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Stand der Technik
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren, ein LOC (Lab-on-a-Chip) und eine Analysevorrichtung zur Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation der DNA der Zellen.
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In der Diagnostik von Infektionskrankheiten gewinnt der Nachweis von Antibiotika-Resistenzen aufgrund zunehmender Verbreitung dieser Resistenzen eine immer größere Bedeutung. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), Lungenentzündung (Pneumonie), Sepsis, Tuberkulose, und Fluorchinolonresistenz bei Escherichia coli seien als einige Beispiele genannt. In der herkömmlichen Diagnostik werden diese Resistenzen meist zellkulturbasiert ermittelt. Die zellkulturbasierte Resistenzbestimmung ist jedoch ein relativ langwieriges Verfahren, da für die Kultur und Auswertung 2–3 Tage angesetzt werden müssen. Mittels DNA-Analyse der Bakterien-DNA lassen sich Resistenzen deutlich schneller bestimmen. Dabei muss jedoch die DNA der Zellen amplifiziert, d. h. vermehrt werden.
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Die Polymerase-Chain-Reaction (PCR, Polymerase-Kettenreaktion) wurde Mitte der 80-er Jahre entdeckt und wird für die DNA-Amplifizierung heute flächendeckend in Diagnostik, Forschung und Forensik eingesetzt. Dabei wird eine temperaturstabile DNA-Polymerase zu der zu amplifizierenden DNA zugegeben und ein Temperaturzyklus bestehend aus
- – Denaturierung, d. h. Aufspaltung DNA in Einzelstränge, bei ca. 95°C;
- – Primeranlagerung bei ca. 55°C; und
- – Elongation. d. h. Synthese der neuen DNA, bei ca. 72°C;
mehrfach – bis zu 40 × – wiederholt, wobei sich bei jedem Zyklus die DNA-Menge verdoppelt. Für die Verzehnfachung der DNA-Menge sind also im Schnitt 3,3 Zyklen notwendig. Generell wird dazu das DNA-haltige Material vor der PCR aufgereinigt, wobei nach einem Assay-Ablauf-Protokoll vorgegangen wird.
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Bei Gram-negativen Zellen funktioniert die PCR auch wenn nach einem verlängerten ersten Hochtemperaturschritt direkt ohne Reinigung Zellmaterial eingesetzt wird, da bei Temperaturen nahe dem Siedepunkt die Zellen zerstört werden und DNA freigesetzt wird. Dies funktioniert jedoch nicht bei Gram-positiven Zellen, die eine besonders widerstandsfähige Zellmembran besitzen. Gram-positive Bakterien sterben zwar bei dieser Erhitzung ab, die in ihnen enthaltene DNA kann jedoch die Bakterienhülle nicht verlassen und entsprechend nicht vervielfältigt werden.
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Für die Lyse Gram-positiver Zellen werden derzeit verschiedene Verfahren eingesetzt, darunter Enzymatische Lyse, Ultraschall-Lyse und Elektroporation. Eine Photolyse mit einem Laser beschreibt die
EP 4342914 A1 . Dort wird zunächst eine Zellen enthaltende Lösung auf einen Metalloxid-Träger gegeben, wobei das Metalloxid Zellen bindet. Anschließend wird das Metalloxid mit dem Laser bestrahlt, wobei die Zellwände zerstört und DNA frei gesetzt werden. Anschließend werden in einem Aufreinigungsschritt nicht gebundene Zellbestandteile ausgewaschen.
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Offenbarung der Erfindung
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Vorteile der Erfindung
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Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, dem LOC und der Analysevorrichtung lassen sich mit im Vergleich zum Stand der Technik geringem Aufwand Zellen, insbesondere Bakterien, Pilze, Viren, Blutzellen und Zellverbände in einem Filter ohne Enzyme lysieren. Dies ist gegebenenfalls auch unter Vermeidung einer Aufreinigung nach der Lyse möglich.
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Die Erfindung lässt sich einfach auf den aktuellen biochemischen Assay übertragen und schafft einen voll integrierten LOC.
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Die Erfindung ermöglicht es, auch Gram-positive Keime oder andere schwer lysierbare Zellen wie Pilze oder Sporen zu amplifizieren, was erst eine Plattform mit Applikationen für Harnwegsinfekte, MRSA, Pneumonie, Sepsis, Mycosen, usw. ermöglicht.
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Ein Laser-Scanner zum Abscannen einer Probe kann günstig mit einem Mikrospiegel in sehr kleiner Bauweise realisiert werden und ermöglicht ein kompaktes Analysegerät.
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Die Laserlyse lässt sich mit standardisierten Bauelementen für Optik, Scanner und Laser kompakt realisieren mit einem wesentlich geringeren Aufwand als Lyseeinrichtungen nach dem Stand der Technik.
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Gegenüber enzymatischen/chemischen Lysen ist die deutliche Vereinfachung des Assays ausschlaggebend.
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Gegenüber Ultraschalllysen ist neben dem Aufwand für den Generator die einfachere Auslegung und Abstimmung des Chips entscheidend.
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Die Erfindung ermöglicht ein LOC als μTAS (Micro Total Analysis System), da der Ablauf der Aufarbeitungs- und Amplifizierungsschritte vor der Detektion gegenüber dem Stand der Technik vereinfacht ist und eine in einen Biochip übertragbare, automatisierungsfähige Vereinfachung des Protokolls geschaffen worden ist.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 zeigt eine schematische Darstellung eines LOC in einer Analysevorrichtung zur Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation, beide jeweils gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
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2 zeigt eine schematische Darstellung eines LOC in einer Analysevorrichtung zur Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation, beide jeweils gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
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3 zeigt ein Flussdiagramm des Verfahrens zur Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ohne Reinigungsschritt.
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4 zeigt ein Flussdiagramm des Verfahrens zur Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mit Reinigungsschritt.
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Ausführungsformen der Erfindung
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1 zeigt ein LOC 10 in einer Analysevorrichtung 30 zur Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation, beide jeweils gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur DNA-Auswertung mit einem Array 18. Das LOC 10 weist ein steifes, flaches Substrat 11 mit einem fluidischen Netzwerk 12 in dem Substrat 11 auf. Zum fluidischen Netzwerk 12 gehören beispielhaft gezeigte Mikrokanäle 13, Ventile 14 und Kammer 15, sowie eine Multifunktionskammer 19 mit einem Filter 16, in der unter anderem eine PCR stattfindet, und eine Array-Kammer 17 mit dem Array 18. Der Filter 16 enthält hier als Filtermedium ein Silica-Pad und ist über ein erstes externes Temperierelement 43 unter dem Substrat 11 temperierbar. Der Filter 16 füllt einen durchströmten Querschnitt der Multifunktionskammer 19 voll aus. Die Array-Kammer 17 ist über ein zweites Tempererelement 44 unter dem Substrat 11 temperierbar. Elemente des fluidischen Netzwerks 12 können auch im Inneren des LOC 10 verlaufen und sind an der Oberseite mit einer nicht gezeigten Membran bzw. Folie flüssigkeitsdicht abgeschlossen. Die Betätigungselemente für den Betrieb des fluidischen Netzwerks 12 und eine fluidische Schnittstelle zur Analysevorrichtung 30 sind nicht dargestellt.
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Die Analysevorrichtung 30 weist eine Photolyse-Lichtquelle 31 zur Bestrahlung des Filters 16 und eine Steuerung 32 zur Durchführung der Lyse mittels Bestrahlung des Filters auf. Die Photolyse-Lichtquelle 31 weist in dieser Ausführungsform einen Laser 33, einen Strahlaufweiter 34, einen Mikrospiegel 35 und eine Linse 36 auf. Ein den Laser 33 verlassender Lichtstrahl 37 verläuft über den Strahlaufweiter 34 zum Mikrospiegel 35 und wird dort umgelenkt und verläuft weiter über die Linse 36 zum Filter 16. In dieser Ausführungsform ist der Mikrospiegel 35 ein steuerbarer Mikrospiegel, mit dem der Laser-Lichtstrahl 37 den Filter 16 fokussiert und entsprechend dem Strahldurchmesser rasterförmig überstreichen kann. Die Analysevorrichtung 30 weist weiterhin eine Kamera 39 und eine Array-Beleuchtungs-Lichtwelle 40 auf, die jeweils auf das Array 18 gerichtet sind.
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Die Steuerung 32 ist über elektrische Steuerleitungen 38 mit dem Laser 33, dem Mikrospiegel 35, der Kamera 39, der Array-Beleuchtungs-Lichtwelle 40, dem Mikrospiegel 35 und den Temperierelementen 43 und 44 verbunden.
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Die Analysevorrichtung 30 weist weiterhin eine nicht gezeigte mechanische Schnittstelle mit dem LOC 10 auf, mit der das LOC 10 in der Analysevorrichtung 30 definiert positioniert wird. Aufgrund der definierten Positionierung des Filters 16 und des Arrays 18 im LOC sind LOCs austauschbar in der Analysevorrichtung 30 ohne eine erneute optische Justierung einsetzbar. Die Photolyse-Lichtquelle 31 ist bei eingelegtem LOC 10 auf die Position des Filters 16 gerichtet und die Kamera 39 ist auf die Position des Array 18, hier in der Array-Kammer 17 angeordnet, gerichtet. Bei eingelegtem LOC 10 ist der Filter 16 über dem ersten externen Temperierelement 43 angeordnet, und die Array-Kammer 17 ist über dem zweiten Temperierelement 44 angeordnet. Als Temperierelemente können Peltierelemente, Micro-Hotplates oder konvektive Heiz-/Kühl-Elemente, gegebenenfalls elektrische Widerstände, auch in Kombination verwendet werden. Die mechanische Schnittstelle ermöglicht einen geeigneten Wärmeübergang.
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Im Betrieb steuert die Steuerung 32 den Ablauf des Assay-Protokolls auf dem LOC 10. Das fluidische Netzwerk 12 wird über die fluidische Schnittstelle gesteuert. Temperaturen und Temperaturänderungen werden über die Temperierelemente 43 und 44 gesteuert. Die Detektion erfolgt mit einem Array-/Biochip und wird mittels der eine Fluoreszenz anregenden eine Array-Beleuchtungs-Lichtwelle 40 und der ein Fluoreszenzlicht beobachtenden Kamera 39, alternativ einem weiteren (nicht gezeigten) Photometer überprüft. Die Auswertung einer DNA-Analyse erfolgt durch die Beobachtung, an welchen Positionen auf einem Array 18 eine Fluoreszenz statt findet, mit der Kamera 39.
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Das LOC 10 zur Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation hat eine gemeinsame, einen Filter 16 aufweisende, Multifunktionskammer 19 für Akkumulation von Zellen, Färbung der Zellen, Zellen-Lyse und PCR.
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2 zeigt ein LOC 46 in einer Analysevorrichtung 47 zur Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation, beide jeweils gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur DNA-Auswertung. Die aus 1 bekannten Elemente haben wieder dieselben Bezugsziffern. In dieser Ausführungsform erfolgt die Detektion mittels Real-Time-PCR in derselben Kammer wie die Lyse, in der Multifunktionskammer 19. Dazu werden die in der Real-Time-PCR eingesetzten Fluoreszenzfarbstoffe mittels einer Lichtquelle 41 angeregt und mit einem Detektor 42 wird die resultierende Fluoreszenzstrahlung, ggf. bei verschiedenen Wellenlängen, beobachtet. In dieser Ausführungsform ist eine Arraykammer nicht erforderlich.
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3 zeigt ein Flussdiagramm 50 des Verfahrens zur Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation der DNA der Zellen gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Das Verfahren weist die Verfahrensschritte auf:
- a) Positionierung der Zellen auf einem Filter;
- b) Färbung der Zellen;
- c) Zugeben einer PCR-Behandlungs-Lösung;
- d) Photolyse der Zellen; und
- e) Amplifikation von DNA der Zellen mittels PCR.
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Damit liegt die DNA der Zellen in hinreichender Menge für DNA-Untersuchungen vor. Das Verfahren ist für Gram-negative und Gram-positive Zellen geeignet.
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Vorteilhaft folgt der weitere Verfahrenschritt
- f) Mischung der amplifizierten DNA mit einem Hybridisation Buffer. Dies dient der Vorbereitung für den weiteren Verfahrenschritt
- g) Analyse der amplifizierten DNA. Dies betrifft die Analyse mittels einem Array, entsprechend einer Vorrichtung wie zum Beispiel in 1 gezeigt.
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In einer alternativen Ausführungsform ohne Array, entsprechend einer Vorrichtung wie zum Beispiel in 2 gezeigt, entfallen Verfahrenschritte f) und g) und Verfahrenschritt e), in diesem Fall Real-Time-PCR, findet direkt in der Multifunktionskammer 19 in 2 statt.
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Zu den einzelnen Verfahrensschritten folgen weitere Erläuterungen, gegebenenfalls unter beispielhafter Bezugnahme auf die Analysevorrichtung 30 und das LOC 10 aus 1 oder 2. In Verfahrensschritt a) wird zur Positionierung der Zellen auf dem Filter eine zellhaltige Flüssigkeit, meist Körperflüssigkeit wie Urin, Sputum, Serum, Plasma, Abstriche, BAL (Broncheoalveoläre Lavage), etc. über ein Filtermedium, in 1 und 2 über das Silica-Faserpad des Filters 16, gepumpt. Dabei werden die Zellen abgeschieden und mit wenigen 100 μl Puffer gewaschen. Das Silica-Faserpad enthält Glasfasern mit Durchmesser d = 0,5 μm–10 μm.
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Bezüglich der Reihenfolge der Verfahrensschritte a) und b) sind zwei alternative Ausführungsformen möglich, nämlich die Zellen vor oder nach dem Aufbringen auf dem Filter 16 zu färben.
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Zur Färbung der Zellen in Verfahrensschritt b) wird eine Farbstofflösung, ca. 50 μl, auf den Filter gegeben und ca. 30 s inkubiert. Anschließend wird gewaschen, z. B. zuerst mit 200 μl Ethanol und danach mit 200 μl Wasser. Als Färbereagentien können verwendet werden:
- 1) Gram-Färbung – Kristallviolett-Lösung, waschen mit 200 μl Wasser, 2 min fixieren mit 50 μl Lugolscher Lösung (Lugol's solution, Kl3-Lösung);
- 2) Methylenblau-Lösung;
- 3) weitere Farbstoffe wie Malachitgrün, Safranin, Fuchsin (mit PAS-Reaktion, Periodic acid-Schiff reaction), Fuchsinschwefelige Säure für Pilze, Brillant-Grün, Methylgrün, Ethyl-Grün, Brillant-blau, Coomassie violett, etc.. Diese Farbstoffe weisen eine Ammoniumgruppe auf, typischerweise in einem Chinoiden System mit weiteren Alkyl-/Aryl-aminogruppen. Viele gehören zur Klasse der Triphenylmethan-Fabstoffe. Die Farbstoffe können auch als Feststoffe in Depots auf dem LOC 10, z. B. lyophilisiert, gelagert werden und mit Wasser in den Filter 16 geschwemmt werden. Die gefärbten Bakterien lassen sich mit Licht mit vergleichsweise geringen Intensitäten lysieren.
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In Verfahrensschritt c) wird der Filter mit der PCR-Behandlungs-Lösung, dem so genannten Mastermix, befüllt. Diese PCR-Behandlungs-Lösung besteht aus einer Mischung aus DNTPs (deoxynucleotide triphosphate), Primern, Polymerase und Puffer. Ferner ist in der Mischung noch eine Substanz zur Blockierung der Filteroberfläche enthalten, z. B. BSA (Bovine serum albumin), PEG (Polyethylene glycol), PPG (Polypropylene glycol). Es ist auch möglich, die erst in Verfahrensschritt e) benötigten Substanzen erst nach Verfahrensschritt d) zuzugeben.
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Die Photolyse der Zellen in Verfahrensschritt d) erfolgt bevorzugt mittels Laserlyse. Bei der Photolyse wird die DNA der Zellen freigesetzt. Der Filter, auf dem sich die angefärbten Zellen befinden, wird mit einem handelsüblichen Laser bestrahlt. Dabei wird vorzugsweise der Laserstrahl fokussiert und mit einem Mikrospiegel über den Filter geführt, wobei möglichst die gesamte Filterfläche lückenlos mit dem Laserstrahl überstrichen wird. Alternativ kann der Filter auch mit Hochenergie-LEDs, Blitzlampen oder fokussierten Lichtquellen mit hoher Energiedichte bestrahlt werden. Entscheidend ist dabei, dass die Bakterien möglichst viel Licht absorbieren, wohingegen die Matrix und die umgebende Flüssigkeit möglichst wenig Energie aufnehmen sollen. Dies wird erreicht, indem das zur Photolyse benutzte Licht im Wesentlichen in einem Wellenlängenbereich liegt, der von den gefärbten Zellen stark absorbiert wird, jedoch von Wasser schwach absorbiert wird. Die Farbe der gefärbten Zellen wird vom Farbstoff bestimmt, kann aber von der Farbe des Farbstoffs verschieden sein. Die Wellenlänge oder Wellenlängen des Photolyse-Lichts sind auf die Farbe der gefärbten Zellen abgestimmt, so dass der Absorptionskoeffizient der gefärbten Zelle ein Vielfaches des Absorptionskoeffizienten eines Fluids oder einer stationären Phase eines um die Zellen vorhanden Puffermediums, meist Wasser, beträgt. Ein Vielfaches kann beispielsweise mindestens den Faktor 2,5, zum Beispiel 10 sein. Eine hohe Energieaufnahme des Fluids oder der stationären Phase hätte eine starke schlecht kontrollierbare Temperaturerhöhung zur Folge, die zur Inaktivierung der Polymerase, zum Verdampfen des flüssigen Mediums und zum Platzen der LOCs führen kann. Die Photolyse-Lichtquelle weist vorteilhafterweise eine Wellenlänge im sichtbaren Bereich, die komplementär zur Farbe der angefärbten Zellen ist auf, z. B. 532 nm bei Rotfärbung der Zellen mit Methylenblau, so dass die Absorption durch die gefärbten Bakterien möglichst hoch ist.
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Zwischen den Verfahrensschritten d) und e) findet in dieser Ausführungsform keine Aufreinigung statt. Die Verfahrensschritte a) bis d) finden alle im Filter 16 statt. Anschließend wird der Inhalt des Filters 16 in die Array-Kammer 17 gepumpt, in der anschließend die Hybridisierung und Detektion stattfindet.
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Bei der PCR-Amplifikation der DNA in Verfahrensschritt e) wird der Filter den für die PCR üblichen thermischen Zyklen unterworfen. Bei diesen Temperaturzyklen wird die DNA wie bereits oben beschrieben vervielfältigt. Nun liegt die DNA der Zellen in hinreichender Menge für DNA-Untersuchungen vor. Das Verfahren ist für Gram-negative und Grampositive Zellen geeignet. Anschließend kann die DNA von dem Filterelement eluiert werden. So werden z. B. aus 10 ml Urin mit 105 Zellen nach 20 Zyklen 1011 DNA Moleküle in 50 μl isoliert. Alternativ kommen andere Amplifikationen, auch isotherme, ebenso in Frage, z. B. NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplifikation).
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Nach dem Zufügen eines so genannten Hybridisation Buffer in Verfahrensschritt f) und Aufbringen auf das DNA-Array 18 mittels des fluidischen Netzwerks 12 ist die DNA für die Detektion bzw. Analyse der amplifizierten DNA in Verfahrensschritt g), mittels DNA-Array, beispielsweise Array 18 in 1, vorbereitet. Der Hybridisation Buffer kann ein Puffersystem und ein Salz zur Erhöhung einer Salzkonzentration umfassen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich einfach sowohl auf die Filter-PCR als auch auf einen voll integrierten LOC übertragen.
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4 zeigt ein Flussdiagramm 60 des Verfahrens zur Lyse von Zellen und PCR-Amplifikation der DNA der Zellen gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mit einem Reinigungsschritt. Das Verfahren weist die Verfahrensschritte auf:
- a) Positionierung der Zellen auf einem Filter;
- b) Färbung der Zellen;
- d) Photolyse der Zellen;
- d1) Reinigung von DNA der Zellen;
- c) Zugeben einer PCR-Behandlungs-Lösung; und
- e) Amplifikation der DNA der Zellen mittels PCR.
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Damit liegt die DNA der Zellen in hinreichender Menge für DNA-Untersuchungen vor. Das Verfahren ist für Gram-negative und Gram-positive Zellen geeignet.
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Vorteilhaft folgt der weitere Verfahrenschritt
- f) Mischung der amplifizierten DNA mit einem Hybridisation Buffer. Dies dient der Vorbereitung für den weiteren Verfahrenschritt
- g) Analyse der amplifizierten DNA. Die Analyse umfasst die Hybridisierung und die Detektion.
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In dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung entsprechen die gleichnamigen Verfahrensschritte den aus der Beschreibung von 3 bekannten Verfahrensschritten, unter Berücksichtigung der folgenden Unterschiede. Nach der Photolyse der Zellen in Verfahrensschritt d) erfolgt nun eine Reinigung von DNA der Zellen in Verfahrensschritt d1). Diese Reinigung kann durch einen oder mehrere Waschschritte erfolgen, in denen Zellbestandteile außer DNA entfernt werden. Wegen des mit der Reinigung einher gehenden Flüssigkeitsaustauschs wird die PCR-Behandlungs-Lösung erst nach der Reinigung zugegeben – Verfahrensschritt c) erfolgt also nach Verfahrensschritt d1).
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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