TWI502072B - B型肝炎病毒檢測方法及其套組 - Google Patents

Description

B型肝炎病毒檢測方法及其套組

本發明係關於一種微生物之檢測方法及其套組，特別是關於一種B型肝炎病毒之檢測方法及檢測套組。

B型肝炎病毒(Human hepatitis B virus；HBV)乃係全球重要的感染病源，為亞洲國家國人死亡的十大主因之一，B型肝炎病毒主要造成肝臟相關的疾病，如肝臟發炎、猛爆性肝炎或肝硬化，若未適時加以遏止更可能衍生肝衰竭及肝癌等末期肝臟疾病。

B型肝炎病毒的臨床診斷主要以偵測B型肝炎病毒表面抗原-HBsAg或鞘蛋白HBeAg-為主要手段，惟該表面抗原或鞘蛋白之抗原決定區(antigenic determinant)往往易隨外界環境變異而發生突變，以致不易被抗體所辨識，影響該B型肝炎病毒的早期診斷。據此可知，習用B型肝炎病毒之檢測具有低特異性之缺點，恐有延誤B型肝炎之診斷，影響治療成效之虞。

聚合酶連鎖反應為習用B型肝炎病毒診斷的另一方法，係以聚合酶連鎖反應增幅並分析該B型肝炎病毒的特異性片段。然，該聚合酶連鎖反應所獲得之反應產物需藉由膠體電泳分析或者以螢光染色的方式方可呈現，以致習用B型肝炎病毒檢測方法之操作流程較為複雜、費時，為習用B型肝炎病毒檢測方法自動化操作之瓶頸。

因此，有鑒於習用B型肝炎病毒檢測方法之種種缺 點及不便，有必要針對習用檢測方法之技術手段加以改良，以提升B型肝炎病毒檢測之效能及檢測品質。

本發明之主要目的係提供一種B型肝炎病毒之檢測方法，針對B型肝炎病毒建立一檢測平台，簡化檢測程序，以提升B型肝炎病毒之檢測效率。

本發明之次要目的係提供一種B型肝炎病毒之檢測套組，使B型肝炎病毒之檢測可兼具低成本及簡易操作之功效。

一種B型肝炎病毒檢測方法，包含：一增幅步驟，以聚合酶連鎖反應增幅一核苷酸片段，而獲得一聚合酶連鎖反應片段，該聚合酶連鎖反應片段之兩端分別標示一第一親合物；一磁珠步驟，準備複數個磁珠，該複數個磁珠之表面係具有第二親合物，且該第二親合物與該第一親合物之間具有專一性地親合關係；一複合物形成步驟，混合該聚合酶連鎖反應片段以及該複數個磁珠，使該聚合酶連鎖反應片段一端之第一親合物與該磁珠之第二親合物相互反應、進而結合，該聚合酶連鎖反應片段另一端之第一親合物則呈一端游離，以形成聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物；一阻斷及洗滌步驟，係利用一阻斷緩衝液及洗滌緩衝液除去未與該磁珠結合之聚合酶連鎖反應片段，其中，該阻斷緩衝液係用以懸浮該聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物，而該洗滌緩衝液則係用以清洗該聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物；以及一呈色步驟，提供一呈色劑 及一酵素受質，該呈色劑係標示一第三親合物，使該呈色劑與該聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物反應，而形成呈色劑-聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物，再加入酵素受質進一步反應，以透過分析該呈色劑而得檢測結果；其中，該呈色劑係藉由該第三親合物而結合於該聚合酶連鎖反應片段另一端之第一親合物，該第三親合物與該第一親合物之間具有專一性地親合關係，且不等同於該第二親合物。

本發明之B型肝炎病毒檢測方法，其中，該增幅步驟中之聚合酶連鎖反應，係利用如序列辨識編碼：1及2所示之引子對進行增幅。

本發明之B型肝炎病毒檢測方法，其中，該引子對之5’端係標示第一親合物。

本發明之B型肝炎病毒檢測方法，其中，該第一親合物係生物素(biotin)。

本發明之B型肝炎病毒檢測方法，其中，該第二親合物係鏈球菌卵白素(streptavidin)。

本發明之B型肝炎病毒檢測方法，其中，該第三親合物係卵白素(avidin)。

本發明之B型肝炎病毒檢測方法，其中，該呈色劑係親合素辣根過氧化氫酶(avidin conjugated horseradish peroxidase；AV-HRPo)。

一種B型肝炎病毒檢測套組，包含：一引子對，包含一B型肝炎病毒之特異性片段，且該引子對之5’端係 標示一生物素(biotin)；複數個磁珠，該複數個磁珠之表面設有鏈球菌卵白素(streptavidin)；一呈色劑，包含一呈色酵素，該呈色酵素係標示卵白素(avidin)；以及一酵素受質。

本發明之B型肝炎病毒檢測套組，其中，該引子對之序列如序列辨識編碼：1及2所示。

本發明之B型肝炎病毒檢測套組，其中，該呈色酵素係親合素辣根過氧化氫酶(avidin conjugated horseradish peroxidase；AV-HRPo)。

本發明之B型肝炎病毒檢測套組，其中，該套組更包含一洗滌緩衝液、一阻斷緩衝液及一結合緩衝液。

為了讓本發明之上述和其他目的、特徵和優點能更明確被了解，下文將特舉本發明較佳實施例，並配合所附圖式，作詳細說明如下。

請參照第1圖所示，本發明之微生物檢測方法包含一增幅步驟S1；一磁珠步驟S2；一複合物形成步驟S3；一阻斷及洗滌步驟S4；一呈色步驟S5。該增幅步驟S1係利用聚合酶連鎖反應增幅一微生物特異之核苷酸片段，以獲得一聚合酶連鎖反應片段，且該聚合酶連鎖反應片段之兩端係各標示一第一親合物。更詳言之，該增幅步驟S1係依據該微生物之特異片段設計一引子對，該引子對之正向引子及反向引子之5’端皆標示該第一親合物，藉此，由該引子對對該微生物進行聚合酶連鎖反應即可獲得 該聚合酶連鎖反應片段。其中，該增幅步驟S1中所指之微生物，可以係各種所欲檢測之病原菌，包含病毒、細菌及真菌，較佳係B型肝炎病毒。

該磁珠步驟S2，係準備複數個磁珠，各該複數個磁珠之表面係具有第二親合物，且該第二親合物與該第一親合物之間具有專一性地親合關係。因此，本發明之第一、第二親合物可以為任何具有親合關係之二分子，如抗原及抗體或是生物素及卵白素，較佳係生物素及鏈球菌卵白素。

該複合物形成步驟S3，係混合該聚合酶連鎖反應片段以及該複數個磁珠，使該聚合酶連鎖反應片段一端之第一親合物與該磁珠表面之第二親合物可相互反應、彼此結合，進而形成聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物。其中，該聚合酶連鎖反應片段僅以一端之第一親合物與該磁珠表面之第二親合物結合，並以該聚合酶連鎖反應片段另一端之第一親合物維持游離狀。本發明係先將該複數個磁珠懸浮於一結合緩衝液，再與該聚合酶連鎖反應片段於室溫下共同10至30分鐘，使該聚合酶連鎖反應片段可因應該第一、第二親合物之間的作用關係而結合於該磁珠，如第2圖所示。另外，本發明所採用之結合緩衝液包含10mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA及2M NaCl。

請參照第2圖所示，係明確顯示本發明之聚合酶連鎖反應片段1與該磁珠2確實可藉由該聚合酶連鎖反應片段1所標示的第一親合物11及該磁珠2上設有之該第二 親合物21之間的親合關係而彼此結合，而本發明之第一、第二親合物11、21係選擇但不限定為生物素(biotin)及鏈球菌卵白素(streptavidin)。由該生物素(biotin)及鏈球菌卵白素(streptavidin)之間快速、穩定之非共價結合，可將一經生物素標定之分子，如本發明之聚合酶連鎖反應片段1，的其中一端，連結於經鏈球菌卵白素標定之磁珠上，如本發明之磁珠2，並使該生物素標定分子的另一端保持游離，而可於後續反應中與其他特定分子進行反應。

該阻斷及洗滌步驟S4，係準備一阻斷緩衝液及一洗滌緩衝液，並且以該阻斷緩衝液及洗滌緩衝液懸浮且清洗該聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物，以除去未與該磁珠結合之聚合酶連鎖反應片段。更詳言之，該聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物係先利用一磁珠分離器，將該聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物與上清液分離，所收集的聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物再以該洗滌緩衝液反覆地清洗，較佳係清洗至少三次，以除去可能沾染之雜質。此外，經清洗後之聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物則以該阻斷緩衝液懸浮且於室溫下靜置10分鐘，之後，同樣以該磁珠分離器收集該聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物、重複以該洗滌緩衝液反覆地清洗，最後再將該聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物懸浮於一磷酸鹽緩衝液(1×PBS)中，以待後續反應。本發明之阻斷緩沖液包含該磷酸鹽緩衝液(1×PBS)及基質，而該洗滌緩液則包含10mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA與2M NaCl。

該呈色步驟S5，係準備一呈色劑及一酵素受質，並依序與該聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物共同反應，以透過分析該呈色劑而得檢測結果。該呈色劑係標示一第三親合物，該第三親合物與該聚合酶連鎖反應片段上之第一親合物具有專一性地親合關係，將聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物與該呈色劑共同反應，藉此，該呈色劑與該聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物可由該第三親合物與該第一親合物之交互關係而結合，使該呈色劑結合於該聚合酶連鎖反應片段之另一端，進而形成呈色劑-聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物，再加入該酵素受質，捕捉信號，以便於利用一光分析儀進行偵測，如此，即可透過分析該呈色劑而獲得本發明之檢測結果。本發明之第三親合物雖與第一親合物具有特異性之親合關係，但該第三親合物較佳係不同於該第二親合物，使該聚合酶連鎖反應片段二端之第一親合物可分別與該磁珠上之第二親合物、呈色劑標示之第三親合物分別反應。本發明之第一、第三親合物係選擇但不限定為生物素(biotin)與卵白素(avidin)。而本發明之呈色劑則可選自各種常用之螢光染劑、放射標記、化學冷光等，較佳係親合素辣根過氧化氫酶(avidin conjugated horseradish peroxidase；AV-HRPo)。

承上所述，本發明之微生物檢測方法係利用生物素標定之分子分別與親合素辣根過氧化氫酶、鏈球菌卵白素標定磁珠之間快速、穩定且專一性地結合關係，而形成一複合物，以利偵測，使特定分子之檢測可藉由一簡便且快 速之方法達成。因此，本發明之微生物檢測方法可適用於各種微生物之檢測，較佳係用於B型肝炎病毒之偵測，並針對各種不同之檢體進行分析，如血液、血清等各類體液。

為證實本發明之方法確實可有效檢驗各種待測之微生物，並且具有良好的靈敏度及穩定性，特操作以下試驗：準備一微生物樣品，依照不同的微生物含量而分為數組，利用本發明之檢測方法加以分析，以測得本發明之方法的靈敏度。

本實施例係選用一B型肝炎病毒的選殖株-pHBV-300,106，該pHBV-300,106包含B型肝炎病毒的基因片段。請參照下方第1表所示，該pHBV-300,106係依照不同劑量，如4×、8×、16×、32×、64×、128×、256×、512×、1024×、2048×及4096×，而分為11組，該11組pHBV-300,106連同一陰性對照組則同樣利用前述所載明之步驟流程進行本發明之檢測方法的分析，其檢測結果如第3圖所示。本實施例之增幅步驟係依照B型肝炎病毒之專一性序列設計並利用一引子對，該引子對之序列如序列辨識編碼：1及2所示，其中，該引子對之正向引子及反向引子的5’端均標示一生物素(biotin)。

請參見該第3圖，其結果顯示利用本發明之微生物檢測方法可有效偵測到微量的待測病原菌，最低甚至可測達0.078125奈克(ng)之病原菌量，因此，可證實本發明之方法的確具有良好的靈敏度。

再者，本實施例另將數個經鏈球菌卵白素標定之磁珠分為數組，各組係分別將該鏈球菌卵白素標定之磁珠於4℃或25℃的環境下保存7、14或30天，再同樣以本發明之方法檢測各種劑量(32×、64×、128及256×)的pHBV-300,106，檢測結果如第4圖所示。

請參照第4圖結果，顯示本發明經鏈球菌卵白素標定之磁珠係具有良好的穩定性，因此，利用該磁珠操作本發明的檢測方法將不會受到磁珠儲存環境、溫度或時間的影響，而損及該檢測方法的靈敏度；又，本發明之磁珠即使儲存於常溫下依然可保有穩定且快速反應的活性，因此，可方便以各種運輸工具送往各地，不需另以特殊的保存系統，如恆溫室，加以儲藏。

因此，利用本發明之微生物檢測方法確實可有效進行B型肝炎病毒的檢測，不僅可維持良好的靈敏度，更降低一般檢測方法的操作複雜度。據此，本發明係建立一個更為簡便、低成本且高效率的微生物檢測平台，因此， 本發明更可依據該檢測方法另提供一微生物檢測套組，包含一引子對，具有一微生物之特異性片段，如B型肝炎病毒的特異性片段；複數個磁珠，該複數個磁珠之表面設有鏈球菌卵白素(streptavidin)；一呈色劑以及一酵素受質，該呈色劑包含一呈色酵素，該呈色酵素係標示卵白素(avidin)。其中，該引子對之正向引子及反向引子的5’端係標示一生物素(biotin)，且該引子對可針對該微生物之特定片段進行增幅，本發明之微生物可以係各種所欲檢測之病原菌，包含病毒、細菌及真菌，較佳係B型肝炎病毒。而該複數個磁珠係於各該磁珠之表面標示鏈球菌卵白素(streptavidin)，該鏈球菌卵白素可與生物素標示的各種分子進行專一性地親合反應、結合，藉此，各種經生物素標示的分子即可利用自身的生物素與該鏈球菌卵白素之結合，而便於分離且分析。最後，該呈色劑係包含一呈色酵素，如辣根過氧化氫酶(horseradish peroxidase；HRPo)或鹼性磷酸酶(Alkaline phosphatase；AP)，本發明之呈色酵素係選用但不限定為卵白素結合之冷光，如親合素辣根過氧化氫酶(avidin conjugated horseradish peroxidase；AV-HRPo)，藉此，利用該親合素辣根過氧化氫酶可與該生物素標示之分子、鏈球菌卵白素標示之磁珠共同反應、結合而形成呈色劑-生物素標示分子-鏈球菌卵白素標示磁珠之複合物，再利用該呈色劑與該酵素受質反應及信號之捕捉，達到快速分析且定量該生物素標示分子之功效。

另外，本發明之微生物檢測套組可另包含一阻斷緩 衝液、一洗滌緩衝液及一結合緩衝液，以輔助該引子對、磁珠及呈色劑之間的交互作用。該阻斷緩沖液包含該磷酸鹽緩衝液(1×PBS)及基質，該洗滌緩液包含10mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA、及2M NaCl，而該結合緩衝液則包含10mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM EDTA及2M NaCl。

本發明之微生物檢測方法，係針對B型肝炎病毒建立一檢測平台，以簡化B型肝炎病毒的檢測程序，進而提升檢測效率。

本發明之微生物檢測套組，係應用前述之微生物檢測方法而開發之快速檢測套組，使B型肝炎病毒之檢測可兼具低成本及簡易操作之功效。

雖然本發明已利用上述較佳實施例揭示，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者在不脫離本發明之精神和範圍之內，相對上述實施例進行各種更動與修改仍屬本發明所保護之技術範疇，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

S1‧‧‧增幅步驟

S2‧‧‧磁珠步驟

S3‧‧‧複合物形成步驟

S4‧‧‧阻斷及洗滌步驟

S5‧‧‧呈色步驟

1‧‧‧聚合酶連鎖反應片段

11‧‧‧第一親合物

2‧‧‧磁珠

21‧‧‧第二親合物

第1圖：本發明之微生物檢測方法的流程圖。

第2圖：本發明之磁珠與聚合酶連鎖反應片段的結合示意圖。

第3圖：本發明之微生物檢測方法的靈敏度示意圖。

第4圖：本發明之磁珠的儲存穩定性示意圖。

<110> 亞洲基因科技股份有限公司

<120> B型肝炎病毒檢測方法及其套組

<130> PK12884

<140> 100135025

<141> 100-09-28

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBV forward primer

<400> 1

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> HBV reverse primer

<400> 2

S1‧‧‧增幅步驟

S2‧‧‧磁珠步驟

S3‧‧‧複合物形成步驟

S4‧‧‧阻斷及洗滌步驟

S5‧‧‧呈色步驟

Claims (5)

1. 一種B型肝炎病毒檢測方法，包含：一增幅步驟，以聚合酶連鎖反應增幅一核苷酸片段，而獲得一聚合酶連鎖反應片段，該聚合酶連鎖反應係利用如SEQ ID NOS：1及2所示之引子對進行增幅，該引子對之5’端皆標示一生物素，使該聚合酶連鎖反應片段之兩端分別標示該生物素；一磁珠步驟，準備複數個磁珠，該複數個磁珠之表面係具有鏈球菌卵白素，且該鏈球菌卵白素與該生物素之間具有專一性地親合關係；一複合物形成步驟，混合該聚合酶連鎖反應片段以及該複數個磁珠，使該聚合酶連鎖反應片段一端之生物素與該磁珠之鏈球菌卵白素相互反應、進而結合，該聚合酶連鎖反應片段另一端之生物素則呈一端游離，以形成聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物；一阻斷及洗滌步驟，係利用一阻斷緩衝液及洗滌緩衝液除去未與該磁珠結合之聚合酶連鎖反應片段，其中，該阻斷緩衝液係用以懸浮該聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物，而該洗滌緩衝液則係用以清洗該聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物；以及一呈色步驟，提供一呈色劑及一酵素受質，該呈色劑係標示一卵白素，使該呈色劑與該聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物反應，而形成呈色劑-聚合酶連鎖反應片段-磁珠之複合物，再加入酵素受質進一步反應， 以透過分析該呈色劑而得檢測結果；其中，該呈色劑係藉由該卵白素而結合於該聚合酶連鎖反應片段另一端之生物素，該卵白素與該生物素之間具有專一性地親合關係，且不等同於該鏈球菌卵白素。
2. 依申請專利範圍第1項所述之一種B型肝炎病毒檢測方法，其中，該呈色劑係親合素辣根過氧化氫酶(avidin conjugated horseradish peroxidase；AV-HRPo)。
3. 一種B型肝炎病毒檢測套組，包含：一引子對，係為如SEQ ID NOS：1及2所示之序列，且該引子對之5’端係皆標示一生物素(biotin)；複數個磁珠，該複數個磁珠之表面設有鏈球菌卵白素(streptavidin)；一呈色劑，包含一呈色酵素，該呈色酵素係標示卵白素(avidin)；以及一酵素受質。
4. 依申請專利第3項所述之微生物檢測套組，其中，該呈色酵素係親合素辣根過氧化氫酶(avidin conjugated horseradish peroxidase；AV-HRPo)。
5. 依申請專利第3項所述之微生物檢測套組，其中，該套組更包含一洗滌緩衝液、一阻斷緩衝液及一結合緩衝液。