CN1818054A - 利用微磁珠和激光快速破碎细胞或病毒的方法和装置 - Google Patents

利用微磁珠和激光快速破碎细胞或病毒的方法和装置 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种利用微磁珠和激光快速破碎细胞或病毒的方法和装置。根据利用微磁珠和激光快速破碎细胞或病毒的方法和装置，在40秒钟内细胞裂解是可行的，该装置利用激光二极管可得以小型化，在破碎细胞或病毒后可直接实施DNA纯化步骤，并在用电磁体除去与随后反应的抑制剂进行吸附的细胞碎片和珠子后，将含有DNA的溶液转入随后的步骤。此外，通过本发明的细胞裂解芯片，蒸发问题得以解决，并且振荡通过磁珠可有效地传递到细胞，粗糙表面上的微流化问题通过疏水化处理芯片的内表面得以解决，以及细胞裂解芯片可应用于LOC。

Description

利用微磁珠和激光快速破碎细胞或病毒的方法和装置
技术领域
本发明涉及利用微磁珠和激光快速破碎(disruption)细胞或病毒的方法和装置。
背景技术
一般地，具体的病原菌(pathogenic bacteria)的分子诊断以四个步骤进行：1)细胞裂解，2)DNA分离，3)DNA扩增和4)DNA检测。
在许多应用中需要从细胞有效地提取DNA，并且在分子诊断中是不可缺少的，尤其是在病原菌的鉴定和定量中。分子诊断通常在提取DNA后通过DNA扩增而进行。DNA扩增包括聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应、链置换扩增、基于核酸的扩增、修复链式(repair chain)反应、解旋酶(helicase)链式反应、QB复制酶(replicase)扩增、连接激活转录(ligation activated transcription)。
使用具有结合DNA倾向的物质来实施从细胞分离DNA的方法。用于DNA分离的物质的实例包括硅石(silica)、玻璃纤维、阴离子交换树脂和磁珠(Rudi，K.等，Biotechniqures 22，506-511(1997)；和Deggerdal，A.等，Biotechniqures 22，554-557(1997))。为避免手工步骤和消除操作者的误差，研制一些用于高通量(high-throughput)DNA提取的自动化仪器。
细胞裂解通常通过机械法、化学法、热法、电法、超声波法或微波法得以实施(Michael T.Taylor等，Anal.Chem.，73，492-496(2001))。
化学法包括利用裂解剂破碎细胞以释放DNA。使用离液剂(chaotropic)进行细胞提取物的附加处理是为变性蛋白质所必需的。化学裂解法不利在于使用粗制化学品来破碎细胞。由于它们会干扰随后的PCR，必须在PCR前纯化DNA。化学法是费力费时的，需要昂贵的消耗品而且经常得到低DNA产量。热法包括冻/融的循环，但经常不能破碎细胞内的许多结构。
加热是破碎细胞壁或膜的可选择方法。简单加热不利在于它导致蛋白质的变性，其可附着于释放的DNA。它们也可干扰DNA扩增。物理法使用庞大的和昂贵的压力装置，其不适合芯片实验室(Lab-on-a-chip)(LOC)应用。
超声波处理是物理法的替换方案，其中细胞溶液或悬浮液置于超声波浴(bath)中的小室中。超声波破碎在细胞裂解中具有许多缺点。首先，超声能的分布不均匀。超声能的不均匀分布带来不一致的结果。其次，由于在超声波浴中能量分散，经常需要几分钟来完全破碎细胞。最后，超声波法产生令人不适的声波。
激光在细胞破碎中具有许多优点，可容易地应用于LOC(Huaina Li等，AnalChem，73，4625-4631(2001))。
美国公开专利2003/96429A1公开激光诱导的细胞裂解系统。当只使用激光时，并没有出现高效的细胞裂解。作为使用很清澈的溶液中的大肠杆菌进行实验的结果，可以确定当只用激光照射时，可获得较低的细胞裂解率。在激光照射150秒钟后，测量的DNA浓度是3.77ng/ul，这是因为激光能量没有有效地转入细胞。依靠常规加热法在95℃煮沸细胞5分钟后，测量的DNA浓度是6.15ng/μl。
美国专利6,685,730公开用于增强组织修复的光学吸收性纳米粒子(optically-absorbing nanoparticle)。该专利包括连接组织的方法，包括：将可在一个或多个波长吸收光的、具有1至1000纳米尺寸的纳米粒子输送到要被连接的组织；和将所述的纳米粒子暴露于可被该纳米粒子吸收的一个或多个波长的光。该方法通过使用激光和纳米粒子只引起细胞的功能丧失，并没有描述通过振荡含有细胞和微粒的溶液而破碎细胞的方法。
因此，为克服以上问题，发明者进行深入研究并发现：使用微磁珠和激光，当振荡含有细胞或病毒的溶液时，所述的细胞或病毒能得以快速地破碎。
发明内容
本发明提供破碎细胞或病毒的方法，该方法包括：将磁珠加入含有细胞或病毒的溶液中；振荡磁珠；和用激光照射磁珠以破碎细胞或病毒。
本发明还提供用于破碎细胞或病毒的装置，包括：具有输入样品和磁珠的入口(inlet hole)的细胞裂解小室；连接于所述小室并使该小室中的样品和磁珠混合的振荡器；和连接于所述小室并提供激光的激光发生器(laser generator)。
本发明还提供用于破碎细胞或病毒的装置，包括：具有输入样品和磁珠的入口的细胞裂解芯片(chip)；通过振荡传递部件(vibration transfer part)连接于所述芯片的振荡器以在该芯片上混合所述的样品和磁珠，连接于所述芯片的振荡传递部件将振荡传递到所述芯片；连接于所述芯片的激光发生器提供激光；和连接于所述芯片的抗蒸发部件(anti-evaporation part)以抑制所述样品的蒸发。
本发明还提供用于破碎细胞或病毒的装置的细胞裂解芯片，包括：具有暴露的顶面和底面(opened top surface and bottom surface)的芯片体，并包括反应室、入口(inlet hole)和出口(outlet hole)；连接于芯片体顶面的芯片盖(cover)以关闭所述反应室的上部(upper portion)，可允许激光穿过，并具有入口和出口；以及通过芯片连接部件(chip bonding part)连接于芯片体底面的芯片底部(chip bottom)，以关闭所述反应室的下部、入口以及出口。
附图说明
通过结合附图对本发明的代表性的实施方案进行详细描述，本发明的以上和其他特征以及优点将会变得更加清楚，其中：
图1是利用微磁珠和激光用于细胞裂解的系统的示意图；
图2A是根据本发明实施方案利用激光和微磁珠用于微芯片上细胞裂解的系统的示意图；
图2B是图2A中显示的系统的设计；
图3是细胞裂解装置的隔片部的照片；
图4是在利用微磁珠和激光在用于破碎细胞的装置中所用微芯片的实施方案的示意图；
图5是根据本发明实施方案的微芯片的照片；
图6表示在激光照射后确定细胞生存力的结果；
图7显示仅存在微磁珠时，激光照射有效地释放细菌DNA；
图8显示通过激光照射释放的DNA比通过常规方法制备的DNA可被Taq聚合酶更高效地扩增；
图9显示磁珠大小的影响；
图10是显示Pyrex 7740和抗反射(AR)包被的Pyrex 7740的透射率(transmittance)的曲线图；
图11是在激光照射后根据本发明实施方案的细胞裂解芯片的照片；
图12是表示相对于磁珠浓度，从大肠杆菌细胞释放的DNA的PCR结果曲线图；
图13是显示相对于振荡器电压，从大肠杆菌细胞释放的DNA的PCR结果曲线图；
图14是显示相对于激光功率(laser power)，从表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)细胞(1×105细胞/μl)中释放的DNA的PCR结果曲线图；
图15是显示相对于激光功率，从表皮葡萄球菌细胞(1×102细胞/μl)中释放的DNA的PCR结果曲线图；
图16是显示从表皮葡萄球菌细胞和变异链球菌(Streptococcus mutans)细胞中释放的DNA的PCR结果曲线图；
图17是显示相对于激光功率，从大肠杆菌细胞(1×105细胞/μl)中释放的DNA的PCR结果曲线图；
图18是显示相对于激光功率，从大肠杆菌细胞(1×102细胞/μl)中释放的DNA的PCR结果曲线图；
图19是显示相对于激光功率，大肠杆菌样品的温度的曲线图；
图20是显示相对于磁珠的表面电荷和珠子材质，从大肠杆菌细胞(1×105细胞/μl)中释放的DNA的PCR结果曲线图；
图21显示根据本发明实施方案的磁珠表面上的亚氨二乙酸(IDA)、Cu-IDA、芘(pyrene)和硫醇官能团的合成过程；
图22是相对于磁珠表面上的官能团，从大肠杆菌细胞中释放的DNA的PCR结果[交点(crossing point)(Cp)]的曲线图；
图23显示合成磁珠表面上的聚羧基官能团的实施方案；
图24是显示相对于磁珠表面上的官能团和珠子溶液的pH，从大肠杆菌细胞中释放的DNA的PCR结果(Cp)的曲线图；
图25是显示存在10％血清时相对于磁珠表面上的官能团，从大肠杆菌细胞中释放的DNA的PCR结果(Cp)的曲线图；
图26是显示存在10％血清时相对于磁珠表面上的官能团，从乙型肝炎病毒(HBV)中释放的DNA的PCR结果(PCR产物的浓度)的曲线图；
图27是显示相对于激光照射，大肠杆菌细胞生存力的照片；和
图28是激光照射携带pCRII-TOPO(Invitrogen)质粒的大肠杆菌BL21细胞后，DNA分析的照片。
具体实施方式
在下文，本发明得到更详细地描述。
根据本发明实施方案破碎细胞或病毒的方法包括：将磁珠加入含有细胞或病毒的溶液中；振荡磁珠；和用激光照射磁珠以破碎细胞或病毒。
在该方法中，将激光射入含有磁珠的溶液中，磁珠由于激光的能量而引起烧蚀(ablation)，并将冲击波(shock waves)、蒸气压和热量传递到细胞表面。此时，物理冲击(shock)也可施加于细胞表面。通过激光加热的磁珠提高所述溶液的温度并直接破碎细胞。所述溶液中的磁珠并不充当单纯的热导体，而将热、机械和物理冲击施加于细胞表面，从而有效地破碎细胞表面。
利用磁珠和激光的快速细胞裂解通过在液体介质中加热和激光烧蚀(laserablation)得以进行。所述的激光连同微磁珠把热源转换为高度受热的磁珠的物理和机械冲击以促进细胞裂解。近年来，小尺寸、大功率的激光二极管得到快速地发展，使用相同技术的很小的细胞裂解装置将能够安装于芯片实验室(Lab-on-acbip)(LOC)上。此外，借助于光学纤维、镜子或透镜或直接这样做，激光可将动力和能量集中在芯片上的具体区域。
磁珠的最大优点是减化DNA分离步骤，因为借助于微磁珠和激光的细胞裂解可导致蛋白质的变性。变性的蛋白质和细胞碎片附着于磁珠并通过重力或磁力得以除去。结果，降低了检测极限，DNA提取时间由于省略了DNA提取过程的一个步骤而显著地缩短，聚合酶链式反应(PCR)分析的结果由于信号幅度的增加而显著地改善。利用微磁珠和激光破碎细胞所需的总时间仅仅是40秒钟。
激光烧蚀(laser ablation)指物质暴露于激光束中产生的现象。激光烧蚀可将物质表面的温度从几百度快速提高到几千度。如果物质表面的温度被提高到汽化点或更高，表面的饱和蒸气压根据液相物质的蒸发作用而快速地提高。饱和蒸气压通过Clausius-Clapeyron方程以温度函数表示，并在大功率脉冲激光过程的情况下通常上升到几十个大气压(atm)或更高。通过喷出的蒸气而施加于物质表面的压力称作“排斥压(repulsive pressure)”，并且排斥压值是约0.56Psat，其中Psat表示蒸气压。
在使用具有极大的瞬时强度的激光(如脉冲激光)的过程中可产生冲击波。在从几毫微秒(nano second)到几十毫微秒短时间地被加热到汽化点或更高的物质的表面上生成的蒸气，从几个大气压增长到几十个大气压的压力，并形成冲击波，同时膨胀到周围空气中。由于极高的压力，膨胀的蒸气对物质施加约0.56Ps(其中Ps表示表面的饱和蒸气压)。
在本发明的实施方案中，所述的激光包括脉冲激光或连续波(CW)激光。
在很低的激光功率时，不能有效地发生激光烧蚀。对于CW激光，该激光功率是10mW或更高，对于脉冲激光则是1mJ/脉冲或更高。优选地，脉冲激光是3mJ/脉冲或更高，CW激光具有100mW或更高的功率。这是因为当CW低于10mW和脉冲激光低于1mJ/脉冲时，不能传递破碎细胞的充足能量。
在本发明的实施方案中，所述的激光应该在磁珠可吸收激光能量的特异波长范围内得以产生。优选激光在400nm或更高的波长范围内，更优选在750nm到1300nm的波长范围内得以产生。这是因为DNA在低于400nm的波长变性或被破坏。所述的激光也可在一个或多个波长范围内产生。就是说，激光可具有在上述范围内的一个波长或两个或多个不同波长。
在本发明的实施方案中，所述磁珠的直径优选从50nm到1,000μm，更优选从1μm到50μm。当磁珠的直径小于50nm时，物理和机械冲击不足以导致细胞裂解。当磁珠直径超过1,000μm时，则不适于LOC。所述的磁珠也可以是两种或多种尺寸的珠子混合物。就是说，磁珠具有彼此相等的尺寸或者是具有不同尺寸的珠子混合物。
在本发明的实施方案中，所述的磁珠可以是任何的磁化物质。具体地说，磁珠优选包括至少一种选自铁磁Fe、Ni、Cr或其氧化物的物质。
在本发明的实施方案中，所述的磁珠可以是用铁磁金属包被的聚合物、有机物、硅或玻璃。
在本发明的实施方案中，磁珠表面优选带负电荷以使DNA不会附着在其上面。因为DNA带负电荷，由于排斥力它不会附着于带负电荷的磁珠。当DNA附着于所述磁珠时，在破碎细胞后很难从磁珠分离DNA，这使得DNA纯化变得困难。
在本发明的实施方案中，磁珠表面上的官能团可以是亲水性的，并且含有磁珠的溶液具有6-9的pH。从裂解的细胞中获得的DNA的扩增效率可根据磁珠表面上的官能团和含有磁珠的溶液的pH而变化。当官能团的亲水性增强时，细胞裂解后DNA的扩增效率得以提高。优选地，官能团是具有负电荷的羧基或其衍生物。羧基衍生物包括亚氨二乙酸(IDA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、多羧酸(polycarboxylic acid)等等。含有磁珠的溶液的pH优选是6-9。如果pH在以上范围之外，细胞裂解后DNA的扩增效率降低。
在本发明的实施方案中，所述的溶液选自唾液、尿液、血液、血清或细胞培养物溶液。所述的溶液可以是任何含有核酸的溶液，诸如动物细胞、植物细胞、细菌、病毒、噬菌体等等。
根据本发明的另一个实施方案用于快速破碎细胞或病毒的装置包括：具有输入样品和微磁珠的入口的细胞裂解小室；连接于所述小室并该小室中的样品和微磁珠混合的振荡器(vibrator)；以及连接于所述小室并提供激光的激光发生器。
图1是利用激光和微磁珠(macro magnetic beads)，用于细胞裂解的系统的实施方案的示意图。样品通过入口得以供应。将样品与磁珠彻底地混合。样品和磁珠的彻底混合通过振荡器得以进行。当振荡所述的混合物时发射出激光。细胞裂解小室窗口应该由激光能充分穿过的物质组成。暴露于激光的磁珠将光转化为热，也就是出现激光烧蚀。热、振荡、冲击波、蒸气压等等由于有效的热传递和持续振荡引起的磁珠与细胞的碰撞而得以充分地转化。当细胞裂解小室的温度通过激光得以提高时，打开石蜡阀(paraffin valve)，这可通过石蜡阀的厚度得以控制。在破碎足够的细胞后，关闭激光并且剩下的微磁珠通过电磁体得以除去。如果石蜡阀通过加热得以除去，将得到的溶液上样至扩增纯化的DNA的PCR小室。
在本发明的实施方案中，所述的振荡器包括超声波仪、利用磁场的振荡器、利用电场的振荡器、机械振荡器例如涡流仪(vortex)等等，或压电(piezoelectric)材料。所述的振荡器连接于细胞裂解小室，并可以是任何能振荡细胞和微磁珠的混合溶液的装置。
在本发明的实施方案中，用于快速破碎细胞或病毒的装置还可包括：完成细胞裂解后，连接于所述的细胞裂解小室并除去细胞裂解小室中磁珠的电磁体(electromagnet)。该电磁体可连接于所述的细胞裂解小室，并且为了LOC实现(implementation)的目的，完成细胞裂解后磁珠可通过所述的电磁体得以除去，以使所破碎的细胞溶液能直接上样至PCR小室而不必进行磁珠的分离。为了被电磁体除去，所述的珠子应该能被磁化。
在本发明的实施方案中，如果需要纯化更完全的DNA，用于快速破碎细胞或病毒的装置还可包括通过PCR小室前的通道连接于细胞裂解小室的DNA纯化小室。如果利用磁场或电场的石蜡阀或MEMS结构的阀门在完成细胞裂解后被打开，所述的DNA纯化小室可连接于所述的细胞裂解小室以纯化DNA。
在本发明的实施方案中，用于快速破碎细胞或病毒的装置还可包括位于连接所述细胞裂解小室的通道的石蜡阀，其厚度由细胞裂解时间控制。当细胞裂解小室的温度通过激光得以提高时，打开石蜡阀，这可由该石蜡阀的厚度得以控制。
在本发明的实施方案中，用于快速破碎细胞或病毒的装置还包括通过通道连接于所述细胞裂解小室的DNA扩增小室。由于如上所述可获得由微磁珠纯化的效果，所述的DNA扩增小室可直接连接于所述的细胞裂解小室。
在本发明的实施方案中，用于快速破碎细胞或病毒的装置还包括通过通道连接于所述细胞纯化小室的DNA扩增小室。为了LOC实现的目的，需要纯化的DNA的扩增系统。纯化的DNA利用分光光度计、微磁珠、电化学法、电致化学发光法(electrochemiluminescence)、辐射和荧光标记、实时PCR法等等得以检测。所述的PCR法是最适合于充分扩增需要的DNA。可应用其他DNA扩增法，而通过实时PCR法等进行直接检测也是可能的。
根据本发明的另一个实施方案用于破碎细胞或病毒的装置包括：具有输入样品和磁珠的入口的细胞裂解芯片；通过振荡传递部件连接于所述芯片的振荡器以在该芯片中混合所述的样品和磁珠，连接于所述芯片的振荡传递部件将振荡传递到芯片；连接于所述芯片的激光发生器提供激光；和连接于所述芯片的抗蒸发部件以抑制所述样品的蒸发。
图2A是利用了激光和微芯片上的微磁珠，在细胞裂解中应用的系统的实施方案的示意图，图2B是图2A中所示系统的设计。细胞裂解芯片是利用通过入口导入的样品和磁珠而裂解细胞或病毒的装置。所述的细胞裂解芯片包括芯片盖、芯片体、芯片连接部件(a chip bonding part)以及芯片底部。随后将更加具体地描述细胞裂解芯片的元件。所述细胞裂解芯片功能是作为裂解细胞或病毒的反应室。
所述的振荡器通过振荡传递部件连接于所述的细胞裂解芯片，并使该细胞裂解芯片中的样品和磁珠混合。所述的振荡器可以是竖直振荡。所述的振荡器包括超声波仪、利用磁场的振荡器、利用电场的振荡器、机械振荡器例如涡流仪等等，或压电材料。所述的振荡器可以是任何能振荡细胞和微磁珠的混合溶液的装置。所述的振荡器可以是用于移动电话(mobile phone)的振荡传动器(motor)。
通过细胞裂解芯片底部表面，振荡传递部件可传递由振荡器对小室产生的振荡。所述的振荡传递部件可由金属例如铝组成。
所述的激光发生器连接于所述的细胞裂解芯片并提供对该细胞裂解芯片的激光。
所述的抗蒸发部件连接于所述的细胞裂解芯片以防止样品免于蒸发。当使用激光裂解细胞时，由于温度提高而出现蒸发。因此，抗蒸发部件为减少蒸发所必需。所述的抗蒸发部件应当具有能承受10psi(磅/平方英寸)或更高压力的结构。所述的抗蒸发部件可包括隔片(septa)。有可能光学磁带连接于入口和出口，然后隔片固定于所述的细胞裂解芯片上。图3是该细胞裂解装置的隔片的照片。所述的隔片可以是阀门、聚合物结构或金属结构，但只要能抑制蒸发，隔片就不具体地被限制为这些。
在本发明的实施方案中，所述的激光可包括脉冲激光或连续波(CW)激光。
在很低的激光功率时，不能有效地发生激光烧蚀。对于CW激光，该激光功率是10mW或更高，对于脉冲激光则是1mJ/脉冲或更高。这是因为当CW低于10mW和脉冲激光低于1mJ/脉冲时，不能传递破碎细胞的充足能量。
在本发明的实施方案中，所述的激光应该在磁珠可吸收激光能量的特异波长范围内得以产生。优选激光在400nm或更多的波长范围内，更优选在750nm到1300nm的波长范围内得以产生。这是因为DNA在低于400nm的波长内变性或被破坏。所述的激光也可在一个或多个波长范围内得以产生。就是说，激光可具有在上述范围内的一个波长或两个或多个不同波长。
在本发明的实施方案中，所述磁珠的直径优选从50nm到1,000μm，更优选从1μm到50μm。当磁珠的直径小于50nm时，物理和机械冲击不足以导致细胞裂解。当磁珠直径超过1,000μm时，则不适于LOC。所述的磁珠也可以是两种或多种尺寸的珠子混合物。就是说，磁珠具有彼此相等的尺寸或者是具有不同尺寸的珠子混合物。
在本发明的实施方案中，所述的磁珠可以是任何的磁化物质。具体地说，磁珠优选包括至少一种选自铁磁Fe、Ni、Cr或其氧化物的物质。
在本发明的实施方案中，所述的磁珠是铁磁金属包被的聚合物、有机物、硅或玻璃。
在本发明的实施方案中，磁珠表面优选带负电荷以使DNA不会附着在其上面。因为DNA带负电荷，由于排斥力它不会附着于带负电荷的磁珠。当DNA附着于所述磁珠时，在破碎细胞后很难从磁珠分离DNA，这使得DNA纯化变得困难。
在本发明的实施方案中，所述的样品选自唾液、尿液、血液、血清或细胞培养物溶液。所述的样品可以是任何含有核酸的溶液，诸如动物细胞、植物细胞、细菌、病毒、噬菌体等等。
根据本发明的另一个实施方案用于破碎细胞或病毒的装置的细胞裂解芯片包括：具有暴露(opened)的顶面和底面的芯片体，包括反应室、入口和出口；连接于芯片体顶面的芯片盖以关闭所述反应室的上部，允许激光穿过，并具有入口和出口；以及通过芯片连接部件连接于芯片体底面的芯片底部，以关闭所述反应室的下部、入口以及出口。
图4是使用微磁珠和激光，在用于破碎细胞的装置中用到的微芯片的实施方案的示意图。关于图4，芯片体具有暴露的顶面和底面，并包括反应室、入口和出口。所述的芯片体可以是能承受100℃或更高温度的硅片。所述的芯片体可由玻璃、聚合物或硅组成。优选玻璃是Pyrex7740。所述的芯片体具有连接于芯片盖的顶面，和连接于芯片连接部件的底面。所述芯片体的内表面可以进行疏水性处理，以抑制产生气泡。例如，芯片体的内表面可以用Sigmacoat进行包被。
芯片盖连接于芯片体的顶面以关闭反应室的上部。所述的芯片盖可允许激光穿过，并具有入口和出口。所述的芯片盖可由玻璃、聚合物、氧化铟锡(indium tinoxide)(ITO)玻璃等等组成。优选玻璃是Pyrex 7740。优选地，芯片盖的原料可承受高温并具有90％或更高的透射率。所述的芯片盖可具有抗反射(AR)包被，以提高激光的透射率。可使用本领域公知的方法形成所述的抗反射包被。因此，所述的芯片盖可使用AR包被的Pyrex 7740得以制备。
芯片底部通过芯片连接部件连接于芯片体的底面，以关闭反应室的下部、入口以及出口。所述芯片底部可由聚合物、硅、玻璃、ITO玻璃等等组成。优选地，芯片底部的原料能承受高温并是弹性的。所述的芯片底部优选由能有效传递由振荡器对芯片体产生的振荡的材料组成，例如，聚碳酸酯薄膜(polycarbonate film)。
所述的芯片连接部件将芯片底部连接于芯片体，并作为含有样品的反应室的辅助装置。所述的连接借助于选自胶带(adhesive tape)和胶粘剂(adhesive)的粘合材料得以完成。尽管所述反应室仅仅利用所述的芯片体和芯片底部得以形成，可发生反应溶液的泄漏。所述的芯片连接部件可抑制反应溶液的泄漏。图5是根据本发明实施方案的微芯片的照片。
现在本发明根据下列实施例得以更详细的描述。下列实施例仅仅用于说明性目的，并非限制本发明的范围。
预备实施例1：细胞裂解系统
如图1所示，将下列制备的细菌细胞(90μl)和微磁珠(30μl，DynabeadsM-270羧酸，DYNAL，挪威)在位于小管导向装置(vial guide)(AMITECH，韩国)的小瓶中混合。当通过涡流搅拌小瓶时，在独立实验的特定时间中，将808nm、13.8W高功率的激光束(HLU25F100-808，LIMO，德国)应用于所述的混合物以破碎细胞(参见图1)。
预备实施例2：细菌菌株和确定细菌细胞的生存力
将大肠杆菌菌株BL21和变异链球菌(ATCC#35668)在脑心浸液(BHI)培养基中于37℃充分通气培养，直至指数生长期(OD600＝0.5～1.0)。细菌细胞通过离心进行收获并以3ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液洗涤两次。所述的细胞重悬于PBS(细胞密度：1×105细胞/μl)。活细胞数量通过单个细胞形成菌落的能力进行测定。在激光束辐射后，将等分量的大肠杆菌细胞(1×103)涂布于BHI平板。将该平板在37℃过夜温育，并对菌落的数目进行计数。
将表皮葡萄球菌(ATCC#14990→12228)在营养琼脂(NA)培养基中于37℃充分通气培养，直至指数生长期(OD600＝0.5～1.0)。细菌细胞通过离心进行收获并以3ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液洗涤两次。所述的细胞重悬于PBS(细胞密度：1×105细胞/μl)。活细胞数量通过单个细胞形成菌落的能力进行测定。在激光束辐射后，将等分量的表皮葡萄球菌细胞(1×103)涂布于NA平板。将该平板在37℃过夜温育，并对菌落的数目进行计数。
预备实施例3：提取细菌基因组DNA
为了比较通过激光法释放DNA的效率和其他公知的常规方法的效率，将大肠杆菌基因组DNA(来自0.9×105个细胞，其相当于每次激光裂解用到的细胞数的)应用煮沸法于95℃、5分钟得以制备。
预备实施例4：对来自细菌的DNA释放进行定量
为了监控细胞裂解并定量来自裂解的细胞的DNA释放的量，使用AgilentBioanalyzer随后是聚合酶链式反应(PCR)扩增。下列引物对用于PCR：引物A(SEQID No：1)；引物B(SEQ ID No：2)。该引物对与编码16S核糖体RNA的基因的各个末端互补，允许在PCR过程中扩增它的全部编码区。
使用Taq聚合酶(Solgent.Co，Ltd，韩国)进行25轮循环的大肠杆菌PCR扩增(95℃1分钟的预变性，95℃5秒钟的变性，60℃13秒钟的退火，和72℃15秒钟的延伸，以及72℃1分钟的附加延伸)。对于革兰氏阳性细菌细胞；使用Taq聚合酶(Solgent.Co，Ltd，韩国)进行30轮循环的变性链霉菌和表皮葡萄球菌的PCR扩增(95℃1分钟的预变性，95℃5秒钟的变性，60℃13秒钟的退火，和72℃15秒钟的延伸，以及72℃1分钟的附加延伸)。在扩增循环结束后，通过60至90℃缓慢加热(0.1℃/s)样品得到解链曲线。通过LightCycler(Roche DiagnosticsCorporation，IN，美国)，并使用含有1×FastStart DNA Master SYBR(Roche DiagnosticsCorporation，IN，美国)、0.25μM的正向和反向引物(Genotech，韩国)、4mMMgCl2(Roche Diagnostics Corporation)、D.W(PCR级，Roche DiagnosticsCorporation，IN，美国)的总体积20μl的反应混合液进行PCR。利用商业可获得的DNA 500分析大小筛分试剂组，扩增的DNA在Agilent BioAnalyzer 2100(AgilentTechnologies，Palo Alto，加拿大)中得以分析。
预备实施例5：本发明的细胞裂解芯片的制作
用于10μl样品体积的7.5mm×15mm芯片尺寸的微芯片，通过利用硅氧烷(silicone)、玻璃、聚碳酸酯薄膜和双面胶带(Double Coated Tape)(9495MP，3M，MN，美国)得以制作。如图4所示，对于激光诱导的样品制备，所述制作过程由两个影印法步骤和通过双面胶带与聚碳酸酯薄膜的连接步骤而组成。清洁直径六英寸和厚度500μm的玻璃晶片，并通过BF410膜光刻胶(film photoresist)压为薄片。通过光刻法对所述的光刻胶形成图案，以形成用于样品入口和出口通道的直径1.5mm的孔。通过喷砂(sand blast)法在所述玻璃晶片上形成孔。所述的硅晶片是具有直径六英寸和厚度680μm的两面抛光的硅基片。由于成本关系通过喷砂法在硅晶片上形成小室。为了最优化点样，在硅晶片的喷砂处理的表面包被Sigmacoat(Sigma-aldrich，MO，美国)。然后，利用厚度150μm的双面胶带，将厚度100μm的聚碳酸薄膜连接到硅晶片。
预备实施例6：激光诱导的芯片内(on-chip)样品的制备系统
如图2A所示，为了细菌细胞裂解，将下列制备的细菌细胞(1μl)和微磁珠(9μl，约9×106珠/μl，DynabeadsMyOneTM Carboxylic Acid，DYNAL，挪威)在已置于芯片导向组件(guide module)(AMITECH，韩国)的微芯片中进行混合。由于磁珠和珠子材质的表面电荷的影响，额外制备硅珠(3.0μm，Bangs Laboratories Inc.，IN，美国)、末端氨基化的聚苯乙烯磁珠(1.5μm，Bangs Laboratories Inc.，IN，美国)、聚苯乙烯珠(4.16μm，Bangs Laboratories Inc.，IN，美国)和末端羧酸化的聚苯乙烯磁珠。
当利用铝振荡条(bar)通过硬币式振荡马达(coin-type vibration motor)(DMJBRK20X，三星机电，韩国)荡微芯片时，在每个实验中利用具有0.22NA分散度(divergence)的光纤耦合激光系统(fiber-coupled laser systems)(HLU25F100-808，LIMO，德国)，808nm(1W)的高功率激光束得以应用以破碎所示时期的细胞。所述的激光功率通过30瓦Broadband Power/Energy Meter(MELLESGRIOT，美国)得以测量。通过在水中波长的吸光系数选择激光波长。在水中具有0.021773(cm-1)吸光系数的808nm的大多数激光束可通过水传播并到达所述的微磁珠。为了本发明的目的，也可应用可见激光束，但不能应用作为手提式装置的高功率激光二极管，因为成本效率不佳。此外，IR波长在水中的吸光系数非常高；大多数IR激光能量可在水中得以吸收，使得其不适合这种应用。紫外线(UV)激光束不适合细胞裂解和DNA纯化，因为已知紫外线照射可导致DNA损伤。以紫外线照射的DNA积累胸腺嘧啶二聚体作为主要的光化产物(photoproduct)。因此，使用具有808nm光谱的连续激光二极管。
应用主要使用于移动式电话(DMJBRK20X，三星机电，韩国)中的振荡马达(motor)和铝(AMITECH，韩国)，设计用于芯片内样品制备测试组件的振荡系统，从而以12,000转/分仅仅振荡样品小室区中可弯曲的微芯片聚碳酸酯薄膜。振荡马达的振荡功率通过电源(E3620A，Agilent，CA，美国)进行调节。微芯片小室中的样品温度通过具有数据采集系统(34970A，Agilent，CA，美国)的热电偶(thermocouple)(K型，Omega)进行测量。如图3所示，在含有磁珠的样品溶液上样后，入口和出口都用光学透明胶带(Applied Biosystems，CA，美国)进行密封。为了确定在激光照射期间没有发生泄漏，入口和出口都用位于芯片内样品制备测试组件的顶盖上的两个弹性体(elastomers)(Thermogreen LB-2，Sigma-Aldrich，MO，美国)进行压紧(compress)。
预备实施例7：活细胞和死细胞与磁珠的照片
为了观察激光照射后样品溶液中剩余的活细胞和死细胞，根据供应商推荐的方法，利用Live/DeadBacLightTM Bacterial Viability试剂盒(L7012，Molecular Probe，OR，美国)进行染色。使用显微镜(Eclipse TE 300，Nikon，日本)拍摄图像。
预备实施例8：激光照射后DNA分析
使用各种方法，从含有pCRII-TOPO(Invitrogen)质粒的相同数量的BL21细胞中分离基因组和质粒DNA。对于激光裂解，将细胞与磁珠进行混合，并用激光照射40秒，在酚/氯仿/异戊醇抽提净化后，DNA通过含有0.3M乙酸钠的乙醇沉淀得以纯化。对于煮沸裂解，将细胞在95℃加热5分钟，并且DNA随激光裂解得以纯化。将Qiagen QIAprepMiniprep试剂盒用于分离质粒。将Qiagen QIAampDNAMini试剂盒用于分离BL21的基因组DNA。将DNA和1kb分子量标记通过0.7％琼脂糖凝胶进行电泳。
实施例1：磁珠存在时激光照射对细胞存活的影响
研究磁珠存在时激光照射对细胞存活的影响。图6显示激光照射后测定细胞生存力的结果。将细胞(3×103)在存在(A和B)或缺乏(C)微磁珠时用激光照射指定时间，然后在LB平板上涂布。将该平板在37℃过夜温育，然后计数形成的菌落数目(A：在存在微磁珠时激光照射指定时间后悬浮液中的细胞；B：在激光照射后通过洗涤磁珠回收的细胞；C：如A的细胞的相同条件下的细胞，除了在缺乏微磁珠时进行激光照射；注意通过激光束对细胞照射延长的时间；D：无激光照射的阳性对照)。
如图6所示，由于激光照射，细菌细胞丧失生存力。生存力的损失可通过加入磁珠得以显著地增长。在激光照射3秒后，5％的原始细胞(3000个细胞中的153个细胞)在磁珠的存在下得以幸存，并且激光照射10秒后，没有细胞幸存(图6A)。相反，在缺乏磁珠时，即使激光照射30秒后，约三分之二的原始细胞(约2000个细胞)幸存(图6C)。为了鉴定细胞非特异结合于珠子，将所述的珠子用高盐缓冲溶液(PBS+0.3M NaCl)洗涤，而且所述的洗涤溶液也用于检查活细胞(图6B)。回收少数活细胞，并且幸存动力学与从所述悬浮液回收的细胞的动力学相同，这表明来自珠子的细胞类似于用珠子之间的溶液收集的细胞。这些结果表明：在存在磁珠时，由于激光照射可导致细胞快速破碎，它可用于释放任何类型的DNA，例如存在于活细胞的基因组DNA、游离型(episomal)DNA或病毒DNA。
实施例2：激光照射对细胞释放DNA的影响
如以上观察，由于生存力的损失不必要涉及需要细胞释放DNA的细胞裂解，溶液中DNA的存在可通过利用以上描述的PCR来扩增16S rDNA而得以检验。图7表明仅仅在磁珠存在时激光照射可有效地释放细菌DNA。条形图代表扩增的DNA浓度(ng/μl)。PCR产物量通过Agilent BioAnalyzer 2100进行定量。误差棒(errorbar)代表平均值的标准偏差。
如图7所示，当溶液用作模板DNA源时，16S rDNA得以最有效地扩增。此外，PCR产物量与照射时间成正比，并且所述的磁珠可显著地(20倍或更多)提高PCR效率。这些结果与细胞生存力一致。就是说，这些结果表明细胞生存力的损失不是由无细胞裂解的细胞热钝化引起，而是由细胞的物理破碎引起。
实施例3：比较激光烧蚀细胞裂解与微磁珠和化学细胞裂解的DNA释放效率
为了直接比较根据本发明的细胞裂解的DNA释放效率与常规化学细胞裂解的效率，使用DNeasy，其为用于细胞裂解和纯化释放的DNA的Qiagen试剂盒。图8表明通过激光烧蚀释放的DNA比通过常规方法制备的DNA，可更有效地被Taq聚合酶扩增。在所有的实验中，通过使用相同数量的细胞制备DNA。条形图代表扩增的DNA浓度(ng/μl)。PCR产物量通过Agilent BioAnalyzer 2100进行定量。误差棒代表平均值的标准偏差。
如图8所示，存在磁珠时，在激光照射后16S rDNA可与获得的DNA进行更有效地扩增。考虑到Qiagen试剂盒对于含有细胞数量少(＜1×109)的样品不是最适的，可能利用Qiagen试剂盒回收的DNA的量比预期的少。尽管如此，由于容易将该技术整合于LOC，通过激光联合磁珠进行细胞裂解可提供在应用中更大的多能性。此外，可以观察到应用激光烧蚀释放的DNA比通过Qiagen试剂盒或煮沸法获得的DNA，PCR扩增效率更高。这表明激光照射释放DNA至少相同于或大于其他两种常规方法的DNA的量。如果释放出相同量的DNA，用来自激光烧蚀的DNA进行更有效地PCR扩增，这表明抑制物质的释放通过激光烧蚀得以最小化。
实施例4：磁珠尺寸对细胞裂解效率的影响
研究磁珠尺寸对细胞的DNA释放的影响。图9显示磁珠尺寸的影响。条形图代表扩增的DNA浓度(ng/μl)。PCR产物数量通过AgilentBioAnalyzer2100得以定量。误差棒代表平均值的标准偏差。
如图9所示，在细胞裂解中，直径2.7μm的磁珠效率更高于5-nm金粒子(G1402，Sigma，MO，美国)。
实施例5：对芯片盖的激光透射率(transmittance)测试
为了检测激光发生器产生的激光能有效地穿过芯片盖，将Pyrex 7740和AR包被的Pyrex 7740(Corning)用作芯片盖。利用30瓦Broadband Power/Energy Meter(MELLES GRIOT，美国)以1、2、3和4瓦的激光功率测量激光透射率。图10显示对Pyrex7740和AR包被的Pyrex 7740的激光透射率。如图10所示，AR包被的Pyrex 7740比未被AR包被的Pyrex 7740高约1.75％的激光透射率。因此，AR包被的Pyrex 7740适合于有效提供进入细胞裂解芯片的激光。
实施例6：对细胞裂解芯片的抗蒸发测试
由于激光可产生蒸气压，为了检查本发明的细胞裂解芯片引起蒸发，进行蒸发测试。对于以上制备的细胞裂解芯片，以1、2、3和4瓦的激光功率进行至少200次相同的实验。图11是激光照射后本发明的细胞裂解芯片的照片。在2瓦或更低的激光功率，由于提高了样品溶液的温度，蒸气压上升，并且没有发生细胞裂解芯片内的蒸发。
实施例7：磁珠数量对细胞裂解效率的影响
研究磁珠数量对细胞裂解效率，即释放的DNA量的影响。将不同数量的珠子加入样品溶液(0至9×106个珠子/μl)中，并以1瓦激光辐射功率在808nm照射40秒钟。图12是相对于磁珠数量，大肠杆菌细胞释放的DNA的PCR结果显示图。交叉点(crossing point)(Cp)是当在实时PCR中首次测定可探测荧光时的循环数。就是说，当DNA起始浓度提高时，Cp值降低。Cp还与DNA纯化有关。当DNA纯度提高时，Cp值降低。因此，当Cp值更低时，溶液中DNA是更纯化的形态。
如图12所示，当加入更多的磁珠时，释放的DNA量增加。在高于5×106个珠子/μl的珠子浓度，可获得有效的细胞裂解和DNA释放的高效率。同样，为了准确测定起始目标的拷贝数，通过作为已知的实时PCR仪器的LightCycler(RocheDiagnostics Corporation，IN，美国)检测扩增大肠杆菌DNA的Cp值。如图12所示，当加入更多的磁珠时，Cp值降低。这个结果说明当加入更多的磁珠时，起始目标的拷贝数增加。
实施例8：振荡功率对细胞裂解效率的影响
为了检查振荡功率对细胞裂解效率的影响，使用0-4伏振荡马达的电压。在每个反应中，使用革兰氏阴性细菌细胞的大肠杆菌细胞(1×105细胞/μl)。用0.5瓦激光辐射功率在808nm对10μl样品照射40秒。细胞裂解芯片和光纤的间隔是1mm。样品中珠子浓度是5×106个珠子/μl，并对每个条件重复测定三次。图13是相对于振荡马达的电压，大肠杆菌细胞释放的DNA的PCR结果显示图。在图13中，煮沸(阳性对照)指当在95℃将大肠杆菌细胞煮沸5分钟后，对释放的DNA进行PCR的情形；而阴性对照指当仅使用无DNA的蒸馏水进行PCR的情形。条形图代表扩增的DNA浓度(ng/μl)。PCR产物量通过Agilent BioAnalyzer 2100进行定量。误差棒代表平均值的标准偏差。当扩增的DNA量增加时，裂解的细胞数目增加，表明细胞裂解效率提高。
如图13所示，当振荡马达的电压升高时，细胞裂解效率提高。高于3伏的振荡马达的电压足够得到比使用煮沸法更高的细胞裂解效率。此外，当振荡马达的电压升高时，由于提高了细胞裂解效率，释放的DNA量增加，从而Cp值降低。
因此，用磁珠混合细胞或病毒后，细胞裂解效率通过振荡得到提高。
实施例9：激光辐射功率对革兰氏阳性细菌细胞的裂解效率的影响
为了检查激光辐射功率对革兰氏阳性细菌细胞的裂解效率的影响，使用0.5-3瓦的激光辐射功率。除了使用革兰氏阳性细菌细胞的表皮葡萄球菌(1×105细胞/μl)细包之外，实施如实施例8中的相同实验，细胞裂解芯片和光纤的间隔是3mm，并且样品中珠子浓度9×106个珠子/μl。图14是表皮葡萄球菌细胞(1×105细胞/μl)释放的DNA的PCR结果显示图。在图14中，对照指当在以13,200转/分对表皮葡萄球菌细胞离心5分钟后获得的上清液进行PCR的情形；煮沸(阳性对照)指当在95℃将表皮葡萄球菌细胞煮沸5分钟后，对释放的DNA进行PCR的情形；而阴性对照指当仅使用无DNA的蒸馏水进行PCR的情形。条形图代表扩增的DNA浓度(ng/μl)。PCR产物量通过Agilent BioAnalyzer 2100进行定量。误差棒代表平均值的标准偏差。如图14所示，当激光辐射功率提高时，细胞裂解效率提高。具体地，高于1瓦的激光辐射功率足以获得相同于或高于使用煮沸法的细胞裂解效率。因此，当使用本发明的微芯片裂解细胞或病毒时，激光辐射功率可显著地降低。
为了检查细胞浓度对细胞裂解效率的影响，实施上述相同的实验，除了使用革兰氏阳性细菌细胞的表皮葡萄球菌细胞(1×102细胞/μl)之外。
图15是相对于激光功率，表皮葡萄球菌细胞(1×102细胞/μl)释放的DNA的PCR结果显示图。在图15中，对照指当在以13,200转/分对表皮葡萄球菌细胞离心5分钟后获得的上清液进行PCR的情形；煮沸(阳性对照)指当在95℃将表皮葡萄球菌细胞煮沸5分钟后，对释放的DNA进行PCR的情形；以及阴性对照指当仅使用无DNA的蒸馏水进行PCR的情形。条形图代表扩增的DNA浓度(ng/μl)。PCR产物量通过Agilent BioAnalyzer 2100进行定量。误差棒代表平均值的标准偏差。如图15所示，当激光辐射功率提高时，细胞裂解效率提高。具体地，3瓦的激光辐射功率比使用煮沸法可提供更高的细胞裂解效率。因此，无论细胞浓度，使用本发明的方法，革兰氏阳性细菌细胞可得到有效地裂解。
此外，为了检查使用本发明的细胞裂解芯片可有效地裂解另一种的革兰氏阳性细菌细胞变性链霉菌，实施与上述的相同实验，除了使用表皮葡萄球菌细胞和变异链球菌细胞，并且以1瓦的激光辐射功率使用40秒之外。
图16是表皮葡萄球菌细胞和变性链霉菌细胞释放的DNA的PCR结果显示图。在图16中，样品1指当对表皮葡萄球菌细胞释放的DNA进行PCR的情形；样品2指当在以95℃煮沸葡萄球菌细胞5分钟后对释放的DNA进行PCR的情形；样品3指当对变性链霉菌细胞释放的DNA进行PCR的情形；样品4指当在以95℃煮沸变性链霉菌细胞5分钟后对释放的DNA进行PCR的情形；以及样品5指当仅使用无DNA的蒸馏水进行PCR的情形。条形图代表扩增的DNA浓度(ng/μl)。PCR产物量通过Agilent BioAnalyzer 2100进行定量。误差棒代表平均值的标准偏差。如图16所示，本发明的细胞裂解方法比使用煮沸法，对于表皮葡萄球菌细胞和变性链霉菌细胞具有更好的细胞裂解效率。
实施例10：激光功率对革兰氏阴性细菌细胞的裂解效率的影响
为了检查激光辐射功率对革兰氏阴性细菌细胞的裂解效率的影响，使用0-3瓦的激光辐射功率。除了使用革兰氏阴性细菌细胞的大肠杆菌细胞(1×105细胞/μl)之外，实施如实施例9中的相同实验。图17是大肠杆菌细胞(1×105细胞/μl)释放的DNA的PCR结果显示图。在图17中，煮沸(阳性对照)指当在95℃将大肠杆菌细胞煮沸5分钟后，对释放的DNA进行PCR的情形；以及阴性对照指当仅使用无DNA的蒸馏水进行PCR的情形。条形图代表扩增的DNA浓度(ng/μl)。PCR产物量通过Agilent BioAnalyzer 2100进行定量。误差棒(bars)代表平均值的标准偏差。如图17所示，当激光辐射功率提高时，细胞裂解效率提高。具体地，高于1瓦的激光辐射功率比使用煮沸法，足够得到更高的细胞裂解效率。此外，当激光辐射功率提高时，Cp值降低，表明释放的DNA量增加。但是，高于2瓦的激光辐射功率已经饱和。这个结果说明当激光辐射功率增加时，起始目标的拷贝数增加直到所有细胞得到裂解。
因此，使用本发明的微芯片裂解细胞或病毒时，激光辐射功率可得以显著地降低。
为了检查细胞浓度对细胞的裂解效率的影响，实施与上述相同的实验，除了使用革兰氏阴性细菌细胞的大肠杆菌细胞(1×102细胞/μl)之外。
图18是大肠杆菌细胞(1×102细胞/μl)释放的DNA的PCR结果显示图。在图18中，对照指当在以13,200转/分对大肠杆菌细胞离心5分钟后获得的上清液进行PCR的情形；煮沸(阳性对照)指当在95℃将大肠杆菌细胞煮沸5分钟后，对释放的DNA进行PCR的情形；以及阴性对照指当仅使用无DNA的蒸馏水进行PCR的情形。条形图代表扩增的DNA浓度(ng/μl)。PCR产物量通过AgilentBioAnalyzer 2100进行定量。误差棒代表平均值的标准偏差。如图18所示，当激光辐射功率提高时，细胞裂解效率提高。具体地，高于0.5瓦的激光辐射功率比使用煮沸法，足够得到更高的细胞裂解效率。3瓦的激光辐射功率比使用煮沸法，可提供更高的细胞裂解效率。因此，使用本发明的微芯片裂解细胞或病毒时，激光辐射功率可得以显著地降低。
所以，无论细胞浓度，使用本发明的方法，革兰氏阴性细菌细胞可有效地得以裂解。
实施例11：激光辐射功率对大肠杆菌样品温度的影响
为了检查激光辐射功率对大肠杆菌温度的影响，使用0.5、1以及2瓦的激光辐射功率。除了使用革兰氏阴性细菌细胞的大肠杆菌细胞(1×105细胞/μl)之外，实施如实施例10中相同的实验。图19是相对于激光辐射功率，大肠杆菌样品的温度变化显示图。如图19所示，样品温度随着激光辐射功率而升高。具体地，在以高于1瓦的激光辐射功率照射几秒钟后，样品温度可迅速升高超过65℃。
实施例12：磁珠和珠子材料的表面电荷的影响
为了检查磁珠和珠子材料的表面电荷对细胞裂解效率的影响，使用四种不同类型的珠子。除了珠子浓度是0.5％之外，实施如实施例10中相同的实验。图20是相对于磁珠和珠子材料的表面电荷，大肠杆菌细胞(1×105细/μl)释放的DNA的PCR结果显示图。在图20中，样品1、2、3和4指对分别使用末端氨基化的聚苯乙烯磁珠、硅珠、聚苯乙烯珠和末端羧酸化的聚苯乙烯磁珠而释放的DNA进行PCR的情形。样品5(阳性对照)指当在95℃将大肠杆菌细胞煮沸5分钟后，对释放的DNA进行PCR的情形，以及样品6(阴性对照)指当仅使用无DNA的蒸馏水进行PCR的情形。条形图代表扩增的DNA浓度(ng/μl)。PCR产物量通过AgilentBioAnalyzer 2100进行定量。误差棒代表平均值的标准偏差。如图20所示，仅仅存在末端羧酸化的聚苯乙烯磁珠时，激光照射可有效地释放大肠杆菌DNA。
此外，以四种类型的磁珠研究样品溶液温度(数据未显示)。由于用1瓦激光辐射功率时硅珠吸收激光束不充分，含有硅珠的样品溶液温度可非常缓慢地升高。类似于末端羧酸化的聚苯乙烯微珠，含有末端氨基化的聚苯乙烯微珠的样品溶液温度可升高，但由于所述珠子表面的氨基官能团的正电荷的静电相互作用，释放的DNA结合于微珠。由于微珠的热容量，聚苯乙烯珠的样品溶液温度以硅珠和磁珠之间的中档速度而升高。
末端羧酸化的聚苯乙烯磁珠的最大优点在于可减化DNA分离的步骤，因为利用激光和微磁珠的细胞裂解可导致蛋白质的变性和消除。变性的蛋白质和细胞碎片通过吸附作用粘附于磁珠的聚苯乙烯表面，这有利于通过重力或磁场得以轻松除去。由于珠子的羧酸负电荷的电荷排斥，DNA不结合珠子。通过降低检测极限、减少DNA提取时间和增加信号幅度，这可显著地提高PCR产量。
实施例13：磁珠表面的官能团对DNA扩增效率的影响
为了检查磁珠表面的官能团对细胞裂解效率的影响，对细胞裂解释放的DNA的扩增效率进行研究。首先，在磁珠表面合成多种官能团。图21显示在磁珠表面上合成亚氨基乙酸(iminoacetic acid)(IDA)、芘和硫醇官能团的实施方案。以下是在磁珠(Dynabeads)上合成各个官能团的方法：
(1)IDA-珠
采用具有氨基官能团(DynabeadsM-270Amine，30mg/ml)的500μl磁珠，然后利用磁体除去溶液。将500μlNMP(1-甲基-2-吡咯烷酮)与珠子充分混合，然后除去溶液。该过程重复三次。将溴乙酸乙酯(6μl)和三乙胺(10μl)的NMP(500μl)溶液与珠子充分混合，并于45℃放置1天。反应完成后，用500μl的NMP(×3)洗涤珠子，再用500μl的乙醇(×3)洗涤珠子。利用磁体除去溶液，然后将500μl以1∶1(v/v)混合的1N的NaOH和乙醇溶液加入所述的珠子，并在室温放置1小时。所述反应完成后，用500μl的乙醇(×3)洗涤珠子，再用500μl的三蒸水(×3)洗涤珠子。此后，除去溶液，并加入500μl所需的缓冲液。冷冻保藏生成物。
(2)Cu-IDA-珠
将Cu(NO3)2(100mg)和TEA(100μl)的NMP(500μl)溶液加入IDA珠，然后将生成物放置1天。所述反应完成后，用500μlNMP(×3)、500μl乙醇(×3)和三蒸水(×3)洗涤珠子。此后，除去溶液，并加入500μl所需的缓冲液。冷冻保藏生成物。
(3)芘-珠
采用500μl具有氨基官能团(DynabeadsM-270Amine，30mg/ml)的磁珠，然后利用磁体除去溶液。将500μlNMP(1-甲基-2-吡咯烷酮)与珠子充分混合，然后除去溶液。该过程重复三次。将1-吡丁酸(pyrenebutyric acid)(15mg)、HBTU(o-苯并三唑-1-基-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸(o-benzotriazole-1-yl-N，N，N’，N’-tetramethyluroniumhexafluorophosphate))(22mg)和TEA(三乙胺)(7μl)的NMP(500μl)溶液与珠子充分混合，并于室温放置1天。所述反应完成后，用500μl的NMP(×3)、500μl的乙醇(×3)以及500μl的三蒸水(×3)洗涤珠子。此后，除去溶液，并加入500μl所需的缓冲液。冷冻保藏生成物。
(4)硫醇-珠
采用500μl具有氨基官能团(DynabeadsM-270Amine，30mg/ml)的磁珠，然后利用磁体除去溶液。将500μlNMP与珠子充分混合，然后除去溶液。该过程重复三次。将3-巯基丙酸(10μl)、HBTU(22mg)和TEA(7μl)的NMP(500μl)溶液与珠子充分混合，并于室温放置1天。所述反应完成后，用500μl的NMP(×3)和500μl的乙醇(×3)洗涤珠子。利用磁体除去溶液，然后将500μl以1∶1(v/v)混合的1N的NaOH和乙醇溶液加入所述的珠子，并在室温放置1小时。所述反应完成后，用500μl的乙醇(×3)再用500μl的三蒸水(×3)洗涤珠子。此后，除去溶液，并加入500μl所需的缓冲液。冷冻保藏生成物。
使用合成了各个官能团的磁珠，对DNA扩增效率进行研究。除了使用大肠杆菌细胞(1×107细胞/μl)之外，实施如实施例12中相同的实验。图22是相对于磁珠表面的官能团，大肠杆菌细胞释放的DNA的PCR结果(Cp)显示图。在图22中，羧基珠指当使用DynabeadsMyOneTM Carboxylic Acid(DYNAL，挪威)裂解细胞后进行PCR的情形。煮沸(阳性对照)指当在95℃将大肠杆菌细胞煮沸5分钟后，对释放的DNA进行PCR的情形；对照指对以13,200转/分对大肠杆菌细胞离心5分钟后的上清液进行PCR的情形；以及阴性对照(NTC)指当仅使用无DNA的蒸馏水进行PCR的情形。如图22所示，官能团之中的IDA具有最低的Cp值，并且硫醇的Cp值小于Cu-IDA的Cp值。此外，当官能团的亲水性增加时，Cp值降低。就是说，IDA具有低于硫醇的Cp值。从以上结果可以看出具有羧基官能团的珠子，其是亲水性的，具有最佳的细胞裂解效率，且具有封闭的官能团Cu-IDA珠具有低的细胞裂解效率。
实施例14：含有磁珠的溶液的pH对DNA扩增效率的影响
为了检查含有磁珠的溶液的pH对DNA扩增效率的影响，使用三种类型的磁珠，即，具有羧基的磁珠(Dynabeads)、具有IDA的磁珠以及聚羧基磁珠。由于在上述实验结果中，具有羧基官能团的珠子具有最佳的细胞裂解效率，合成具有许多羧基官能团的聚羧基珠。图23显示在磁珠表面上合成聚羧基官能团的过程。以下是在磁珠(Dynabeads)上合成所述的官能团的方法：
采用具有氨基官能团(DynabeadsM-270Amine，30mg/ml)的500μl磁珠，然后利用磁体除去溶液。将500μlNMP与珠子充分混合，然后除去溶液。该步骤重复三次。将聚(乙烯-alt-马来酐)(100mg)和三乙胺(10μl)的NMP(500μl)溶液与珠子充分混合，并于室温放置1天。所述反应完成后，用500μl的NMP(×3)再用500μl的乙醇(×3)洗涤珠子。利用磁体除去溶液，然后将500μl100mM的Tris-HCl缓冲溶液(pH9.0)加入所述的珠子，并在室温放置1小时。所述反应完成后，用500μl的乙醇(×3)再用500μl的三蒸水(×3)洗涤珠子。此后，除去溶液，并加入500μl所需的缓冲液。冷冻保藏生成物。
除了将三种类型的珠子调整到pH5、7和9之外，实施如实施例13中相同的实验。图24是相对于磁珠表面的官能团和珠子溶液的pH，大肠杆菌细胞释放的DNA的PCR结果(Cp)显示图。在图24中，对照指当使用DynabeadsMyOneTMCarboxylic Acid(DYNAL，挪威)裂解细胞后进行PCR的情形。如图24所示，当pH升高时，Cp值降低。因此，可以看出细胞裂解效率随着含有磁珠的溶液的pH升高而升高。然而在相同的pH时，由于官能团，细胞裂解效率并没有明显地改变。
实施例15：存在抑制剂时，比较PCR效率
在实施例13和14中，当使用纯大肠杆菌细胞时，细胞裂解效率取决于含有磁珠的溶液的pH。当所述的表面官能团是羧基时，由于它的结构，细胞裂解效率没有明显地变化。这因为当仅仅使用纯大肠杆菌细胞时，细胞碎片对PCR的抑制作用并不明显。因此，为了检查磁珠表面的官能团对于PCR抑制剂去除的影响，根据磁珠的类型和pH比较了细胞裂解效率。
首先，除了加入作为抑制剂的10％血清和将含有磁珠的溶液的pH调整到7和9之外，实施如实施例14中相同的实验。图25是存在10％血清时相对于磁珠表面的官能团，大肠杆菌细胞释放的DNA的PCR结果(Cp)显示图。在图25中，对照指当存在10％血清时使用DynabeadsMyOneTM Carboxylic Acid(DYNAL，挪威)裂解细胞后进行PCR的情形；和PTC(阳性对照)指当在大肠杆菌释放的DNA中加入10％血清后进行PCR的情形。如图25所示，具有相同官能团的磁珠的Cp值变化取决于pH。就是说，羧基和IDA在pH7比在pH9时具有更低的Cp值，而聚羧基在pH9比在pH7时具有更低的Cp值。因此，可以看出当适当组合羧基官能团和含有磁珠的溶液的pH时，抑制剂对PCR的影响可得以显著地降低。
接着，除了使用乙型肝炎病毒(HBV)代替大肠杆菌以及将含有磁珠的溶液的pH调整到7之外，实施上述相同的实验。下列引物对可用于PCR：正向引物(SEQID No：3)；反向引物(SEQ ID No：4)。此引物对是对应于HBV基因组核心区域的位点。图26是存在10％血清时相对于磁珠表面的官能团，HBV释放的DNA的PCR结果(PCR产物的浓度)显示图。在图26中，对照指当存在10％血清时使用DynabeadsMyOneTM Carboxylic Acid(DYNAL，挪威)裂解HBV后进行PCR的情形；和PTC(阳性对照)指当对分离自HBV的DNA没有10％血清进行PCR的情形。如图26所示，即使存在10％血清时也可生成所述的PCR产物。因此，当适当组合羧基官能团和含有磁珠的溶液的pH时，抑制剂对PCR的影响可得以显著地降低。
实施例16：根据激光照射研究细胞生存力
为了观察根据激光照射存在于样品溶液中的活细胞和死细胞，使用大肠杆菌细胞。图27是显示根据激光照射大肠杆菌细胞的生存力的照片。在图27中，A组是激光照射前没有微磁珠的大肠杆菌细胞的图像；B组是存在微磁珠时，在808nm以0.5瓦激光辐射功率进行激光照射40秒钟后大肠杆菌细胞的图像；以及C组是存在微磁珠时，在808nm以1瓦激光辐射功率进行激光照射40秒钟后大肠杆菌细胞的图像。染成绿色的细胞是活细胞，染成红色的细胞是死细胞。如图27所示，在激光照射后多数细胞是活的，死细胞的比例随着激光辐射功率的增加而提高。
实施例17：激光照射对基因组DNA损伤的影响
为了检查激光照射是否损伤基因组DNA，检查在以激光照射40秒钟后分离的DNA是否受到剪切。图28是对携带pCRII-TOPO(Invitrogen)质粒的大肠杆菌BL21细胞激光照射后DNA分析的照片。在图28中，泳道1指使用本发明的方法分离DNA的情形；泳道2指在95℃煮沸5分钟后分离DNA的情形；泳道3指使用Qiagen QIAprepMiniprep试剂盒分离质粒DNA的情形；泳道4指使用Qiagen QIAampDNAmini试剂盒分离BL21的基因组DNA的情形；以及泳道5指使用Qiagen QIAampDNA mini试剂盒，从无质粒的大肠杆菌BL21细胞中分离BL21的基因组DNA的情形。泳道5用于鉴定基因组DNA的正确条带。如图28所示，DNA未受到损伤。正如所料，采用用于制备质粒的QIAprep mini试剂盒(Qiagen)，基因组DNA带有很少的污染(contamination)(泳道3)。有意思的是，通过本发明的方法，优先分离含有更少质粒DNA污染的基因组DNA。相反，在蛋白酶K处理所述细菌后，采用用于基因组DNA分离的、应用了硅石-凝胶-膜技术的QIAamp mini试剂盒，会出现很多质粒DNA污染(泳道4)。这可以解释为什么使用通过本发明的方法分离的DNA比使用通过Qiagen试剂盒分离的DNA进行PCR扩增，可获得更好的产量。
在本发明中，通过组合激光和微磁珠，开发了用于高效细胞裂解的新方法；当将激光束应用于该样品中，细胞悬浮液中存在的微磁珠导致快速的细胞裂解，使得细菌细胞在几秒钟内得到破碎。更重要的是，此法破碎的细胞所释放的DNA比通过其他两种常规方法裂解细胞的DNA可得到更有效地扩增，这表明在细胞裂解期间，干扰DNA扩增的物质的释放与其他方法相比是最小的。这种便利、高效的细胞裂解和DNA释放使得新的细胞裂解法十分适合被整合到LOC应用中。
如以上所述，根据本发明的方法，在40秒钟内快速裂解细胞是可行的，用于破碎细胞或病毒的装置利用激光二极管可得以小型化，在破碎细胞或病毒后可直接实施DNA纯化步骤，并在除去与随后反应的抑制剂进行吸附的细胞碎片和磁珠后，将含有DNA的溶液转入随后的步骤。此外，通过本发明的细胞裂解芯片，蒸发问题得以解决，振荡通过磁珠可有效地传递到细胞，粗糙表面上的微流化问题通过疏水化处理所述芯片的内表面而得以解决，而且所述的细胞裂解芯片可应用于LOC。
虽然本发明已借助其中的示范性实施例进行了具体说明和详细描述，但本领域技术人员应当理解：根据下列权利要求的限定，不脱离本发明的精神和范围，可在形式上和实质上进行各种改变。
                            序列表
<110>三星电子株式会社(Samsung Electronics Co.，Ltd.)
<120>利用微磁珠和激光快速破碎细胞或病毒的方法和装置
<160>2
<170>KopatentIn 1.71
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
cccagactcc tacgcgaggc                                                  20
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
gtattaccgc aactgctggc ac                                               22

Claims (43)

1.破碎细胞或病毒的方法，该方法包括：
将磁珠加入含有细胞或病毒的溶液中；
振荡磁珠；和
用激光照射磁珠以破碎细胞或病毒。
2.权利要求1的方法，其中所述的激光包括脉冲激光或连续波(CW)激光。
3.权利要求2的方法，其中所述的脉冲激光是1mJ/脉冲或更高，而且所述的CW激光具有10mW或更高的功率。
4.权利要求3的方法，其中所述的脉冲激光是32mJ/脉冲或更高，而且所述的CW激光具有100mW或更高的功率。
5.权利要求1的方法，其中所述的激光在400nm或更高的波长范围内产生。
6.权利要求5的方法，其中所述的激光在750nm到1300nm波长范围内产生。
7.权利要求5的方法，其中所述的激光在一种或多种波长范围产生。
8.权利要求1的方法，其中所述磁珠的尺寸是50nm-1000μm。
9.权利要求8的方法，其中所述磁珠的尺寸是1-50μm。
10.权利要求8的方法，其中所述的磁珠是具有两种或多种尺寸的珠子混合物。
11.权利要求1的方法，其中所述的磁珠包括至少一种选自铁磁Fe、Ni、Cr或其氧化物的物质。
12.权利要求1的方法，其中所述的磁珠是用铁磁金属包被的聚合物、有机物、硅或玻璃。
13.权利要求1的方法，其中所述磁珠表面的官能团是亲水性的和带负电荷的。
14.权利要求13的方法，其中所述磁珠表明的官能团是羧基或其衍生物。
15.权利要求1的方法，其中含有磁珠的溶液具有6至9的pH。
16.权利要求1的方法，其中所述的溶液选自唾液、尿液、血液、血清或细胞培养物溶液。
17.一种用于破碎细胞或病毒的装置，包括：
具有输入样品和磁珠的入口的细胞裂解小室；
连接于小室并使所述小室中的样品和磁珠混合的振荡器；和
连接于所述小室并提供激光的激光发生器。
18.权利要求17的装置，其中所述的振荡器选自超声波仪、利用磁场的振荡器、利用电场的振荡器、机械振荡器，或压电材料。
19.权利要求17的装置，还包括完成细胞裂解后，连接于所述细胞裂解小室并可除去细胞裂解小室中磁珠的电磁体。
20.权利要求17的装置，还包括穿过通道连接于所述细胞裂解小室的DNA纯化小室。
21.权利要求17的装置，还包括穿过通道连接于所述细胞裂解小室的DNA扩增小室。
22.权利要求20的装置，还包括穿过通道连接于所述DNA纯化小室的DNA扩增小室。
23.一种用于破碎细胞或病毒的装置，包括：
具有输入样品和磁珠的入口的细胞裂解芯片；
通过振荡传递部件连接于所述芯片的振荡器以在该芯片上混合所述的样品和磁珠，连接于所述芯片的振荡传递部件将振荡传递到所述芯片；
连接于所述芯片的激光发生器提供激光；和
连接于所述芯片的抗蒸发部件以抑制所述样品的蒸发。
24.权利要求23的装置，其中所述的振荡器选自利用磁场的振荡器、利用电场的振荡器、机械振荡器，或压电材料。
25.权利要求24的装置，其中所述的振荡器通过振荡传递部件可将振荡传递到细胞裂解芯片的底部。
26.权利要求23的装置，其中所述的抗蒸发部件包括隔片。
27.权利要求26的装置，其中所述的隔片选自阀门、聚合物结构、或金属结构。
28.一种用于破碎权利要求23-27任一项的用于破碎细胞或病毒的装置的细胞裂解芯片，包括：
具有暴露的顶面和底面的芯片体，并包括反应室、入口和出口；
连接于芯片体顶面的芯片盖以关闭所述反应室的上部，可允许激光穿过，并具有入口和出口；以及
通过芯片连接部件连接于芯片体底面的芯片底部，以关闭所述反应室的下部、入口以及出口。
29.权利要求28的芯片，其中芯片盖由选自玻璃、聚合物或氧化铟锡(ITO)玻璃的材料组成。
30.权利要求29的芯片，其中所述的芯片盖是抗反射(AR)包被的。
31.权利要求30的芯片，其中所述的芯片盖是AR包被的Pyrex7740。
32.权利要求28的芯片，其中所述的芯片底部由选自玻璃、聚合物、硅氧烷或双面胶的材料组成。
33.权利要求28的芯片，其中所述的芯片底部由选自聚合物、硅氧烷、玻璃或氧化铟锡(ITO)玻璃的材料组成。
34.权利要求33的芯片，其中所述的芯片连接部件通过选自胶带或胶连剂的粘合材料将所述的芯片体与芯片底部连接。
35.权利要求23的装置，其中所述的激光包括脉冲激光或连续波CW)激光。
36.权利要求35的装置，其中所述的脉冲激光是3mJ/脉冲或更高，而且所述的CW激光具有100mW或更高的功率。
37.权利要求23的装置，其中所述的激光在400nm或更高的波长范围内产生。
38.权利要求37的装置，其中所述的激光在一种或多种波长范围内产生。
39.权利要求23的装置，其中所述磁珠的尺寸是50nm到1000μm。
40.权利要求39的装置，其中所述的磁珠是具有两种或多种尺寸的珠子混合物。
41.权利要求23的装置，其中所述的磁珠包括至少一种选自铁磁Fe、Ni、Cr或其氧化物的物质。
42.权利要求23的装置，其中所述的磁珠是用铁磁金属包被的聚合物、有机物、硅或玻璃。
43.权利要求23的装置，其中所述的样品选自唾液、尿液、血液、血清或细胞培养物溶液。
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