CN1626674A - 用于微生物检测分析系统、套组及方法 - Google Patents
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Abstract
用于微生物检测分析系统、套组及方法,对于因结核分枝杆菌所引起的感染,能够提供一种简单、灵敏又经济有效的诊断法。本方法检验的高灵敏度和准确度,可提供对结核分枝杆菌的迅速侦测与鉴定能力,可在临床检体中有效分辨结核分枝杆菌与鸟型分枝杆菌、堪萨斯结核分枝杆菌和其他NTM(间的差异性。此外,RAPIDTMBAP-MTB检验试剂也能侦测最低达10微微克肺结核杆菌的核酸,或相当于1到20套的结核分枝杆菌基因组DNA。本发明的分子检验装置-RAPIDTMBAP技术,由测量化学冷光或可见光,提供了高灵敏度与极具特异性的方法来检测结核分枝杆菌。是一种极具价值与多功能的平台技术,能侦测多种传染性疾病。
Description
技术领域
本发明是有关一种可用来检测疑似病例检体中的微生物(特别是肺结核菌)的分析系统、套组及方法。本发明亦有关一种可在同一仪器中同时进行温度及磁性控制的仪器装置,以大幅减少杂合反应的时间。
背景技术
肺结核(Tuberculosis,TB)是儿童与成年人的主要感染杀手之一,且为世界上最常见的传染性疾病。目前世界上有三分之一人口感染肺结核,其中两千万人为已登录的病例;据估计肺结核在未来十年内将使三千万人致死。另目前可能已有超过五千万人感染多重抗药性(multidrug-resistant,MDR)的肺结核菌。抗药性的出现是来自公卫系统的自满以及缺乏适当管理肺结核的治疗所致。在多重抗药性的肺结核菌出现之前,多重药物治疗肺结核的治愈率在同时感染爱滋病的病患中仍可超过90%。如今多重抗药性的肺结核菌不但具高度传染性,亦无法完全治愈,死亡率将近50%。现今,在人类免疫力不全病毒(Human,Immunodeficiency Virus,HIV)呈阳性的患者群中,肺结核为引起死亡的主因,且死亡率高达80%。
肺结核是由肺结核分枝杆菌(一种杆菌)所传染,它是由空气悬浮微粒散播并会造成不可逆的肺部损害。若病菌自肺部释出将可能造成全身性的疾病,影响器官包括:骨、关节、肺、脾、肠胃道及脑部等。凡接触肺结核菌患者,50%会受感染,而15%受感染者会发病。贫穷、营养不良以及人口过剩,皆会增加肺结核菌的扩散与蔓延。
过去控制肺结核的方法涉及使用不同抗生素的组合。最近由于多重抗药性菌株的出现,投用抗生素的种类与组合方式,都必须视病患感染的菌株而定。在极端的情况下,得以手术方式取出肺部感染的区域。
依据传统作法,肺结核诊断是奠基于临床症状发现与肺部放射线检查,再以痰液或组织抹片中有无肺结核菌来进一步确认。这些方法仍然是诊断的金科玉律,但新近发展出的DNA探针、聚合酵素链锁反应(PCR)分析,以及液态培养法使得诊断更加灵敏与快速。但是,快速技术所增加的灵敏度,并不能确保精确度也随之增加。
皮肤试验应该并同其他临床发现一起运用,惟当病患已接受BCG疫苗注射或被非肺结核分枝杆菌感染时,皮肤试验无法成为确定诊断的灵敏性或特异性的测试方法。检测感染至肺外的结核病患时,常需提供特定位置组织或体液的检体用作抹片、组织培养或组织学的分析。典型的肺结核损害包括肝酪化(caseating)或是未肝酪的肉芽瘤与巨细胞。能够快速检验出病患所感染的肺结核菌及其对抗药物的方法,对于诊断、治疗与社区的肺结核控制具有莫大帮助。
适切的诊断对于控制肺结核的扩散极为重要。一般先以显微镜检验痰液检体,再以易于观察的快速酸性萤光染料(acid-fast fluorochromedye)auramine O,或较具专一性的Zeehl-Neelsen染色法进行检验。检体若不是在固态的基质上培养(如Lowenstein-Jensen slant),就是存放在组织培养液中生长,如BACTEC自动放射计数系统(automated radiometricsystem)。然后再以生化技术或核糖核酸探针来鉴定不同菌株。以常用的几种抗生素测试,在新型的液态培养而非传统的洋菜稀释法测试分离出的菌株的易受性。
运用Ziehl-Neelzsen石碳酸品红(carbolfuchSsn)或Kinyoun石碳酸品红染剂来检测肺结核已有百年历史,虽然没有组织培养那么敏锐,但此种快速酸性的抹片,属于快速而又价廉的测试方法,仅须基本设备即可执行测试工作,并可以高度专一性来辨识、分析杆菌。依据细菌量的不同,一个痰液抹片的敏锐度可在22%到80%之间,辨别率亦可由联合多个抹片的检查而提升。
大多数美国的实验室均采用萤光染料染剂,如auramine-rhodamine染料。利用这种科技分枝杆菌可在低倍率的显微镜下显示明亮的桔色,以增加抹片灵敏度。
Gen-Probe公司的Amplified Mycobacterium Tuberculosis Direct Test是针对分枝杆菌的核糖体RNA检测进行转录放大。这个测验使用对肺结核菌专一性极高的DNA探针。此种测验最适于(也仅限于)酸性快速杆菌抹片呈阳性反应,且组织培养仍在进行中的病患。由于专一性低于100%,即使对于抹片呈阳性反应的病患,仍偶有伪阳性出现,通常出现在非肺结核型的分枝感菌感染中。
这个技术会放大,即使是目标肺结核菌DNA复合体非常小的一部份。这个测验使用一自动化的系统,可以快速侦测到小至在检体,支气管肺泡lavage(bronchoalveolar lavage),胸腔液(pleural fluid),或其他体液或组织检体中的单一生物体,并且在肺部疾病中有90%的灵敏度与专一性。
Mantoux测验是检验肺结核较佳与较标准的皮肤诊断法。包括皮下注射5单位结核菌素(tuberculin unit,TU)的纯化蛋白质衍生物(purified proteinderivative,PPD,结核菌素tuberculin),通常为0.1mL。硬化(Induration)程度则在注射后48到72小时量测。硬化程度(而非红肿)应量测两个垂直的直径后再平均。若欲减少观察期间的变异性,可以圆珠笔自硬化区外缘小心的移到中心。当愈靠近硬化区,阻力会愈高,应在硬化区的外缘作记号。然而,约20%的肺结核病患的皮肤测试可能出现阴性反应,有些族群有更高的伪阳性出现率。例如明显被人类免疫不全病毒(HIV)感染者,其伪阳性出现率可能提高50%以上。伪阳性也可能出现在感染非肺结核分枝杆菌的病患中(例如,Mycobacterium avium复合体)。因此,一个阴性的皮肤测试结果,将永远无法剔除肺结核的可能性,只有一个阳性的皮肤测试结果,也无法确定必须接受诊疗。
有鉴于全球抗药性结核菌有日益蔓延的趋势,美国疾病管制与预防中心(Centers for Disease Control and Prevention)以及世界卫生组织(WorldHealth Organization)均建议对所有分离出的肺结核菌,进行灵敏度测试。
此项发明分析是利用萤火虫的冷光性质,以基因体学方式引入肺结核菌检测中。此方法可在数小时内测试分枝杆菌的药物灵敏度。虽然目前仍在发展阶段,但在未来数年内可能被广泛利用。
由以上可知,目前已知的试验皆无法快速且完全的侦测肺结核菌。因此,需要一种快速且有高灵敏度与专一性的分析法,期能从检体中检测肺结核菌。
发明内容
本发明是针对疑似病例检体中微生物(特别是肺结核菌)的一种分析系统、套组及方法。
本发明亦有关能在一种仪器内进行双股核酸的分离、杂交、洗涤程序,并能分离磁珠与温度控制。
本发明的一种侦测疑似病人样本中微生物DNA的方法,包含:
(a)将微生物的cDNA与微生物专一探针于杂交管中进行杂交,且探针与磁珠相连;
(b)将杂交试管移到磁性槽中进行清洗;
(c)将阻断液加入试管中;
(d)加入卵白素酵素复合物或链霉抗生物素酵素复合物至试管中;
(e)进行清洗反应,利用磁性去除干扰物质;
(f)使磁珠悬浮;
(g)在加入酵素受质后侦测冷光或颜色的变化。
其中该微生物为肺结核杆菌。
其中该微生物cDNA由引子所执行的PCR放大而来。
其中该链霉抗生物素酵素复合物为链霉抗生物素山葵过氧化氢酵素。
其中磁珠悬浮是利用涡漩震荡(vortex)试管。
其中该测定颜色变化,是利用冷光分析仪或分光光度计进行测定。
其中步骤(a)至(g)是在同一试管内进行。
本发明的一种可在同一仪器装置中进行核酸双股分离、杂交、清洗、磁珠分离及温度控制的仪器装置,包含:
(a)可放置反应容器的装置;
(b)可控制容器温度的装置;
(c)可控制容器磁力的装置,
其中,控制容器温度的装置与放置反应容器的装置相连接,以及控制容器磁力的装置与放置反应容器的装置相连接。
其中该控制容器温度的装置可加热容器,根据温度的改变来完成核酸双股的分离。
其中控制容器磁力的装置可使磁珠的磁性改变,以便进行容器中的杂交、清洗及磁珠的分离。
本发明的一个可测定杂交缓冲液中放大的微生物cDNA诊断套组,包含:
(a)一个连接至磁珠的探针;
(b)一个具生物反应性的引子;
(c)卵白素酵素复合物或链霉抗生物素酵素复合物;
(d)酵素受质。
其中具生物反应性的引子是由将DNA标定物与引子反应所得。
其中DNA标定物具有以下结构:
FU-BE-D
其中,Fu代表含有白芷素衍生物及补骨脂素衍生物组合所挑选出的呋喃香豆精(furocoumarin)衍生物;
其中,BE代表没有或一个含有C4-12烷基、烯基、聚烷基胺及聚乙二醇组合所挑选出来的结合增强子;以及其中,D代表自含有生物素、荧光素、吖锭酯(acridinium ester)及吖锭-9-羧醯胺组合所挑选出来的一群可测定物。
其中DNA标定物为9-(4”-(胺甲基)-4’,5”-二甲白芷素)吖锭羧醯胺。
本发明亦提供了一个可检测微生物的分析系统,该系统包含:
(i)一个可测定微生物的cDNA的诊断套组,包含:
(a)一个连接至磁珠的探针;
(b)一个DNA标定试剂;
(c)卵白素酵素复合物或链霉抗生物素酵素复合物:
(d)酵素受质;
(ii)一种可在同一仪器装置中进行核酸双股分离、杂交、清洗、磁珠分离及温度控制的仪器装置,包含:
(a)可放置反应容器的装置;
(b)可控制容器温度的装置;及
(c)可控制容器磁力的装置,
其中,控制容器温度的装置与放置反应容器的装置相连接,以及控制容器磁力的装置与放置反应容器的装置相连接;
(iii)一个可吸附容器壁上的磁珠的磁架;以及
(iv)一个侦测器。
其中具生物反应性的引子是由将DNA标定物与引子反应得来。
其中链霉抗生物素酵素复合物为链霉抗生物素山葵过氧化氢酵素。
其中此诊断套组可自M.marinum,M.avium与M.intracellulare中辨别M.tuberculosis。
其中侦测器为冷光分析仪或分光光度计。
其中DNA标定物为9-(4”-(胺甲基)-4’,5”-二甲白芷素)吖锭羧醯胺。
附图说明
图1显示本发明侦测方法的流程图。
图2显示本发明套组所侦测的肺结核菌基因体DNA。
图3显示经由本发明分析法侦测的肺结核菌。
图4显示本发明分析法的专一性。
图5显示本发明套组的灵敏度与专一性。
图6显示本发明的相关仪器。
具体实施方式
本发明提供一种可侦测微生物DNA的方法,包括:
(a)将微生物的cDNA与微生物专一探针于杂交管中进行杂交,其中该探针与磁珠相连;
(b)将杂交试管移到磁性槽中进行清洗;
(c)将阻断液(blocking solution)加入试管中;
(d)加入卵白素(avidin)酵素复合物或链霉抗生物素(streptavidin)酵素复合物至管中;
(e)进行清洗反应,利用磁场来去除干扰物质;
(f)使磁珠悬浮;
(g)加入酵素受质后,侦测冷光或颜色的变化。
本发明所用的方法可适用于任何微生物,包括:病毒、细菌、真菌等。本发明方法特别适用于肺结核菌。
一般而言,任何体液如脑脊髓液、血清、血液、痰液、肺流出物、喉咙棉拭与粪便皆可用以检验。较佳的肺结核菌检体是来自于脑脊髓液、血清、血液、唾液、肺流出物与喉咙棉拭等。
聚合酵素链锁反应(PCR)可见于Salil et al.(1985),Science,230 1350。PCR是由重复周期的DNA聚合酵素所引起的引子延长反应所组成。将标的DNA加热变性,并与欲放大的DNA标定的序列互补的两段寡核酸(oligonucleotide)进行杂交。和DNA聚合酵素一起时,这些寡核酸用来作为引子。DNA的复制是由延长引子,做出双股的第二份复制品。经由反覆热变性、引子杂交及延长过程后,标的DNA便可在约2至4小时内放大至一百万倍或更多。PCR是一种分子生物学方法,必须和测定技术同时使用,才能测得放大的结果。本发明中,使用带有生物素(boitin)标记的引子对来进行PCR放大。
本发明中所用的探针,是一种类似分子的物质,可被某一特定标的物辨识出来。一般来说,探针会连接于固相体上,以便分离DNA。本发明中,以磁珠连接探针(MagPrObe)为佳。本MagProbe探针的序列为胺-TAACCGGCTGTGGGTAGCAG。
一般常使用的标志物质包括(但不限于):生物素(biotin)、萤光分子、放射性分子、呈色受质、化学冷光及其他类似物等。将核酸以生物素标定的方法,如同将萤光分子及放射性分子放入寡核酸及核酸的方法,是该领域所熟知的技术。
当使用生物素时,可利用与如酵素(例如辣根过氧化物酵素(horseradishperoxidase))的可测定性标记共轭结合的卵白素(avidin)、链霉抗生物素(streptavidin)或其他类似物来侦测。酵素共轭结合物可自市面上购得,例如自Vector Laboratores(Burlingame,加州)。链霉抗生物素与生物素结合的亲和力很高,将未结合的链霉抗生物素完成清洗后,再利用存放于过氧化氢及适当缓冲液中的冷光受质来侦测山葵过氧的存在。可利用Berthold冷光分析仪(Pforzheim,德国)来测定其产物。
测定萤光、放射线、化学冷光、呈色标记、以及其他常用的标定物质的方法,已是众所熟知的技术。简言之,化学冷光因其散射波长及强度,最能直接被侦测出来并予定量。
为了便于在一种仪器装置中操作整合温度及磁性控制,本发明亦提供了一种可在该同一装置中进行核酸双股分离、杂交、清洗、磁珠分离及温度控制的设备。包括:
(a)可放置反应容器的装置;
(b)可控制容器温度的装置;
(c)可控制容器磁力的装置。
其中,控制容器温度的装置与放置反应容器的装置相连接,以及控制容器磁力的装置与安装反应容器的装置相连接。
详言之,控制容器温度的装置可加热容器,根据温度的改变来完成核酸双股的分离。温度控制器很容易便可自器材市场中购得。因为杂交后大部分的操作步骤都和磁性探针(MagProbe)有关,因此,将控制容器磁力的装置与温度控制器结合在一起,以制造出本发明的仪器装置。特别值得一提的是:控制容器磁力的装置可改变磁珠的磁性,以便在容器中进行杂交、清洗及磁珠分离等操作。
本发明亦提供了一个可检测微生物cDNA的诊断套组,包含:
(a)一个连接磁珠的探针;
(b)一个具生物反应性的引子;
(c)卵白素酵素复合物或链霉抗生物素酵素复合物:
(d)酵素受质。
在套组中,具生物反应性引子是由DNA标定试剂与引子反应而制备。DNA标定试剂是一种标的DNA试剂。较佳试剂不限,但具有下式的化合物:
Fu-BE-D
其中,Fu代表白芷素衍生物及补骨脂素衍生物的组合所挑选出的呋喃香豆精(furocoumacn)衍生物;其中,BE代表没有或一个含有C4-12烷基、烯基、聚烷基胺及聚乙二醇组合的结合增强子;以及其中,D代表含有生物素、萤光素、吖锭酯(acridum ester)及吖锭由9-羧醯胺组合的可测定物。最佳DNA标定试剂定9-(4″(胺甲基)-4′,5″-二甲白芷素)吖锭羧醯胺。
本发明亦提供了一个可检测微生物的分析系统,该系统包含:
(i)一个可测定微生物cDNA的诊断套组,包含:
(a)一个连接至磁珠的探针;
(b)一个具生物反应性的引子;
(c)卵白素酵素复合物链霉抗生物素酵素复合物;
(d)酵素受质;
(ii)一种可在同一装置中进行核酸双股分离、杂交、清洗、磁珠分离及温度控制的装置,其包含:
(a)可放置反应容器的装置;
(b)可控制容器温度的装置;
(c)可控制容器磁力的装置。
(iii)一个可吸住容器壁上磁珠的磁架;
(iv)一个侦测器。
在本发明的分析系统中,套组另外含有杂交缓冲液、清洗缓冲液及阻断缓冲液。这些缓冲液可从市面上购得,例如:Pierce、Biolab、Qiagen等公司的产品。一般而言,本发明分析系统可将整个侦测肺结核菌过程缩短至5小时以内。
实施例
以下实施例不具限制性,而仅代表本发明的不同方面及特性。
1.器材与方法
主要套组I:
(1)溶解缓冲液1(5ml)
(2)溶解缓冲液II(4ml)
(3)杂交缓冲液(5ml)
(4)清洗缓冲液(60ml)
(5)溶解试管(1.8ml,25管)
(6)杂交试管(12×75mm,50管)
(7)延长试管(3ml,抵达后储存于-20℃)
主要套组II:(50反应/套组,储存于4℃)
(1)MagProb(450μl,抵达后储存于4℃)
测定套组-I:(250反应/套组,储存于4℃)
(1)阻断缓冲液(0.5%,60ml,储存于4℃)
(2)受质A(7.5ml,储存于4℃)
(3)受质B(7.5ml,储存于4℃)
侦测套组-II:(250反应/套组,储存于-20℃)
(1)生物催化剂(BC,1mg/ml,15μl,储存于-20℃)
其他器材:
(1)磁力架
(2)NALC(N-乙醯基-L-半胱胺酸)
(3)4%氢氧化钠溶液
(4)2.94%柠檬酸钠(sodium citrate)溶液
(5)磷酸缓冲盐溶液(PBS),pH7.0
(6)0.1%PBST(磷酸缓冲盐溶液加0.1%tween-20)
(7)0.5%PBST(磷酸缓冲盐溶液加0.5%tween-20)
(8)磁性干浴槽
(9)连接至电脑的Berthold冷光分析仪
过程:
I.净化临床检体(以各医学中心P3级实验室内执行为佳)
(1)收集检体并储藏于4℃冰箱。
(2)将1g的NALC溶于100ml无菌的4%氢氧化钠溶液与100ml的2.94%柠檬酸钠溶液(当日准备)。
(3)将同体积的氢氧化钠-柠檬酸-NALC加入临床检体。
(4)以震荡漩涡混合器混合30秒后,将检体试管反转数次,并置于室温下15分钟。
(5)加入磷酸缓冲盐溶液至检体试管的50ml刻度位置,以3000rpm离心20分钟。
(6)将上清液移除,然后以1ml磷酸缓冲盐溶液回溶沉淀物。
II沉淀物的溶解(可在P2层级实验室进行)
(1)将10ml的ddH2O与1ml回溶的沉淀物混合,以震荡漩涡混合器混合20秒后,以3,800rpm离心15分钟。
(2)移除上清液,加入150μl溶解缓冲盐溶液I,并以震荡旋涡混合器混合1分钟后,置于室温下10分钟。
(3)将溶解试管放置在100℃水浴槽中20分钟,然后加入125μl溶解缓冲液II。
(4)以10,000rpm离心2分钟,收集DNA裂解物,并存于-20℃冰箱。
III.目标放大(两步骤)
步骤1:
(1)依照顺序将下列试剂置入0.2ml的微试管(microfuge tube):
试剂 体积
DNA 1μl
反应混合液* 49μl
*反应混合物包含以下试剂:
试剂 体积
10×放大缓冲盐溶液 5μl
#4引子(TGAGGGCACGAGGTGGCA) 5μl
#5引子(CGTAGGCGTCGGTCACAA) 5μl
dNTP 1μl
TaqDNA聚合酵素(2U/μl) 0.5μl
ddH2O 32.5μl
(2)遵照下列程序同时启动加热盖:
温度 | 时间 | 周期数 | |
1 | 94℃ | 5分钟 | 1个周期 |
2 | 94℃62.5℃72℃ | 30秒15秒15秒 | 30个周期 |
3 | 72℃ | 10分钟 | 1个周期 |
4 | 4℃ | 静置 | --- |
步骤2:
(1)依照顺序将下列试剂置入一新的0.2ml微试管(microfuge tube):
试剂 体积
自步骤I取得的PCR产物 15μl
反应混合液* 35μl
*反应混合液包括以下成份:
试剂 体积
10×放大缓冲盐溶液 5μl
#6引子(GATGCACCGTCGAACGGC) 5μl
#7引子(CCACGTAGGCGAACCCT) 5μl
dNTP 1μl
TaqDNA聚合酵素(2U/μl) 0.5μl
ddH2O 18.5μl
(2)启动放大程序。
*放大程序如同步骤1。
IV.杂交反应
(1)完成杂交反应管标示后,将125μl的ddH2O、15μl的MagProbe、150μl的杂交缓冲液及50μl带有标记的样本DNA混合。
(2)将杂交反应管置于100℃干浴槽5分钟。
(3)将温度调整至60℃,并静置20分钟。
(4)将杂交反应管移到磁性槽中,静置5分钟。
(5)将杂交缓冲液抽除。
(6)于每一试管加入1ml 60℃预热的清洗缓冲液,震荡混合后,放回磁性槽中静置5分钟。
(7)将杂交缓冲液抽除。
(8)重复步骤(6)至(7)。
(9)于室温中静置杂交反应器。
V.测定
(1)于室温取200μl的阻断缓冲液至每一管中,震荡混合。
(2)加入5μl新鲜配制的BC(99μl 0.1%PBST+1μl BC贮液),震荡混合均匀。于室温静置20分钟。避免反应管接触光。
(3)将杂交反应管放入磁架中,静置5分钟,然后将溶液抽除。
(4)加入1ml 0.5%PBST,震荡混合并将反应管放回磁架上,静置5分钟,然后抽除溶液,再重复一次。
(5)加200μl的PBS至每一试管中,并以震荡混合使磁珠重新悬浮。
(6)自步骤(5)中取出20μl的悬浮溶液。
(7)加50μl混合受质至每一试管中,(25μl受质A+25μl受质B)。
(8)以冷光分析仪测定每一个样本的冷光数值。
VI.结果解释
(1)数值大于或等于100,000RLU,表示肺结核菌呈阳性反应。
(2)数值小于25,000RLU,表示肺结核菌呈阴性反应。
(3)数值介于25,000至100,000RLU,表示可能为肺结核菌阳性反应,须再试验以确认结果。
(4)再试验数值大于或等于25,000RLU,表示肺结核菌呈阳性反应。
(5)再试验数值小于25,000RLU,表示肺结核菌呈阴性反应。
实施例1:
依上列过程,分析10微微米(fentogram)来自肺结核菌(M.tb)及鸟类结核菌(M.avium)的基因体DNA。图2清楚显示肺结核菌与鸟类结核菌有所区分,建议此检测套组可侦测低至1至20个肺结核菌。
实施例2:
如图3所示,相对于大肠杆菌(EC),人类DNA(HU)或鲱鱼精子DNA(HS),本发明肺结核菌检测试剂能专一性地侦测核结核菌。
实施例3:
以本发明分析系统分析不同检体。图4中清楚显示本发明肺结核菌检测试剂能从临床检体中,以高度专一性侦测肺结核菌,但不会侦测到非肺结核的分枝杆菌(MOTT),包括:M.marinum(Mma)、鸟类分枝杆菌(MUC)及胞内分枝杆菌(Mint)。
实施例4:
以本发明检查临床检体,不论呈阳性或阴性反应,均以抹片试验培养及二行程PCR(Nested PCR)加以确认,所得结果均与前述相同。上述结果显示:本发明肺结核菌侦测套组具备极高的灵敏度及专一性。
本发明已详细说明及例式,使熟悉此项技术者能自行操作并加以利用,惟任何替代、变更与修改均应在不脱离本发明的精神与范围内进行。
熟悉此项技术者,能在短时间内即可达到本发明预期的目标,并得到本文中所述的结果及优点。细胞株、胚胎、动物及其制造过程和方法仅为示范性的较佳实施例代表,并非欲限制发明的范围。熟悉此项技术者可能对本发明进行修改及运用于其他用途,惟任何可能的修改均应包含在本发明的精神内,并仅限于申请专利范围之用。
熟悉此项技术者极易在不脱离本发明的精神与范围内,对本发明进行变更与修改。
本说明书所述的所有专利及发表,均为此领域中和发明有关的一般技术。本说明书所述及的专利与发表文章,可说明熟悉有关本发明领域的人士具有的技术程度。
本文所述的发明图示,可在没有任何要件或限制下施行,而非特定于本文所揭露的。所使用的名词及表达仅为说明之用,而非用于限制,且非利用这些名词及表达来排除任何所示及所述或其部分特徵的均等物,而足认为各种变更修改仍可能在发明申请专利范围内。因此,应该了解虽然已利用较佳实施例及选择性的特征来具体描述本发明,但熟悉此项技术者可能会根据此中所描述的构想加以修改及变更,惟这些修改与变更应当在本发明所附申请专利请求项所定义的范围内。
其他实施例在申请专利范围中有提到。
Claims (20)
1.一种侦测疑似病人样本中微生物DNA的方法,包含:
(a)将微生物的cDNA与微生物专一探针于杂交管中进行杂交,且探针与磁珠相连;
(b)将杂交试管移到磁性槽中进行清洗;
(c)将阻断液加入试管中;
(d)加入卵白素酵素复合物或链霉抗生物素酵素复合物至试管中;
(e)进行清洗反应,利用磁性去除干扰物质;
(f)使磁珠悬浮;
(g)在加入酵素受质后侦测冷光或颜色的变化。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,其中该微生物为肺结核杆菌。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,其中该微生物cDNA由引子所执行的PCR放大而来。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,其中该链霉抗生物素酵素复合物为链霉抗生物素山葵过氧化氢酵素。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,其中磁珠悬浮是利用涡漩震荡(vortex)试管。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,其中该测定颜色变化,是利用冷光分析仪或分光光度计进行测定。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,其中步骤(a)至(g)是在同一试管内进行。
8.一种可在同一仪器装置中进行核酸双股分离、杂交、清洗、磁珠分离及温度控制的仪器装置,包含:
(a)可放置反应容器的装置;
(b)可控制容器温度的装置;
(c)可控制容器磁力的装置,
其中,控制容器温度的装置与放置反应容器的装置相连接,以及控制容器磁力的装置与放置反应容器的装置相连接。
9.如权利要求8所述的仪器装置,其特征在于,其中该控制容器温度的装置可加热容器,根据温度的改变来完成核酸双股的分离。
10.如权利要求8所述的仪器装置,其特征在于,其中控制容器磁力的装置可使磁珠的磁性改变,以便进行容器中的杂交、清洗及磁珠的分离。
11.一个可测定杂交缓冲液中放大的微生物cDNA诊断套组,包含:
(a)一个连接至磁珠的探针;
(b)一个具生物反应性的引子;
(c)卵白素酵素复合物或链霉抗生物素酵素复合物;
(d)酵素受质。
12.如权利要求11所述的诊断套组,其特征在于,其中具生物反应性的引子是由将DNA标定物与引子反应所得。
13.如权利要求12所述的诊断套组,其特征在于,其中DNA标定物具有以下结构:
FU-BE-D
其中,Fu代表含有白芷素衍生物及补骨脂素衍生物组合所挑选出的呋喃香豆精(furocoumarin)衍生物;
其中,BE代表没有或一个含有C4-12烷基、烯基、聚烷基胺及聚乙二醇组合所挑选出来的结合增强子;以及其中,D代表自含有生物素、荧光素、吖锭酯(acridinium ester)及吖锭-9-羧醯胺组合所挑选出来的一群可测定物。
14.如权利要求12所述的诊断套组,其特征在于,其中DNA标定物为9-(4”-(胺甲基)-4’,5”-二甲白芷素)吖锭羧醯胺。
15.本发明亦提供了一个可检测微生物的分析系统,该系统包含:
(i)一个可测定微生物的cDNA的诊断套组,包含:
(a)一个连接至磁珠的探针;
(b)一个DNA标定试剂;
(c)卵白素酵素复合物或链霉抗生物素酵素复合物:
(d)酵素受质;
(ii)一种可在同一仪器装置中进行核酸双股分离、杂交、清洗、磁珠分离及温度控制的仪器装置,包含:
(a)可放置反应容器的装置;
(b)可控制容器温度的装置;及
(c)可控制容器磁力的装置,
其中,控制容器温度的装置与放置反应容器的装置相连接,以及控制容器磁力的装置与放置反应容器的装置相连接;
(iii)一个可吸附容器壁上的磁珠的磁架;以及
(iv)一个侦测器。
16.如权利要求15所述的诊断套组,其特征在于,其中具生物反应性的引子是由将DNA标定物与引子反应得来。
17.如权利要求15所述的诊断套组,其特征在于,其中链霉抗生物素酵素复合物为链霉抗生物素山葵过氧化氢酵素。
18.如权利要求15所述的诊断套组,其特征在于,其中此诊断套组可自M.marinum,M.avium与M.intracellulare中辨别M.tuberculosis。
19.如权利要求15所述的诊断套组,其特征在于,其中侦测器为冷光分析仪或分光光度计。
20.如权利要求15的诊断套组,其特征在于,其中DNA标定物为9-(4”-(胺甲基)-4’,5”-二甲白芷素)吖锭羧醯胺。
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