. Beispielsweise kann die Reaktionslösung als einen Puffer sämtliche Inhaltstoffe enthalten, welche typischerweise in einer Stabilisierungslösung zur Stabilisierung kommerziell erhältlicher Nanopartikel enthalten sind (beispielsweise von BBI).
  • Puffer bzw. Pufferlösungen bzw. Lösungsmittel die Lösung der Mikroorganismen und/oder Nanopartikel, insbesondere geeignet für eine Lyse und/oder nachfolgende Laser-PCR können beispielsweise Reagenzien umfassen, welche auch für auf herkömmliche Weise durchgeführte PCR Verfahren geeignet sind. Beispielsweise können die Puffer bzw. Pufferlösungen die folgenden Reagenzien umfassen oder daraus bestehen:
  • Tris-HCL (1 - 20 mM; pH 6 bis 12); Tricine (100 - 300 mM); Triton X-100 (0,01 - 0,1%); Natriumphosphat-Puffer, insbesondere NaH2PO4/Na2HPO4 oder Na2HPO4/Na3PO4 (2 mM, pH 7 bis 12); phosphatgepufferte Salzlösung (PBS, bspw. mit 137 mM Natriumchlorid, 2,7 mM Kaliumchlorid und 12 mM Gesamt-Phosphat in Form von HPO4 2- und H2PO4 -); Boratpuffer, insbesondere Na2B4O7 (2mM, pH 7 bis 9, insbesondere pH 7,2); HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethanesulfonsäure (pH 6,8 bis 8,2); HEPPS 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-1-propansulfonsäure (pH 7,3 bis 8,7); MES: 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (pH 5,2 bis 6,7); TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (pH 7,2 bis 9,0); TE-Puffer; TBS-T-Puffer; Citrat-Puffer; und/oder Citronensäure/Natriumcitrat.
  • Ferner können die Puffer bzw. Pufferlösungen optional zusätzliche Bestandteile bzw. Additive aufweisen, wie etwa die im Folgenden genannten Reagenzien mit beispielhaften bevorzugten Konzentrationen bzw. Anteilen bzw. Volumenanteilen:
  • Magnesiumchlorid (MgCl2; 0,1 - 15 mM); Kaliumchlorid (KCl; 10 - 100 mM); Natriumchlorid (NaCl; 1 - 100 mM); Tween20 (0,01 - 1%); EDTA (0,01 - 0,1 mM); Nonidet P40 (0,01 - 0.5% v/v); Glycerol (5 -10% v/v); DTT (0,1 - 1 mM); BSA (0,03 - 0,7 mg/ml; und/oder Natriumazid.
  • Die Reaktionslösung ist vorzugsweise zumindest teilweise transparent für den Lichtstrahl, d.h. der Lichtstrahl wird durch die Reaktionslösung zumindest nicht vollständig absorbiert. Insbesondere weist der Lichtstrahl vorzugsweise eine Eindringtiefe in die Reaktionslösung von zumindest einem Millimeter auf. Besonders bevorzugt ist die Reaktionslösung jedoch nahezu vollständig transparent für den Lichtstrahl.
  • Nanopartikel sind dabei bevorzugt solche Partikel, welche insbesondere aufgrund ihrer Größe besondere physikalische und/oder optische Eigenschaften aufweisen. Vorzugsweise sind deren optische Eigenschaften hauptsächlich durch die Größe der Nanopartikel gegeben, und optional in geringerem Maße durch deren Materialeigenschaften. Die besonderen optischen Eigenschaften können dabei beispielsweise charakteristische Extinktionsspektren und/oder Streuspektren sein, welche maßgeblich durch die Partikelgröße beeinflusst werden und nicht notwendigerweise im Volumenmaterial bzw. makroskopischen Material ausgeprägt sind. Besonders bevorzugt sind die Nanopartikel solche Nanopartikel, deren optische Eigenschaften zumindest teilweise durch die plasmonischen Eigenschaften der Nanopartikel hervorgerufen werden. Vorzugsweise haben die Nanopartikel dabei einen Durchmesser zwischen 2 und 500 nm, besonders bevorzugt zwischen 3 und 300 nm, weiter bevorzugt zwischen 5 und 200 nm, noch weiter bevorzugt zwischen 7 und 150 nm, am meisten bevorzugt zwischen 10 und 100 nm. Die Nanopartikel können von kugelförmiger bzw. sphärischer Form sein, sind jedoch in ihrer Form nicht darauf limitiert. Beispielsweise sind auch andere Formen der Nanopartikel denkbar, wie etwa elongierte bzw. stäbchenförmige Nanopartikel („Nanorods“) oder auch andere geometrische Formen, wie etwa Sternformen, platonische Formen, wie etwa Tetraeder, Hexaeder, insbesondere kubisch, Oktaeder, Dodekaeder und/oder Ikosaeder. Auch können die Nanopartikel als ein oder mehrere Nanocluster bereitgestellt werden und/oder mehrschichtig als bzw. aus Nano-Schalen aufgebaut sein.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst zumindest ein Teil der Nanopartikel zumindest ein Metall und/oder einen Halbleiter. Das Metall umfasst dabei vorzugsweise ein Edelmetall, wie etwa Gold, Silber, Platin und/oder Kupfer. Der Halbleiter kann beispielsweise Silizium und/oder Germanium umfassen, sowie auch zusammengesetzte Halbleitermaterialien, wie etwa Cadmiumtellurid und/oder Bleisulfid. Des Weiteren kann zumindest ein Teil der Nanopartikel auch aus verschiedenen Materialien zusammengesetzt sein. Beispielsweise kann dabei zumindest ein Teil der Nanopartikel als Schale-Kern-Nanopartikel („core shell nanoparticle“) ausgebildet sein, wobei beispielsweise der Kern ein Metall und die Hülle ein Halbleitermaterial umfasst, oder der Kern ein Halbleitermaterial und die Hülle ein Metall umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform sind alle verwendeten Nanopartikel gleichartig ausgebildet, insbesondere vom gleichen Material gefertigt, wenngleich auch verschiedenartige Nanopartikel für ein Lyse-Verfahren simultan verwendet werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Nanopartikel an seiner Oberfläche Poren aufweisen, welche von Atomen und/oder Molekülen mit einer für die Poren geeigneten Größe und/oder Ladung besetzt werden können, wenn sich beispielsweise derartige Atome und/oder Moleküle zusammen mit den Nanopartikeln in einer Lösung befinden. Ein Nanopartikel soll dabei auch die an seiner Oberfläche angelagerten Atome und/oder Moleküle umfassen.
  • In einer besonders bevorzugten Ausführungsform eignen sich die Nanopartikel aufgrund ihrer besonderen optischen Eigenschaften dazu, Licht bei bestimmten Wellenlängen besonders effektiv zu absorbieren und/oder zu streuen. Insbesondere absorbieren bzw. streuen die Nanopartikel dabei in besonders effizienter Weise Licht, dessen Wellenlänge mit einer Plasmonenresonanzwellenlänge der Nanopartikel übereinstimmt, wobei die Plasmonenresonanzwellenlänge bzw. die Anregungsenergie der Plasmonenresonanz maßgeblich durch die Größe und/oder die Form und/oder das Material der Nanopartikel bestimmt wird. Eine Anregung der Nanopartikel mit Licht, dessen Photonenenergie in etwa mit der Plasmonenresonanzenergie übereinstimmt, eignet sich in besonders effizienter Weise dazu, Lichtenergie auf die Nanopartikel zu übertragen, bzw. Lichtenergie von den Nanopartikeln absorbieren zu lassen.
  • Dass die Nanopartikel und/oder die Mikroorganismen in der Reaktionslösung „im Wesentlichen frei beweglich“ sind, bedeutet dabei, dass die Nanopartikel bzw. Mikroorganismen nicht ortsfest in der Reaktionslösung bereitgestellt werden. Insbesondere werden die Nanopartikel und/oder Mikroorganismen nicht alle an ein Reaktionsgefäß gebunden bzw. befestigt und/oder an ein anderes Element, wie etwa ein Filter, befestigt bereitgestellt, sondern derart, dass diese sich in der Reaktionslösung relativ zum Reaktionsgefäß bewegen können. Dem steht jedoch nicht entgegen, dass sich beispielsweise ein Teil der Nanopartikel und/oder Mikroorganismen zeitweise oder dauerhaft an einer Stelle aufhält oder sich dort anlegt und/oder ablagert, beispielsweise an einer Gefäßwand und/oder am Boden des Reaktionsgefäßes, solange sich nicht alle der Nanopartikel an gleicher Stelle oder ähnlicher Stelle aufhalten oder anlegen. Vorzugsweise werden die Nanopartikel in kolloidaler Form und/oder gleichmäßig über die Reaktionslösung verteilt in der Reaktionslösung bereitgestellt. Vorzugsweise sind die Nanopartikel an Ihrer Oberfläche funktionalisiert, beispielsweise mit Oligonukleotiden, um ein aggregieren mehrerer Nanopartikel miteinander teilweise oder vollständig zu vermeiden und/oder um die elektrostatischen Eigenschaften der Oberfläche der Nanopartikel zu modifizieren. Die Nanopartikel können beispielsweise zeitlich vor den Mikroorganismen in die Reaktionslösung eingebracht werden und/oder die Mikroorganismen zeitlich vor den Nanopartikeln in die Reaktionslösung eingebracht werden und/oder die Nanopartikel und die Mikroorganismen zeitgleich in die Reaktionslösung eingebracht werden. Vorzugsweise sind die Nanopartikel und/oder die Mikroorganismen in der gesamten Reaktionslösung bzw. im gesamten Reaktionsvolumen bzw. im gesamten Reaktionsgefäß frei beweglich. Dies bietet den Vorteil, dass nicht ein Teil der Reaktionslösung von einem anderen Teil der Reaktionslösung abgetrennt bzw. separiert werden muss, sondern dass das Verfahren im Wesentlichen in der Gesamten Reaktionslösung durchgeführt werden kann, ohne einen Teil davon separieren und/oder entnehmen und/oder abgrenzen zu müssen.
  • Als „zeitlich kontinuierliches Licht“ ist dabei insbesondere Licht zu verstehen, welches nicht in Form von Nanosekunden und/oder kürzeren Pulsen bereitgestellt wird. Vorzugsweise wird das zeitlich kontinuierliche Licht als eine kontinuierliche Lichtwelle bereitgestellt, beispielsweise in Form eines cw-Laserstrahls (cw = continuous wave). Das Licht soll auch dann als zeitlich kontinuierliches Licht erachtet werden, wenn das kontinuierliche Licht mittels anderweitiger, technischer Vorrichtungen in pulsartige Zeitabschnitte unterteilt wird, beispielsweise durch mechanische und/oder elektrische Hilfsmittel. Beispielsweise kann das zeitlich kontinuierliche Licht mit mechanischen und/oder elektrischen bzw. elektronischen Mitteln zerhackt bzw. gechoppt werden. Auf diese Weise kann das zeitlich kontinuierliche Licht beispielsweise in Millisekunden- und/oder gar Mikrosekunden Zeitbereiche unterteilt werden und in derartigen Zeitabständen abwechselnd an und ausgeschaltet werden.
  • Als Teilvolumen der Reaktionslösung wird dabei ein Teil der Reaktionslösung erachtet, welcher jedoch nicht zwingend von anderen Teilen der Reaktionslösung abgetrennt bzw. abgegrenzt sein muss. Insbesondere kann sich ein Teilvolumen dadurch auszeichnen, dass dieses vom Lichtstrahl erfasst wird, während der Rest der Reaktionslösung oder andere Teile des Reaktionsvolumens nicht vom Lichtstrahl erfasst werden. Auch kann das Teilvolumen eine fließende Bewegung innerhalb der Reaktionslösung ausführen und/oder zwischen verschiedenen Teilvolumen ein Austausch von Reaktionsflüssigkeit stattfinden. Beispielsweise kann die gerichtete Relativbewegung des Lichtstrahls und der Reaktionslösung dazu führen, dass zu unterschiedlichen Zeitpunkten verschiedene Teilvolumina der Reaktionslösung vom Lichtstrahl erfasst werden. Alternativ oder zusätzlich kann eine Bewegung der Reaktionsflüssigkeit bzw. der Reaktionslösung, beispielsweise eine Fließbewegung und/oder eine Konvektionsbewegung, dazu beitragen, dass zu unterschiedlichen Zeitpunkten verschiedene Teilvolumina der Reaktionslösung vom Lichtstrahl erfasst werden.
  • Die Erfindung bietet den Vorteil, dass für die Lyse der Mikroorganismen nicht notwendigerweise chemische Zusätze verwendet werden müssen, welche beispielsweise eine optional nachfolgende Amplifikation und/oder Detektion einer Nukleinsäure, welche aus den lysierten Mikroorganismen freigesetzt wurde, erschweren oder gar verhindern können. Somit bietet die Erfindung den Vorteil, dass ein Verfahren zur Lyse von Mikroorganismen bereitgestellt wird, welches besonders gut geeignet ist, wenn nachfolgend die aus den lysierten Mikroorganismen freigesetzten Nukleinsäuren amplifiziert und/oder detektiert werden sollen.
  • Des weiteren bietet die Erfindung den Vorteil, dass bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens nicht notwendigerweise Erschütterungen und/oder Vibrationen und/oder andere mechanische Belastungen auftreten, wie diese beispielsweise bei einer mechanischen Lyse von Mikroorganismen, welche beispielsweise mittels magnetischer Beads oftmals auftreten. Dies hat zur Folge, dass gemäß der Erfindung eine Störanfälligkeit und/oder eine Gefahr von Beschädigungen von gegebenenfalls verwendeten sensiblen technischen Geräten, wie etwa Detektoren oder Laser-Strahlungsquellen, aufgrund mechanischer Belastungen reduziert oder gar ganz vermieden werden können.
  • Ferner bietet die Erfindung den Vorteil, dass erfindungsgemäß ein geringerer Zeitaufwand für die Lyse der Mikroorganismen erforderlich ist, als bei der Verwendung herkömmlicher chemischer und/oder mechanischer und/oder thermischer Lyse-Verfahren.
  • Ferner bietet die Erfindung den Vorteil, dass aufgrund der Verwendung von zeitlich kontinuierlichem Licht im Gegensatz zu herkömmlicherweise oftmals verwendeten Laserpulsen niedrigere Spitzenintensitäten ausreichend sind, um die Mikroorganismen zu lysieren. Dadurch kann die Gefahr einer Beschädigung der durch die Lyse der Mikroorganismen freigesetzten Nukleinsäuren durch eine zu hohe Bestrahlungsintensität reduziert oder gar ganz gemieden werden, da durch das Einstrahlen von zeitlich kontinuierlichem Licht in die Reaktionslösung ein ausreichender Energieeintrag erreicht werden kann, ohne dass hohe Spitzenintensitäten bereitgestellt werden müssen.
  • Darüber hinaus bietet die Erfindung den Vorteil, dass durch die Verwendung von zeitlich kontinuierlichem Licht auf die Verwendung von technisch aufwendigen, und kostenintensiven gepulsten Laser-Strahlungsquellen abgesehen werden kann und anstatt dessen anderweitige Strahlungsquellen, wie beispielsweise Dioden-Laser und/oder Laserdioden, verwendet werden können, welche oftmals günstiger in der Anschaffung und im Unterhalt und auch weniger aufwendig in der Wartung und im Betrieb sind. Zudem weisen Strahlungsquellen für zeitlich kontinuierliches Licht, wie beispielsweise Laserdioden und/oder Dioden Laser, oftmals kleinere räumliche Abmessungen auf und sind daher häufig einfacher in eine kompakte Vorrichtung zur Lyse von Mikroorganismen und/oder in Vorrichtungen für gegebenenfalls noch anderweitige Verfahrensschritte zu integrieren. Auch weisen Strahlungsquellen für zeitlich kontinuierliches Licht häufig einen geringeren Energieverbrauch bzw. Stromverbrauch auf, wodurch wiederum die räumlichen Abmessungen reduziert werden können und auch gegebenenfalls erforderliche Vorrichtungen für deren Kühlung reduziert oder gar ganz eingespart werden können.
  • Ferner bietet die Erfindung den Vorteil, dass zumeist ein großer Anteil der zu lysierenden Mikroorganismen in der Reaktionslösung lysiert werden kann und somit oftmals eine höhere Effizienz der Lyse erreicht werden kann, als beispielsweise bei herkömmlichen mechanischen Verfahren. Dies kann insbesondere dann vorteilhaft sein, wenn die zu Lysieren den Mikroorganismen nur in sehr geringen Konzentrationen vorliegen.
  • Vorzugsweise umfasst das Einstrahlen des Lichtstrahls ein Fokussieren des Lichtstrahls in das entsprechende Teilvolumen der Reaktionslösung, wobei das Fokussieren vorzugsweise derart erfolgt, dass der Lichtstrahl im Fokus eine Intensität von zumindest 0,1 kW/mm2, mehr bevorzugt von zumindest 1 kW/mm2 und besonders bevorzugt von zumindest 3 kW/mm2 aufweist, und/oder wobei das Fokussieren vorzugsweise derart erfolgt, dass der Lichtstrahl im Fokus eine Intensität von höchstens 1.000 kW/mm2, mehr bevorzugt von höchstens 100 kW/mm2 und besonders bevorzugt von höchstens 35 kW/mm2 aufweist. Dies bietet den Vorteil, dass auch mittels Lichtquellen mit geringer Emissionsleistung geeignete Intensitäten im Fokus erreicht werden können. Dadurch können insbesondere die Anschaffungskosten und/oder der technische Aufwand für die Bereitstellung und/oder den Betrieb der Lichtquelle reduziert werden, wobei dennoch zumindest im Fokus des Lichtstrahls die Lyse der Mikroorganismen erfolgen kann. Die begrenzten, maximalen Intensitäten im Lichtstrahl haben dabei den Vorteil bzw. den Effekt, dass eine Beschädigung der durch die Lyse freigesetzten Nukleinsäuren der Mikroorganismen durch den eingestrahlten Lichtstrahl vermieden werden kann, was besonders dann vorteilhaft ist, wenn die durch die Lyse freigesetzten Nukleinsäuren anschließend amplifiziert und/oder detektiert werden sollen.
  • Vorzugsweise umfasst das Bereitstellen der gerichteten Relativbewegung in Schritt c) ein Bewegen und/oder Führen des Lichtstrahls senkrecht zu einer Ausbreitungsrichtung des Lichtstrahls, wobei vorzugsweise durch das Bewegen und/oder das Führen des Lichtstrahls die Reaktionslösung von dem Lichtstrahl abgescannt wird. Dies bietet den Vorteil, dass auch mit einem Lichtstrahl, dessen transversale Ausdehnung deutlich kleiner ist als die Abmessungen der Reaktionslösung, ein großer Teil oder gar die gesamte Reaktionslösung sequenziell von dem Lichtstrahl erfasst werden kann. Insbesondere dann, wenn der Lichtstrahl in die Reaktionslösung fokussiert wird und die transversalen Abmessungen des Fokus deutlich kleiner sind als die Reaktionslösung, kann es besonders vorteilhaft sein, wenn der Lichtstrahl bzw. der Fokus durch die Reaktionslösung geführt wird. Auf diese Weise kann bewerkstelligt werden, dass ein großer Teil oder die gesamte Reaktionslösung dadurch bestrahlt wird, dass zeitlich nacheinander eine Vielzahl von Teilvolumina der Reaktionslösung von dem Lichtstrahl bzw. vom Fokus erfasst werden und somit die Nanopartikel in der Mehrzahl der Teilvolumina vorzugsweise im Großteil der Reaktionslösung oder gar in der gesamten Reaktionslösung durch den Lichtstrahl erhitzt werden.
  • Weiter bevorzugt wird die gerichtete Relativbewegung des Lichtstrahls und der Reaktionslösung durch einen Scan des Lichtstrahls durch die Reaktionslösung bereitgestellt, d.h. dass der Lichtstrahl senkrecht zu seiner Ausbreitungsrichtung entlang einer vorzugsweise vorbestimmten Trajektorie durch zumindest einen Teil der Reaktionslösung geführt wird. Beispielsweise kann der Lichtstrahl vorzugsweise mittels eines oder mehrerer Spiegel in seiner Position und/oder Ausbreitungsrichtung geändert bzw. umgelenkt werden. Besonders bevorzugt erfolgt der Scan des Lichtstrahls durch die Reaktionslösung sequenziell mehrmals nacheinander, wobei bei den Wiederholungen des Scans des Lichtstrahls durch die Reaktionslösung gleichartige und/oder verschiedenartige Trajektorien verwendet werden können. Dies bietet insbesondere den Vorteil, dass die erforderliche Leistung des Lichtstrahls und/oder der Lichtquelle weiter reduziert werden kann, da der erforderliche Energieeintrag über mehrere zeitlich nacheinander erfolgende Einstrahlungen des Lichtstrahls in die Reaktionslösung erfolgen kann.
  • Die Anzahl der Wiederholungen beträgt dabei vorzugsweise mindestens 1 bis höchstens 10.000, bevorzugt jedoch mindestens 2 bis höchstens 1.000, weiter bevorzugt mindestens 5 bis höchstens 500, noch weiter bevorzugt mindestens 10 bis höchstens 250, besonders bevorzugt mindestens 25 bis höchstens 125. Die Zeitdauer des Bestrahlens der jeweiligen Teilvolumina beträgt vorzugsweise 0,01 µs bis 100 ms, mehr bevorzugt 0,1 µs bis 50 ms, noch mehr bevorzugt 1 µs bis 25 ms, besonders bevorzugt 10 µs bis 10 ms und am meisten bevorzugt 100 µs bis 1 ms.
  • Je nach Art der Probe, beispielsweise wenn Mikroorganismen in klinischen Proben lysiert werden sollen, kann unter Umständen eine Vorbehandlung der Proben vorteilhaft sein. Dazu können zum Beispiel Heizschritte und/oder mechanische Vorbehandlungen, wie zum Beispiel ein Schütteln der Probe in einem Vortexmischer, vorzugsweise in der Anwesenheit von zum Beispiel Glas-Beads, die Lyse der Mikroorganismen begünstigen.
  • Vorzugsweise weist zumindest ein Teil der Nanopartikel eine Oberflächenfunktionalisierung auf, d.h. dass vorzugsweise zumindest manche der Mehrzahl von Nanopartikeln eine Oberflächenfunktionalisierung aufweisen können, welche sich zumindest über einen Teil der Nanopartikeloberfläche erstreckt. Optional können dazu die Mikroorganismen und/oder die Nanopartikel bei einer vorbestimmten Temperatur in der Reaktionslösung vorinkubiert und/oder vorbehandelt werden. Beispielsweise kann die Oberflächenfunktionalisierung durch physikalische und/oder chemische Verfahren erfolgen. Beispielsweise können Thiole und/oder Amine und/oder Moleküle mit einer oder mehreren Thiolgruppen und/oder einer oder mehreren Aminogruppen und/oder einer oder mehreren Phosphinen zur Oberflächenfunktionalisierung verwendet werden.
  • Vorzugsweise sind die Nanopartikel, beispielsweise an ihrer Oberfläche, mit Nukleinsäuren, wie etwa Oligonukleotiden, und/oder mit kationisch modifizierten Nukleinsäuren, wie etwa einer Zipped Nucleic Acid (ZNA) modifiziert. Dies kann beispielsweise dazu dienen, die elektrostatischen Eigenschaften der Nanopartikel bzw. ihrer Oberflächen zu ändern, etwa um eine positive elektrische Gesamt-Ladung der Nanopartikel zu bewirken. Bei dieser kationischen Modifikation werden z.B. Spermin-Einheiten an das Oligonukleotid hinzugefügt, wie beispielsweise in den Druckschriften WO 2007 069 092 A2 oder WO 2009 083 763 A1 beschrieben. Das Hinzufügen der ZNA kann vorzugsweise am 5' und/oder 3' Ende des Oligonukleotids erfolgen und/oder innerhalb eines Oligonukleotids als Anhang und/oder als Basenanalogon. Alternativ oder zusätzlich kann vorzugsweise eine Anbindung der Nanopartikel an CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid) vorteilhaft sein, beispielsweise um die Gesamt-Ladung der Nanopartikel zu verändern und somit eine Bindung der Nanopartikel mit den Mikroorganismen zu begünstigen. Vorzugsweise ist auch die Verwendung von magnetischen Nanopartikeln möglich bzw. vorteilhaft. Als weitere Modifikation kann zum Beispiel PEG (Polyethylenglycol) dienen. Besonders bevorzugt werden jedoch Nanopartikel verwendet, deren Oberfläche nicht mit Oligonukleotiden oder anderweitigen Modifizierungen funktionalisiert ist. Dennoch bieten Funktionalisierungen der Nanopartikel vielfältige Möglichkeiten, um die Funktionalität der Nanopartikel und deren Wechselwirken mit den Mikroorganismen zu beeinflussen.
  • Auch können Funktionalisierungen der Nanopartikel mit Antikörpern vorteilhaft sein, beispielsweise um ein effizientes Binden der Nanopartikel an die zu lysierenden Mikroorganismen zu ermöglichen. Beispielsweise können verschiedene oder gleichartige Nanopartikel mit unterschiedlichen Funktionalisierungen bereitgestellt werden, um beispielsweise an verschiedenartige Mikroorganismen zu binden, um diese zu lysieren. Dies bietet den Vorteil, dass neben einem effizienten Wärmeübertrag vom geheizten Nanopartikel auf den daran gebundenen Mikroorganismus optional auch ein Multiplexing zum Lysieren verschiedenartiger Mikroorganismen erfolgen kann. Mit anderen Worten können vorzugsweise zumindest manche der Nanopartikel in der Reaktionslösung an in der Reaktionslösung vorhandene Mikroorganismen binden, oder umgekehrt. Dabei können die Nanopartikel direkt oder indirekt an die Mikroorganismen binden, beispielsweise über eine oder mehrere Nukleinsäuren.
  • Beispielsweise kann das Binden der Nanopartikel Mikroorganismen zu Beginn des Lyse-Verfahrens erfolgen und/oder während des Verlauf des Lyse-Verfahrens erfolgen. Beispielsweise kann vor und/oder zu Beginn des eigentlichen Lyse-Verfahrens zunächst in Vorbereitung des Lyse-Verfahrens ein Verfahrensschritt durchgeführt werden, in welchem die Nanopartikel mit Mikroorganismen binden können. Ein Binden der Nanopartikel an die Mikroorganismen oder umgekehrt bietet den Vorteil, dass die Nanopartikel, welche vom Lichtstrahl erhitzt werden, sich in unmittelbarer Nähe zu den Mikroorganismen befinden und somit eine Wärmeabgabe der Nanopartikel, nachdem diese vom Lichtstrahl geheizt wurden, zu einem effektiven Wärmeübertrag auf den daran gebundenen Mikroorganismus zur Folge haben kann. Insbesondere wird durch ein Binden der Nanopartikel und der Mikroorganismen ein maximaler Abstand bzw. eine Entfernung des Nanopartikels zum jeweiligen Mikroorganismus vorbestimmt bzw. vorgegeben, welcher insbesondere durch die Art des Bindens beeinflusst werden kann.
  • Die Oberfläche der Nanopartikel kann beispielsweise zeitlich vor dem Durchführen der Lyse mit daran gebundenen Oligonukleotiden gleicher und/oder unterschiedlicher Länge und/oder mit gleichen und /oder unterschiedlichen Modifikationen versehen werden. Dabei können die Oligonukleotide gleiche und/oder unterschiedliche Nukleotidsequenzen aufweisen. Ebenso ist eine Mischung von unterschiedlich beladenen bzw. funktionalisierten Nanopartikeln möglich.
  • Eine geeignete Anzahl bzw. Konzentration der Nanopartikel pro Mikroorganismus in der Reaktionslösung kann dabei insbesondere von der Art der Nanopartikel und/oder der Art der Mikroorganismen abhängen. Beispielsweise kann die geeignete Anzahl der Nanopartikel relativ zur Anzahl bzw. zur Konzentration der Mikroorganismen von der Form und/oder Größe der Oberfläche und/oder Art der Oberfläche abhängen. Beispielsweise kann es vorteilhaft sein, mindestens ein Nanopartikel pro zu lysierendem Mikroorganismus in der Reaktionslösung bereitzustellen, bevorzugt mindestens 10 Nanopartikel pro Mikroorganismus, mehr bevorzugt mindestens 100 Nanopartikel pro Mikroorganismus, noch mehr bevorzugt mindestens 1.000 Nanopartikel pro Mikroorganismus. Jedoch können vorzugsweise auch mindestens 10.000 Nanopartikel pro Mikroorganismus, mindestens 100.000 Nanopartikel pro Mikroorganismus, oder mindestens 1.000.000 Nanopartikel pro Mikroorganismus in der Reaktionslösung bereitgestellt werden. Je größer die Anzahl bzw. Konzentration der Nanopartikel und/oder der Mikroorganismen in der Reaktionslösung ist, desto geringer ist der typischerweise mittlere Abstand zwischen den Nanopartikeln und den Mikroorganismen. Entsprechend ist auch die Anzahl bzw. Konzentration der Nanopartikel und/oder Mikroorganismen größer, welche sich in einem Bereich befinden, in welchem ein effizienter Wärmeübertrag von einem beheizten Nanopartikel zu einem benachbarten Mikroorganismus möglich ist. Dementsprechend kann eine große Anzahl bzw. Konzentration der Nanopartikel und/oder der Mikroorganismen in der Reaktionslösung zu einem effizienteren Wärmeübertrag von einem beheizten Nanopartikel zum nächstgelegenen Mikroorganismus führen und somit eine effizientere Lyse zumindest eines Teils der Mikroorganismen bewirken.
  • Vorzugsweise ist die Reaktionslösung in einem Reaktionsgefäß angeordnet. Dies bietet den Vorteil, dass die Reaktionslösung in dem Reaktionsgefäß in einem vorgegebenen Volumen bereitgestellt werden kann. Vorzugsweise ist das Reaktionsgefäß zumindest teilweise transparent für den Lichtstrahl. Dies bietet den Vorteil, dass der Lichtstrahl über das Reaktionsgefäß, beispielsweise über eine Seitenwand bzw. Gefäßwand und einen Boden und/oder über einen Deckel des Reaktionsgefäßes in die Reaktionslösung eingestrahlt werden kann. Besonders bevorzugt ist die erfindungsgemäße Vorrichtung dazu eingerichtet, den Lichtstrahl seitlich durch eine Seitenwand bzw. Gefäßwand des Reaktionsgefäßes und/oder vertikal von oben, beispielsweise durch einen Deckel des Reaktionsgefäßes, in die Reaktionslösung einzustrahlen. Besonders bevorzugt ist das Reaktionsgefäß derart ausgebildet, dass dieses den Lichtstrahl nicht oder nur in besonders geringem Maße absorbiert, um eine Abschwächung des Lichtstrahls zu vermeiden und optional ein unerwünschtes Aufheizen des Reaktionsgefäßes durch den Lichtstrahl zu vermeiden. Beispielsweise kann der Lichtstrahl über einen zumindest teilweise transparenten Deckel in die Reaktionslösung eingestrahlt werden. Alternativ kann der Laserstrahl von oben in die Reaktionslösung eingestrahlt werden, wenn dieses keinen Deckel aufweist und somit keine Absorption des Lichtstrahls oder Teile davon durch das Reaktionsgefäß oder einen Deckel zu befürchten sind.
  • Vorzugsweise umfasst das Bereitstellen der gerichteten Relativbewegung in Schritt c) ein Bewegen der Reaktionslösung in dem Reaktionsgefäß zumindest teilweise senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des Lichtstrahls. Besonders bevorzugt wird das Bereitstellen der gerichtete Relativbewegung im Schritt c) ausschließlich durch eine Bewegung des Lichtstrahls relativ zur Reaktionslösung senkrecht zur Ausbreitung des Lichtstrahls bewirkt. Dabei kann vorzugsweise das Bewegen der Reaktionslösung in dem Reaktionsgefäß durch ein Rühren der Reaktionslösung und/oder ein Umwälzen der Reaktionslösung und/oder eine Konvektion der Reaktionslösung in dem Reaktionsgefäß erfolgen. Beispielsweise kann zu diesem Zweck eine erfindungsgemäße Vorrichtung vorzugsweise eine Reaktionslösungsbewegungsvorrichtung aufweisen, die dazu eingerichtet ist, die Reaktionslösung zu rühren und/oder umzuwälzen. Insbesondere kann das Bewegen der Reaktionslösung in dem Reaktionsgefäß alternativ oder zusätzlich zu einer Bewegung des Lichtstrahls erfolgen. Das Bewegen der Reaktionslösung in dem Reaktionsgefäß bietet dabei den Vorteil, dass diese Bewegung gegebenenfalls auf besonders einfache Weise realisiert werden kann. Beispielsweise kann in und/oder an dem Reaktionsgefäß ein Rührmechanismus vorgesehen sein, um die Reaktionslösung in dem Reaktionsgefäß zu rühren und dadurch in Bewegung zu versetzen. Alternativ oder zusätzlich kann beispielsweise durch das aktive oder passive Erzeugen eines Wärmegradienten eine Konfektionsbewegung der Reaktionslösung dem Reaktionsgefäß hervorgerufen werden. Die Bewegung der Reaktionslösung in dem Reaktionsgefäß muss dabei nicht notwendigerweise entlang einer vorbestimmten Trajektorie erfolgen. Vielmehr kann es ausreichend sein, eine ungerichtete und/oder unkontrollierte Bewegung der Reaktionslösung in dem Reaktionsgefäß zu erzeugen. Dabei kann es ausreichend sein, dass sich statistisch betrachtet jedes Teilvolumen der Reaktionslösung bzw. jeder Nanopartikel in der Reaktionslösung durch den Lichtstrahl bzw. den Fokus bewegt und dort durch den Lichtstrahl geheizt wird. Sollte sich dabei ergeben, dass manche Nanopartikel öfters und/oder über eine längere Zeitdauer von dem Lichtstrahl erfasst werden als andere Nanopartikel, kann dies dennoch für die Effizienz des Lyse-Verfahrens unerheblich sein, da über eine große Anzahl und/oder eine im Vergleich zur Zeitdauer des Heizens des Nanopartikels und Lysieren des Mikroorganismus sehr lange Zeitdauer gemittelt wird und ferner häufig lediglich eine gemittelte Effizienz des Lyse-Verfahrens maßgeblich ist.
  • Vorzugsweise erfolgt das Bereitstellen der gerichteten Relativbewegung des Lichtstrahls und der Reaktionslösung derart, dass die mehreren unterschiedlichen Teilvolumina von dem Lichtstrahl zumindest teilweise mehrmals zeitlich nacheinander erfasst werden. Mit anderen Worten werden vorzugsweise die Nanopartikel von dem Lichtstrahl mehrmals zeitlich nacheinander erfasst. Dies bietet den Vorteil, dass der durch den Lichtstrahl bereitgestellte Energieeintrag in die Reaktionslösung bzw. zu den Nanopartikeln kumuliert werden kann, wodurch auch mit einer geringen Leistung des bereitgestellten Lichtstrahls bzw. der Lichtquelle eine effiziente Lyse der Mikroorganismen in der Reaktionslösung ermöglicht wird. Insbesondere bietet dies den Vorteil, dass durch das mehrmals zeitlich nacheinander erfolgte Einstrahlen des Lichtstrahls in zumindest teilweise die gleichen Teilvolumina die Verwendung von leistungsschwächeren Lichtstrahlen bzw. Lichtquellen ermöglicht wird und daher kostengünstigere und/oder weniger aufwendige Lichtquellen verwendet werden können. Beispielsweise können dazu zeitlich nacheinander mehrere Scans des Lichtstrahls durch die Reaktionslösung durchgeführt werden und/oder durch eine anhaltende Bewegung der Reaktionslösung, beispielsweise durch ein Rühren, eine zeitlich ausreichend lange Relativbewegung der Reaktionslösung relativ zum Lichtstrahl bewerkstelligt werden.
  • Vorzugsweise ist ein Gesamtvolumen der Reaktionslösung zumindest 10 mal, bevorzugt zumindest 100 mal, mehr bevorzugt zumindest 1.000 mal, noch mehr bevorzugt zumindest 104 mal, noch viel mehr bevorzugt zumindest 105 mal, am meisten bevorzugt zumindest 106 mal größer als das von dem Lichtstrahl erfasste Teilvolumen der Reaktionslösung, und/oder ist das Gesamtvolumen der Reaktionslösung höchstens 1010 mal, bevorzugt höchstens 109 mal, weiter bevorzugt höchstens 108 mal, am meisten bevorzugt höchstens 107 mal größer als das von dem Lichtstrahl erfasste Teilvolumen der Reaktionslösung. Mit anderen Worten wird zu jedem Zeitpunkt durch den Lichtstrahl nur ein sehr kleines Teilvolumen der Reaktionslösung erfasst. Auch dies bietet den Vorteil, dass im Vergleich zu den aus dem Stand der Technik bekannten optothermischen Lyse-Verfahren eine Lichtquelle mit vergleichsweise geringer Leistung verwendet werden kann, da durch den Lichtstrahl zu jedem Zeitpunkt nur ein kleines Teilvolumen der Reaktionslösung bestrahlt bzw. die Nanopartikel darin beheizt werden, nicht jedoch die gesamte Reaktionslösung, insbesondere nicht gleichzeitig.
  • Vorzugsweise sind die Teilvolumina in einer Projektionsebene senkrecht zu der Ausbreitungsrichtung des Lichtstrahls an unterschiedlichen Positionen angeordnet und/oder vorzugsweise im Wesentlichen nebeneinander angrenzend. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass der Lichtstrahl schrittweise und/oder kontinuierlich seine Position in der Projektionsebene senkrecht zu der Ausbreitungsrichtung des Lichtstrahls verändert. Diese Lenkung bzw. Führung des Lichtstrahls erfolgt derart, dass durch die zeitlich sequenzielle Bestrahlung der Teilvolumina vorzugsweise zumindest 50 %, weiter bevorzugt zumindest 60 %, mehr bevorzugt zumindest 80 %, am meisten bevorzugt zumindest 90 % der gesamten Reaktionslösung in dem Reaktionsgefäß bestrahlt werden.
  • Vorzugsweise umfassen die Nanopartikel zumindest ein Metall und/oder ein Halbleitermaterial und/oder sind im Wesentlichen kugelförmig ausgebildet. Die Nanopartikel können dabei vorzugsweise eine beliebige Form aufweisen, zum Beispiel elongiert (oftmals auch als „Nanorods“ bezeichnet) oder sphärisch. Hinsichtlich des Materials können sich insbesondere solche Nanopartikel eignen, die sich auf Grund ihrer materialbedingten Absorptionseigenschaften und/oder durch ihre plasmonischen Eigenschaften dazu eignen, optische Energie zu absorbieren und/oder zu streuen. Beispielsweise können hierzu Edelmetall- und/oder Metall- und/oder Halbleiter-Nanopartikel vorteilhaft sein. Auch können mehreren verschiedenen Materialien umfassende Schale-Kern-Nanopartikel verwendet werden, bei welchen beispielsweise der Kern ein anderes Material umfasst als die Schale. Besonders vorteilhaft kann dabei die Verwendung von Gold-beinhaltenden Nanopartikeln bzw. von Gold-Nanopartikel sein. Die Größe bzw. der Durchmesser der Nanopartikel kann beispielsweise 1 - 1000 nm betragen, vorzugsweise 3 - 300 nm, mehr bevorzugt 5 - 200 nm, besonders bevorzugt 7 - 150 nm und am meisten bevorzugt 10 - 100 nm. Dies bietet den Vorteil, dass in diesem Größenbereich vorteilhafte plasmonischen und/oder optoelektronische Eigenschaften der Nanopartikel erzielt werden können, welche insbesondere zur Verwendung in einem Verfahren zu Lyse besonders gut geeignet sein können. Vorzugsweise sind die Nanopartikel nicht größer als 1 µm, bevorzugt nicht größer als 750 nm, weiter bevorzugt nicht größer als 500 nm, noch weiter bevorzugt nicht größer als 250 nm, besonders bevorzugt nicht größer als 100 nm, am meisten bevorzugt nicht größer als 70 nm sind und/oder nicht kleiner als 1 nm, bevorzugt nicht kleiner als 10 nm, weiter bevorzugt nicht kleiner als 20 nm, noch weiter bevorzugt nicht kleiner als 30 nm, am meisten bevorzugt nicht kleiner als 40 nm.
  • Vorzugsweise umfasst das Verfahren zur Lyse von Mikroorganismen ferner den Schritt:
    • d) Amplifizieren zumindest eines Teils der freigesetzten Nukleinsäuren der lysierten Mikroorganismen unter Verwendung des Lichtstrahls.
  • Dies bietet den Vorteil, dass vorzugsweise zur Amplifikation der freigesetzten Nukleinsäuren der gleiche Lichtstrahl verwendet werden kann, der auch zur Lyse der Mikroorganismen verwendet wurde. Dies ermöglicht es beispielsweise, das Verfahren und/oder die Vorrichtung zu Lyse der Mikroorganismen zu vereinfachen, da beispielsweise die Lichtquelle des Lichtstrahls sowohl zur Lyse als auch zur Amplifikation verwendet werden kann. Dies kann ferner den Vorteil bieten, dass nicht notwendigerweise eine weitere Energiequelle bzw. Wärmequelle für die Amplifikation, insbesondere für die Denaturierung der Nukleinsäuren bzw. der Amplikons, bereitgestellt werden muss, wodurch sich beispielsweise die Anschaffungskosten und/oder der Aufwand für den Betrieb und/oder die Wartung einer Vorrichtung zur Lyse von Mikroorganismen reduzieren kann.
  • Vorzugsweise weist die Lichtquelle einen Laser bzw. eine Laserquelle auf. Vorzugsweise wird der Lichtstrahl als ein Laserstrahl bereitgestellt, wobei besonders bevorzugt das Amplifizieren in Schritt d) mittels einer Laser-PCR unter Verwendung des Laserstrahls erfolgt. Beispielsweise kann die Laser-PCR wie in der Druckschrift DE 10 2012 201 475 B4 beschrieben durchgeführt werden. Dies bietet zum einen den Vorteil, dass der für die Lyse verwendete Lichtstrahl bzw. Laserstrahl auch für die Amplifikation der bei der Lyse freigesetzten Nukleinsäuren mittels einer Laser-PCR verwendet werden kann. Andererseits bietet die Erfindung den Vorteil, dass aufgrund des erfindungsgemäßen Verfahrens eine ohnehin für die Laser-PCR bereitgestellte Lichtquelle bzw. ein ohnehin für die Laser-PCR bereitgestellter Laser aufgrund der im Vergleich zum Stand der Technik geringeren Anforderungen an die Emissionsleistung auch für die Lyse der Mikroorganismen verwendet werden kann. Insbesondere da der in einer Vorrichtung zur Durchführung einer Laser-PCR bereitgestellte Laser möglicherweise nicht die Emissionsleistung aufweist, um herkömmliche, aus dem Stand der Technik bekannte Lyse-Verfahren unter Verwendung dieses Lasers durchzuführen, bietet die Erfindung den erheblichen Vorteil, dass dennoch das erfindungsgemäße Verfahren zur Lyse unter Verwendung dieses relativ leistungsschwachen Lasers durchgeführt werden kann. Dies ist besonders deshalb vorteilhaft, da auf diese Weise eine Integration zweier Funktionalitäten, nämlich einerseits die Lyse von Mikroorganismen und andererseits die Amplifikation der dabei freiwerdenden Nukleinsäuren mittels einer Laser-PCR, vorzugsweise in einer Vorrichtung und/oder unter Verwendung einer einzigen Lichtquelle bzw. Laserquelle möglich ist. Auf diese Weise kann beispielsweise ein automatisiertes Verfahren bzw. eine automatische Vorrichtung bereitgestellt werden, welche in einem ersten Verfahrensschritt in einer Reaktionslösung bereitgestellte Mikroorganismen gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren lysiert und in einem weiteren Verfahrensschritt die bei der Lyse freigewordenen Nukleinsäuren mittels einer Laser-PCR amplifiziert, wobei zu beiden Zwecken das Bereitstellen lediglich einer Laserquelle, insbesondere einer im Vergleich zum Stand der Technik leistungsschwachen Laserquelle, ausreichend ist.
  • Ein optionaler, nachfolgender Nachweis von freigesetzten Nukleinsäuren, wie z.B. Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Ribonukleinsäure (RNA), und/oder von Amplikons kann direkt und/oder indirekt erfolgen. Beispielsweise kann der Nachweis mit Hilfe von Farbstoffen durchgeführt werden. Dabei ist zumindest ein Teil der Nukleotidsequenz der nachzuweisenden Nukleinsäure vorher bekannt. Oftmals soll lediglich eine Anwesenheit der Nukleinsäure in der Reaktionslösung nachgewiesen werden und/oder eventuelle Variationen der Sequenz bestimmt werden und/oder eine anfängliche Konzentration der Nukleinsäure in der Reaktionslösung ermittelt werden. Ein direkter Nachweis der Nukleinsäure ist häufig nur bei ausreichend hoher Menge der gesuchten Nukleinsäure möglich. Daher erfolgt der Nachweis in der Regel indirekt also z.B. nach und/oder während einer zum Beispiel enzymatischen Vervielfältigungsreaktion, wie zum Beispiel einer PCR und/oder Laser-PCR. Ein Vorteil dieser Methode ist, dass die Detektion erst ab einer gewissen Mindestmenge von nachzuweisender und/oder vervielfältigter Nukleinsäure stattfindet. Somit kann der Zeitpunkt der erstmaligen Signaldetektion als ein Maß für die Menge bzw. Konzentration der ursprünglich vorhandenen Nukleinsäure in der Reaktionslösung genutzt werden, beispielsweise mittels einer Real-Time PCR und/oder einer qPCR.
  • Während des Lyse-Verfahrens kann die Probe vorzugsweise auf einer festgelegten bzw. vorbestimmten Grundtemperatur gehalten werden. Diese Grundtemperatur kann beispielsweise gleich einer Raumtemperatur bzw. Umgebungstemperatur der Umgebung der Reaktionslösung sein. Jedoch kann es vorteilhaft sein, wenn die Grundtemperatur vorzugsweise mehr als 30℃, mehr be vorzugt mehr als 50℃, besonders bevorzugt mehr als 70℃ und am meisten be vorzugt mehr als 90℃ beträgt. Insbesondere können die Grundtemperatur und die Intensität des Lichtstrahls, beispielsweise im Fokus, voneinander abhängen, d.h. es kann vorteilhaft sein, wenn die Grundtemperatur und die Intensität des Lichtstrahls aufeinander abgestimmt werden. Je höher der Energieeintrag durch den Lichtstrahl ist, desto vorteilhafter kann es sein, eine niedrige Grundtemperatur zu wählen, um ein Überhitzen der Reaktionslösung und ein etwaiges Kochen der Reaktionslösung zu vermeiden. Entsprechend kann es vorteilhaft sein, bei niedrigen Intensitäten bzw. Leistungen des Lichtstrahls eine höhere Grundtemperatur zu wählen, um eine effiziente Lyse zu erzielen. Je niedriger die gewählte Grundtemperatur ist und je kleiner die Konzentration der Nanopartikel pro Mikroorganismus ist, desto mehr findet die Lyse lokal in der unmittelbaren Umgebung der geheizten Nanopartikel statt, da in diesem Fall lediglich in diesen Bereichen die dafür nötigen Temperaturen erreicht werden. Die Grundtemperatur kann beispielsweise über ein zusätzliches Heizelement bereitgestellt werden, welches beispielsweise in den Probenhalter integriert sein kann.
  • Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
  • Die Erfindung ist anhand von bevorzugten Ausführungsformen und Ausführungsbeispielen mit Bezug auf die Zeichnungen schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung beschrieben, wenngleich die Erfindung nicht auf diese Ausführungsbeispiele und bevorzugten Ausführungsformen beschränkt ist
  • Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und den beiliegenden Zeichnungen.
  • Figurenliste
    • 1 zeigt in einer schematischen Darstellung eine Anordnung zur Lyse von Mikroorganismen gemäß einer ersten bevorzugten Ausführungsform.
    • 2 zeigt in einer schematischen Darstellung eine vergrößerte Ansicht von Nanopartikeln 16 und eines Mikroorganismus in der Reaktionslösung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform.
    • 3A zeigt in einer schematischen Darstellung eine Trajektorie der Relativbewegung des Lichtstrahls relativ zur Reaktionslösung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform.
    • 3B zeigt ein Reaktionsgefäß mit einer Reaktionslösungsbewegungsvorrichtung gemäß einer bevorzugten Ausführungsform.
    • 4 zeigt in einem Balkendiagramm in einer logarithmischen Darstellung einen Vergleich der Effizienzen der optothermischen Lyse gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung mit herkömmlichen Lyse-Verfahren.
    • 5 zeigt in einem Balkendiagramm in linearer Auftragung die Lyse-Effizienzen weiterer Beispiele für Lyse-Verfahren gemäß bevorzugter Ausführungsformen unter Verwendung von Nanopartikeln, welche eine Modifikation mit ZNA aufweisen.
  • Detaillierte Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt in einer schematischen Darstellung eine Anordnung zur Lyse von Mikroorganismen 14 gemäß einer ersten bevorzugten Ausführungsform. Die Anordnung umfasst dabei ein Reaktionsgefäß 10, welches eine Reaktionslösung 12 beinhaltet. In der Reaktionslösung 12 sind eine Mehrzahl von Mikroorganismen 14 und eine Mehrzahl von Nanopartikeln 16 bereitgestellt, wobei sowohl die Nanopartikel 16 als auch die Mikroorganismen 14 im Wesentlichen frei beweglich in der Reaktionslösung 12 sind.
  • Gemäß der gezeigten, bevorzugten Ausführungsform weisen die Nanopartikel 16 keine spezielle Funktionalisierung an ihrer Oberfläche auf, mittels welcher diese an die Mikroorganismen 14 binden könnten. Andere Ausführungsformen (nicht gezeigt) können jedoch zusätzlich oder ausschließlich Nanopartikel 16 mit derartigen Funktionalisierungen aufweisen. Auch können andere Ausführungsformen Funktionalisierungen der Nanopartikel aufweisen, beispielsweise mit ZNA oder mit Oligonukleotiden, um die elektrostatischen Eigenschaften der Oberflächen der Nanopartikel zu beeinflussen.
  • Das Reaktionsgefäß 10 umfasst zumindest eine Gefäßwand 10a sowie einen Deckel 10b, wobei zumindest eines der Gefäßwand 10a und des Deckels 10b derart ausgebildet ist, dass dieses optisch zumindest teilweise transparent für den Lichtstrahl 18 ist.
  • In der gezeigten Ausführungsform ist der Lichtstrahl 18 symbolisch durch einen Pfeil dargestellt, welcher über eine Gefäßwand 10a in die Reaktionslösung 12 zeigt und dadurch symbolisch andeutet, dass der Lichtstrahl 18 über die Gefäßwand 10a in das Reaktionsgefäß 10 bzw. in die Reaktionslösung 12 eingestrahlt wird. Dabei ist anzumerken, dass die schematische Darstellung nicht notwendigerweise maßstabsgetreu ist, d.h. dass die Größenverhältnisse der gezeigten Elemente, insbesondere der Nanopartikel 16, der Mikroorganismen 14 und des Lichtstrahls 18, nicht notwendigerweise den realen Größenverhältnissen entsprechen müssen.
  • Die Nanopartikel 16 sind dabei derart ausgelegt, dass diese aufgrund ihrer Materialeigenschaften und/oder plasmonischen Eigenschaften ein optisches Absorptionsspektrum aufweisen, welches zumindest teilweise mit dem optischen Spektrum des Lichtstrahls 18 überlappt, sodass der Lichtstrahl 18 zumindest teilweise, bevorzugt möglichst vollständig, von den erfassten Nanopartikeln 16 absorbiert wird. Die vom Lichtstrahl 18 erfassten Nanopartikel 16 werden durch die absorbierte Energie aufgeheizt und geben die aufgenommene Energie lokal an die Reaktionslösung 12 bzw. an Mikroorganismen 14 in ihrer unmittelbaren Umgebung ab. Dadurch können Mikroorganismen 14, welche sich in der unmittelbaren, lokalen Umgebung der geheizten Nanopartikel 16 befinden, erhitzt werden, sodass die Mikroorganismen 14 durch den erfolgenden Wärmeeintrag bzw. thermischen Energieeintrag lysiert bzw. aufgebrochen werden.
  • Dabei kann während des Lyse-Verfahrens die Reaktionslösung 12 auf einer Grundtemperatur, die höher als die Umgebungs- oder Raumtemperatur ist, gehalten werden, beispielsweise durch ein zusätzlich bereitgestelltes Heizelement, wie etwa einen Heizblock (nicht gezeigt), in welchem beispielsweise das Reaktionsgefäß 10 angeordnet werden kann, sodass zur Lyse der Mikroorganismen 14 ein geringerer Temperaturhub in der lokalen Umgebung der geheizten Nanopartikel 16 erforderlich ist, als wenn die Reaktionslösung 12 bei Raumtemperatur oder der regulären Umgebungstemperatur gehalten werden würde.
  • 2 zeigt in einer schematischen Darstellung eine vergrößerte Ansicht von Nanopartikeln 16 und eines Mikroorganismus 14 in der Reaktionslösung 12, welche von dem Lichtstrahl 18 erfasst werden. Die Nanopartikel 16, welche von dem Lichtstrahl 18 erfasst werden, werden dadurch angeregt und aufgeheizt, woraufhin die aufgeheizten Nanopartikel 16 die aufgenommene thermische Energie lokal an ihre Umgebung abgeben, wie durch die gestrichelten konzentrischen Ringe um die Nanopartikel 16 dargestellt ist. Dieser Wärmeübertrag kann insbesondere in und gegebenenfalls nahe dem Fokus des Lichtstrahls 18 stärker ausgeprägt sein, was durch eine größere Anzahl konzentrischen Ringen dargestellt ist, als in weiter vom Fokus bzw. Lichtstrahl 18 entfernten Regionen, was durch eine geringere Anzahl konzentrischer Ringe dargestellt ist. Befindet sich ein Mikroorganismus 14 in der lokalen, unmittelbaren Umgebung eines oder mehrerer der geheizten Nanopartikel 16, so wird dieser Mikroorganismus zumindest teilweise von der durch die Nanopartikel 16 abgegebene thermische Energie erfasst und aufgeheizt. Durch diesen thermischen Wärmeeintrag, welcher über die Nanopartikel 16 auf den Mikroorganismus 14 erfolgt, kann ein Temperaturhub in und/oder um den Mikroorganismus 14 derart erfolgen, dass dieser lysiert wird und eine darin vorhandene Nukleinsäure in die Reaktionslösung 12 freigesetzt wird. Sofern eine ausreichende Anzahl von Mikroorganismen 14 mittels des Lichtstrahls 18 und der Nanopartikel 16 lysiert wurde, können optional die dabei freigesetzten Nukleinsäuren in weiteren Verfahrensschritten, beispielsweise mittels einer Laser-PCR unter Verwendung des Lichtstrahls 18, amplifiziert und gegebenenfalls detektiert werden.
  • Da das vom Lichtstrahl 18 bzw. vom Fokus erfasste Teilvolumen der Reaktionslösung 12 gemäß der gezeigten Ausführungsform deutlich kleiner ist, als das gesamte Volumen der Reaktionslösung 12, ist es für eine effiziente und/oder vollständige Lyse der Mikroorganismen in der Reaktionslösung 12 vorteilhaft, eine Relativbewegung der Reaktionslösung 12 zum Lichtstrahl 18 bereitzustellen. Diesbezüglich zeigt 3A in einer schematischen Darstellung eine Trajektorie der Relativbewegung des Lichtstrahls 18 relativ zur Reaktionslösung 12, welche dadurch erzielt wird, dass der Lichtstrahl 18 bzw. der Fokus entlang der als gepunktete Linie dargestellten Trajektorie in einer Projektionsebene senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des Lichtstrahls 18 durch die Reaktionslösung 12 geführt bzw. gescannt wird. Beispielsweise kann dies mittels ablenkbarer Spiegel (nicht gezeigt) erfolgen. Dabei sei darauf hingewiesen, dass die schematisch dargestellte Trajektorie nicht notwendigerweise maßstabsgetreu dargestellt ist, sondern beispielsweise eine andere Länge und/oder einen anderen Verlauf relativ zum Reaktionsgefäß 10 bzw. zur Reaktionslösung 12 aufweisen kann. Insbesondere kann die Trajektorie die transversale Ausdehnung des Lichtstrahls 18 bzw. des Fokus abgestimmt sein, sodass sich durch ein schrittweises und/oder kontinuierliches Bewegen des Lichtstrahls 18 in der Projektionsebene senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des Lichtstrahls 18 eine kontinuierliche bzw. überlappende Abdeckung der Reaktionslösung mit einem intensiven Teil des Lichtstrahls 18, wie etwa dem Fokus, erreicht wird, um vorzugsweise an jeder Position in der Reaktionslösung 12 bzw. in jedem Teilvolumen eine für die Lyse der Mikroorganismen erforderliche Lichtintensität bereitzustellen. Gemäß bevorzugter Ausführungsformen erfolgt zur Lyse der Mikroorganismen nicht nur ein einziger Scan des Lichtstrahls 18 durch die Reaktionslösung 12, sondern eine Mehrzahl von Scans entlang der gleichen und/oder entlang unterschiedlicher Trajektorien. Auf diese Weise kann der Energieeintrag mittels des Lichtstrahls 18 in die Reaktionslösung 12 erhöht werden, ohne jedoch eine leistungsstärkere Lichtquelle, wie etwa einen leistungsstärkeren Laser, verwenden zu müssen.
  • Alternativ oder zusätzlich kann gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die Relativbewegung der Reaktionslösung 12 zum Lichtstrahl 18 durch ein herbeiführen einer Bewegung zumindest eines Teils der Reaktionslösung 12 erzielt werden. Dazu kann, wie beispielsweise in 3B gezeigt, in dem Reaktionsgefäß 10 eine Reaktionslösungsbewegungsvorrichtung bereitgestellt werden, welche beispielsweise als ein Rührelement 22 ausgebildet sein kann, und welche zumindest einen Teil der Reaktionslösung 10 in Bewegung versetzt. Das Rührelement 22 kann beispielsweise mittig im Reaktionsgefäß und/oder in der Nähe des Bodens des Reaktionsgefäßes angeordnet sein. Beispielsweise kann das Rührelement 22 als ein Magnetrührelement ausgebildet sein, welches beispielsweise durch einen externen Magnetrührer (nicht gezeigt) angetrieben und in Bewegung versetzt werden kann, um auf diese Weise auch zumindest einen Teil der Reaktionslösung 12 in Bewegung zu versetzen, wie mit den Pfeilen 24 angedeutet ist.
  • Gemäß anderer bevorzugte Ausführungsformen kann alternativ oder zusätzlich ein Temperaturgradient in der Reaktionslösung 12 erzeugt werden, aufgrund dessen sich eine Konvektionsströmung zumindest eines Teils der Reaktionslösung 12 einstellen kann, um die Reaktionslösung 12 relativ zum Lichtstrahl 18 zu bewegen.
  • Im folgenden ist die Erfindung anhand mehrerer Beispiele erläutert, ohne dass die Erfindung jedoch auf die genannten Beispiele beschränkt ist. Vielmehr sollen die Beispiele lediglich zur Erläuterung diverser Aspekte der Erfindung dienen.
  • Beispiele
  • Im Nachfolgenden sind einige Experimente zur Lyse von Mikroorganismen mit optothermisch aufgeheizten Nanopartikeln erläutert. Als Mikroorganismen wurden grampositive Bakterien vom Typ Staphylococcus aureus verwendet, welche aufgrund ihrer mehrschichtigen Zellwände aus Murein als besonders schwer lysierbare Bakterien eingestuft werden. Trägt das Bakterium beispielsweise eine Resistenz gegen das Antibiotikum Methicilin, so handelt es sich um den in Krankenhäusern häufig verbreiteten Keim MRSA (Methicilin-Resistenter-Staphylococcus-aureus). Ist das Bakterium dagegen Methicilin sensitiv, so wird es MSSA genannt. Bei den nachfolgenden Beispielen wurde hauptsächlich mit MSSA (ATCC 29737) gearbeitet, welcher sich im morphologischen Aufbau und somit in den für die Lyse relevanten Eigenschaften jedoch nicht von MRSA unterscheidet.
  • Um die Effizienz der jeweiligen Lyse-Verfahren beurteilen zu können, wurde zur Referenzmessung die mechanische Lyse-Methode des „Beadbeaters“ gewählt. Bei dieser Referenzmessung werden die Bakterien beispielsweise mit Glas-Beads in eine Reaktionslösung, die Wasser und/oder einen Puffer beinhaltet, eingebracht und für drei Minuten in einem Amalgamator behandelt. Dabei wurden die Bakterien mit etwa 5.000 Oszillationen pro Minute in Anwesenheit von Glas-Beads stark geschüttelt. Die durch diese Methode aus den Mikroorganismen in die Reaktionslösung freigesetzte Menge an genomischer DNA wurde der jeweils ursprünglich eingesetzten Menge an Bakterien zugeordnet und zur Normierung die Effizienz auf 100 % gesetzt. Die getesteten Methoden wurden dementsprechend nachfolgend mit dieser Referenzmessung verglichen. Die Quantifizierung der freigesetzten DNA wurde dabei entweder mit einem handelsüblichen LIGHTCYCLER (ROCHE DEUTSCHLAND HOLDING GMBH) oder zum Beispiel mittels einer durchgeführten Laser-PCR (siehe auch Patentschrift DE 10 2012 201 475 B4 ) bestimmt.
  • Das in 4 gezeigte Balkendiagramm 100 zeigt in einer logarithmischen Darstellung einen Vergleich der Effizienzen der optothermischen Lyse gemäß dem in diesem Beispiel verwendeten Verfahren. Dabei ist auf der y-Achse die Lyse-Effizienz aufgetragen, wobei die Werte auf die Lyse-Effizienz des Beadbeaters 104 bzw. der mechanischen Lyse 120 normiert wurden, weshalb folgerichtig das Lyse-Verfahren basierend auf dem Beadbeater (Balken 104) mit einer Lyse Effizienz von 100 % angegeben ist. Zudem sind verschiedene Variationen der thermischen Lyse 122 im Vergleich zur mechanischen Lyse 120, welche die Referenzmessung dargestellt, in den Balken 106 bis 116 aufgetragen.
  • Die bereits aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren, wie zum Beispiel die thermische Lyse durch Aufheizen der gesamten Reaktionslösung umfasste dabei sowohl konstant gehaltene Temperaturen von 99° C (B alken 106), 50° C (Balken 108), bzw. 20°C (Balken 110)für jeweils 7 Minuten, als auch einen Wechsel der Temperaturen (Balken 112 und 114). Bei den Verfahren mit wechselnden Temperaturen wurden jeweils 40 Zyklen mit abwechselnd 99°C und 50°C (Balken 112), bzw. abwechselnd 99°C und 20°C (Balken 114) mit Hilfe eines Thermocyclers (ANALYTIK JENA, SPEEDCYCLER) durchgeführt. Für die verwendeten MSSA-Bakterien konnte mit den herkömmlichen, thermischen Lyse-Verfahren allerdings nur eine maximale Lyse-Effizienz von ca. 13 % erreicht werden (Balken 114).
  • Eine unbehandelte Probe liefert wie erwartet keine nennenswerte Lyse-Effizienz, wie mit Balken 102 dargestellt ist.
  • Die erfindungsgemäße Lyse gemäß der bevorzugten Ausführungsform aus diesem Beispiel, basierend auf dem Heizen von Gold-Nanopartikeln weist hingegen mit einer Lyse-Effizienz von ca. 80 % (Balken 118) eine mit der mechanischen Lyse aus der Referenzmessung vergleichbare Effizienz auf. Hierfür wurden 60 nm große Gold-Nanopartikel ohne Modifikationen auf ihrer Oberfläche, d.h. ohne Funktionalisierung, verwendet und mit zuvor kultivierten und aufgereinigten Bakterien für 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Proben wurden anschließend in einen auf 80 ℃ vorgeheizten Probenhalter gestellt. Danach wurde mit dem Einstrahlen eines Laserstrahls zum Heizen der Nanopartikel begonnen, wobei das Einstrahlen des Laserstrahls als Laserscannen erfolgte, d.h. dass mit dem Laserstrahl die Reaktionslösung im Rahmen einer Relativbewegung zur Reaktionslösung abgescannt wurde. Dazu wurde ein Dauerstrichlaser bzw. cw-Laser verwendet. Typische Parameter hierfür waren zum Beispiel 1,4 W Laserleistung, 500 Hz Zeilenfrequenz, d.h. bei dem Scan wurden 500 Zeilen pro Sekunde durchgescannt, mit 1000 Zeilen pro Scandurchgang, wobei 75 Durchgänge gescannt wurden. Der Laser, der zum Lysieren der Mikroorganismen verwendet wurde, ist ein frequenzverdoppelter diodengepumpter Nd:YAG-Laser (OEM-Micro-1600, Pegasus Lasersysteme GmbH), der bei einer Ausgangsleistung von 1,6 W und einer Zentral-Wellenlänge von 532 nm nach Strahlaufweitung um einen Faktor 2,5 mit einem Galileischen Teleskop mit einer F-Theta-Linse (Jenoptik, Brennweite 100 mm) hinter einem Spiegelscanner (Cambridge Technologies, Pro Series 1) in die Probe bzw. Reaktionslösung fokussiert wird (Fokusdurchmesser circa 25-30 µm). Der Spiegelscanner erlaubt, den Fokus zeilenweise durch die Reaktionslösung zu bewegen und somit die gesamte Reaktionslösung der Laserstrahlung auszusetzen.
  • Die verwendeten Gold-Nanopartikel hatten dabei ein Maximum ihrer optischen Absorptivität bei etwa 530 nm, was im Wesentlichen der Zentralwellenlänge des eingestrahlten Laserstrahls entspricht und somit eine effizienzente Absorption des Laserstrahls durch die Nanopartikel ermöglicht.
  • Vergleicht man die Lyse-Effizienz mit (Balken 118) und ohne (Balken 116) Gold-Nanopartikel, so lässt sich erkennen, dass der Laserbeschuss ohne Nanopartikel (Balken 116) nahezu keine Lyse bewirkt, hingegen in Anwesenheit der Nanopartikel eine effiziente Lyse mit einer Effizienz von ca. 80 % stattfindet.
  • Bei der hier eingesetzten Konzentration von Gold-Nanopartikeln und der verwendeten Bestrahlungsdauer lässt sich eine absolute Temperaturerhöhung bzw. ein Temperaturhub von 22 ℃ errechnen. Da die Grundtemp eratur bei diesem Versuchsaufbau auf 80 ℃ eingestellt wurde, wäre al so theoretisch eine maximale Temperatur von 102 ℃ denkbar. Allerdings wird die eingestellte Grundtemperatur während der optothermischen Lyse kontinuierlich reguliert, wodurch der mittlere Temperaturanstieg bzw. Temperaturhub der gesamten Reaktionslösung in der Praxis vernachlässigbar gering ausfällt. Betrachtet man dennoch die Probe, welche sogar für sieben Minuten (versus zwei Minuten während der optothermischen Lyse) bei 99 ℃ ohne Nanopartikel und Laserbestrahlung erhitzt wurde, so sieht man, dass die reine Temperaturbehandlung nur eine Lyse-Effizienz von ca. 10 % bewirkt. Dieser Sachverhalt deutet darauf hin, dass es sich bei der beobachteten Lyse um einen lokalen Effekt handelt, welcher durch die Anregung von Nanopartikeln hervorgerufen wird und wodurch der Temperaturhub auf eine lokale Umgebung der geheizten Nanopartikel beschränkt ist.
  • In 5 sind in Balkendiagramm 200 in linearer Auftragung die Lyse-Effizienzen weiterer Beispiele für Lyse-Verfahren unter Verwendung von Nanopartikeln, welche die bereits erwähnten Modifikationen mit ZNA aufweisen, gezeigt (Balken 208 und 210). Dabei zeigt Balken 204 bzw. 206 die Effizienz bei Verwendung von Gold-Nanopartikeln, an deren Oberfläche ZNA mit deren 3'-Ende (Balken 208) bzw. 5'-Ende (Balken 210) funktionalisiert wurden. Die Modifikationen bzw. Funktionalisierungen mit ZNA verleihen den Nanopartikeln eine positive elektrische Grundladung in der Reaktionslösung. Diese zeigen eine vergleichbar bzw. geringfügig bessere Lyse-Effizienz als die Nanopartikel, welche mittels einer Funktionalisierung bzw. Modifikation mit Oligonukleotiden elektrisch negativ geladen wurden. Dabei zeigt Balken 204 bzw. 206 die Effizienz bei Verwendung von Gold-Nanopartikeln, an deren Oberfläche Oligonukleotide mit deren 3'-Ende (Balken 204) bzw. 5'-Ende (Balken 206) funktionalisiert wurden.
  • Damit die Unterschiede des Vergleichs deutlicher sichtbarer werden, wurden in diesen Beispiel-Lyse-Verfahren lediglich 6 pM Gold-Nanopartikel pro Bakterium eingesetzt. Daher fällt die Effizienz mit unmodifizierten Gold-Nanopartikeln (Balken 202) im Vergleich zur Referenzmessung diesmal deutlich geringer aus, als in dem in 4 dargestellten Beispiel, und liegt nur bei ca. 15 %. Der Vergleich zeigt dabei eindeutig, dass die Funktionalisierung der Nanopartikel mit Oligonukleotiden und die daraus resultierende negative elektrische Ladung an der Oberfläche der Nanopartikel zu einer Abnahme der Lyse-Effizienz führt, wohingegen eine Funktionalisierung der Nanopartikel mit ZNA an deren Oberfläche mit positiv geladener ZNA, insbesondere mit deren 5'-Ende, zu einer weiteren Erhöhung der Lyse-Effizienz führt.
  • Bezugszeichenliste
    • 10
    Reaktionsgefäß
    10a
    Gefäßwand
    10b
    Deckel
    12
    Reaktionslösung
    14
    Mikroorganismus
    16
    Nanopartikel
    18
    Lichtstrahl
    20
    Trajektorie
    22
    Rührelement
    24
    Pfeil
    100
    Balkendiagramm 1
    102 - 118
    Balken
    200
    Balkendiagramm 2
    202 - 210
    Balken
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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  • Zitierte Patentliteratur
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    • DE 102011007035 A1 [0012]
    • US 2008/0014122 A1 [0014]
    • WO 2007069092 A2 [0047]
    • WO 2009083763 A1 [0047]
    • DE 102012201475 B4 [0060, 0078]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • „Bead Beating“ bekannt ist und beispielsweise in der Veröffentlichung Hwang et al.: Lab on a Chip 11, 3649-3655 (2011) [0004]

Claims (18)

  1. Verfahren zur Lyse von Mikroorganismen (14), umfassend die Schritte: a) Bereitstellen der Mikroorganismen (14) und einer Mehrzahl von Nanopartikeln (16) in einer Reaktionslösung (12) derart, dass die Mikroorganismen (14) und/oder die Nanopartikel (16) in der Reaktionslösung (12) im Wesentlichen frei beweglich sind; b) Einstrahlen eines Lichtstrahls (18) von zeitlich kontinuierlichem Licht in die Reaktionslösung (12) derart, dass ein Teilvolumen der Reaktionslösung (12) von dem Lichtstrahl (18) erfasst wird; c) Bereitstellen einer gerichteten Relativbewegung des Lichtstrahls (18) und der Reaktionslösung (12) derart, dass zeitlich nacheinander mehrere unterschiedliche Teilvolumina der Reaktionslösung (12) von dem Lichtstrahl (18) erfasst werden; wobei die Nanopartikel (16) ein Absorptionsspektrum aufweisen, welches zumindest teilweise mit dem Spektrum des eingestrahlten Lichtstrahls (18) überlappt, so dass die Nanopartikel (16) den eingestrahlten Lichtstrahl (18) zumindest teilweise absorbieren, wobei ein durch das Absorbieren hervorgerufenes Erhitzen zumindest eines Teils der Nanopartikel (16) die Mikroorgansimen (14) zumindest teilweise lysiert.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Einstrahlen des Lichtstrahls (18) ein Fokussieren des Lichtstrahls (18) in das entsprechende Teilvolumen der Reaktionslösung (12) umfasst, wobei das Fokussieren vorzugsweise derart erfolgt, dass der Lichtstrahl (12) im Fokus eine Intensität von zumindest 0,1 kW/mm2, mehr bevorzugt von zumindest 1 kW/mm2 und besonders bevorzugt von zumindest 3 kW/mm2 aufweist, und/oder wobei das Fokussieren vorzugsweise derart erfolgt, dass der Lichtstrahl (18) im Fokus eine Intensität von höchstens 1.000 kW/mm2, mehr bevorzugt von höchstens 100 kW/mm2 und besonders bevorzugt von höchstens 35 kW/mm2 aufweist.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei das Bereitstellen der gerichteten Relativbewegung in Schritt c) ein Bewegen und/oder Führen des Lichtstrahls (18) senkrecht zu einer Ausbreitungsrichtung des Lichtstrahls (18) umfasst, und wobei vorzugsweise durch das Bewegen und/oder das Führen des Lichtstrahls (18) die Reaktionslösung (12) von dem Lichtstrahl (18) abgescannt wird.
  4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zumindest ein Teil der Nanopartikel (16) eine Oberflächenfunktionalisierung aufweist, wobei die Oberflächenfunktionalisierung vorzugsweise zumindest ein Oligonukleotid und/oder eine kationisch modifizierte Nukleinsäure umfasst.
  5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Reaktionslösung (12) in einem Reaktionsgefäß (10) angeordnet ist und das Reaktionsgefäß (10) vorzugsweise zumindest teilweise transparent für den Lichtstrahl (18) ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Bereitstellen der gerichteten Relativbewegung in Schritt c) ein Bewegen der Reaktionslösung (12) in dem Reaktionsgefäß (10) zumindest teilweise senkrecht zur Ausbreitungsrichtung des Lichtstrahls (18) umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei das Bewegen der Reaktionslösung (12) in dem Reaktionsgefäß (10) durch ein Rühren der Reaktionslösung (12) und/oder ein Umwälzen der Reaktionslösung (12) und/oder eine Konvektion der Reaktionslösung (12) in dem Reaktionsgefäß (10) erfolgt.
  8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Bereitstellen der gerichteten Relativbewegung des Lichtstrahls (18) und der Reaktionslösung (12) derart erfolgt, dass die mehreren unterschiedlichen Teilvolumina von dem Lichtstrahl (18) zumindest teilweise mehrmals zeitlich nacheinander erfasst werden.
  9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Gesamtvolumen der Reaktionslösung (12) zumindest 10 mal, bevorzugt zumindest 100 mal, mehr bevorzugt zumindest 1.000 mal, noch mehr bevorzugt zumindest 104 mal, noch viel mehr bevorzugt zumindest 105 mal, am meisten bevorzugt zumindest 106 mal größer als das von dem Lichtstrahl erfasste Teilvolumen der Reaktionslösung (12) ist, und/oder wobei das Gesamtvolumen der Reaktionslösung (12) höchstens 1010 mal, bevorzugt höchstens 109 mal, weiter bevorzugt höchstens 108 mal, am meisten bevorzugt höchstens 107 mal größer als das von dem Lichtstrahl erfasste Teilvolumen der Reaktionslösung (12) ist.
  10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel (16) zumindest ein Metall und/oder ein Halbleitermaterial umfassen und/oder im Wesentlichen kugelförmig sind.
  11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nanopartikel (16) nicht größer als 1 µm, bevorzugt nicht größer als 750 nm, weiter bevorzugt nicht größer als 500 nm, noch weiter bevorzugt nicht größer als 250 nm, besonders bevorzugt nicht größer als 100 nm, am meisten bevorzugt nicht größer als 70 nm sind und/oder nicht kleiner als 1 nm, bevorzugt nicht kleiner als 10 nm, weiter bevorzugt nicht kleiner als 20 nm, noch weiter bevorzugt nicht kleiner als 30 nm, am meisten bevorzugt nicht kleiner als 40 nm sind.
  12. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mikroorganismen (14) zumindest teilweise eine Nukleinsäure beinhalten und wobei die Nukleinsäure der durch das Verfahren lysierten Mikroorganismen (14) zumindest teilweise in die Reaktionslösung (12) freigesetzt wird.
  13. Verfahren nach Anspruch 12, ferner umfassend den Schritt: d) Amplifizieren zumindest eines Teils der freigesetzten Nukleinsäuren der lysierten Mikroorganismen (14) unter Verwendung des Lichtstrahls (18).
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei der Lichtstrahl (18) als ein Laserstrahl bereitgestellt wird und wobei das Amplifizieren in Schritt d) mittels einer Laser-PCR unter Verwendung des Laserstrahls (18) erfolgt.
  15. Vorrichtung zur Lyse von Mikroorganismen, aufweisend: - einen Probenhalter für ein Reaktionsgefäß (10) mit einer Reaktionslösung (12) mit Mikroorganismen (14) und einer Mehrzahl von Nanopartikeln (16), wobei die Mikroorganismen (14) und/oder die Nanopartikel in der Reaktionslösung (12) im Wesentlichen frei beweglich sind; - eine Lichtquelle, welche dazu eingerichtet ist, einen Lichtstrahl (18) von zeitlich kontinuierlichem Licht in die Reaktionslösung (12) derart einzustrahlen, dass ein Teilvolumen der Reaktionslösung (12) in dem Reaktionsgefäß (10) von dem Lichtstrahl (18) erfasst wird; - eine Ablenkvorrichtung zum Ablenken des Lichtstrahls (18) und/oder eine Reaktionslösungsbewegungsvorrichtung, wobei die Ablenkvorrichtung und/oder die Reaktionslösungsbewegungsvorrichtung dazu eingerichtet sind, eine gerichtete Relativbewegung des Lichtstrahls (18) und der Reaktionslösung (12) derart zu bewirken, dass zeitlich nacheinander mehrere unterschiedliche Teilvolumina der Reaktionslösung (12) von dem Lichtstrahl (18) erfasst werden; wobei die Lichtquelle derart ausgestaltet ist, dass der eingestrahlte Lichtstrahl ein Spektrum aufweist, welches mit einem Absorptionsspektrum der Nanopartikel (16) zumindest teilweise überlappt, sodass die Nanopartikel den eingestrahlten Lichtstrahl (18) zumindest teilweise absorbieren und ein durch das Absorbieren hervorgerufenes Erhitzen zumindest eines Teils der Nanopartikel (16) die Mikroorgansimen (14) zumindest teilweise lysiert.
  16. Vorrichtung nach Anspruch 15, wobei die Reaktionslösungsbewegungsvorrichtung dazu eingerichtet ist, die Reaktionslösung (12) zu rühren und/oder umzuwälzen.
  17. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Vorrichtung dazu eingerichtet ist, den Lichtstrahl (18) seitlich durch eine Gefäßwand (10a) des Reaktionsgefäßes (10) und/oder vertikal von oben in die Reaktionslösung (12) einzustrahlen.
  18. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die Lichtquelle einen Laser aufweist.
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