DE2141387C3 - Verfahren zur auf Mikrobereiche beschränkten Verdampfung, Zerstörung, Anregung und/oder Ionisierung von Probenmaterial sowie Anordnung zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Description

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■ ·« · ,, _r 1. t \* laserstrahlung tatsächlich erfaßten und zur Emission

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur auf Mi- ^^Γ™3 _von Material angeregten Berei-

krobeieiche beschrankten Verdampiung, Zentonmg, -bzw. Ve camp> g _{subzelluläre}r Strukturen

Anregung und/oder Ionisierung von Probenmatenal cftes. t-ζ ax ^ * Bereiches in allen Rich-

mittels kohärenter elektromagnetischer Strahlung, die 4° sollte die Abmessung_aieb s vorzuesweise

durch ein optisches System auf die Probe fokussiert ^J^^^^^^"^^.

^¹ «, _t . , .α c nerseits eelanct man bei der Fokussierang von Laser-Ein derartiges Verfahren kann entweder rum Er- £^e™* «^ft^ _kleine Bereiche bereits an die zeugen bestimmter gewünschter und zu untersuchen- straniung aui "^CId'¹ . _Wellenlän„_{e ee}gebeder Veränderungen und Zerstörungen an der Probe 45 Grenze des durch Beugung und Wellenlänge gegebe selbst oder zum Erzeugen einer Emission von Ato- nen ^^^ψ^^^^^^^η^^ men und Molekülen des Probenmaterials im gelade- und andererseits ware das
nen oder ungeladenen Zustand dienen, die dann mit nen Bereiches um ,^mm^_p^^
weiteren Nachweismethoden, z.B. Massenspektrome- gen kleiner as die bei bisherigen Versuchen zur Latrie. weiter analysiert werden. Anordnung» zur 50 ser-Verdampfung von J^ro^^^f J[^" Duichfühmng eines solchen Verfahrens und Prinzip- mina und entsprechend nimmt die Zahl der emittierüberlegungen über seine Anwendbarkeit sind aus der ten und nachweisbarenIonen.ab
DT-OS 15 98 632 bekannt. Verhältnismäßig problem- Das erfindungsgemaße Verfahren beruht auf der los ist die Anwendung eines solchen Verfahrens Erkenntnis, daß bei Erhöhung der Leistung dich e dann, wenn es sich um itark absorbierendes Proben- 55 im Fokus eines ^^ret^* ^d« ^AJ ⁰¹J 1°" "ⁿ material handelt und außerdem an die Kleinheit des schwach absorbierendem Probenmatenal wie ζ. Β zu analysierenden Bereichs keine besonders großen biologischem Material, sich in eineniι verhaltnismaßig Anforderunee. cestellt werden engen Intervall sprunghaft erhöht, dessen Lage und dZiSSÄ JA«« Aufgabe zugrunde, Breite von dem betreffenden Material und der verein Verfahren der genannten Art auf biologisches 60 wendeten Wellenlange abhangen kann. Wahrend Probenmatenal anzuwenden und dabei Untersuchun- man unterhalb der betreffenden Grenze praktisch gen im subzellulären Bereich durchzuführen. Es soll fehlende Absorption und kaum Emission von Atoalso ein »Strahlenstichverfahren« geschaffen werden, men oder Ionen des Probenmatenals beobachtet, tritt mit dem aus kleinsten, wohl definierten Bereichen oberhalb der Grenze eine sehr starke Absorption von biologischen Mikrostrukturen, z.B. Zellen bzw. 65 mit praktisch vollständiger Matenalzerstorung ein.
Zellenbestandteilen, Materie entfernt werden kann, Erfindungsgemäß ist nun ein Verfahren der einwobei entweder die hierdurch hervorgerufenen Ver- gangs genannten Art dadurch gekennzeichnet, daß änderungen und Zerstörungen und ihr Einfluß auf man zur Mikroanalyse von biologischem Probenma-

terial und Erzielung einer unter Zellengröße liegenden Ausdehnung des angeregten Bereiches der Probe die Leistungsdichte der Strahlung derart einstellt, daß sie im Fokus im Beugungsmaxhmm nullter Ordnung oberhalb, im Beugungsmaximum erster Ordnung dagegen unterhalb der Grenze liegt, bei der die sprunghafte Steigerung der Absorption im Probenmaterial eintritt.

Man erzielt hierdurch den Vorteil, daß maii einerseits im Fukus im zentralen Beugungsscheibchen sehr starke Absorption und dementsprechend eine starke Emission von ungeladenen und geladenen Teilchen des Probenmaterials erhält und daß andererseits diese starke Absorption auf das zentrale Beugungsscheibchen beschränkt ist, während bereits im Beugungsmaximum erster Ordnung und in allen weiteren Beugungsringen praktisch keine Absorption der Strahlung mehr eintritt und das ProLenmaterial somit unbeeinflußt bleibt. Hierdurch ist es möglich, die Abmessungen des Areals, von dem Material aus der Probe austritt, sehr stark zu verkleinern, und zwar noch unter die Grenze, die sich theoretisch nach den Gesetzen der Beugungsoptik für die Größe des Fokus ergibt. Erst hierdurch wird die Anwendung des Verfahrens für die Untersuchung biologischen Probenmaterials im subzellulären Bereich möglich. Voraussetzung hierfür ist die Tatsachs, daß die sprunghafte Erhöhung der Absorption so ausgeprägt ist, daß es möglich ist, das Austreten von Material nur im nullten, nicht aber im ersten Beugungsmaximum erfolgen zu lassen. Bei sorgfältiger Justierung und Konstanthaltung der Leistungsdichte kann es sogar möglich sein, die starke Absorption auf einen kleinen Bereich im Mittelpunkt bzw. Maximum des zentralen Beugungsscheibchens zu begrenzen, wodurch das Auflösungsvermögen noch weiter gesteigert werden kann.

Es wurde allerdings gefunden, daß beim Arbeiten in dem genannten Bereich der Leistungsdichte die Gefahr auftritt, daß sich die auf das zentrale Beugungsscheibchen konzentrierte Anregung und Aufheizung des Probenmaterials durch Sekundärprozesse, insbesondere vermutlich Stoßwellen, selbsttätig im Probenmaterial ausbreitet und zu einer explosionsartigen Vergrößerung des von der Abtragung und Verdampfung erfaßten Bereiches führt. Dieser Gefahr kann durch geeignete Wahl der Wellenlänge und/oder der Impulsdauer der verwendeten Laserstrahlung entgegengewirkt werden.

Vorzugsweise sollte die Leistungsdichte im Fokus im Beugungsmaximum nullter Ordnung oberhalb, im Beugungsmaximum erster Ordnung unterhplb einer Grenze liegen, die für übliches biologisches Probenmaterial und für normale Laserwellenlängen bei etwa 10⁷ bis 10⁹ W/cm² liegt und sich für das jeweils vorliegende Probenmaterial und die benutzte Wellenlänge durch einfache Versuche ermitteln läßt.

Um einerseits die Absorption der verwendeten Strahlung im Probenmaterial zu erhöhen und dadurch mit geringeren Leistungsdichten arbeiten zu können und um andererseits einen Fokus mit nach ^6υ den Beugungsgesetzen kleineren Abmessungen zu erzielen, arbeitet man vorzugsweise mit einem im UV-Bereich emittierenden Laser oder einem Laser, dessen Strahlung durch Frequenzverdoppelung bzw. durch nichtlineare Effekte in den UV-Wellenlängenbereich transponiert wird.

Das Arbeiten in dem genannten Bereich der Leistunesdichte ist zwar besonders vorteilhaft im Hinblick auf die Erzielung sehr kleiner Anregungsbereiche. Dabei kann jedoch der Nachteil auftreten, daß das Energiespektrum der vermutlich durch verschiedene Prozesse wie Verdampfung, Stoßionisat'on, Feldemission, den angeregten Bereich verlassenden geladenen Teilchen äußerst breit gezogen ist. Es reicht von 0 bis über 1000, bei mehrfach geladenen Ionen auch bis über 20OeV. Dem muß man dann durch geeignete Mittel begegnen, z. B. indem man auf das Probenmaterial ein elektrisches und/ oder magnetisches Feld zur Bremsung und Energiekonzentrierung der austretenden Ionen einwirken läßt.

Die Erfindung wird im folgenden an Hand der Zeichnungen näher erläutert.

F i g. 1 zeigt eine Prinzipskizze einer zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Vorrichtung;

F i g. 2 zeigt schematisch die Wirkungsweise des Verfahrens an einer mikrobiologischen Probe.

In F i g. 1 ist mit 1 eine Lasereinrichtung üblicher und im Handel erhältlicher Art bezeichnet, bestehend aus Leistungslaser, Laseroptik, Frequenzverdoppler bzw. nichtlinearem optischem Element, Blenden usw. Durch den Frequenzverdoppler kann die Wellenlänge der Laserstrahlung in den UV-Bereich verlegt werden. Der Laser arbeitet im Impulsbetrieb, wobei die Impulsdauer je nach Art des Probenmaterials und des gewünschten Anregungs- oder Zerstörungseffektes im Bereich von ns oder ns liegen kann. Sehr kurze Impulse im Bereich von 20 ns und darunter kann man durch sogenannte Pockels-Zellen steuern.

Die Laserstrahlung wird z. B. seitlich in ein Mikroskop 2 eingeleitet und durch einen Spiegel 3 zum Objektiv 2 b des Mikroskops gelenkt. Das Objektiv 2 b befindet sich in einer Kühlflüssigkeit 4, die durch eine (nicht dargestellte) Kühleinrichtung zirkuliert und dort z. B. mit flüssigem Stickstoff ständig auf eine tiefe Temperatur von z. B. 77° K gekühlt wird. Diese das Objektiv 2 b kühlende Flüssigkeit 4 wirkt gleichzeitig auf Grund ihrer optischen Eigenschaften als Immersionsflüssigkeit zur Vergrößerung der numerischen Apertur des Mikroskops. Als Kühl- und Immersionsflüssigkeit kann insbesondere Frigen 23 verwendet werden.

Die vom Objektiv 2 b fokussierte Laserstrahlung gelangt durch ein Fenster 6 in eine Vakuumkammer 5, in der durch (nicht dargestellte) Einrichtungen ständig ein hohes Vakuum aufrechterhalten wird. In der Vakuumkammer 5 befindet sich die zu untersuchende Probe 7 auf einer tiefgekühlten Probenhalterung 7 o. Eine Verbindungsstange 10 zu einem (nicht dargestellten) Probenmanipulator zum Verschieben der Probenhalterung Ta ist durch eine Vakuumdurchführung 9 aus der Vakuumkammer 5 herausgeführt und weist ferner eine Verbindung 11 zu einem Kühlmittel 12 auf. Während bei der dargestellten Ausführungsform die Probe 7 ausschließlich durch die Probenhalterung Ta gekühlt wird, kann die Anordnung auch so getroffen werden, daß die Probe 7 in direktem Kontakt am Vakuumfenster 6 anliegt, so daß die Kühlung auch direkt durch die Kühl- und Immersionsflüssigkeit 4 stattfindet.

Die Laserstrahlung wird durch das Objektiv 2 b auf die Probe 7 fokussiert. Durch die Laserstrahlung werden aus der Probe 7 geladene und ungeladene Atome und Moleküle verdampft bzw. durch direkte

Emission herausgeschlagen. Die geladenen Teilchen nach Probenmaterial und Wellenlänge — im Bereich werden mittels eines unterhalb der Probe angeordne- von etwa 10⁷ bis 10» W/cm* liegen kann, sprungten Massenspektrometers IS mit Nachweisdetektor haft an. Dieser Bereich der sprunghaften Zu-16, z. B. Sekundärelektronenvervielfacher, empfan- nähme ist so eng, daß es möglich ist, die Leistungsgen und hinsichtlich ihrer Masse analysiert. 5 dichte im zentralen BeugungsmaxiiKium 21 höher und

Um die emittierten geladenen Teilchen energtemä- im Beugungsmaximum erster Ordnung 22 niedriger Big zu homogenisieren und um gegebenenfalls unge- zu wählen. Es findet dann nur im zentralen Beuladene Teilchen nachträglich zu ionisieren, kann eine gungsmaximum 21 Absorption und eine Zerstörung Vorrichtung zur Erzeugung eines magnetischen, elek- und Verdampfung des Probenmaterials statt. Auf taschen und/oder Hochfrequenzfeldes vorgesehen io diese Weise können Bereiche 23, 24, 25 des Probensein, die durch eine Spule 8 im Innern der Vakuum- materials untersucht werden, die außerordentlich eng kammer S angedeutet ist Eine weitere felderzeu- begrenzt sind. Je knapper die Leistungsdichte im gende Einrichtung 18 außerhalb der Vakuumkam- zentralen Beugungsmaximum 21 oberhalb der mer 5 kann die Wirkung unterstützen. Statt dieser Sprunggrenze liegt, desto kleiner wird der Durchmes-Anordnung mit einer besonderen Einrichtung zur Er- 15 ser der entstehenden Krater, und er kann in günstizeugung eines Feldes kann die Vorrichtung auch so gen Fällen bis zu 0,1 μπι und darunter erreichen,
ausgestaltet sein, daß die Probe 7 direkt im Magnet- Vor dem Auslösen eines Laserimpulses muß durch feld des Massenspektrometers 15 angeordnet ist. Verschieben des Probenträgers die gewünschte, zu

Weitere unterhalb der Probe 7 angeordnete Hilfs- untersuchende oder zu beeinflussende Stelle der

und Nachweiseinrichtungen sind ein Monitor 13, be- ao Probe in den Brennfleck der Optik eingestellt wer-

stehend aus einem Kollektor oder Sekundärelektro- den. Dies gilt nicht nur für die Einstellung in den X-

nenvervielfacher zur Überwachung einer gleichmäßi- und Y-Koordinaten in der Probenebene, sondern

gen Emissionsrate von der Probe, eine Beleuchtungs- auch die Einstellung in der dazu senkrechten Z-Rich-

einrichtung 14 für die mikroskopische Beobachtung tung muß wegen der durch die große numerische

der Probe im Hellfeld, Dunkelfeld, mit Phasenkon- as Apertur sehr geringen Schärfentiefe (etwa 0,1 μΐη)

trast usw., sowie eine Vorrichtung 17 (die hinter der sehr genau erfolgen. Als Hilfmittel hierfür dient eine

Beleuchtungseinrichtung 14 nach hinten ausgestellt Hilfslichtquelle 26, die aus einer einfachen Lampe,

zu denken ist) zur Beobachtung der Lumineszenz. vorteilhafterweise aber aus einem kontinuierlich be-

Ferner kann ein (nicht dargestellter) Monitor zur triebenen und mit sichtbarem Licht arbeitenden La-

Überwachung der Konstanz der Laserstrahlung vor 30 ser (z.B. He-Ne-Laser) besteht. Von der Hilfslicht-

und/oder hinter der Probe angeordnet sein. quelle ausgehendes paralleles bzw. parallelgerichtetes

Die Einrichtungen 13, 14, 15 und 17 können bei- Licht wird durch einen Spiegel TI in den Strahlenspielsweise an einer schwenkbaren Revolverhalte- gang des impulsweise arbeitenden Lasers 1 gelenkt rung austauschbar angeordnet sein und wahlweise in und fällt dann mit diesem zusammen, so daß sein ihre Betriebsstellung eingeschwenkt werden. 35 vom Mikroskopobjektiv erzeugter Brennfleck an der-

Bei Betrieb der Vorrichtung wird folgendermaßen selben Stelle und in derselben Schärfenebene liegt vorgegangen: Durch zirkulierende Kühlflüssigkeit 4 wie der des Lasers 1. Dieser Brennfleck ist im Blickwird das Objektiv 2 b gekühlt Die Probe wird in feld des Mikroskops vom Okular 2 α her durch den einer getrennten Vorrichtung in Form eines tiefge- halbdurchlässigen Spiegel 3 sichtbar und dient nach kühlten, wasserhaltigen Schnitts hergestellt, und zwar 40 Art eines Fadenkreuzes als Marke für die Einstellung mit Hilfe der Kryotomietechnik und unter Anwen- auf eine gewünschte Stelle der Probe. Kriterium für dung einer so raschen Abkühlung, daß keine die die richtige Einstellung einer Zellsubstruktur in der Zellstrukturen zerstörende Kristallbildung eintritt. Z-Richtung ist dabei im wesentlichen die deutlich an-Die Probe wird durch Kühlung der Probenhalterung steigende Intensität des reflektierten bzw. gestreuten Ta sowie gegebenenfalls durch Kontakt am gekühl- 45 Lichts, die dann eintritt, wenn sich im Brennfleck ten Vakuumfenster 6 auf der erforderlichen Tieftem- eine Zelle oder Zellensubstruktur an Stelle von peratur gehalten. Durch Beobachtung durch das durchsichtiger Probenflüssigkeit befindet
Okular la des Mikroskops2 wird nun der zu unter- Dieser Effekt läßt sich auch für eine automatische suchende Bereich der Probe 7 unter das Objektiv 2 b Auslösung der Laserimpulse ausnutzen. Hierzu sind eingestellt. Sodann wird die von der Einrichtung 1 50 oberhalb und/oder unterhalb der Probe, z.B. an den erzeugte Laserstrahlung, ζ. B. in Impulsen von 20 ns mit 28 und 29 bezeichneten Stellen, d. h. außerhalb oder kürzer, auf die gewünschte Stelle der Probe ge- des direkten Strahlengangs, ein oder mehrere Photorichtet. Beispielsweise zeigt Fig.2 einen Ausschnitt empfänger angeordnet, die für die Strahlung der aus einer Probe mit roten Blutkörperchen 20, die Hilfslichtquelle 26 vorzugsweise selektiv empfindlich einen Durchmesser von etwa 8 μ haben. Die Lei- 55 sind. An die Photoempfänger ist ein Steuergerät 30 stungsdichte im Fokus des Laserstrahls verteilt sich angeschlossen. Gelangt eine der in der Probenflüssigzu etwa 96°/o auf das zentrale Beugungsmaximum keit schwimmenden Mikrostrukturen in den Brenn-21, zu etwa 3 % auf das Beugungsmaximum erster fleck der Hilfslaserstrahlung, und steigt dadurch die Ordnung 22 und zu weniger, als. 1 °/o auf die restli- von den Photoempfängern 28 bzw. 29 empfangene chen, zu vernachlässigenden Beugungsringe. 60 Streustrahlung über einen nach Erfahrung einzustel-

Die Absorption der Laserstrahlung in dem organi- lenden Schwellenwert an, so löst das Steuergerät 3(

sehen Probenmaterial ist bei geringer Leistungsdichte einen Impuls des Lasers 1 aus.
äußerst gering, d. h. nahezu null, und steigt bei zu- Der Hilfslaser 26 kann außer zum Zielen im Be

nehmender Leistungsdichte zunächst innerhalb eines trieb auch zum Vorjustieren der Vorrichtung ver

verhältnismäßig engen Intervalls, dessen Mitte — je 65 wendet werden.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

¹ den betreffenden Mikroorganismus Gegenstand der

Γ- t J^-rhuiM! sind (z. B. »Genchirurgie« und ähnliche

Patentansprüche: αΞΑΑ oder die Zusammensetzung des

Z"„.„Materials gemessen und dadurch Auf-

1. Verfahren zur auf Mikrobereiche be- ermmertenMatVertÄung bestimmter Substanzen schränkten Verdampfung, Zerstörung, Anregung 5 scbiuß uoer " gewonnen wird. Beisoiele für und/oder Ionisierung von Probenmaterial mittels ^m?^e,!™ ,?_nt#«_1IchunBen sind z. B. die allgemeine Erkohärenter elektromagnetischer Strahlung, die solche Untersuchmngen^ ^ Stoffwechselvorgänge durch ein optisches System auf die Probe fokus- ^™h*n%™ ^ innerhalb der Zelle und siert wird, dadurch gekennzeichnet, und ™^s^™ _{h Enzvme> die} an Substmkturen daß man zur Mikroanalyse von biologischem » ^ l^k wie Membranen, Mitochondrien, Lysoso-Probenmaterial und Erzielung einer unter Zellen- der£juk _γ gebunden sind. Insbesondere größe liegenden Ausdehnung des angeregten Be- ^mf^{n u}*f ™^ _{ώε su}bzelluläre Verteilung der für reichs der Probe die Leistungsichte der Strah- f^f^J^^ wichtigen aktivierenden cder lung derart einstellt, daß sie im Fokus im Beu- die EnzymtaugK.c_u |₊ ^₊ ^ .^

gungsmaximum nullter Ordnung oberhaib, im 15 %™Z^J^™ \_onenverteilungen innerhalb der Beugangsmaximum erster Ordnung oagegen un- °™*™?*™^_{e erheb]iche Rol)e bei} der Erterhalb der Grenze liegt, bei der die spnmghaf* f^^ZT^nZskelertezniLungen, Nierener-Steigerung der Absorption im Probenmatenal ^™« "£ J_er Krebsforschung u. dgl. Schließ-"i" Verfahren nach Anspruch 1, dadurch _ge- ,o lieh können[ .ud> allgemeine Erkenntnhse über die kennzeichnet, daß die Leistungsdichte im Beu- JjJr — b£ nn^oder neue^Pharmaka durJ,

gungsmaximum nullter Ordnung oberhalb, im ^Un _f ^tersucnT^g _lh^_{r 7e}i_{le ee}wonnen werden
Maximum erster Ordnung unterhalb einer zwi- Stoffs innerhalb der Zeil gewann«we««"·
sehen ΙΟ» _{und 10}> w/cm« liegenden Grenze liegt, Die Anwendung,des ^fj^

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ,₅ rens auf diesem ^Auf^
gekennzeichnet, daß man mit von einem Rubinla- Schwierigkeiten entgegen.
fer mittels Frequenzverdopplung bzw. nichtü- Verfahren .^P*™*
nearer optischer Effekte erzeugter kohärenter Schwierigkeiten
Strahlung im UV-Wellenlängenbereich oder kanntgeworden. ^

einem im UV emittierenden Lastr arbeitet. 30 dann, -enn das Absorpt.onsve

Probenmaterials fur die anregende Laserstrahlung sehr gering ist, insbesondere wenn es sich um mikroskopisch beobachtbare Dünnschichtpräparate mit

Zellflüssigkeit enthaltendem Zellenmatenal handelt.

_a5 Ein zweites Hauptproblem besteht in der Forderung nach äußerst kleinen Abmessungen des von der