JP4190223B2 - 細胞破砕装置及び細胞破砕方法、治療装置並びに細胞成分の選択的分離方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、標的細胞を含む試料に熱を付与することなく、該試料中の標的細胞を選択的にかつ物理的に破砕可能な細胞破砕装置及び細胞破砕方法、該細胞破砕装置を少なくとも有し、正常細胞にダメージを与えることなく病気細胞(癌細胞)のみに効率的にダメージを与えることが可能な治療装置、並びに該細胞破砕方法を用い、標的細胞を含む試料中から該標的細胞のDNA等の細胞構成成分のみを選択的にかつ効率的に分離可能な細胞成分の選択的分離方法に関する。
【0002】
【従来の技術】
従来、細胞を死滅させ破砕する方法として、細胞の物理的破砕、自己消化などを利用する方法が知られている。細胞の物理的破砕を利用する方法としては、圧力破砕法、ボールミルなどを用いた機械的磨砕法などが知られている。また、細胞の自己消化を利用する方法としては、酢酸エチル等を細胞に働かせる方法などが知られている。しかし、これらの場合、試料液中の細胞を全部破砕し、破砕に選択性がないため、試料液中の特定細胞のみを死滅させ破砕する場合には、予め試料液中から標的細胞を分離しなければならなかった。このため、試料中の細胞を選択的に破砕する場合には、その作業が複雑で大変であった。
近時、細胞を選択的に死滅させることができる方法として、ハイパーサーミア法が知られている。しかし、このハイパーサーミア法の場合、標的細胞に熱を印加し、該標的細胞のアポトーシスを利用するので、極めて瞬時に該標的細胞を死滅させることができない。また、死滅させた該標的細胞から細胞成分を酵素分解等の影響を受けることなく得ることは難しい。
したがって、標的細胞を選択的にかつ瞬時に死滅させ破砕することができる簡便な細胞破砕装置及び細胞破砕方法は未だ提供されていないのが現状である。また、標的細胞の細胞成分を選択的にかつ酵素分解等の影響を受けることなく効率的に得ることができる細胞成分の選択的分離方法も未だ提供されていないのが現状である。
【0003】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、従来における問題を解決し、前記現状に鑑み、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明は、従来における問題を解決し、標的細胞を含む試料に熱を付与することなく、該試料中の標的細胞を選択的にかつ瞬時に死滅させ物理的破砕が可能な簡便な細胞破砕装置及び細胞破砕方法、該細胞破砕装置を少なくとも有し、正常細胞にダメージを与えることなく病気細胞(癌細胞)のみに効率的にダメージを与えることが可能な治療装置、並びに該細胞破砕方法を用い、標的細胞を含む試料中から該標的細胞のDNA等の細胞構成成分のみを選択的にかつ酵素分解等の影響を受けることなく効率的に分離可能な細胞成分の選択的分離方法を提供することを目的とする。
【0004】
<1> 標的細胞に特異的に結合可能であり、磁場を受けると移動可能な磁性ビーズと、前記標的細胞に特異的に結合した前記磁性ビーズに磁場を付与して該磁性ビーズを移動させ、該標的細胞を破壊させる標的細胞破砕手段とを少なくとも有することを特徴とする細胞破砕装置である。該細胞破砕装置においては、標的細胞に特異的に結合可能であり、該標的細胞に特異的に結合した前記磁性ビーズに対し、標的細胞破砕手段が磁場を付与する。すると、磁性ビーズは磁場を受けると移動可能であるので、該磁場により前記磁性ビーズが瞬時に移動する。前記標的細胞が該磁性ビーズにより表面が強く引っ張られ、物理的に破砕されて死滅する。このとき、破砕されるのは前記磁性ビーズが表面に付着した前記標的細胞だけであり、試料中に該標的細胞以外の細胞がある場合であっても、該標的細胞だけが選択的に破砕され死滅する。
<2> 磁性ビーズが標的細胞に特異的に結合可能な抗体を表面に有してなる前記<1>に記載の細胞破砕装置である。該細胞破砕装置においては、前記磁性ビーズが前記抗体を介して前記標的細胞に特異的に結合する。その結果、該磁性ビーズが表面に付着した前記標的細胞だけが選択的に破砕され死滅する。
<3> 磁性ビーズが超常磁性である前記<1>及び<2>のいずれかに記載の細胞破砕装置である。該細胞破砕装置においては、前記磁性ビーズが超常磁性であるので、該磁性ビーズは、磁場が付与されている時にだけ、磁場に沿って移動可能であり、磁場が付与されていない時には、磁性が残らず、試料液中を分散可能である。
<4> 磁性ビーズの表面がプロテインGでコートされた前記<1>〜<3>のいずれかに記載の細胞破砕装置である。該細胞破砕装置においては、前記磁性ビーズの表面がプロテインGでコートされているので、その表面に前記抗体が容易に吸着され得る。
<5> 磁性ビーズの粒径が0.5〜10μmである前記<1>〜<4>のいずれかに記載の細胞破砕装置である。該細胞破砕装置においては、前記磁性ビーズの粒径が0.5〜10μmであるので、前記標的細胞の表面に前記抗体を介して容易に結合可能である。
<6> 標的細胞破砕手段がパルス磁気刺激装置である前記<1>〜<5>のいずれかに記載の細胞破砕装置である。該細胞破砕装置においては、前記標的細胞破砕手段がパルス磁気刺激装置であるので、前記磁性ビーズに対して磁気のパルス波が印加される。このため、前記標的細胞は、磁気のパルス波を受けて瞬時に移動する前記磁性ビーズにより破砕され死滅する。
<7> パルス磁気刺激装置が発生する磁気刺激パルスが、シングルパルス及びマルチパルスの少なくともいずれかである前記<6>に記載の細胞破砕装置である。該細胞破砕装置においては、前記パルス磁気刺激装置が発生する磁気刺激パルスが、シングルパルス及びマルチパルスの少なくともいずれかであるので、前記標的細胞が、磁気のパルス波の1回乃至多数回を受けて前記磁性ビーズが1回乃至多数回、瞬時に移動することにより効率よく破砕され死滅する。
<8> パルス磁気刺激装置が、電気が導通されると電磁誘導により磁場を発生可能な磁場発生部を有する前記<6>及び<7>のいずれかに記載の細胞破砕装置である。該細胞破砕装置においては、前記パルス磁気刺激装置が、電気が導通されると電磁誘導により磁場を発生可能な磁場発生部を有するので、磁場の発生、磁場の強さ等の制御が容易である。
<9> 磁場発生部が円形コイルである前記<8>に記載の細胞破砕装置である。該細胞破砕装置においては、前記磁場発生部が円形コイルであるので、該磁場発生部の中心に試料を配置させると、該磁場発生部より試料に磁場が印加可能である。
<10> 標的細胞に特異的に結合した磁性ビーズを収容可能であり、内部における下底部が略テーパー形状であり、かつ該下底部近傍に永久磁石が設けられた磁性ビーズ収容器を有してなり、該磁性ビーズ収容器が、パルス磁気刺激装置における磁場発生部に配置されて処理される前記<8>及び<9>のいずれかに記載の細胞破砕装置である。該細胞破砕装置においては、前記磁場発生部に配置された磁性ビーズ収容器中の磁性ビーズが前記永久磁石により引き寄せられているので、磁場を一箇所に集中的に印加することができ、破砕処理効率に優れる。
<11> 抗体が標的細胞の表面に存在する抗原に特異的に結合可能である前記<1>〜<10>のいずれかに記載の細胞破砕装置である。該細胞破砕装置においては、前記標的細胞の表面に存在する抗原に対し、前記磁性ビーズの表面における前記抗体が特異的に結合する。このため、該磁性ビーズは前記標的細胞に抗原抗体反応により選択的に結合する。
<12> 標的細胞に特異的に結合可能な抗体が磁性ビーズの表面に吸着された前記<1>〜<11>のいずれかに記載の細胞破砕装置である。該細胞破砕装置においては、前記標的細胞の表面に存在する抗原に対し、前記磁性ビーズの表面に吸着された前記抗体が特異的に結合する。このため、該磁性ビーズは前記標的細胞に抗原抗体反応により選択的に結合する。
<13> 標的細胞が癌細胞であり、抗体が癌特異的抗体である前記<1>〜<12>のいずれかに記載の細胞破砕装置である。該細胞破砕装置においては、前記癌細胞の表面に存在する癌特異的抗原に対し、前記磁性ビーズの表面における前記癌特的抗体が特異的に結合する。このため、該磁性ビーズは前記癌細胞に抗原抗体反応により選択的に結合する。その結果、前記磁性ビーズが表面に付着した前記癌細胞だけが選択的に破砕され死滅する。
<14> 癌細胞が、白血病細胞、固形癌細胞及び腫瘍細胞から選択される前記<13>に記載の細胞破砕装置である。該細胞破砕装置においては、癌細胞の種類の如何に拘らず、核癌細胞のみが選択的に破砕され死滅する。
<15> 前記<1>〜<14>のいずれかに記載の細胞破砕装置を少なくとも有することを特徴とする治療装置である。該治療装置は、前記細胞破砕装置を有しており、該細胞破砕装置における標的細胞破砕手段が磁場を付与する。すると、該磁性ビーズは磁場を受けると移動可能であるので、該磁場により前記磁性ビーズが瞬時に移動する。前記標的細胞(癌細胞等)が該磁性ビーズにより表面が強く引っ張られ、物理的に破砕されて死滅する。このとき、破砕されるのは前記磁性ビーズが表面に付着した前記標的細胞(癌細胞等)だけであり、試料中に該標的細胞以外の細胞がある場合であっても、該標的細胞(癌細胞等)だけが選択的に破砕され死滅する。
<16> 標的細胞に特異的に結合可能であり、磁場を受けると移動可能な磁性ビーズを、前記標的細胞を含む試料中に添加させ該標的細胞に特異的に結合させる磁性ビーズ結合工程と、該標的細胞に特異的に結合した前記磁性ビーズに磁場を付与して該磁性ビーズを移動させ、該標的細胞を破砕させる標的細胞破砕工程とを少なくとも含むことを特徴とする細胞破砕方法である。該細胞破砕方法においては、前記磁性ビーズ結合工程では、磁性ビーズと標的細胞とを特異的に結合させる。前記標的細胞破砕工程では、前記抗体を介して前記標的細胞に特異的に結合した前記磁性ビーズに対し磁場を付与し、該磁性ビーズを瞬時に移動させる。前記標的細胞が該磁性ビーズにより表面が強く引っ張られ、物理的に破砕されて死滅する。このとき、破砕されるのは前記磁性ビーズが表面に付着した前記標的細胞だけであり、試料中に該標的細胞以外の細胞がある場合であっても、該標的細胞だけが選択的に破砕され死滅する。
<17> 前記<16>に記載の細胞破砕方法により処理した試料を遠心分離する遠心分離工程を少なくとも含むことを特徴とする細胞成分の選択的分離方法である。該細胞成分の選択的分離方法においては、前記細胞破砕方法により前記標的細胞だけを選択的に破砕させ死滅させた後、前記遠心分離工程において、前記試料を遠心分離する。すると、破砕された前記標的細胞の細胞成分だけが選択的に分離される。
【0005】
【発明の実施の形態】
本発明の細胞破砕方法は、粒子結合工程と標的細胞破砕工程とを少なくとも含み、更に必要に応じて適宜選択したその他の工程を有してなる。また、本発明の細胞成分の選択的分離方法は、本発明の細胞破砕方法により処理した試料を遠心分離する遠心分離工程を少なくとも含み、更に必要に応じて適宜選択したその他の工程を含む。本発明の細胞破砕方法及び細胞成分の選択的分離方法は、本発明の細胞破砕装置により、あるいは該細胞破砕装置を用いて好適に実施することができる。
本発明の細胞破砕装置は、粒子と標的細胞破砕手段とを少なくとも有してなり、更に必要に応じて適宜選択したその他の手段を有してなる。
本発明の治療装置は、本発明の細胞破砕装置を少なくとも有してなり、更に必要に応じて適宜選択したその他の手段を有してなる。
【0006】
−粒子−
前記粒子は、標的細胞に特異的に結合可能であり、外刺激を受けると移動可能である限り特に制限は無く、目的に応じて適宜選択することができる。
【0007】
前記外刺激としては、特に制限はなく目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、磁場(磁気)、超音波、電場(電気)、圧力などが挙げられる。本発明においては、これらの中でも、磁場(磁気)、超音波が好ましく、前記標的細胞を含む試料に熱を付与することなく、該試料中の標的細胞を選択的にかつ物理的に破砕可能とする観点からは、磁場(磁気)が特に好ましい。
【0008】
前記粒子は、前記外刺激の種類に応じて適宜選択することができ、該外刺激が磁場(磁気)である場合には、磁性ビーズであることが好ましい。
前記磁性ビーズとしては、超常磁性であるのが好ましい。この場合、該磁性ビーズは、磁場が付与されている時にだけ、磁場に沿って移動可能であり、磁場が付与されていない時には、磁性が残らず、試料液中を分散可能である。
【0009】
前記粒子の材料としては、表面に前記標的細胞と特異的に結合可能な抗体等を吸着等でき、粒度分布が制御し易い材料が好ましく、具体的には高分子ポリマーなどが好適に挙げられる。前記磁性ビーズの場合には、可磁化材料が分散された高分子ポリマーが好ましい。
前記粒子は、その最表面が、例えばプロテインG等でコートされているのが好ましい。この場合、該粒子の表面に前記抗体を容易に吸着させることができる点で有利である。
なお、前記高分子ポリマーとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、ポリエチレン等のポリオレフィンなどが挙げられる。
【0010】
前記粒子は、適宜作製したものであってもよいし、市販品であってもよい。
なお、前記市販品としては、例えば、Dynabeads(ダイナビーズ、(株式会社ベリタス製)のシリーズなどが好適に挙げられる。
【0011】
前記粒子の粒径としては、特に制限はなく、前記標的細胞の種類、大きさ等に応じて適宜選択することができるが、例えば、0.5〜10μmであるのが好ましい。前記粒子の粒径が前記数値範囲内であると、前記標的細胞の表面に前記抗体を介して容易に結合させることができる点で有利である。
【0012】
前記粒子と前記標的細胞とを特異的に結合可能とするには、目的に応じて適宜選択した手法が利用できるが、例えば、抗原−抗体反応が好適に利用できる。該抗原−抗体反応を利用する場合には、前記粒子が、前記標的細胞の表面に存在する抗原に特異的に結合可能な抗体をその表面に有しているのが好ましい。
なお、前記抗体を前記粒子の表面に吸着等させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、前記抗原と前記粒子とを混合等することにより、該粒子の表面に該抗体を吸着等させることができる。
【0013】
前記抗体としては、前記標的細胞の表面に存在する抗原に対して特異的に結合可能である限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、抗標的細胞IgG抗体、抗標的細胞IgA抗体、抗標的細胞IgM抗体、抗標的細胞IgD抗体、抗標的細胞IgE抗体などが挙げられる。これらは、1種単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。これらの中でも、抗標的細胞IgG抗体が好ましい。また、前記抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であるのが好ましい。前記抗体は、公知の方法に従って調製することができる。
前記抗原としては、特に制限はなく、前記標的細胞の種類等に応じて適宜選択することができるが、例えば、タンパク質、脂質、糖などが挙げられる。
【0014】
なお、前記抗体と前記抗原との好ましい組合せの一例として、前記標的細胞が白血病細胞等の癌細胞である場合には、前記抗体としては癌特異的抗体である組合せが好適に挙げられる。また、「第6回CD分類に関する国際ワークショップ」(1996.11 神戸)において公表された「クラスター分類」の一覧表に掲載された、抗原と抗体との組合せが好適に挙げられる。この「クラスター分類」によれば、CD番号「CD1a」〜「CD93」と、それぞれに対応する抗原分子「gp49」〜「p120」と、それぞれに対応する機能・分布「胸腺皮質細胞、L細胞」〜「顆粒球、単球」と、それぞれに対応するモノクローナル抗体「OKT6,T6,Leu6」〜「VIMD2,X2」とが一覧表として示されている。更に、前記「クラスター分類」の1998年改訂では、「CD94」〜「CD166」と、それぞれに対応する抗原分子「gp43」〜「gp185」と、それぞれに対応する機能・分布「KP43,LFA−1,L,NK」〜「ALCAM,CD6,L,活性化T&B,胸腺皮質細胞,繊維芽細胞」と、それぞれに対応するモノクローナル抗体「HP3B1」〜「3AB」とが一覧表として示されている。
【0015】
なお、ここでCDについて特異性に基づいて分類すると以下の通りである。
T細胞関連抗原としては、CD:1a,1b,1c,2,2R,3,4,5,6,7,8,27,28,29,w60,98,99R,100,152,153,154、が挙げられる。
活性化細胞関連抗原としては、CD:25,26,30,34,54,69,70,71,96,97、が挙げられる。
B細胞関連抗原としては、CD:5,9,10,19,20,21,22,23,24,37,38,39,40,72,73,74,w75,w76,77,w78,79a,79b,80,81,82,83,w84,85138,139,w150、が挙げられる。
NK細胞関連抗原としては、CD:11a,11b,11c,16a,16b,16b,56,57,94,95,158a,158b,161、が挙げられる。
骨髄球系関連抗原としては、CD:w12,13,14,15,16a,16b,56,57,94,95,158a,158b,161、が挙げられる。
血小板関連抗原としては、CD:9,w17,29,31,36,41,42a,42b,42c,51,61,61A,63,107a,107b,151、が挙げられる。
サイトカイン関連抗原としては、CD:25,116,117,w119,120a,120b,121a,w121b,122,w123,124,126,127,w128,130,w131,132,134,135,w136,w137、が挙げられる。
帰属特異性のない抗原としては、CD:43,44,44R,45RA,45RB,45RO,46,47,48,52,55,59,148,w149、が挙げられる。
【0016】
前記粒子の前記標的細胞に特異的に結合させる量としては、該標的細胞を破砕させ死滅させることができる限り特に制限はなく、該標的細胞の種類、前記抗原の種類・数、該粒子の種類、前記抗体の種類、前記外刺激の種類・大きさ等に応じて適宜選択することができる。なお、前記標的細胞の表面には、1細胞当たり、通常、100〜10,000程度の抗原が存在する。
【0017】
−標的細胞破砕手段−
前記標的細胞破砕手段としては、前記標的細胞に特異的に結合した前記粒子に外刺激を付与して該粒子を移動させ、該標的細胞を破砕させることができる限り特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記標的細胞破砕手段としては、前記外刺激が磁場(磁気)である場合には、例えば、パルス磁気刺激装置などが好適に挙げられ、前記外刺激が超音波である場合には、例えば、超音波発振装置などが好適に挙げられる。
【0018】
前記パルス磁気刺激装置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、磁気刺激パルスが好適に挙げられる。
前記パルス磁気刺激装置が発振するパルスとしては、シングルパルスであってもよいし、マルチパルスであってもよく、前記標的細胞の種類、前記磁場(磁気)の大きさ等に応じて適宜選択することができる。
【0019】
前記パルス磁気刺激装置としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、電気が導通されると電磁誘導により磁場を発生可能な磁場発生部を有するのが好ましく、該磁場発生部が、空芯コイル、鉄芯コイル等の円形コイルで形成されているのが好ましい。この場合、該磁場発生部の中心に試料を配置させると、該磁場発生部より試料に磁場が印加可能である。
なお、本発明においては、前記試料は、前記標的細胞を含んでいれば、該標的細胞以外の細胞等を含んでいてもよく、該標的細胞のみを含む試料とする必要がないので、試料の調製・取扱いが容易である。
【0020】
前記粒子が特異的に結合した前記標的細胞を含む試料は、粒子収容器中に収容させることができる。該粒子収容器としては、該試料を収容可能である限り、その形状、構造、大きさ、材質等については特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、例えば、内部における下底部が略テーパー形状で尖端部を有し、かつ該下底部近傍に永久磁石が設けられた構造のものなどが好適に挙げられる。この場合、前記粒子が前記永久磁石により引き寄せられているので、該試料収容器を前記磁場発生部に配置させ、該磁場発生部から磁場を、引き寄せられた前記粒子に向けて一箇所に集中的に印加することができ、破砕処理効率に優れる。
【0021】
本発明の細胞破砕装置においては、まず、前記標的細胞に対し、該標的細胞に特異的に結合可能な前記粒子を結合させる。以上の処理が、本発明の細胞破砕方法における粒子結合工程である。なお、該結合には、化学結合のみならず、吸着等も含まれる。前記結合に抗原−抗体反応を利用する場合には、例えば、まず、前記粒子と前記抗体とを混合させて該粒子の表面に該抗体を吸着させる。次に、前記標的細胞を含む試料中に、前記抗体が表面に吸着された前記粒子を添加し、混合させることにより、該標的細胞に前記粒子を、前記抗体を介して結合させる。なお、前記標的細胞への前記粒子の吸着は、両者を混合しておくだけでできるが、インターナリゼージョン反応が生ずる可能性がある場合には、前記標的細胞を含む試料を低温(例えば2〜8℃程度)に維持し、該標的細胞の活性を抑えた状態で処理するのが好ましい。
【0022】
次に、前記標的細胞に特異的に結合した前記粒子に対し、前記標的細胞破砕手段が外刺激を付与する。すると、該粒子は外刺激を受けると移動可能であるので、該外刺激により前記粒子が瞬時に移動する。前記標的細胞が該粒子により表面が強く引っ張られ、物理的に破砕されて死滅する。このとき、破砕されるのは前記粒子が表面に付着した前記標的細胞だけであり、試料中に該標的細胞以外の細胞がある場合であっても、該標的細胞だけが選択的に破砕され死滅する。以上の処理が、本発明の細胞破砕方法における標的細胞破砕工程である。なお、前記粒子が磁性ビーズであり、前記外刺激が磁場であり、前記標的細胞破砕手段が磁性ビーズに磁場を付与して該磁性ビーズを磁場方向に移動させるパルス磁気刺激装置などである場合には、該パルス磁気刺激装置などにより発振される磁場(磁気)のパルスにより、前記磁性ビーズは瞬時に磁場の方向に沿って移動し、その際、前記標的細胞が該磁性ビーズにより表面が強く引っ張られ、物理的に破砕されて死滅する。このとき、破砕されるのは前記磁性ビーズが表面に付着した前記標的細胞だけであり、試料中に該標的細胞以外の細胞がある場合であっても、該標的細胞だけが選択的に破砕され死滅する。
【0023】
そして、前記標的細胞破砕工程の後に、さらに前記試料を遠心分離すると、該試料中から前記標的細胞の細胞成分のみを容易に分離することができる。以上の処理が、本発明の細胞成分の選択的分離方法における標的細胞破砕工程である。本発明の細胞破砕方法及び細胞成分の選択的分離方法は、試料中から標的細胞以外の細胞等を予め分離・除去等する必要がないことから、処理が極めて容易であり、各種細胞の細胞成分の選択的分離に好適に利用することができる。
【0024】
【実施例】
以下、本発明の実施例について具体的に説明するが、本発明はこの実施例に何ら限定されるものではない。
【0025】
(実施例1)
前記標的細胞として、白血病細胞(TCC−S(慢性骨髄性白血病))を用いた。該白血病細胞の表面に存在する抗原は、CD33である。
一方、高分子ポリマーに可磁化物質(γFe2O3とFe3O4)が一様に分布したものに親水性ポリマーで被覆されたDynabeadsM−280(ダイナービーズM−280、株式会社ベリタス製、直径=2.8μm)を用いた。該DynabeadsM−280と、CD33に特異的に結合可能な抗CD33マウスIgG抗体とを混合することにより、該抗CD33マウスIgG抗体を該DynabeadsM−280の表面に吸着させた。以上により、前記粒子を調製した。
【0026】
こうして得た粒子を、前記白血病細胞を含む試料中に低温(2〜8℃)下で添加し混合した。すると、図1に示すように、粒子3の表面に吸着された抗体4(抗CD33マウスIgG抗体)と、標的細胞1(白血病細胞)の表面に存在する抗原2(CD33)とが、抗原−抗体反応により特異的に結合した(図5及び図6)。なお、このときインターナリゼーション反応は生じなかった。以上が、本発明の細胞破砕方法における粒子結合工程である。
【0027】
次に、標的細胞1をパルス磁気刺激装置10を用いて破砕処理を行うため、図2に示すような、パルス磁気刺激装置10における円形コイル12を用意した。そして、標的細胞1は、図3及び図4に示すような、粒子収容器20中に収容させた。このとき、粒子収容器20の下部は略尖端形状になっており、かつ永久磁石22(直径10mmで厚み4mmの磁石が3個積層されて高さが12mmとなったものであり、図3中の「10mm」は磁石1個の直径を意味し、「12mm」は磁石が3個積層されたときの厚み(高さ)を意味する)が設けられているので、粒子収容器20中に標的細胞1を収容させると、その表面に結合した粒子3が永久磁石22により引き寄せられる。このため、粒子収容器20の下部に標的細胞1が凝集したような状態で集められる。
【0028】
そして、この粒子収容器20を、図2に示す円形コイル12(外径=75mm、内径=15mm)のコイル中心に配置させた。その後、図4に示すように、円形コイル12から磁場(120±25m3/kg)を粒子収容器20に向けて印加した。なお、この磁場は、シングルパルス(2T・100μsec)で印加した。
【0029】
すると、図7及び図8に示すように、前記シングルパルスの磁場(磁気)により、粒子3は瞬時に磁場の方向に沿って移動し、その際、標的細胞1が粒子3により表面が強く引っ張られ、物理的に破砕されて死滅した。このとき、破砕されるのは粒子3が表面に付着した標的細胞1だけであり、試料30中に標的細胞1以外の細胞がある場合であっても、標的細胞1だけが選択的に破砕され死滅した。以上が、本発明の細胞破砕方法における標的細胞破砕工程である。
【0030】
その後、粒子収容器20中の試料30を遠心分離したところ、上清に、前記白血病細胞の細胞成分のみが選択的に得られた。以上が、本発明の細胞成分の選択的分離方法における遠心分離工程である。
【0031】
(実施例2)
実施例1において、DynabeadsM−280(ダイナービーズM−280、株式会社ベリタス製、直径=2.8μm)をDynabeadsM−450(ダイナービーズM−450、株式会社ベリタス製、直径=4.5μm)に代えた以外は、実施例1と全く同様の処理を行った。その結果、実施例1よりも標的細胞の破砕効率が良かった(実施例1に比し30%程度向上)。
【0032】
(比較例1)
実施例2おいて、以下の変更を行った試料(1)〜(15)について実施例2と全く同様の処理を行ったところ、実施例2では標的細胞の生存率が約60%以下であったのに対し、試料(1)〜(15)ではいずれも標的細胞の生存率が約90%(試料(8)は約85%以上)であった。
(1)粒子不使用,標的細胞の凝集なし,パルス磁気なし
(2)粒子不使用,標的細胞の凝集なし,パルス磁気あり
(3)粒子不使用,標的細胞の凝集あり,パルス磁気なし
(4)粒子不使用,標的細胞の凝集あり,パルス磁気あり
(5)標的細胞と粒子の結合なし,標的細胞の凝集なし,パルス磁気なし
(6)標的細胞と粒子の結合なし,標的細胞の凝集なし,パルス磁気あり
(7)標的細胞と粒子の結合なし,標的細胞の凝集あり,パルス磁気なし
(8)標的細胞と粒子の結合なし,標的細胞の凝集あり,パルス磁気あり
(9)粒子不使用・標的細胞に抗体のみ結合,標的細胞の凝集なし,パルス磁気なし
(10)粒子不使用・標的細胞に抗体のみ結合,標的細胞の凝集なし,パルス磁気あり
(11)粒子不使用・標的細胞に抗体のみ結合,標的細胞の凝集あり,パルス磁気なし
(12)粒子不使用・標的細胞に抗体のみ結合,標的細胞の凝集あり,パルス磁気あり
(13)標的細胞と粒子の結合あり,標的細胞の凝集なし,パルス磁気なし
(14)標的細胞と粒子の結合あり,標的細胞の凝集なし,パルス磁気あり
(16)標的細胞と粒子の結合あり,標的細胞の凝集あり,パルス磁気なし
【0033】
【発明の効果】
本発明によると、従来における問題を解決し、標的細胞を含む試料に熱を付与することなく、該試料中の標的細胞を選択的にかつ瞬時に死滅させ物理的破砕が可能な簡便な細胞破砕装置及び細胞破砕方法、該細胞破砕装置を少なくとも有し、正常細胞にダメージを与えることなく病気細胞(癌細胞)のみに効率的にダメージを与えることが可能な治療装置、並びに、該細胞破砕方法を用い、標的細胞を含む試料中から該標的細胞のDNA等の細胞構成成分のみを選択的にかつ酵素分解等の影響を受けることなく効率的に分離可能な細胞成分の選択的分離方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、標的細胞の表面における抗原に、粒子の表面に吸着された抗体が結合する際の概略説明図である。
【図2】図2は、パルス磁気刺激装置における円形コイルの一例を説明するための概略説明図である。
【図3】図3は、試料収容器の中心から外側に向かう距離と、印加される磁場の強さとの関係図である。
【図4】図4は、本発明の標的細胞破砕装置を用いて標的細胞の処理を行っている状態を説明する概略説明図である。
【図5】図5は、標的細胞の表面に粒子が結合した状態の一例を説明するための概念図である。
【図6】図6は、標的細胞の表面に粒子が結合した状態の他の例を説明するための概念図である。
【図7】図7は、粒子の移動により標的細胞が破砕された瞬間の一例を説明するための概念図である。
【図8】図8は、粒子の移動により標的細胞が破砕された瞬間の他の例を説明するための概念図である。
【符号の説明】
1 標的細胞
2 抗原
3 粒子
4 抗体
10 パルス磁気刺激装置
12 円形コイル
20 粒子収容器
22 永久磁石
30 試料
Claims (17)
- 標的細胞に特異的に結合可能であり、磁場を受けると移動可能な磁性ビーズと、前記標的細胞に特異的に結合した前記磁性ビーズに磁場を付与して該磁性ビーズを移動させ、該標的細胞を破壊させる標的細胞破砕手段とを少なくとも有することを特徴とする細胞破砕装置。
- 磁性ビーズが標的細胞に特異的に結合可能な抗体を表面に有してなる請求項1に記載の細胞破砕装置。
- 磁性ビーズが超常磁性である請求項1及び2のいずれかに記載の細胞破砕装置。
- 磁性ビーズの表面がプロテインGでコートされた請求項1〜3のいずれかに記載の細胞破砕装置。
- 磁性ビーズの粒径が0.5〜10μmである請求項1〜4のいずれかに記載の細胞破砕装置。
- 標的細胞破砕手段がパルス磁気刺激装置である請求項1〜5のいずれかに記載の細胞破砕装置。
- パルス磁気刺激装置が発生する磁気刺激パルスが、シングルパルス及びマルチパルスの少なくともいずれかである請求項6に記載の細胞破砕装置。
- パルス磁気刺激装置が、電気が導通されると電磁誘導により磁場を発生可能な磁場発生部を有する請求項6及び7のいずれかに記載の細胞破砕装置。
- 磁場発生部が円形コイルである請求項8に記載の細胞破砕装置。
- 標的細胞に特異的に結合した磁性ビーズを収容可能であり、内部における下底部が略テーパー形状であり、かつ該下底部近傍に永久磁石が設けられた磁性ビーズ収容器を有してなり、該磁性ビーズ収容器が、パルス磁気刺激装置における磁場発生部に配置されて処理される請求項8及び9のいずれかに記載の細胞破砕装置。
- 抗体が標的細胞の表面に存在する抗原に特異的に結合可能である請求項1〜10のいずれかに記載の細胞破砕装置。
- 標的細胞に特異的に結合可能な抗体が磁性ビーズの表面に吸着された請求項1〜11のいずれかに記載の細胞破砕装置。
- 標的細胞が癌細胞であり、抗体が癌特異的抗体である請求項1〜12のいずれかに記載の細胞破砕装置。
- 癌細胞が、白血病細胞、固形癌細胞及び腫瘍細胞から選択される請求項13に記載の細胞破砕装置。
- 請求項1〜14のいずれかに記載の細胞破砕装置を少なくとも有することを特徴とする治療装置。
- 標的細胞に特異的に結合可能であり、磁場を受けると移動可能な磁性ビーズを、前記標的 細胞を含む試料中に添加させ該標的細胞に特異的に結合させる磁性ビーズ結合工程と、該標的細胞に特異的に結合した前記磁性ビーズに磁場を付与して該磁性ビーズを移動させ、該標的細胞を破砕させる標的細胞破砕工程とを少なくとも含むことを特徴とする細胞破砕方法。
- 請求項16に記載の細胞破砕方法により処理した試料を遠心分離する遠心分離工程を少なくとも含むことを特徴とする細胞成分の選択的分離方法。
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