KR20060046032A - 레이저 및 마이크로 자성 비드를 이용한 세포 또는바이러스의 신속한 파괴 방법 및 장치 - Google Patents

레이저 및 마이크로 자성 비드를 이용한 세포 또는바이러스의 신속한 파괴 방법 및 장치 Download PDF

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KR20060046032A KR1020050038988A KR20050038988A KR20060046032A KR 20060046032 A KR20060046032 A KR 20060046032A KR 1020050038988 A KR1020050038988 A KR 1020050038988A KR 20050038988 A KR20050038988 A KR 20050038988A KR 20060046032 A KR20060046032 A KR 20060046032A
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Abstract

본 발명은 레이저 및 마이크로 자성 비드를 이용한 세포 또는 바이러스의 신속한 파괴 방법, 파괴 장치, 및 상기 파괴 장치에 이용되는 세포 용해 칩에 관한 것이다. 본 발명에 따르면 40초 이내의 빠른 세포 용해가 가능하고, 레이저 다이오드를 이용한 소형화가 가능하며, 바로 정제 단계로 진행할 수 있으며, 세포 찌꺼기와 비드를 전자석으로 제거하고 DNA 가 포함된 용액이 다음 단계로 진행될 수 있다. 또한, 본 발명의 세포 용해 칩을 통해 증발 문제를 해결하였으며, 진동을 통한 기계적 힘을 동시에 자성 비드를 통하여 세포에 효율적으로 전달할 수 있으며, 칩 내부의 소수성 처리로 거친 면에 대한 마이크로플루이딕스 문제를 해결하였으며, 랩온어칩에 적용이 가능하게 되었다.

Description

레이저 및 마이크로 자성 비드를 이용한 세포 또는 바이러스의 신속한 파괴 방법 및 장치{Method and apparatus for the rapid disruption of cells or viruses using LASER and micro magnetic beads}
도 1 은 레이저 및 마이크로 자성 비드를 이용한 세포 용해에 사용되는 시스템의 모식도이다.
도 2A는 마이크로 칩 상에서 레이저 및 마이크로 자성 비드를 이용한 세포 용해에 이용되는 시스템의 일 구체예를 나타내는 모식도이며, 도 2B는 이의 전체적인 설계도이다.
도 3은 세포 용해 장치의 셉타 부분을 나타내는 사진이다.
도 4는 레이저 및 마이크로 자성 비드를 이용한 세포 파괴 장치에 이용되는 마이크로칩의 일 구체예를 나타내는 모식도이다.
도 5는 본 발명의 마이크로칩의 실제도를 나타낸 것이다.
도 6은 레이저 조사 후의 세포 생존능의 측정을 보여준다.
도 7은 레이저 조사가 단지 자성 비드의 존재하에 박테리아 DNA 를 효율적으로 방출한다는 것을 보여준다.
도 8은 레이저 어블레이션에 의해 방출된 DNA 가 통상의 방법으로 제조된 DNA 보다 Taq 중합효소에 의해 더욱 효율적으로 증폭된다는 것을 보여준다.
도 9는 자성 비드의 크기의 효과를 보여준다.
도 10은 Pyrex 7740 및 반사방지 코팅된 Pyrex 7740에 대한 레이저의 투과율을 보여준다.
도 11은 본 발명의 세포 용해 칩에 레이저를 조사한 후의 사진이다.
도 12는 자성 비드 농도에 따라 대장균 세포로부터 방출된 DNA의 PCR 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 진동기의 전압에 따라 대장균 세포로부터 방출된 DNA의 PCR 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 레이저의 출력에 따라 스태필로코커스 에피더미디스 세포(1×105 세포/㎕)로부터 방출된 DNA의 PCR 결과를 나타내는 그래프이다.
도 15는 레이저의 출력에 따라 스태필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 세포(1×102 세포/㎕)로부터 방출된 DNA의 PCR 결과를 나타내는 그래프이다.
도 16은 스태필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 세포 및 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 세포로부터 방출된 DNA의 PCR 결과를 나타내는 그래프이다.
도 17은 레이저의 출력에 따라 대장균(E. coli) 세포(1×105 세포/㎕)로부터 방출된 DNA의 PCR 결과를 나타내는 그래프이다.
도 18은 레이저의 출력에 따라 대장균(E. coli) 세포(1×102 세포/㎕)로부터 방출된 DNA의 PCR 결과를 나타내는 그래프이다.
도 19는 레이저의 출력에 따른 대장균(E. coli) 시료의 온도 변화를 나타내는 그래프이다.
도 20은 자성 비드 및 비드 물질의 표면 전하에 따라 대장균(E. coli) 세포(1×105 세포/㎕)로부터 방출된 DNA의 PCR 결과를 나타내는 그래프이다.
도 21은 레이저 조사 유무에 따른 대장균 세포의 생존능을 나타내는 사진이다.
도 22는 pCR
Figure 112005024496745-PAT00001
II-TOPO
Figure 112005024496745-PAT00002
(Invitrogen) 플라스미드를 포함하는 대장균 BL21 세포에 레이저 조사 후에 DNA를 분석한 사진이다.
본 발명은 레이저 및 마이크로 자성 비드를 이용한 세포 또는 바이러스의 신속한 파괴 방법 및 장치에 관한 것이다.
일반적으로, 특정 병원균의 분자학적 진단은 4 단계, 즉 세포 용해(lysis), DNA 분리, DNA 증폭 및 DNA 검출로 이루어진다.
세포에서 DNA 의 효율적인 추출은 많은 적용에서 필요하고, 분자학적 진단, 특히 병원균 동정 및 정량화에 본질적이다. 분자학적 진단은 일반적으로 DNA 추출 단계 후에 DNA 증폭에 의해 수행된다. DNA 증폭에는 중합효소 연쇄반응(PCR), 리가제 연쇄반응(Ligase Chain Reaction), 가닥 이동 증폭(stranded-displacement amplification), 핵산 기재 증폭, 복구 연쇄반응(repair chain reaction), 헬리카제 연쇄반응, QB 복제효소 증폭, 및 연결 활성화된 전사가 포함된다.
세포로부터 DNA의 분리 방법은 DNA를 결합하는 경향을 갖는 물질을 이용하여 수행되었다. DNA의 분리를 위한 물질의 예는 실리카, 유리섬유, 음이온교환수지, 및 자성 비드이다(Rudi, K. 등, Biotechniqures 22, 506-511 (1997); 및 Deggerdal, A. 등, Biotechniqures 22, 554-557 (1997)). 수작업 단계를 피하고, 작업자 오차를 제거하기 위해, 몇 가지 자동화 기계가 대량 DNA 추출을 위해 개발되었다.
세포 용해는 통상적으로 기계적, 화학적, 열적, 전기적, 초음파 및 마이크로웨이브 방법으로 수행된다 (Michael T. Taylor 등, Anal.Chem., 73, 492-496 (2001)).
화학적 방법은 세포를 파괴하고 DNA 를 방출하기 위해 용해제를 포함한다. 카오트로픽 시약(chaotropic reagent)를 이용한 세포 추출물의 부가적인 처리 단계가 단백질을 변성시키기 위해 필요하다. 화학적 용해 방법의 단점은 세포를 파괴하기 위해 거친 화학물질을 이용한다는 것이다. 이들은 이은 PCR 반응을 방해할 수 있기 때문에, PCR 반응 전에 DNA 를 정제하는 것이 불가피하다. 상기 화학적 방법은 노동 집약적이고, 시간을 요구하고, 비싼 소모품을 요구하며, 종종 DNA 회수 수율이 낮다는 문제점이 있다. 열적 방법은 반복된 동결/융해 사이클이 관여되 나, 종종 세포 내의 많은 구조물을 파괴할 수 없다는 단점이 있다.
가열은 세포벽 또는 세포막을 파괴하는 대안적인 방법이다. 간단한 가열의 단점은 방출된 DNA 에 부착될 수 있는 단백질을 변성시킨다는 것이다. 이들은 DNA 증폭을 방해할 수 있다. 물리적인 방법은 부피가 크고, 비싼 압력 장치를 이용하는데, 이는 LOC (Lab-on-a-Chip) 적용에 적합하지 않다.
초음파처리는 대안적인 물리적 방법인데, 세포 용액 또는 현탁액을 초음파 수조에 위치한 챔버내에 위치한다. 초음파 파괴는 세포 용해에서 많은 단점을 가진다. 우선, 초음파의 에너지 분포는 균일하지 않다. 초음파 에너지의 불균일한 분포는 또한 일관성 없는 결과를 초래한다. 두번째로, 초음파 수조는 용기에 에너지를 집중시키지 못하므로, 세포의 파괴를 완성하는데 종종 수 분이 소요된다. 마지막으로, 초음파 방법은 인간 귀에 불쾌한 소리를 가진다.
레이저는 세포를 파괴하는데 많은 장점을 가지며, LOC 에 잘 적용될 수 있다 (Huaina Li 등, Anal Chem, 73, 4625-4631 (2001)).
미국 특허 공개공보 2003/96429 A1 에는 레이저 유도된 세포 용해 시스템이 기재되어 있다. 레이저만을 이용했을 때 세포를 효과적으로 용해하지 못하였다. 투명도가 높은 용액에 대장균을 넣고 실험한 결과, 레이저만을 조사한 경우에 낮은 세포 용해 효율을 보이고 있음을 확인하였는데, 150초 동안 레이저를 조사한 후의 DNA 농도는 3.77ng/ul 이었으나, 95℃에서 5분 동안 끓인 후의 DNA 농도는 6.15ng/ul 이었다. 이는 레이저 에너지가 효과적으로 세포에 전달되지 않았기 때문이다.
미국 특허 제 6,685,730 호에는 증가된 조직 복구를 위한 광학적으로 흡수하는 나노입자가 기재되어 있다. 이 방법은 하나 이상의 파장에서 빛을 흡수하는 1 내지 1000 나노미터 크기의 나노입자를 연결될 조직에 전달하고, 상기 나노입자를 나노입자에 의해 흡수된 하나 이상의 파장의 빛에 노출하는 것을 포함하는 조직을 연결하는 방법에 대한 것이다. 이 방법은 레이저와 나노입자를 이용하여 세포의 기능만 잃게 하는 세포를 파괴하는 방법이나, 세포와 입자가 포함된 용액을 진동(vibration)시켜 세포를 파괴하는 방법에 대한 언급은 없다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래 기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 레이저와 마이크로 자성 비드를 함께 사용하여 진동시키는 경우, 세포 또는 바이러스를 신속하게 파괴할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 세포 또는 바이러스를 포함하는 용액에 자성 비드를 주입하는 단계; 상기 자성 비드를 진동시키는 단계; 및 상기 자성 비드에 레이저를 조사하여 세포 또는 바이러스를 파괴하는 단계를 포함하는 세포 또는 바이러스의 파괴 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 시료 도입구가 형성되어 있어 상기 시료 도입구를 통해 시료와 자성 비드를 수용하는 세포 용해 챔버; 상기 챔버에 부착되어, 상기 챔버 내에서 시료와 자성 비드를 혼합하는 진동기(vibrator); 및 상기 챔버에 부착되어, 레이저를 공급하는 레이저 발생부를 포함하는 세포 또는 바이러스의 파괴 장 치에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 시료 도입구가 형성되어 있어 상기 시료 도입구를 통해 시료와 자성 비드를 수용하는 세포 용해 칩; 상기 칩에 진동 전달부를 통해 연결되며, 상기 칩 내에서 시료와 자성 비드를 혼합하는 진동기(vibrator); 상기 칩에 부착되어, 상기 진동기에 의해 발생한 진동을 상기 칩에 전달하는 진동 전달부; 상기 칩에 부착되어, 레이저를 공급하는 레이저 발생부; 및 상기 칩에 부착되어, 시료의 증발을 억제하는 증발억제부를 포함하는 세포 또는 바이러스의 파괴 장치에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상단과 하단이 개방되어 있으며, 반응 챔버, 시료의 도입구 및 출구가 형성되어 있는 칩 바디부; 상기 칩 바디부의 상단에 부착되어 상기 반응 챔버의 상단부를 밀폐시키며, 상기 칩 내에 레이저를 통과시켜주며, 시료의 도입구 및 출구가 있는 칩 커버부; 및 칩 부착부를 통하여 상기 칩 바디부의 하단에 부착되어 반응 챔버, 시료 도입구 및 출구의 하단부를 밀폐시키는 칩 바닥부를 포함하는 상기 세포 또는 바이러스의 파괴 장치에 이용하기 위한 세포 용해 칩에 관한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 또는 바이러스를 포함하는 용액에 자성 비드를 주입하는 단계; 상기 자성 비드를 진동시키는 단계; 및 상기 자성 비드에 레이저를 조사하여 세포 또는 바이러스를 파괴하는 단계를 포함하는 세포 또는 바이러스의 파괴 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 자성 비드가 포함된 용액에 레이저를 조사하고, 자성 비드가 레이저에 의해 어블레이션 현상을 일으킴으로써, 충격파, 증기압 및 열을 세포 표면에 전달하는데, 이 때 물리적 충격이 동시에 가해진다. 레이저에 의해 가열된 자성 비드는 수용액의 온도를 올리며, 뜨거워진 자성 비드가 세포를 직접 파괴한다. 수용액 중의 자성 비드는 단순한 열 전달체로 존재하는 것이 아닌 열적, 기계적, 물리학적 영향을 세포 표면에 전달하고 이를 이용하여 세포 표면을 효과적으로 파괴하는 것이다.
레이저 및 자성 비드를 이용한 신속한 세포 용해는 액체 배지에서 가열 및 레이저 어블레이션(ablation)에 의해 수행된다. 마이크로 자성 비드와 함께 레이저는 열 공급원을 매우 가열된 자성 비드의 물리적, 기계적 충격으로 전환시킴으로써 세포 용해를 개선시킬 수 있다. 최근에, 작은 크기를 가진 고출력의 레이저 다이오드가 빠른 속도로 개발되고 있으며, 이를 이용한 매우 작은 세포 용해 장치가 LOC 상에서 장착될 수 있을 것이다. 게다가, 레이저는 광섬유, 거울, 렌즈 또는 직접적으로 출력 및 전달 에너지를 칩상의 국부적인 지역에 집중할 수 있다.
자성 비드의 가장 큰 장점은 DNA 분리 단계를 줄이는 것인데, 이는 레이저 및 마이크로 자성 비드를 이용한 세포 용해가 단백질 변성을 초래하기 때문이다. 변성된 단백질 및 세포 찌꺼기는 중력 또는 자기력에 의해 제거될 수 있는 자성 비드에 부착된다. 이는 검출 한계를 낮추고, DNA 추출 단계를 한 단계 줄임으로써 DNA 추출 시간을 대폭 절감하고, 신호 진폭을 증가시킴으로써 PCR 분석을 현저하게 개선한다. 레이저 및 마이크로 자성 비드를 이용하여 세포를 파괴하는데 요구되는 총 시간은 단지 40초이다.
레이저 어블레이션이란 레이저 빔에 노출된 소재에 발생하는 현상을 총칭한다. 레이저 어블레이션에 의해 소재 표면의 온도는 수백에서 수천도까지 급속히 상승하며 소재 표면의 온도가 증발점 이상으로 상승하면 액체 상태 재료의 증발과 함께 표면에서의 포화증기압도 급속히 상승한다. 포화증기압은 Clausius-Clapeyron 식에 의해 온도의 함수로 표시되며 고출력 펄스 레이저 가공의 경우 보통 수십기압 이상까지 상승한다. 증기의 분출과 함께 증기에 의해 소재 표면에 작용하는 압력을 반발압력이라고 하며 반발압력의 크기는 증기압을 Psat 라고 할 때 약 0.56Psat 정도 된다.
충격파는 주로 펄스 레이저와 같이 순간 강도가 매우 큰 레이저 가공에서 발생한다. 수나노 초 또는 수십나노 초 사이의 짧은 시간 동안에 온도가 증발점 이상으로 가열된 재료 표면에서 발생된 증기는 압력이 수기압에서 수십기압까지 상승하며, 주변의 대기 중으로 팽창해 나가면서 충격파를 형성한다. 매우 큰 압력으로 인해 팽창하는 증기는 소재에도 약 0.56Ps (여기에서 Ps 는 표면에서의 포화증기압이다)의 압력이 작용된다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 레이저는 펄스 레이저 또는 연속파동 레이저를 포함할 수 있다.
너무 낮은 레이저 출력에서는 효율적으로 레이저 어블레이션 현상을 일으킬 수 없으며, 레이저 출력은 연속파동(CW)의 경우 10mW 이상, 펄스 레이저의 경우 1mJ/펄스 이상을 전달해 주어야 한다. 바람직하게는 상기 펄스 레이저가 3mJ/펄스 이상이고, 연속파동 레이저가 100W 이상의 출력을 가진다. 이는 연속파동의 경우 10mW 미만이고, 펄스 레이저의 경우 1mJ/펄스 미만이면 세포를 파괴하는 충분한 에너지 전달이 되지 않는 문제가 발생하기 때문이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 레이저는 자성 비드가 흡수하는 특정 파장대에서 발생하는 것이어야 한다. 상기 레이저는 400nm 이상의 파장대에서 발생하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 상기 레이저는 750nm ~ 1300nm의 파장대에서 발생하는 것이 바람직하다. 이는 400nm 미만의 파장에서는 DNA 의 변성 또는 손상의 문제가 발생하기 때문이다. 또한, 상기 레이저는 하나 이상의 파장대에서 발생할 수 있다. 즉, 레이저는 상기 파장 범위내의 하나의 파장일 수도 있고, 파장이 서로 상이한 2 이상의 파장일 수도 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 자성 비드의 크기가 50nm ~ 1,000㎛인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는, 상기 자성 비드의 크기는 1㎛ ~ 50㎛ 이다. 이는 자성 비드의 크기가 50nm 미만이면 불충분한 물리적, 기계적 충격의 문제가 있고, 1,000㎛를 초과하면 LOC 에 효과적인 크기 제한의 문제가 생기기 때문이다. 또한, 상기 자성 비드는 2 가지 이상의 크기를 갖는 비드로 혼합된 것일 수 있다. 즉, 상기 자성 비드는 동일한 크기일 수도 있고, 서로 상이한 크기의 혼합물일 수도 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 자성 비드가 자성을 띠는 것이면 어느 것이라도 가능하다. 특히, 강자성체를 띠는 Fe, Ni, Cr 의 금속 및 이의 산화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 자성 비드가 중합체, 유기 물질, 규소, 또는 유리에 강자성체를 띠는 금속으로 코팅될 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 자성 비드의 표면이 DNA가 붙지 않는 구조인 음전하를 띠는 구조로 되어 있는 것이 바람직하다. 이는 DNA 가 음전하를 띠고 있어, 자성 비드의 표면이 음전하를 띠면 반발력에 의해 DNA 가 붙지 않기 때문이다. 또한, 자성 비드의 표면에 DNA 가 붙으면 세포가 파괴된 후에 DNA 와 자성 비드의 분리가 어려워 DNA 의 정제를 어렵게 한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 용액이 타액, 소변, 혈액, 혈청 및 세포 배양액으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 용액은 동물세포, 식물세포, 박테리아, 바이러스, 파아지 등 핵산을 가지고 있는 것이면 가능하다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
시료 도입구가 형성되어 있어 상기 시료 도입구를 통해 시료와 자성 비드를 수용하는 세포 용해 챔버;
상기 챔버에 부착되어, 상기 챔버 내에서 시료와 자성 비드를 혼합하는 진동기(vibrator); 및
상기 챔버에 부착되어, 레이저를 공급하는 레이저 발생부를 포함하는 세포 또는 바이러스의 신속한 파괴 장치에 관한 것이다.
도 1 은 레이저 및 마이크로 자성 비드를 이용한 세포 용해에 사용되는 시스템의 일 구체예를 나타내는 모식도이다. 시료가 시료 도입구를 통해 투입된다. 시료는 자성 비드와 잘 혼합된다. 이 때 잘 혼합되게 하는 작용은 진동기를 통해서 이루어진다. 계속적으로 진동하면서 레이저를 조사한다. 세포 용해 챔버 윈도우는 레이저의 파장을 충분히 통과시킬 수 있는 재질이어야 한다. 자성 비드는 레이저를 받아서 빛을 열로 변화시키는데, 레이저 어블레이션 현상을 일으킨다. 계속적인 진동으로 효과적인 열전달과 세포와의 충돌 등으로 열, 진동, 충격파, 증기압 등이 효율적으로 전달된다. 이 때 레이저에 의해 세포 용해 챔버의 온도가 상승되면서 파라핀 밸브가 열리게 되며, 이것은 파라핀 밸브의 두께로 조절할 수 있다. 세포가 충분히 파괴되면 레이저를 끄고, 전자석을 켜서 나머지 마이크로 자성 비드를 제거한다. 파라핀 밸브가 열에 의해 제거되고 PCR 챔버로 용액이 이동되어 정제된 DNA 가 증폭된다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 진동기는 초음파세척기, 자기장을 이용한 진동기, 전기장을 이용한 진동기, 볼텍스 등 기계적 진동기 또는 압전물질을 포함할 수 있다. 진동기는 세포 용해 챔버에 부착되어 있으며, 세포와 마이크로 자성 비드의 혼합 용액을 진동시킬 수 있으면 어느 장치라도 가능하다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 챔버에 부착되어, 세포 용해 작용 종료 후에 상기 세포 용해 챔버내의 자성 비드를 제거하는 전자석을 추가로 포함할 수 있다. 상기 전자석은 상기 세포 용해 챔버에 부착될 수 있으며, 본 발명이 LOC 구현을 위한 것이므로 세포 용해 작용이 종료된 후에 전자석을 이용하여 자성 비드를 제거함으로써 별도의 자성 비드의 분리 작업이 없이도 파괴된 세포 용액이 바로 PCR 챔버로 이동할 수 있게 된다. 또한, 전자석으로 제거할 수 있기 위해서는 비 드가 반드시 자성을 가져야 한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 특별히 좀 더 정제된 DNA 를 원할 때에는 PCR 챔버 앞에 상기 세포 용해 챔버와 연결되는 채널을 통해서 DNA 정제 챔버를 포함할 수 있다. 따라서, 세포가 용해된 후에 파라핀 밸브 또는 MEMS 구조의 자기장, 전기장을 이용한 밸브가 열리면 바로 정제될 수 있도록 DNA 정제 챔버를 세포 용해 챔버에 부착한 것이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 세포 용해 챔버와 연결되는 채널내에 위치하여 세포 용해 시간에 따라 두께가 조절되는 파라핀 밸브를 추가로 포함할 수 있다. 레이저에 의해 세포 용해 챔버의 온도가 상승되면서 파라핀 밸브가 열리게 되며, 이것은 파라핀 밸브의 두께로 조절할 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 DNA 정제 챔버와 연결되는 채널을 통해서 부착된 DNA 증폭 챔버를 추가로 포함할 수 있다. LOC 구현을 위해서는 정제된 DNA 를 증폭하는 시스템이 필요하다. 상기에서는 마이크로 자성비드에 의해 정제 효과가 발생하므로, DNA 증폭 챔버가 세포 용해 챔버에 직접 부착될 수 있다. 정제된 DNA 를 검출하는 방법은 분광광도계를 이용하는 방법, 마이크로 자성비드를 이용하는 방법, 전기화학적 방법, 전기화학발광 방법, 방사선 및 형광표지를 이용하는 방법, 실시간 PCR 방법 등이 있을 수 있다. 원하는 DNA를 충분히 증폭하기 위해서는 PCR 방법이 가장 적합하다. 기타 다른 DNA 증폭 방법도 적용될 수 있으며, 실시간 PCR 법 등을 통해 직접 검출도 가능하다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
시료 도입구가 형성되어 있어 상기 시료 도입구를 통해 시료와 자성 비드를 수용하는 세포 용해 칩;
상기 칩에 진동 전달부를 통해 연결되며, 상기 칩 내에서 시료와 자성 비드를 혼합하는 진동기(vibrator);
상기 칩에 부착되어, 상기 진동기에 의해 발생한 진동을 상기 칩에 전달하는 진동 전달부;
상기 칩에 부착되어, 레이저를 공급하는 레이저 발생부; 및
상기 칩에 부착되어, 시료의 증발을 억제하는 증발억제부를 포함하는 세포 또는 바이러스의 파괴 장치에 관한 것이다.
도 2A는 마이크로 칩 상에서 레이저 및 마이크로 자성 비드를 이용한 세포 용해에 이용되는 시스템의 일 구체예를 나타내는 모식도이며, 도 2B는 이의 전체적인 설계도이다. 세포 용해 칩은 시료 도입구를 통해 도입된 시료 및 자성 비드를 이용하여 세포 또는 바이러스를 용해하는 장치이다. 상기 세포 용해 칩은 칩 커버부, 칩 바디부, 칩 부착부 및 칩 바닥부로 이루어져 있다. 상기 구성 요소의 자세한 설명은 이후에 기재된다. 세포 용해 칩은 세포 또는 바이러스가 용해되는 반응 챔버의 역할을 한다.
상기 진동기는 상기 칩에 진동 전달부를 통해 연결되며, 상기 칩 내에서 시료와 자성 비드를 혼합하는 역할을 하는 장치이다. 진동기의 진동 방향은 수직 방향일 수 있다. 상기 진동기는 초음파세척기, 자기장을 이용한 진동기, 전기장을 이용한 진동기, 볼텍스 등 기계적 진동기 또는 압전물질을 포함할 수 있다. 진동 기는 진동을 상기 칩에 전달하는 진동 전달부를 통해 세포 용해 칩에 부착되어 있으며, 세포와 마이크로 자성 비드의 혼합 용액을 진동시킬 수 있으면 어느 장치라도 가능하다. 상기 진동기는 휴대폰에 이용되는 진동 모터를 이용할 수 있다.
상기 진동 전달부는 상기 진동기에 의해 발생한 진동을 상기 칩에 전달하는 장치로서, 세포 용해 칩의 바닥부의 챔버 부분에 진동을 전달한다. 진동 전달부는 알루미늄 등 금속 종류를 이용할 수 있다.
상기 레이저 발생부는 상기 칩에 부착되어, 상기 세포 용해 칩에 레이저를 공급하는 장치이다.
상기 증발억제부는 상기 칩에 부착되어 시료의 증발을 억제하는 장치로서, 레이저를 이용하여 세포를 용해시, 온도 상승으로 인해 증기압이 발생하게 된다. 따라서, 증발을 줄이기 위해서 증발 억제부가 필요하며, 상기 장치는 10psi 이상의 압력에서 견딜 수 있는 구조이어야 한다. 상기 증발 억제부는 셉타(septa)로 구성될 수 있다. 광 테입(optic tape)으로 먼저 시료 도입구 및 출구를 부착한 후, 셉타로 고정하는 것도 가능하다. 도 3은 세포 용해 장치의 셉타 부분을 나타내는 사진이다. 상기 셉타는 밸브, 중합체 구조물, 금속 구조물 등일 수 있으며, 증발을 억제할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 레이저는 펄스 레이저 또는 연속파동 레이저를 포함할 수 있다.
너무 낮은 레이저 출력에서는 효율적으로 레이저 어블레이션 현상을 일으킬 수 없으며, 레이저 출력은 연속파동(CW)의 경우 10mW 이상, 펄스 레이저의 경우 1mJ/펄스 이상을 전달해 주어야 한다. 이는 연속파동의 경우 10mW 미만이고, 펄스 레이저의 경우 1mJ/펄스 미만이면 세포를 파괴하는 충분한 에너지 전달이 되지 않는 문제가 발생하기 때문이다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 레이저는 자성 비드가 흡수하는 특정 파장대에서 발생하는 것이어야 한다. 상기 레이저는 400nm 이상의 파장대에서 발생하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 상기 레이저는 750nm ~ 1300nm의 파장대에서 발생하는 것이 바람직하다. 이는 400nm 미만의 파장에서는 DNA 의 변성 또는 손상의 문제가 발생하기 때문이다. 또한, 상기 레이저는 하나 이상의 파장대에서 발생할 수 있다. 즉, 레이저는 상기 파장 범위내의 하나의 파장일 수도 있고, 파장이 서로 상이한 2 이상의 파장일 수도 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 자성 비드의 크기가 50nm ~ 1,000㎛인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는, 상기 자성 비드의 크기는 1㎛ ~ 50㎛ 이다. 이는 자성 비드의 크기가 50nm 미만이면 불충분한 물리적, 기계적 충격의 문제가 있고, 1,000㎛를 초과하면 LOC 에 효과적인 크기 제한의 문제가 생기기 때문이다. 또한, 상기 자성 비드는 2 가지 이상의 크기를 갖는 비드로 혼합된 것일 수 있다. 즉, 상기 자성 비드는 동일한 크기일 수도 있고, 서로 상이한 크기의 혼합물일 수도 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 자성 비드가 자성을 띠는 것이면 어느 것이라도 가능하다. 특히, 강자성체를 띠는 Fe, Ni, Cr 의 금속 및 이의 산화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 자성 비드가 중합체, 유기 물질, 규소, 또는 유리에 강자성체를 띠는 금속으로 코팅될 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 자성 비드의 표면이 DNA가 붙지 않는 구조인 음전하를 띠는 구조로 되어 있는 것이 바람직하다. 이는 DNA 가 음전하를 띠고 있어, 자성 비드의 표면이 음전하를 띠면 반발력에 의해 DNA 가 붙지 않기 때문이다. 또한, 자성 비드의 표면에 DNA 가 붙으면 세포가 파괴된 후에 DNA 와 자성 비드의 분리가 어려워 DNA 의 정제를 어렵게 한다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 상기 시료가 타액, 소변, 혈액, 혈청 및 세포 배양액으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 시료 용액은 동물세포, 식물세포, 박테리아, 바이러스, 파아지 등 핵산을 가지고 있는 것이면 가능하다.
본 발명의 또 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
상단과 하단이 개방되어 있으며, 반응 챔버, 시료의 도입구 및 출구가 형성되어 있는 칩 바디부;
상기 칩 바디부의 상단에 부착되어 상기 반응 챔버의 상단부를 밀폐시키며, 상기 칩 내에 레이저를 통과시켜주며, 시료의 도입구 및 출구가 있는 칩 커버부; 및
칩 부착부를 통하여 상기 칩 바디부의 하단에 부착되어 반응 챔버, 시료 도입구 및 출구의 하단부를 밀폐시키는 칩 바닥부를 포함하는 상기 세포 또는 바이러스의 파괴 장치에 이용하기 위한 세포 용해 칩에 관한 것이다.
도 4는 레이저 및 마이크로 자성 비드를 이용한 세포 파괴 장치에 이용되는 마이크로칩의 일 구체예를 나타내는 모식도이다. 도 8에서 보는 바와 같이, 상기 칩 바디부는 상단과 하단이 개방되어 있으며, 반응 챔버, 시료의 도입구 및 출구가 형성되어 있다. 상기 칩 바디부는 100℃ 이상에서 견딜 수 있는 실리콘 웨이퍼를 이용할 수 있다. 칩 바디부의 재질은 유리, 중합체, 실리콘 등을 포함할 수 있다. 상기 유리는 Pyrex 7740이 바람직하다. 칩 바디부는 상단에 칩 커버부가 부착되며, 하단은 칩 부착부가 부착된다. 칩 바디부의 내부는 챔버의 기포 발생을 억제하기 위해 소수성 조건을 도입할 수 있다. 예를 들면, 칩 바디 내부를 Sigmacoat를 이용하여 코팅할 수 있다.
상기 칩 커버부는 상기 칩 바디부의 상단에 부착되어 상기 반응 챔버의 상단부를 밀폐시킨다. 또한, 상기 칩 내에 레이저를 통과시켜주며, 시료의 도입구 및 출구가 존재하게 된다. 칩 커버부의 재질은 유리, 중합체, 인듐주석산화물(ITO) 유리 등을 포함할 수 있다. 상기 유리는 Pyrex 7740이 바람직하다. 상기 재질은 고온에 견디며, 투과율 90% 이상인 것이 바람직하며, 레이저의 투과율을 증가시키기 위해 상기 칩 커버부에 레이저의 반사방지 코팅을 할 수 있다. 반사방지 코팅은 당업계에 공지된 기술을 이용하여 수행할 수 있다. 따라서, 바람직한 칩 커버부는 반사방지 코팅된 Pyrex 7740을 이용할 수 있다.
상기 칩 바닥부는 칩 부착부를 통하여 상기 칩 바디부의 하단에 부착되어 반응 챔버, 시료 도입구 및 출구의 하단부를 밀폐시킨다. 칩 바닥부의 재질은 중합체, 실리콘, 유리, 인듐주석산화물(ITO) 유리 등을 포함할 수 있다. 상기 재질은 고온에 견디며, 유연성이 있는 것이 바람직하다. 또한, 상기 칩 바닥부는 진동기 에 의해 발생한 진동을 칩 바디부에 잘 전달할 수 있는 물질이 바람직하며, 예를 들면, 폴리카보네이트 필름 등을 이용할 수 있다.
상기 칩 부착부는 상기 칩 바디부와 칩 바닥부를 부착시키며, 시료를 수용하는 챔버의 보조 역할을 한다. 상기 칩 부착부는 접착테이프 및 접착제로 구성된 군으로부터 선택되는 접착물에 의해 상기 칩 바디부와 칩 바닥부를 연결한다. 상기 칩 바디부와 상기 칩 바닥부만을 이용하여 반응 챔버를 형성하는 것도 가능하나, 반응액의 유출이 생길 위험이 있으므로, 상기 칩 부착부를 이용하여 유출을 막을 수 있는 것이다. 도 5는 본 발명의 마이크로칩의 실제도를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
제조예 1: 세포 용해 시스템
도 1에 보여준 바와 같이, 하기와 같이 제조된 박테리아 세포(90㎕) 및 마이크로 자성 비드 (30㎕의 50% 슬러리, Dynabeads
Figure 112005024496745-PAT00003
M-270 Carboxylic Acid, DYNAL, 노르웨이)를 바이얼 가이드(AMITECH, 한국)내에 위치한 바이얼에서 혼합하였다. 바이얼을 볼텍싱(vortexing)으로 교반하면서, 각 실험에서 지정된 시간 동안 세포를 파괴하기 위해 808 nm, 21.1W (HLU25F100-808, LIMO, 독일)의 고출력 레이저 빔을 적용하였다 (도 1 참고).
제조예 2: 박테리아 균주 및 박테리아 세포 생존능의 측정
대장균 균주 BL21 및 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)(ATCC# 35668)을 brain heart infusion (BHI) 배지에서 격렬한 호기하에 37℃에서 대수기까지(OD600=0.5~1.0) 배양하였다. 박테리아 세포를 원심분리로 수확하고, 3 ml의 인산완충염수(PBS) 용액으로 2회 세정하였다. 세포를 PBS에 재현탁하였다(세포 밀도; 1 x 105 세포/㎕). 생존 세포의 수를 콜로니를 형성하는 단일 세포의 능력으로 측정하였다. 레이저 빔 조사 후의 대장균 세포(1 x 103)의 분취량을 BHI 플레이트 상에 도말하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하고, 콜로니의 수를 계산하였다.
스태필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)(ATCC#14990→12228)를 영양 한천(NA) 배지에서 격렬한 호기하에 37℃에서 대수기까지(OD600=0.5~1.0) 배양하였다. 박테리아 세포를 원심분리로 수확하고, 3 ml의 인산완충염수(PBS) 용액으로 2회 세정하였다. 세포를 PBS에 재현탁하였다(세포 밀도; 1 x 105 세포/㎕). 생존 세포의 수를 콜로니를 형성하는 단일 세포의 능력으로 측정하였다. 레이저 빔 조사 후의 스태필로코커스 에피더미디스 세포(1 x 103)의 분취량을 NA 플레이트 상에 도말하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하고, 콜로니의 수를 계산하였다.
제조예 3: 대장균 게놈 DNA 의 추출
레이저 방법에 의한 DNA 방출의 효율과 기타 공지된 통상적인 방법의 효율을 비교하기 위해, 95℃에서 5분 동안 보일링 방법을 이용하여 대장균 게놈 DNA(각 레 이저 용해에 사용된 세포수와 동등한 0.9 x 105 세포로부터)를 제조하였다.
제조예 4: 박테리아로부터 DNA 방출의 정량화
세포 용해를 모니터링하고, 용해된 세포로부터 방출된 DNA의 양을 정량하기 위해, Agilent Bioanalyzer에 이은 중합효소 연쇄반응(PCR) 증폭을 이용하였다. 하기 쌍의 PCR 프라이머를 사용하였다: 프라이머 A (서열번호 1); 및 프라이머 B (서열번호 2). 이 프라이머 쌍은 16S 리보좀 RNA 를 코딩하는 유전자의 각 말단에 상보적이며, PCR 동안 전체 코딩 부위의 증폭을 허용한다.
PCR 증폭은 Taq 중합효소 (Solgent. Co, Ltd, 한국)를 이용하여 25 사이클(95℃에서 1분 동안 예비변성, 95℃에서 5초 동안 변성, 60℃에서 13초 동안 어닐링, 및 72℃에서 15초 동안 신장, 및 72℃에서 1분 동안 추가적인 신장)동안 수행하였다. 그람양성 박테리아 세포인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 및 스태필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)에 대해, PCR 증폭은 Taq 중합효소 (Solgent. Co, Ltd, 한국)를 이용하여 30 사이클(95℃에서 1분 동안 예비변성, 95℃에서 5초 동안 변성, 60℃에서 13초 동안 어닐링, 및 72℃에서 15초 동안 신장, 및 72℃에서 1분 동안 추가적인 신장)동안 수행하였다. 증폭 사이클이 종료된 후에, 용융 곡선을 60에서 90℃로 시료를 천천히 가열(0.1℃/초)함으로써 수득하였다. PCR을 LightCycler
Figure 112005024496745-PAT00004
(Roche　Diagnostics　Corporation, IN, USA)에 의해 1X FastStart DNA Master SYBR (Roche　Diagnostics　Corporation, IN, USA), 0.25 mM의 정방향 및 역방향 프라이머(Genotech, 한국), 4mM MgCl2 (Roche　Diagnostics　Corporation), D.W(PCR 등급, Roche　Diagnostics　Corporation, IN, USA)를 포함하는 총 부피 20㎕ 반응 혼합물을 이용하여 수행하였다. 증폭된 DNA 를 시판되는 DNA 500 분석 규모의 시약 세트를 이용하여 Agilent BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)에서 분석하였다.
제조예 5: 본 발명의 세포 용해 칩의 제조
10 ㎕ 시료 부피를 위한 7.5 mm x 15 mm의 칩 크기를 갖는 마이크로칩을 실리콘, 유리, 폴리카보네이트 필름, 및 이중 코팅된 테이프(9495MP, 3M, MN, USA)을 이용하여 제조하였다. 도 4에 보여준 바와 같이, 레이저 유도된 시료 제조를 위해, 제조 방법은 2가지 포토리쏘그래피 단계 및 폴리카보네이트 필름과 이중 코팅된 테이프에 의한 결합 단계로 이루어진다. 직경이 6인치이며, 두께가 500 ㎛인 유리 웨이퍼를 세정하고, BF410 필름 포토레지스트로 라미네이션(lamination)하였다. 포토레지스트를 포토리쏘그래피에 의해 패터닝하여 시료 도입구 및 출구 통로를 위한 직경이 1.5 mm인 구멍을 형성하였다. 구멍을 모래 분사(sand blast) 기술에 의해 유리 웨이퍼 상에 형성하였다. 실리콘 웨이퍼는 직경이 6인치이며, 두께가 680 ㎛인 양면 연마된 실리콘 기판이다. 챔버는 비용 문제로 인해 모래 분사 기술에 의해 실리콘 웨이퍼 상에 형성한다. 시료 로딩의 최적화를 위해, Sigmacoat
Figure 112005024496745-PAT00005
(Sigma-aldrich, MO, USA)를 실리콘 웨이퍼의 모래 분사된 표면 상에 코팅한다. 이어서, 두께가 100 ㎛인 폴리카보네이트 필름을 두께가 150 ㎛인 이중 코팅된 테이프를 이용하여 실리콘 웨이퍼에 결합한다.
제조예 6: 레이저 유도된 온칩(on-chip) 시료 제조 시스템
도 2A에 보여준 바와 같이, 박테리아 세포 용해를 위해, 하기 제조된 박테리아 세포(1㎕) 및 마이크로 자성 비드(9㎕, 대략 9×106 비드/㎕, Dynabeads
Figure 112005024496745-PAT00006
MyOne™ Carboxylic Acid, DYNAL, Norway)를 칩 가이드 모듈(AMITECH, 한국)에 위치한 마이크로칩(SAIT, 한국)에서 혼합하였다. 자성 비드 및 비드 물질의 표면 전하의 효과를 위해, 실리카 비드(3.0 ㎛, Bangs Laboratories Inc., IN, USA), 아민 말단의 폴리스티렌 자성 비드(1.5 ㎛, Bangs Laboratories Inc., IN, USA), 폴리스티렌 비드(4.16 ㎛, Bangs Laboratories Inc., IN, USA), 실리카 비드 및 카르복실산 말단의 폴리스티렌 자성 비드를 별도로 준비하였다.
각 실험에서 지정된 시간 동안 세포를 파괴하기 위해 808 nm (1W)의 고출력 레이저 빔을 마이크로칩을 알루미늄 진동 바를 이용하여 코인 형태 진동 모터(DMJBRK20X, Samsung electro-mechanics, 한국)에 의해 진동하면서, 각 실험에서 0.22 NA 발산(divergence)을 갖는 화이버 커플링된(fiber-coupled) 레이저 시스템(HLU25F100-808, LIMO, 독일)을 이용하여 적용하였다. 레이저 조사 출력을 30W Broadband Power/Energy 측정기 (MELLES GRIOT, US)로 측정하였다. 레이저 파장을 물에서 파장의 흡수 계수에 의해 선택하였다. 물에서 0.021773(㎝-1)의 흡수 계수를 갖는 808nm의 대부분의 레이저 빔은 물을 투과하여, 마이크로 자성 비드에 도달한다. 본 발명의 목적상, 가시광선 레이저 빔이 또한 적용가능하나, 고출력 레이저 다이오드는 휴대용 장치로서 개발되지 않았으며, 비용이 비싸다. 게다가, 물에서 IR 파장의 흡수 계수는 매우 높으며; 대부분의 IR 레이저 에너지는 물에 흡수되 어 본 발명의 용도에 적합하지 않다. UV 레이저 빔은 세포 용해 및 DNA 정제에 좋지 않은데, 이는 UV 조사는 DNA 손상을 야기한다고 알려져 있기 때문이다. UV 로 조사된 DNA는 주요한 광 생성물로서 티민 이합체를 축적한다. 그리하여, 우리는 808 nm 스펙트럼을 갖는 연속 레이저 다이오드를 이용하였다.
알루미늄(AMITECH, 한국)을 갖는 휴대폰(DMJBRK20X, Samsung electro-mechanics, 한국)에 대개 이용되는 진동 모터를 이용한 온칩 시료 제조 시험 모듈에 대한 진동 시스템을 12,000rpm으로 마이크로칩의 단지 시료 챔버 지역의 유연한 폴리카보네이트 필림을 진동하기 위해 디자인하였다. 진동 모터의 진동 출력을 전원 공급장치(E3620A, Agilent, CA, USA)에 의해 조절하였다. 마이크로칩의 챔버내의 시료 온도를 데이타 수득 시스템(34970A, Agilent, CA, USA)을 갖는 열전쌍(K type, Omega)으로 측정하였다. 도 3에 보여준 바와 같이, 입구 및 출구 양자를 자성 비드를 포함하는 시료 용액을 로딩한 후에 광학적으로 투명한 부착 테이프(Applied Biosystems, CA, USA) 로 봉합하였다. 레이저 조사 동안 누수가 발생하지 않는 것을 확인하기 위해, 입구 및 출구 양자를 온칩 시료 제조 시험 모듈의 상단 커버 상에 위치한 2개의 엘라스토머(thermogreen LB-2, Sigma-Aldrich, MO, USA)로 압착하였다.
제조예 7: 자성 비드를 이용한 생존 세포 및 사멸 세포의 사진
레이저 조사에 이은 시료 용액 중에 존재하는 생존 세포 및 사멸 세포를 관찰하기 위해, 공급자에 의해 추천된 절차에 따라 Live/Dead BacLight™ 박테리아 생존능 키트 (L7012, Molecular Probe, OR, USA)를 이용하여 염색하였다. 이미지 를 현미경(Eclipse TE 300, Nikon, Japan)으로 촬영하였다.
제조예 8: 레이저 조사 후의 DNA 분석
게놈 및 플라스미드 DNA를 다양한 방법을 이용하여 pCR
Figure 112005024496745-PAT00007
II-TOPO
Figure 112005024496745-PAT00008
(Invitrogen) 플라스미드를 포함하는 동일한 수의 BL21 세포로부터 분리하였다. 레이저 용해를 위해, 세포를 자성 비드와 혼합하고, 40초 동안 레이저로 조하하고, DNA를 페놀/클로로포름/이소아밀알코올 세정 후에 0.3M 아세트산 나트륨을 이용한 에탄올 침전으로 정제하였다. 보일링 용해를 위해, 세포를 95℃에서 5분 동안 가열하고, DNA를 레이저 용해와 같이 정제하였다. Qiagen QIAprep
Figure 112005024496745-PAT00009
미니프렙 키트를 이용하여 플라스미드를 분리하였다. Qiagen QIAamp
Figure 112005024496745-PAT00010
DNA 미니 키트를 이용하여 BL21의 게놈 DNA를 분리하였다. DNA를 1kb 마커를 이용하여 0.7% 아가로스 겔을 이용하여 전기영동하였다.
실시예 1: 자성 비드의 존재하에 세포 생존에 대한 레이저 조사의 효과
자성 비드의 존재하에 세포 생존에 대한 레이저 조사의 효과를 조사하였다. 도 6 는 레이저 조사 후의 세포 생존능의 측정을 보여준다. 세포(3 x 103)를 지정된 시간 동안 마이크로 자성 비드의 존재(A 및 B) 및 부재(C)하에 레이저 조사 후에 LB 플레이트 상에 도말하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 인큐베이션하고, 생성된 콜로니의 수를 계산하였다 (A; 지정된 시간 동안 마이크로 자성 비드의 존재하에 레이저 조사 후의 현탁액 중의 세포, B; 레이저 조사 후에 자성 비드를 세정함으로써 회수된 세포, C; A 에 기재된 것과 동일하나 세포는 마이크로 자성 비드 의 부재하에 조사됨. 세포는 장기간 동안 레이저 빔으로 조사된 것임을 유의한다. D; 레이저 조사가 없는 양성 대조군).
도 6에 보여준 바와 같이, 박테리아 세포가 레이저 조사에 의해 생존능을 상실한다는 것을 관찰하였다. 생존능의 상실은 자성 비드의 첨가로 급격하게 증가하였다. 3초 조사후에, 5%의 세포(3000 개의 세포 중에서 153개)가 자성 비드의 존재하에 생존하였고, 10초의 조사 후에 어느 세포도 생존하지 못하였다 (도 6A). 대조적으로, 자성 비드의 부재하에는 30초 동안 조사해도 세포의 거의 2/3(대략 2000개)가 생존하였다 (도 6C). 세포가 비특이적으로 비드에 결합되지 않는다는 것을 확인하기 위해, 비드를 높은 염 완충액 (PBS + 0.3 M NaCl)으로 세정하고, 세정액을 또한 생존 세포에 대해 검사하였다 (도 6B). 적은 수의 생존 세포가 회수되며, 생존 역학은 현탁액에서 회수된 세포의 것과 동일하다는 것을 관찰하였는데, 이는 비드 유래의 세포가 비드 사이에 용액으로 포획된 것과 거의 유사하다는 것을 나타낸다. 상기 결과는 레이저 조사가 자성 비드의 존재하에 세포의 신속한 용해를 야기할 수 있으므로, 생존하는 세포에 존재하는 게놈, 에피좀, 또는 바이러스 DNA 와 같은 임의의 유형의 DNA 를 방출하기 위해 사용될 수 있다는 것을 제시한다.
실시예 2: 세포로부터의 DNA 방출에 대한 레이저 조사의 효과
상기 관찰된 생존능의 상실은 세포로부터 DNA 를 방출하기 위해 필요한 세포 용해와 반드시 연관되지 않기 때문에, 전술한 PCR 을 이용하여 16S rDNA 를 증폭함으로써 용액 중에 DNA 가 존재하는지를 검사하였다. 도 7 은 레이저 조사가 단지 자성 비드의 존재하에 박테리아 DNA 를 효율적으로 방출한다는 것을 보여준다. 막대기는 증폭된 DNA 농도(ng/㎕)를 나타낸다. PCR 산물의 양은 Agilent BioAnalyzer 2100 의 사용으로 정량화되었다. 오차 막대기는 평균의 표준편차를 나타낸다.
도 7에 보여준 바와 같이, 16S rDNA 는 주형 DNA 공급원으로서 용액을 사용할 경우에 가장 효율적으로 증폭되었다. 게다가, PCR 산물의 양은 조사 시간에 비례하고, 자성 비드는 PCR 효율을 급격하게 (20배 이상) 증가시켰다. 상기 결과는 세포 생존능과 일치한다. 즉, 상기 결과는 세포 생존능의 상실이 단지 세포 용해가 없는 세포의 열적 불활성화 뿐만 아니라, 세포의 물리적인 파괴에 기인한다는 것을 증명하였다.
실시예 3: 마이크로 자성 비드를 응용한 레이저 어블레이션 세포 용해법과 화학적 세포 용해법의 DNA 방출의 효율 비교
DNA 방출의 효율을 통상적인 화학적 세포 용해의 것과 직접 비교하기 위해, 세포 용해 및 방출된 DNA 의 정제를 위한 Qiagen 키트인 DNeasy 를 이용하였다. 도 8 는 레이저 어블레이션에 의해 방출된 DNA 가 통상의 방법으로 제조된 DNA 보다 Taq 중합효소에 의해 더욱 효율적으로 증폭된다는 것을 보여준다. 모든 실험에 대해, 동일한 수의 세포를 사용하여 DNA 를 제조하였다. 막대기는 증폭된 DNA 농도(ng/㎕)를 나타낸다. PCR 산물의 양은 Agilent BioAnalyzer 2100 의 사용으로 정량화되었다. 오차 막대기는 평균의 표준편차를 나타낸다.
도 8에 보여준 바와 같이, 16S rDNA 는 자성 비드의 존재하에 레이저 조사 후에 수득된 DNA 를 이용할 경우에 더욱 효율적으로 증폭되었다. Qiagen 키트가 적은 세포수(< 1 x 109)를 포함하는 시료에 대해 최적이 아니라는 것을 고려하면, Qiagen 키트를 이용하여 회수된 DNA 의 양은 예상된 것보다 적다는 것이 가능하다. 이에도 불구하고, 자성 비드와 함께 레이저에 의한 세포 용해는 이 기술을 LOC 에 통합할 때 용이성으로 인해 적용에서 더 큰 다양성을 제공할 수 있었다. 게다가, 레이저 어블레이션에 의해 방출된 DNA 를 이용한 PCR 증폭의 효율은 Qiagen 키트 또는 끓이는 방법으로 수득되는 DNA 보다 크다는 것을 관찰하였다. 이것은 레이저 조사가 다른 두가지의 통상적인 방법보다 적어도 동일하거나 또는 더 많은 양의 DNA 를 방출한다는 것을 나타낸다. 동일한 양의 DNA 가 방출된다면, 레이저 어블레이션 유래의 DNA 를 이용한 더욱 효율적인 PCR 증폭은 방해물질의 방출이 레이저 어블레이션에 의해 최소화된다는 것을 나타낸다.
실시예 4: 세포 용해 효율에 대한 자성 비드의 크기의 효과
세포로부터 DNA 의 방출에 대한 자성 비드 크기의 효과를 조사하였다. 도 9 는 자성 비드의 크기의 효과를 보여준다. 막대기는 증폭된 DNA 농도(ng/㎕)를 나타낸다. PCR 산물의 양은 Agilent BioAnalyzer 2100 의 사용으로 정량화되었다. 오차 막대기는 평균의 표준편차를 나타낸다.
도 9에 보여준 바와 같이, 직경이 2.8㎛ 인 자성 비드가 5nm 금 입자 (G1402, Sigma, MO, 미국)보다 세포 용해에서 훨씬 더 효율적이었다.
실시예 5: 칩 커버부에 대한 레이저 투과율 시험
레이저 발생부에서 생성된 레이저가 칩 커버부를 효율적으로 투과할 수 있는지를 알아보기 위해, 칩 커버부로서 Pyrex 7740 및 반사방지 코팅된 Pyrex 7740(Corning 사)을 이용하였다. 레이저 출력은 1, 2, 3, 및 4W를 이용하였으며, 측정 장치로는 30W Broadband Power/Energy 측정기(MELLES GRIOT, US)를 이용하였다. 도 10은 Pyrex 7740 및 반사방지 코팅된 Pyrex 7740에 대한 레이저의 투과율을 보여준다. 도 10에서 보여주는 바와 같이, 반사방지 코팅된 Pyrex 7740은 반사방지 코팅되지 않은 Pyrex 7740에 비해 레이저 투과율이 약 1.75% 높다는 것을 알 수 있다. 따라서, 세포 용해 칩 내로 레이저를 효율적으로 제공하기 위해서는 반사방지 코팅된 Pyrex 7740이 본 발명의 목적에 적합하다는 것을 알 수 있는 것이다.
실시예 6: 세포 용해 칩에 대한 증발 억제 시험
본 발명의 세포 용해 칩이 레이저에 의해 생성된 증기압에 의해 증발이 발생하는지를 알아보기 위해, 증발 시험을 수행하였다. 상기 제조된 세포 용해 칩을 이용하여 레이저 출력은 1, 2, 3, 및 4W를 이용하였으며, 200회 이상 동일한 실험을 반복하였다. 도 11은 본 발명의 세포 용해 칩에 레이저를 조사한 후의 사진이다. 레이저 출력이 2W 이하에서는 시료 용액내의 온도가 상승하여 증기압은 증가하나, 세포 용해 칩 내부에서 증발은 일어나지 않는다는 것을 알 수 있다.
실시예 7: 자성 비드 농도에 따른 세포 용해 효율
자성 비드 농도에 따른 세포 용해 효율, 즉 방출된 DNA의 양을 조사하였다. 상이한 양의 비드를 시료 용액에 첨가하고(0 내지 9 x 106 비드/㎕), 1W 레이저 광선 출력을 808 nm에서 40초 동안 조사하였다. 도 12는 자성 비드 농도에 따라 대장균 세포로부터 방출된 DNA의 PCR 결과를 나타내는 그래프이다. 또한, Cp (Crossing point)는 실시간 PCR 반응에서 검출 가능한 형광 신호가 나타나는 사이클 수를 말한다. 즉 초기 DNA 농도가 높을수록 낮은 Cp에서 형광 신호가 검출가능하고, 초기 DNA 농도가 낮을수록 Cp가 크다. Cp는 또한, DNA 정제와도 관련 있는데, DNA 의 순도가 높을수록 Cp는 낮고, DNA 의 순도가 낮을수록 Cp는 높다. 따라서, Cp가 낮을수록 용액 속의 DNA 는 더욱 정제된 형태라는 것을 알 수 있다.
도 12에 보여주는 바와 같이, 자성 비드의 농도가 증가할수록 방출된 DNA 의 양은 증가한다는 것을 알 수 있으며, 5 x 106 비드/㎕ 이상의 자성 비드의 농도에서는 효율적인 세포 용해 및 DNA 방출에 대한 양호한 효율을 보여주었다. 또한, 출발 표적 카피수의 정확한 측정을 위해, 공지된 실시간 PCR 기계로서 LightCycler
Figure 112005024496745-PAT00011
(Roche　Diagnostics　Corporation, IN, USA)에 의해 대장균 DNA 증폭의 Cp (Crossing point) 값을 조사하였다. 도 12에 보여주는 바와 같이, Cp 값은 자성 비드의 농도의 증가에 따라 감소하였다. 이 결과는 자성 비드의 농도가 증가할 때 출발 표적 카피수가 증가한다는 것을 제시한다.
실시예 8: 진동의 세기에 따른 세포 용해 효율
진동의 세기에 따른 세포 용해 효율을 알아보기 위해, 0V∼4V의 진동기의 전압을 이용하였다. 세포는 반응당 1×105 세포/㎕의 그람음성 세균인 대장균(E. coli)을 이용하였다. 레이저 출력은 808 nm의 0.5W를 이용하고, 용해 시간은 40초이며, 시료 부피는 10㎕이며, 세포 용해 칩과 광 섬유 간의 거리는 1mm이며, 자성 비드 농도는 5×106 비드/㎕를 이용하였으며, 3회 반복하였다. 도 13은 진동기의 전압에 따라 대장균 세포로부터 방출된 DNA의 PCR 결과를 나타내는 그래프이다. 양성 대조군으로서 이용한 보일링은 대장균 세포를 95℃에서 5분 동안 끓인 후에 방출된 DNA를 이용하여 PCR 한 것이며, 음성 대조군은 DNA 없이 증류수만을 이용하여 PCR 한 것이다. 막대기는 증폭된 DNA 농도(ng/㎕)를 나타낸다. PCR 산물의 양은 Agilent BioAnalyzer 2100 의 사용으로 정량화되었다. 오차 막대기는 평균의 표준편차를 나타낸다. 증폭된 DNA의 양이 많을수록 용해된 세포의 수가 많아 세포 용해 효율이 높다는 것을 나타낸다.
도 13에 보여준 바와 같이, 진동기의 전압이 증가할수록 세포 용해 효율이 증가하며, 3V 이상에서는 보일링 방법보다 세포 용해 효율이 높다는 것을 알 수 있다. 또한, 진동기의 전압이 증가할수록 세포 용해 효율이 높아 방출된 DNA가 증가하므로 이로 인해 Cp는 감소한다는 것을 알 수 있다.
따라서, 세포 또는 바이러스와 자성 비드를 혼합하고 진동을 가하지 않은 것에 비해 혼합 후 진동을 하는 것이 세포 용해 효율을 증가시킨다는 것을 알 수 있는 것이다.
실시예 9: 레이저 출력에 따른 그람양성 세균에 대한 용해 효율
레이저 출력에 따른 그람양성 세균에 대한 세포 용해 효율을 알아보기 위해, 0.5W∼3W의 레이저 출력을 이용하였다. 세포로는 1×105 세포/㎕의 그람양성 세균인 스태필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)를 이용하고, 세포 용해 칩과 광 섬유 간의 거리는 3mm를 이용하고, 자성 비드 농도는 9×106 비드/㎕를 이용한 것을 제외하고는 상기 실시예 8과 유사하게 실험을 수행하였다. 도 14는 레이저의 출력에 따라 스태필로코커스 에피더미디스 세포(1×105 세포/㎕)로부터 방출된 DNA의 PCR 결과를 나타내는 그래프이다. 대조군은 스태필로코커스 에피더미디스 세포를 13,200rpm에서 5분 동안 원심분리 후 상등액을 취해서 PCR 한 것이며, 양성 대조군으로서 이용한 보일링은 스태필로코커스 에피더미디스 세포를 95℃에서 5분 동안 끓인 후에 방출된 DNA를 이용하여 PCR 한 것이며, 음성 대조군은 DNA 없이 증류수만을 이용하여 PCR 한 것이다. 막대기는 증폭된 DNA 농도(ng/㎕)를 나타낸다. PCR 산물의 양은 Agilent BioAnalyzer 2100 의 사용으로 정량화되었다. 오차 막대기는 평균의 표준편차를 나타낸다. 도 14에 보여준 바와 같이, 레이저 출력이 증가할수록 세포 용해 효율이 증가하며, 1W 이상에서는 보일링 방법과 비슷하거나 우수한 세포 용해 효율을 보인다는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 마이크로칩을 이용하여 세포 또는 바이러스를 용해시에는 레이저 출력을 상당히 낮출 수 있다는 것을 알 수 있는 것이다.
세포의 농도에 따른 세포 용해 효율을 알아보기 위해, 상기 실험에서 1×105 세포/㎕ 대신에 1×102 세포/㎕의 그람양성 세균인 스태필로코커스 에피더미디스 (Staphylococcus epidermidis)를 이용하였다.
도 15는 레이저의 출력에 따라 스태필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 세포(1×102 세포/㎕)로부터 방출된 DNA의 PCR 결과를 나타내는 그래프이다. 대조군은 스태필로코커스 에피더미디스 세포를 13,200rpm에서 5분 동안 원심분리 후 상등액을 취해서 PCR 한 것이며, 양성 대조군으로서 이용한 보일링은 스태필로코커스 에피더미디스 세포를 95℃에서 5분 동안 끓인 후에 방출된 DNA를 이용하여 PCR 한 것이며, 음성 대조군은 DNA 없이 증류수만을 이용하여 PCR 한 것이다. 막대기는 증폭된 DNA 농도(ng/㎕)를 나타낸다. PCR 산물의 양은 Agilent BioAnalyzer 2100 의 사용으로 정량화되었다. 오차 막대기는 평균의 표준편차를 나타낸다. 도 15에 보여준 바와 같이, 레이저 출력이 증가할수록 세포 용해 효율이 증가하며, 3W에서는 보일링 방법에 비해 현저하게 세포 용해 효율이 높다는 것을 알 수 있다. 따라서, 세포 농도에 무관하게 본 발명의 방법을 이용하면 그람양성 세균을 효율적으로 용해할 수 있음을 알 수 있는 것이다.
또한, 본 발명의 세포 용해 칩을 이용하여 또 다른 그람양성 세균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 세포를 효율적으로 용해할 수 있는지를 알아보기 위해, 스태필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 세포 및 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 세포를 이용하고, 40초 동안 1W의 레이저 출력을 이용한 것을 제외하고는 상기와 동일하게 실험하였다.
도 16은 스태필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 세포 및 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 세포로부터 방출된 DNA의 PCR 결과를 나타내는 그래프이다. 시료 1은 스태필로코커스 에피더미디스 세포로부터 방출된 DNA를 이용하여 PCR 한 것이며, 시료 2는 스태필로코커스 에피더미디스 세포를 95℃에서 5분 동안 끓인 후에 방출된 DNA를 이용하여 PCR 한 것이며, 시료 3은 스트렙토코커스 뮤탄스 세포로부터 방출된 DNA를 이용하여 PCR 한 것이며, 시료 4는 스트렙토코커스 뮤탄스 세포를 95℃에서 5분 동안 끓인 후에 방출된 DNA를 이용하여 PCR 한 것이며, 시료 5는 DNA 없이 증류수만을 이용하여 PCR 한 것이다. 막대기는 증폭된 DNA 농도(ng/㎕)를 나타낸다. PCR 산물의 양은 Agilent BioAnalyzer 2100 의 사용으로 정량화되었다. 오차 막대기는 평균의 표준편차를 나타낸다. 도 16에 보여준 바와 같이, 본 발명의 세포 용해 방법은 그람양성 세균인 스태필로코커스 에피더미디스 세포 및 스트렙토코커스 뮤탄스 세포 모두 보일링 방법에 비해 세포 용해 효율이 높다는 것을 알 수 있다.
실시예 10: 레이저 출력에 따른 그람음성 세균에 대한 용해 효율
레이저 출력에 따른 그람음성 세균에 대한 세포 용해 효율을 알아보기 위해, 0W∼3W의 레이저 출력을 이용하였다. 세포로는 1×105 세포/㎕의 그람음성 세균인 대장균(E. coli)를 이용한 것을 제외하고는 상기 실시예 9와 유사하게 실험을 수행하였다. 도 17은 레이저의 출력에 따라 대장균(E. coli) 세포(1×105 세포/㎕)로부터 방출된 DNA의 PCR 결과를 나타내는 그래프이다. 양성 대조군으로서 이용한 보일링은 대장균 세포를 95℃에서 5분 동안 끓인 후에 방출된 DNA를 이용하여 PCR 한 것이며, 음성 대조군은 DNA 없이 증류수만을 이용하여 PCR 한 것이다. 막대기는 증폭된 DNA 농도(ng/㎕)를 나타낸다. PCR 산물의 양은 Agilent BioAnalyzer 2100 의 사용으로 정량화되었다. 오차 막대기는 평균의 표준편차를 나타낸다. 도 17에 보여준 바와 같이, 레이저 출력이 증가할수록 세포 용해 효율이 증가하며, 1W 이상에서는 보일링 방법에 비해 세포 용해 효율이 높다는 것을 알 수 있다. 또한, Cp 도 레이저 출력이 증가할수록 감소하므로, 방출된 DNA 양이 증가한다는 것을 알 수 있는 것이다. 그러나, 2W 이상의 레이저 출력에서는 세포 용해 효율에 별 다른 차이가 없는 것으로 보아, 포화되었다는 것을 알 수 있다. 이 결과는 모든 세포가 용해될 때까지 레이저 출력을 증가시킬수록 출발 표적 카피수가 증가한다는 것을 제시한다.
따라서, 본 발명의 마이크로칩을 이용하여 세포 또는 바이러스를 용해시에는 레이저 출력을 상당히 낮출 수 있다는 것을 알 수 있는 것이다.
세포의 농도에 따른 세포 용해 효율을 알아보기 위해, 상기 실험에서 1×105 세포/㎕ 대신에 1×102 세포/㎕의 그람음성 세균인 대장균(E. coli)을 이용하였다.
도 18은 레이저의 출력에 따라 대장균(E. coli) 세포(1×102 세포/㎕)로부터 방출된 DNA의 PCR 결과를 나타내는 그래프이다. 대조군은 대장균 세포를 13,200rpm에서 5분 동안 원심분리 후 상등액을 취해서 PCR 한 것이며, 양성 대조군으로서 이용한 보일링은 대장균 세포를 95℃에서 5분 동안 끓인 후에 방출된 DNA를 이용하여 PCR 한 것이며, 음성 대조군은 DNA 없이 증류수만을 이용하여 PCR 한 것 이다. 막대기는 증폭된 DNA 농도(ng/㎕)를 나타낸다. PCR 산물의 양은 Agilent BioAnalyzer 2100 의 사용으로 정량화되었다. 오차 막대기는 평균의 표준편차를 나타낸다. 도 18에 보여준 바와 같이, 레이저 출력이 증가할수록 세포 용해 효율이 증가하며, 0.5W 이상에서는 보일링 방법에 비해 세포 용해 효율이 높으며, 3W에서는 보일링 방법에 비해 세포 용해 효율이 현저하게 높다는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 마이크로칩을 이용하여 세포 또는 바이러스를 용해시에는 레이저 출력을 상당히 낮출 수 있다는 것을 알 수 있는 것이다.
따라서, 세포 농도에 무관하게 본 발명의 방법을 이용하면 그람음성 세균을 효율적으로 용해할 수 있음을 알 수 있는 것이다.
실시예 11: 레이저 출력에 따른 대장균 시료의 온도 변화
레이저 출력에 따른 대장균 시료의 온도 변화를 알아보기 위해, 0.5, 1, 및 2W의 레이저 출력을 이용하였다. 세포로는 1×105 세포/㎕의 그람음성 세균인 대장균(E. coli)를 이용하여 실시예 10과 유사하게 실험을 수행하였다. 도 19는 레이저의 출력에 따른 대장균(E. coli) 시료의 온도 변화를 나타내는 그래프이다. 도 19에 보여준 바와 같이, 레이저 출력이 증가할수록 시료 온도는 증가하며, 특히 수 초 동안 1W 이상의 레이저 조사 후에 65℃ 이상으로 시료 온도는 급격하게 증가하였다.
실시예 12: 자성 비드 및 비드 물질의 표면 전하의 효과
자성 비드 및 비드 물질의 표면 전하에 따른 세포 용해 효율을 알아보기 위 해, 4 가지의 상이한 비드를 이용하였다. 비드 농도는 0.5%인 것을 제외하고는 실시예 10과 유사하게 실험을 수행하였다. 도 20은 자성 비드 및 비드 물질의 표면 전하에 따라 대장균(E. coli) 세포(1×105 세포/㎕)로부터 방출된 DNA의 PCR 결과를 나타내는 그래프이다. 시료 1은 아민 말단의 폴리스티렌 자성 비드, 시료 2는 실리카 비드, 시료 3은 폴리스티렌 비드, 시료 4는 카르복실산 말단의 폴리스티렌 자성 비드를 이용하여 방출된 방출된 DNA를 이용하여 PCR 한 것이며, 시료 5는 양성 대조군으로서, 대장균 세포를 95℃에서 5분 동안 끓인 후에 방출된 DNA를 이용하여 PCR 한 것이며, 시료 6은 음성 대조군으로서 DNA 없이 증류수만을 이용하여 PCR 한 것이다. 막대기는 증폭된 DNA 농도(ng/㎕)를 나타낸다. PCR 산물의 양은 Agilent BioAnalyzer 2100 의 사용으로 정량화되었다. 오차 막대기는 평균의 표준편차를 나타낸다. 도 20에 보여준 바와 같이, 레이저 조사는 카르복실산 말단의 폴리스티렌 자성 비드의 존재하에 단지 대장균 DNA를 효율적으로 방출하였다.
또한, 4가지 유형의 비드에 대해 시료 용액의 온도를 조사하였다(데이타 미제시). 실리카 비드를 이용한 시료 용액의 온도는 매우 천천히 증가하였는데, 이는 실리카 비드가 1W 레이저 출력에 대해 불충분하게 레이저 빔을 흡수하였기 때문이다. 아민 말단의 폴리스티렌 비드를 이용한 시료 용액의 온도는 카르복실산 말단의 폴리스티렌 자성 비드와 유사하게 증가하였으나, 방출된 DNA는 비드의 표면의 아민 작용기의 양전하에 의한 정전기적 인력으로 인해 자성 비드에 결합하였다. 폴리스티렌 비드를 이용한 시료 용액의 온도는 상기 비드의 열용량으로 인해 실리 카 비드와 자성 비드 사이의 중간 속도로 증가하였다.
카르복실산 말단의 폴리스티렌 자성 비드의 가장 큰 이점은 레이저 및 마이크로 자성 비드를 이용한 세포 용해는 단백질의 변성 및 제거를 초래하기 때문에 DNA 분리 단계를 줄일 수 있다는 것이다. 변성된 단백질 및 세포 찌꺼기는 흡착에 의해 자성 비드의 폴리스티렌 표면에 부착되는데, 이는 중력 또는 자기장에 의한 용이한 제거를 촉진시킨다. DNA는 비드의 카르복실산의 음전하에 의한 척력으로 인해 비드에 결합하지 않는다. 이는 검출 한계를 낮추고, DNA 추출 시간을 줄이고, 신호 진폭을 증가시킴으로써 PCR 수율을 현저하게 개선할 수 있다.
실시예 13: 레이저 조사에 따른 세포의 생존능 조사
레이저 조사에 따라 시료 용액 중에 존재하는 생존 세포 및 사멸 세포를 관찰하기 위해, 대장균 세포를 이용하였다. 도 21은 레이저 조사 유무에 따른 대장균 세포의 생존능을 나타내는 사진이다. 패널 (A)는 레이저 조사 전에 마이크로 자성 비드의 부재하의 대장균 세포의 이미지이며, 패널 (B)는 0.5W 레이저 출력을 갖는 808 nm에서 40초 동안 레이저 조사 후의 마이크로 자성 비드 존재하의 대장균 세포의 이미지이며, 패널 (C)는 1W 레이저 출력을 갖는 808 nm에서 40초 동안 레이저 조사 후의 마이크로 자성 비드 존재하의 대장균 세포의 이미지이다. 연두색으로 염색된 세포는 생존한 세포이며, 적색으로 염색된 세포는 사멸 세포를 보여준다. 도 21에서 보여주는 바와 같이, 레이저 조사를 하기 전에는 세포의 대부분이 생존해 있음을 알 수 있으며, 레이저 출력이 증가할수록 사멸 세포의 비율이 증가한다는 것을 알 수 있다.
실시예 14: 레이저 조사에 따른 게놈 DNA의 손상 여부 확인
레이저 조사에 의해 게놈 DNA가 손상되는지를 알아보기 위해, 분리된 DNA가 레이저로 40초 조사 후에 절단되는지를 조사하였다. 도 22는 pCR
Figure 112005024496745-PAT00012
II-TOPO
Figure 112005024496745-PAT00013
(Invitrogen) 플라스미드를 포함하는 대장균 BL21 세포에 레이저 조사 후에 DNA를 분석한 사진이다. 레인 1은 본 발명의 방법을 이용하여 DNA를 분리한 것이며, 레인 2는 95℃에서 5분 동안 끓인 후에 분리된 DNA이며, 레인 3은 Qiagen QIAprep
Figure 112005024496745-PAT00014
미니프렙 키트를 이용하여 플라스미드 DNA를 분리한 것이며, 레인 4는 Qiagen QIAamp
Figure 112005024496745-PAT00015
DNA 미니 키트를 이용하여 BL21의 게놈 DNA를 분리한 것이며, 레인 5는 플라스미드가 없는 대장균 BL21 세포로부터 Qiagen QIAamp
Figure 112005024496745-PAT00016
DNA 미니 키트를 이용하여 BL21의 게놈 DNA를 분리한 것이다. 레인 5는 게놈 DNA에 대한 올바른 밴드를 확인하기 위해 이용하였다. 도 22에 보여주는 바와 같이, DNA에 대한 손상은 없었다. 예상한 바와 같이, 플라스미드를 분리하기 위한 Qiagen QIAprep
Figure 112005024496745-PAT00017
미니프렙 키트는 게놈 DNA로의 오염이 거의 없었다(레인 3 참고). 흥미롭게도, 본 발명의 방법을 이용하면, 플라스미드 DNA로의 오염이 훨씬 적었다. 대조적으로, 박테리아 세포에 대한 단백질분해효소 K 처리 후에 실리카 겔 막 기술을 이용하는 게놈 DNA 분리를 위한 Qiagen QIAamp
Figure 112005024496745-PAT00018
DNA 미니 키트를 이용하면, 많은 플라스미드 DNA 오염이 있었다(레인 4). 이는 Qiagen 키트에 의한 분리된 DNA보다 본 발명의 방법에 의해 분리된 DNA를 이용하여 PCR 증폭하는 경우에 더욱 양호한 수율을 수득할 수 있었던 이유를 설명할 수 있다.
본 발명에서, 레이저 및 마이크로 자성 비드를 조합함으로써 효율적인 세포 용해에 대한 신규 방법을 개발하였으며, 세포 현탁액 중에 존재하는 마이크로 자성 비드는 레이저 빔을 상기 시료에 적용했을 때 신속한 세포 용해를 야기하여, 수 초 내에 박테리아 세포를 파괴시켰다. 가장 중요하게는, 상기 방식으로 파괴된 세포로부터 방출된 DNA 는 다른 두가지 통상적인 방법에 의해 용해된 세포로부터 방출된 DNA 보다 더욱 효율적으로 PCR 에 의해 증폭되었는데, 이는 세포 용해 동안 DNA 의 증폭을 방해하는 물질(들)의 방출이 다른 방법에 비해 최소화된다는 것을 나타낸다. 용이성, 효율적인 세포 용해 및 DNA 의 방출은 본 발명의 새로운 방법이 LOC 적용에 통합되기에 적합하도록 한다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 방법에 따르면 40초 이내의 빠른 세포 용해가 가능하고, 레이저 다이오드를 이용한 소형화가 가능하며, 바로 정제 단계로 진행할 수 있으며, 세포 찌꺼기와 비드를 전자석으로 제거하고 DNA 가 포함된 용액이 다음 단계로 진행될 수 있다. 또한, 본 발명의 세포 용해 칩을 통해 증발 문제를 해결하였으며, 진동을 통한 기계적 힘을 동시에 자성 비드를 통하여 세포에 효율적으로 전달할 수 있으며, 칩 내부의 소수성 처리로 거친 면에 대한 마이크로플루이딕스 문제를 해결하였으며, 랩온어칩에 적용이 가능하게 되었다.
<110> Samsung Electronics Co., Ltd. <120> Method and apparatus for the rapid disruption of cells or viruses using LASER and micro magnetic beads <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 cccagactcc tacgcgaggc 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gtattaccgc aactgctggc ac 22

Claims (41)

  1. 세포 또는 바이러스를 포함하는 용액에 자성 비드를 주입하는 단계;
    상기 자성 비드를 진동시키는 단계; 및
    상기 자성 비드에 레이저를 조사하여 세포 또는 바이러스를 파괴하는 단계를 포함하는 세포 또는 바이러스의 파괴 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 레이저가 펄스 레이저 또는 연속파동 레이저를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 펄스 레이저가 1mJ/펄스 이상이고, 연속파동 레이저가 10mW 이상의 출력을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 펄스 레이저가 32mJ/펄스 이상이고, 연속파동 레이저가 10W 이상의 출력을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 레이저는 400nm 이상의 파장대에서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 레이저는 750nm ~ 1300nm의 파장대에서 발생하는 것 을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서, 상기 레이저는 하나 이상의 파장대에서 발생하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 자성 비드의 크기가 50nm ~ 1,000㎛인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 자성 비드의 크기가 1㎛ ~ 50㎛인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 자성 비드가 2 가지 이상의 크기를 갖는 비드로 혼합된 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 자성 비드가 강자성체를 띠는 Fe, Ni, Cr 및 이의 산화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 자성 비드가 중합체, 유기 물질, 규소, 또는 유리에 강자성체를 띠는 금속으로 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 자성 비드의 표면이 음전하를 띠는 구조로 되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 용액이 타액, 소변, 혈액, 혈청 및 세포 배양액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 시료 도입구가 형성되어 있어 상기 시료 도입구를 통해 시료와 자성 비드를 수용하는 세포 용해 챔버;
    상기 챔버에 부착되어, 상기 챔버 내에서 시료와 자성 비드를 혼합하는 진동기(vibrator); 및
    상기 챔버에 부착되어, 레이저를 공급하는 레이저 발생부를 포함하는 세포 또는 바이러스의 파괴 장치.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 진동기는 초음파세척기, 자기장을 이용한 진동기, 전기장을 이용한 진동기, 기계적 진동기 및 압전물질로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
  17. 제 15 항에 있어서, 상기 챔버에 부착되어, 세포 용해 작용 종료 후에 상기 세포 용해 챔버내의 자성 비드를 제거하는 전자석을 추가로 포함하는 것을 특징으 로 하는 장치.
  18. 제 15 항에 있어서, 상기 세포 용해 챔버와 채널을 통해서 연결된 DNA 정제 챔버를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  19. 제 15 항에 있어서, 상기 세포 용해 챔버와 채널을 통해서 연결된 DNA 증폭 챔버를 추가로 포함하는 것을 특징으로 장치.
  20. 제 18 항에 있어서, 상기 DNA 정제 챔버와 채널을 통해서 연결된 DNA 증폭 챔버를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  21. 시료 도입구가 형성되어 있어 상기 시료 도입구를 통해 시료와 자성 비드를 수용하는 세포 용해 칩;
    상기 칩에 진동 전달부를 통해 연결되며, 상기 칩 내에서 시료와 자성 비드를 혼합하는 진동기(vibrator);
    상기 칩에 부착되어, 상기 진동기에 의해 발생한 진동을 상기 칩에 전달하는 진동 전달부;
    상기 칩에 부착되어, 레이저를 공급하는 레이저 발생부; 및
    상기 칩에 부착되어, 시료의 증발을 억제하는 증발억제부를 포함하는 세포 또는 바이러스의 파괴 장치.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 진동기는 자기장을 이용한 진동기, 전기장을 이용한 진동기, 기계적 진동기 및 압전물질로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 진동기는 진동 전달부를 통해 세포 용해 칩 바닥부에 진동을 전달해 주는 것을 특징으로 하는 장치.
  24. 제 21 항에 있어서, 상기 증발억제부는 셉타(septa)로 구성되는 것을 특징으로 하는 장치.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 셉타(septa)는 밸브, 중합체 구조물 및 금속 구조물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
  26. 상단과 하단이 개방되어 있으며, 반응 챔버, 시료의 도입구 및 출구가 형성되어 있는 칩 바디부;
    상기 칩 바디부의 상단에 부착되어 상기 반응 챔버의 상단부를 밀폐시키며, 상기 칩 내에 레이저를 통과시켜주며, 시료의 도입구 및 출구가 있는 칩 커버부; 및
    칩 부착부를 통하여 상기 칩 바디부의 하단에 부착되어 반응 챔버, 시료 도 입구 및 출구의 하단부를 밀폐시키는 칩 바닥부
    를 포함하는 제 21 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 따른 세포 또는 바이러스의 파괴 장치에 이용하기 위한 세포 용해 칩.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 칩 커버부의 재질은 유리, 중합체 및 인듐주석산화물(ITO) 유리로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 칩.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 칩 커버부에 레이저의 반사방지 코팅을 하는 것을 특징으로 하는 칩.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 칩 커버부는 반사방지 코팅된 Pyrex 7740인 것을 특징으로 하는 칩.
  30. 제 26 항에 있어서, 상기 칩 바디부의 재질은 유리, 중합체, 실리콘 및 양면접착테이프로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 칩.
  31. 제 26 항에 있어서, 상기 칩 바닥부의 재질은 중합체, 실리콘, 유리 및 인듐주석산화물(ITO) 유리로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 칩.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 칩 부착부는 접착테이프 및 접착제로 구성된 군으 로부터 선택되는 접착물에 의해 상기 칩 바디부와 칩 바닥부를 연결하는 것을 특징으로 하는 칩.
  33. 제 21 항에 있어서, 상기 레이저가 펄스 레이저 또는 연속파동 레이저를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 펄스 레이저가 1mJ/펄스 이상이고, 연속파동 레이저가 10mW 이상의 출력을 가지는 것을 특징으로 하는 장치.
  35. 제 21 항에 있어서, 상기 레이저는 400nm 이상의 파장대에서 발생하는 것을 특징으로 하는 장치.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 레이저는 하나 이상의 파장대에서 발생하는 것을 특징으로 하는 장치.
  37. 제 21 항에 있어서, 상기 자성 비드의 크기가 50nm ~ 1,000㎛인 것을 특징으로 하는 장치.
  38. 제 37 항에 있어서, 상기 자성 비드가 2 가지 이상의 크기를 갖는 비드로 혼합된 것을 특징으로 하는 장치.
  39. 제 21 항에 있어서, 상기 자성 비드가 강자성체를 띠는 Fe, Ni, Cr 및 이의 산화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 이상의 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
  40. 제 21 항에 있어서, 상기 자성 비드가 중합체, 유기 물질, 규소, 또는 유리에 강자성체를 띠는 금속으로 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 장치.
  41. 제 21 항에 있어서, 상기 시료가 타액, 소변, 혈액, 혈청 및 세포 배양액으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 장치.
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