CN1100884C - 使用荧光染料检测双链核酸的同相方法和其中使用的药盒 - Google Patents

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Abstract

一种能定量检测扩增过的核酸的高灵敏度同相方法。用高亲合性荧光染料可在扩增期间或扩增后进行检测。所述染料选自非对称花青染料类，具有至少两个正电荷和在从约1×104到约5×105(摩尔浓度-1)，范围内的结合常数(Kb)。用于试验的试剂可以包含在为扩增例如经聚合酶链反应所设计的试剂盒中。

Description

使用荧光染料检测双链核酸的同相方法 和其中使用的药盒
本发明涉及检测靶双链核酸的同相检测法。该方法可用于各种诊断、调查和研究程序中，特别是用于感染因子的检测。本发明还涉及可用于该检测法的试验药盒。
近年来，已逐步将检测核酸作为一种早期检测基因组特征，感染因子及以小量存在于人或动物试验标本中的各种生物的手段。检测方法一般是基于两条DNA链借助互补核苷酸之间的氢键和其他力而结合在一起的互补原理(称为核苷酸对)。
正常情况下，DNA分子是相当稳定的，但在某些条件下，如加热，可使两条链分离或变性。变性的核苷酸链将只能与具有互补核苷酸序列的另一条链重新结合。
为找到只检测少数DNA分子的方法，已进行了许多研究工作。各种方法是已知的并使用了近十年，它们只是扩增或大大增加待检样品中的核苷酸数目。这些扩增技术包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)和研究较少的其他一些方法。
PCR是最为人们所熟知的，包括在适当条件下，于DNA聚合剂及三磷酸脱氧核糖核苷酸存在的条件下，使引物与靶核酸链杂交。经过几个循环后的结果是：形成引物延伸产物并使原有的靶链数目以指数扩增。有关PCR的进一步细节可参见US-A-4,683,195(Mullis等人)，和US-A-4-,683,202(Mullis)和US-A-4,965,188(Mullis等人)。
尽管象PCR这样的扩增方法为检测小量靶核酸提供了机会，但同时也产生一个问题，即寡核苷酸从一个容器到另一容器时，会产生人为的污染。由于污染物会随新样品的靶核酸同时被扩增而得到假阳性结果。这样可能产生严重的后果，特别是在检查感染因子时。认为工业上的物理封闭和化学“消毒”技术可降低这种污染。物理封闭手段有其优点，但在反应容器的加工和设计上还是相当复杂的。化学消毒技术在本领中论述过，但尚未得到成功地证明。
有必要寻找一种方法以简化扩增方法，同时又不必担心物质从一个容器到另一个容器的过程中受到污染。还需要一种实质上可定量的扩增方法。所述方法可用于治疗疾病而不仅仅是对其的检测。
EP-A-0487218(Tosoh 1992年5月27日公开的)中描述了被认为实质上是定量的同相扩增方法，其中在扩增期间或扩增之后使用特定的荧光染料与双链DNA结合。结合后，荧光信号的改变水平显然是与标本中靶核苷酸的量相关联的。认为可用于Tosoh公开文本中的几类荧光素染料是溴化乙锭。吖啶橙、二苯并咪唑(如Hoechst 33258)，二氨基苯基吲哚，放线菌素，噻唑橙和色霉素。“同相”是指该方法不需要将被检测的靶核酸同非靶材料分开。
相同类型的染料也可用于检测DNA聚合酶，如US-A-5,049,490(Sutherland等人)中描述的。
尽管上述染料(如溴化乙锭和Hoescht染料)很容易与DNA结合，但由于显著的敏感性，从而使使其显现的本底通常太高。因此，需要找到既与DNA易结合，又有较高敏感性和较低本底的染料。
已经由Mansfield等人(BioTechniques 15(2)，p274-279(1993))描述了用于着染扩增的核酸的敏感染料—某些双—嵌入染料。虽然上述染料可用于着染核酸并克服了上述的本底问题，但它们与核酸的结合太紧以致抑制了扩增过程。因此，它们只能在扩增终止时而不是在该过程中使用。
需要一种更敏感的同相检测法，它可用于封闭系统中扩增的靶核酸的定量检测，由此避免污染问题。所述检测法应对于低水平核酸是高度敏感的，并易于操作和使用。此外，还需用掺入的检测工具来监测扩增进程，以便使之在扩增期间存在。
已用检测双链靶核酸的同相检测法克服了上述问题，该方法包括下述步骤：
A)扩增双链靶核酸
B)使所得到的扩增的双链靶核酸与荧光染料接触，该染料与双链靶核酸结合时，与染料同双链核酸靶核酸的单链结合所产生的信号相比，或与游离形式的染料的信号相比，呈现出可检测信号，以及
C)检测或监测作为确定双链靶核酸之存在或其数量标准的可检测信号，
因而荧光染料是一种非对称的花青染料，与双股核酸的结合常数(Kb)为从约1×104至5×105，并由结构式(I)代表：
Figure C9510651500181
其中X是-S-、-O-、-Se-、＝CH-或-NR1-，
Y是-CH＝CH-，
R是有1至6个碳原子的烷基，
R1是氢或有1至6个碳原子的烷基，
R2和R6分别是有1至10个碳原子的亚烷基，
R3、R4和R5分别是有1至6个碳原子的烷基，
Z1包括形成一个5或6元杂环所需的碳原子和杂原子，该杂环可有多达3个融合于其上的芳族碳环或杂环，
Z2包括形成5或6元芳环所需的碳和杂原子，所述芳环可有多达2个融合于其上的芳族碳环或杂环，
Q是酸阴离子，
n是0、1或2，
m、p和q分别是0或1，条件是p和q不相同，
r是1或2，且
t是0、1或2，
从而可在扩增的双链靶核酸不与俘获探针结合情况下进行检测或监测。
本发明还提供一种监测双链靶核酸扩增的方法，包括以下步骤：
A)在荧光染料存在的情况下扩增双链靶核酸，当荧光染料结合于双链靶核酸上时，与染料同双链靶核酸的单链结合时所产生的信号，或与其游离形式的信号相比，表现出可检测的信号，并且
B)在扩增过程中，按双链靶核酸的存在情况和其数量检测或监测可检测信号。
因而该荧光染料在前述方法中是如上所述的染料，
并从而不必使扩增的双链靶核酸与俘获探针结合就可进行检测或监测。
更进一步，本发明提供一种进行同相扩增并检测双链靶核酸的试验药盒，该药盒以相同或不同的包装包括：
1)荧光染料，与双链靶核酸结合时，同染料与双链靶核酸的单链结合时所产生的信号，或其游离形式的信号相比，表现出可检测的信号，
从而按上述本发明方法使用该荧光染料，并且
2)至少一种扩增试剂。
本发明提供了一种较简单、高度敏感的同相检测法，它用于在扩增期间或其后检测靶核酸。因此，该方法可用于在扩增过程中的任何给定点上定量监测扩增和核酸的量。也可以用于在扩增终止时检测核酸的量。因为该方法是同相的，故其可在任何适当的容器中进行，而不需要如异相方法中常见的分离和俘获步骤。因为在扩增后不需要从反应容器中除去试剂，故可避免从一个容器到另一个容器所造成的污染。更重要的是，因为本底信号较低，所以该检测法比先前报导的使用常用荧光染料的检测法更为敏感。
这些优点是因使用特定类型的荧光染料而达到的，这些荧光染料对被扩增的和在特定范围内检测的双链核酸有高度的亲和性。这种结合亲和性比许多常用荧光染料更大，但又不致于大到抑制靶核酸扩增的程度。染料至少是二价的，即每个分子至少有两个阳电荷。对这些染料的更详细的限定详见下文。
附图是荧光强度对PCR循环的曲线图，对该图内容的解释详见下文实施例1。
使用聚合链反应扩增和检测核酸的一般原理和条件是众所周知的，其详细介绍可参见US-A-4,683,195、US-A-4,683,202和US-A-4,965,188等大量参考文献，所有这些文献均列为本文参考文献。因此，鉴于本领域中的技术教导和本文提供的特定教导，本领域技术人员通过调整本文教导的方案扩增一个或多个核酸以实践本发明应是没有困难的。
可用于实践本发明的其他扩增方法包括例如EP-A-0320308(1987年12月公开的)和EP-A-0439182(1990年1月公开的)中描述的连接酶链反应、例如Birkenmeyer等人(J.Virol.Meth.35，pp.117-126(1991))所述的自身支持的序列复制(self-sustainedsequence replication)、“Gap-LCR”和其变化方法以及对于本领域技术人员所显见的其他方法。虽然本公开的其余部分是针对使用PCR实现本发明，但对于分子生物学领域的技术人员来说，如何使本文的教导适用于其他扩增技术应是显而易见的。
本发明涉及扩增或检测存在于试验样本内的一个或多个靶核酸中的一个或多个特定核酸序列。试验样品可包括含有可检测基因组DNA或RNA的细胞或病毒材料、头发、体液或其他材料。虽然检测的基本目的实质上是用于诊断的，但本发明也可用于改善克隆DNA或信使RNA的效率，或从化学合成得到的核酸混合物中得到大量的所需序列。
可从各种来源，包括质粒和任何来源(如细菌、酵母、病毒、植物、高等动物或人)的天然DNA或RNR，得到待扩增的核酸。可使用已知方法从包括血液、外周血单核细胞(PBMC)在内的各种组织、其他组织材料或本领域已知的其他来源提取之。本发明特别适用于扩增和检测见于基因组DNA、细菌DNA、真菌DNA、病毒DNA中的核酸序列，或见于细菌或病毒感染之细胞中之DNA或RNA的核酸序列。另外，可使用本发明的方法扩增和检测与肿瘤相关的核酸。
可被检测的细菌包括但不只限于见于人血液中的细菌。沙门氏菌种、衣原体种、淋球菌种、志贺氏菌种和分枝杆菌种。可检测的病毒包括但不只限于单纯疱疹病毒、E-B病毒、人细胞肥大病毒、人乳头状瘤病毒、肝炎病毒和反转录病毒和HTLV-1、HTLV-II、H1V-I和H1V-II。原生寄生虫、酵母和霉菌也可以检测。其他可检测的品种对于本领域技术人员来说是显而易见的。
“PCR试剂”是指对于PCR不可缺少的任何试剂，即一组用于各靶核酸之相对链的引物、DNA聚合酶、DNA聚合酶辅助因子、以及两种或多种脱氧核糖核苷-5′-三磷酸。
术语“引物”是指天然存在的或合成产生的寡核苷酸，当放在合成与一条核酸链(即模板)互补的引物延伸产物的条件下时，其能够起到合成起始点的作用。所说的条件包括存在其他PCR试剂，以及适当的温度和pH。
为达到最大扩增效率，引物较好是单链的，但必要时也可以是双链的。它必是足够长的以便在DNA聚合酶存在下引导合成延伸产物。各引物的确切大小将取决于所期望的用途、靶序列的复杂性、反应温度和引物的来源。一般说来，用于本发明的引物应有10至60个核苷酸，且较好有18至45个核苷酸。
选择用于本发明的引物是“实质上互补”于待扩增之特定序列的不同链。这就意味着它们必须是充分互补的，以便与它们的各自链杂交形成所需的杂交产物，并且是进而可在DNA聚合酶作用下延伸的。在优选的和最实际的情况下，引物与靶核酸具有准确的互补性。
本发明适用的引物可得自许多来源，或者可使用已知技术或设备与其已知的使用方法(使用的方法如上文提到的US-A-4,965,188中所述的)制得，所用设备使用包括ABI DNA合成仪(可购自Applied Biosystems)或Biosearch 8600系列或8800系列合成仪(可购自Milligen-Biosearch公司)。也可使用从生物学来源分离的天然存在的引物(如限制性核酸内切酶消化产物)。本文所用的术语“引物”还指引物的混合物。
DNA聚合酶是一种将脱氧核苷酸单磷酸分子加至引物和模板的复合物中引物3′羟基末端上的酶，但这种加入是以模板依赖性方式进行的(即是说，依赖于模板中的特异核苷酸)。适用的DNA聚合酶例如包括E.coli DNA聚合酶I、T4 DNA聚合酶、Klenow聚合酶、反转录酶及本领域已知的其他聚合酶。
DNA聚合酶较好是“热稳定的”，即它一般是对热稳定的，且较好是在较高温度下，特别是在DNA链变性所用的高温度下仍是有活性的。更具体地说，热稳定性DNA聚合酶在PCR中所使用的高温下是基本上不灭活的。所述温度将依据反应条件，包括pH，盐浓度及其他本领域已知的条件而变化。
本领域已报导了许多热稳定性DNA聚合酶，包括US-A-4,965,188(上文注明的)和US-A-4,889,818(Gelfand等人，1989年12月26日公开)中详细提到的DNA聚合酶。特别适用的聚合酶是得自各种栖热菌属的聚合酶。优选的热稳定性酶是从水生栖热菌(Thermus aquaticus)、线形栖热菌(T.filiformis)、黄色栖热菌(T.flavus)或嗜热栖热菌(T.thermophilus)中得到的DNA聚合酶。其他有用的热稳定性聚合酶可得自各种其他微生物来源，包括Termococcus literalis、Pyrococcus  furiosus、Thermotoga sp.及WO-A-89/06691(1989年7月27日公开)中描述的微生物。某些有用的酶是可从商业途径购得的。从生物体内分离天然存在的聚合酶的许多技术是已知的，使用重组技术制备聚合酶的克隆技术和其他合成技术也可从上文列出的已有技术中了解到。
DNA聚合酶辅因子是指酶发挥活性所依赖的非蛋白质化合物。许多这样的物质是本领域已知的，包括在含水反应混合物中释放二价锰或镁离子的锰和镁化合物。有用的辅因子包括但不只限于锰和镁盐，如氯化物、硫酸盐、乙酸盐和脂肪酸盐。优选的是较小的盐，如氯化物、硫酸盐和乙酸盐。特别优选的是氯化镁和硫酸镁。
PCR还需要两种或多种脱氧核糖核苷-5′-三磷酸，如两种或多种dATP、dCTP、dGTP、dTTP和dUTP。也可使用类似物如dITP和7-脱氮-dGTP。可取的是，PCR中一起使用四种常用的三磷酸酯(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)。
提供本文所述的PCR试剂并以适当浓度用于PCR以适于扩增靶核酸。
DNA聚合酶的最小用量一般为至少每100μl溶液约0.5单位，较好每100μl约2至约25单位，更好每100μl约7至约20单位。对于给定的扩增系统可使用其他适当用量。本文中每“单位”定义为于74℃下；在30分钟内将10nmol总核苷酸(dNTP)掺入延伸核酸链中所需的酶活性量。
各引物的浓度至少为约0.01μmol，较好约0.2至约1μmol。在某些扩增系统中也可使用其他适当量。引物可以以相同或不同的量存在。
在反应混合物中，DNA聚合酶辅因子一般以大约0.5至约20毫摩尔浓度的量存在，且各dNTP一般以大约0.1至约2毫摩尔浓度的量存在。某些扩增系统中也可使用其他量的辅因子和dNTP。
可以使用许多本领域已知的适当缓冲液，在pH约7至9的缓冲溶液中，分别地、或以各种结合方式、或以全部一同加入方式提供PCR试剂。用于扩增的反应混合物一般是相似缓冲的。但在某些扩增系统中可以使用其他pH值。
可从上文提到的各种来源中的任何一种来源得到靶核酸。一般说来，必须以某些方式提取之，以使之适于与引物和其他反应材料接触。一般这通常意味着以适当方式从样品中除去不需要的蛋白质和细胞物质。各种方法是本领域已知的，其中包括Laure等人在Ihe Lancet，pp.538-540(sept.3，1988))、Maniatis等人在Molecular Cloning；A Laboratory Manual，pp.280-281(1982)、Gross-Belland等人在Eur.J.Biochem.，36，32(1973)和US-A-4,965,188(见上文)中所描述的方法。
从全血或其成分中提取DNA的方法例如已有EP-A-0393744(1990年10月24日公布)中，Bell等人的文章(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78(9)，pp.5759-5763(1981)和Saiki等人的文章(Bio/Technology，3，pp.1008-1012(1985))，以及US-A-5,213,015(Cummins et al.)作了描述。
因为待扩增和检测的靶核酸一般是双链形式的，所以在可发生引发之前必须将两条链分离开(即使之变性)。这可在提取过程中完成，或者可在其后加入一个分离的步骤。优选的变性方法是将核酸加热到适当温度(本文指定为“第一温度”)。一般说来，该第一温度是在大约85至100℃范围内，加热几分钟，但通常是约1至约40秒钟。
然后将反应混合物冷却到一般在大约55至75℃范围内的第二温度，用一组适当的引物引发变性的核酸链。冷却可进行长达几分钟的任何适当时间，但一般是在60钞钟之内，更好是大约5至约25秒钟。
一旦变性的核酸链被冷却，即在第三温度下将含有PCR试剂的反应混合物保温几分钟。更常用的保温时间为1至约80秒钟，较好是1至大约40秒钟，借以形成引物延伸产物。一般说来，第三温度在大约55至约75℃范围内，更好是在大约62至约68℃范围内。
在一最优选的实施方案中，第二和第三温度是相同的，并在大约62至约68℃的范围内。因此，引发和引物延伸可在同一温度进行长达几分钟的适当时间，较好是大约5至约120秒钟，最好是大约10至约90秒钟。
形成引物延伸产物之后，将反应混合物加热长达几分钟的适当时间以使引物延伸产物变性。一般说来，要将反应产混合物加热约5至约20秒，并在此温度保持约1至约80秒以使产物变性。如此完成一个扩增循环。
PCR一般进行至少20次循环，较好是20至50次循环。每次循环一般约20至约360秒，较好约30至约120秒，最好约30至约90秒。某些扩增系统可用更长的循环时间。
虽然某些扩增系统和方法可以不连续方式完成，即有不同的循环时间或间插加入试剂或取出样品，但本发明的方法优选地以连续的、自动的方式进行，从而使反应混合物在所需次数内处于以控制的方式进行循环的温度。为此目的，已研制了许多作为本领域普通技术人应知道的装置。
US-A-4,965,188和EP-A-0236069中较详细地描述了一种用于这一目的的装置。这种装置一般包括许多装有含反应混合物之反应试管的热传导容器、加热、冷却和温度维持装置、和用以产生信号的计算装置以控制扩增序列、改变温度和定时。
EP-A-0402994详述了可使用US-A-5,089,233(见上文)中描述的装置加工处理的化学试验盒。其中还描述了适于本发明方法的重复性间隔期(即整个循环)加热和冷却试验盒的装置。可从本领域中相当多的文献中了解到有关适用的PCR处理装置更详细的内容，这些是本领域技术人员可以很容易地查明的。
除上述化学试验盒外，该方法可在其他容器，例如US-A-4,902,624(Columbus et al.)、US-A-4,683,195(见上文)中详述的容器，以及其他一些本领域技术人员很容易了解的适当容器中进行。本发明的主要优点是，在封闭的容器中进行扩增和检测，从而排除了污染问题。因此，已设计的用于该目的的封闭容器适合于实践本发明的同相方法。因为检测是通过测定荧光染料的发射光而进行的，所以容器必须适应于进行这种检测。因此，可用玻璃和本领域技术人员显然很容易识别的透光聚合物制成。
如上文提到的，可在扩增期间或其后的任何时间使用本文所述的荧光染料，以检测靶核酸。最好在实施本方法的开始阶段即加入染料，从而能够监测整个扩增过程的进展。特定的荧光染料，当结合到双链靶核酸上时，与当染料结合于单链靶核酸上所产生的信号相比较，显示出可检测信号。另外，结合于双链靶核酸上的染料发出的信号可与处于游离形式的染料(即未与单链或双链核酸结合的)所提供的信号相比较。本文所用的术语“可检测信号”是指任何可检测的信号的改变，如发光强度的增强或降低、最大发光波长移动(在两个方向)至少5nm但激发波长没有移动、最大激发波长移动(在每个方向)但发光波长没有移动、最大激发和发光波长均有移动、或任何这样效应的组合。可检测信号最好是根据发光强度的增强来证实的。
对于给定荧光染料的给定发光和激发波长，可使用任何一种适当的荧光分光光度仪监测或检测可检测信号。可在扩增过程中的任何时间，即任何一次扩增循环后监测可检测信号，或者亦可在最后一次扩增循环后进行监测。在第一种情况下，至少在某些循环中，在荧光染料的存在下真正地完成扩增。
本文所说的荧光染料一般限定在具有约1×104至5×105(摩尔浓度-1)范围内之结合常数(Kb)的非对称花青染料。为限定Kb所说的“大约”是指10％的变化。染料也是水溶性的或水可分散的，所以它们可与含水反应混合物中的核酸结合。根据所用的阴离子，染料可在水混溶性溶剂中溶解。
此外，用于本发明中的染料可进一步由参数“KC”限定，该参数是使用下列公式计算的：
KC＝Kp×染料浓度(C)×2。Kp是分配系数。本发明使用的荧光染料具有大约为20或更小的“KC”值，其中“大约”是指10％的变化。下文实施例3中提供了几种有用染料，以及几种本发明范围外的染料的KC值。
更具体地说，有用的染料是由下列结构式(I)限定的：
Figure C9510651500281
其中X是-S-、-O-、-Se-、＝CH-或-NR1-。X更好是-S-或-O-。
另外，结构式(I)中，Y是-CH＝CH-。
R是有1至6个碳原子的被取代的或未被取代的烷基(如甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、戊基和己基)。R较好是有1至3个碳原子的被取代或未被取代的烷基，且R更好是甲基或乙基。最优选的R是甲基。
R1可以是氢或如上文限定的R一样，为有1至6个碳原子的被取代或未被取代的烷基。优选的是，R1为氢或如上文限定的有1至3个碳原子的被取代或未被取代的烷基，且最好R1是氢。
R2和R6各自是有1至10个碳原子的被取代或未被取代的亚烷基(如亚甲基、1，2-亚乙基、三亚甲基、异丙烯、正己烯、正戊烯、正辛烯和正癸烯)。优选的是，R2和R6分别是有1至4个碳原子的被取代或未被取代的亚烷基，且最好是三亚甲基。
R3、R4和R5分别是有1至6个碳原子的被取代或未被取代的烷基(如上文R和R1的定义)。这些基团较好分别是有1至3个碳原子的被取代或未被取代的烷基，且最好分别是甲基。
Z1包括构成5或6元杂环所需的碳和杂原子，如苯并噁唑鎓、苯并噻唑鎓、苯并咪唑鎓、喹啉并[2，3-d]噻唑鎓、萘并[2，3-d]噻唑鎓、萘并[1，2-d]噻唑鎓、苯并硒唑啉鎓、吡啶鎓和喹啉鎓。与Z1形成的杂环可有多达三个连接与其上的附加的5元或6元芳族稠合环(碳环或杂环)。其他环结构对于应是本领域技术人员显而易见的。较好是苯并噁唑鎓、苯并噻唑鎓和苯并咪唑鎓环，且最好是前两种环。这样的环可在各不同位置上被低级烷基(1至3个碳原子)或本领域技术人员熟悉的其他取代基所取代，只要这些取代基不会对本发明所依赖的荧光染料和核酸结合性质造成不利影响，或不期望地减慢化合物在含水体系中的扩散能力即可。
在结构式(I)中，Z2包括形成一个5元或6元芳族环所需的碳和杂原子，所说的芳族环连接到举例说明的杂环上，从而提供一稠环体系。Z2可以有多达两个连接于其上的附加芳族稠合环(碳环或杂环)。所构成的环较好是苯并或萘并环，并最优选的是苯并环，从而得到喹啉环。
另外，结构式(I)中的n是0、1或2，且更好是0或1。
再者，m，p和q分别是0或1，条件是p和q是不相同的。优选的是，p和q中至少有一个是1，且最好是p是0而q是1。还有，t是0、1或2，且较好是0。
Q是带有适当的电荷的适当的酸阴离子。这样的阴离子包括但不只限于氯化物、溴化物、对位甲苯磺酸根、硫酸单甲酯根、硫酸根、硝酸根和本领域技术人员易于了解的其他阴离子。该结构式中，r是1或2。
特别有用的荧光染料可购自Molecular Probes，Inc.，其商品名和Kp值列于下面的表I中。然而，本发明不只限于使用本文所列出的Molecular Probes Inc.的特定染料，这些只是优选的染料。这些优选染料的阳离了也借助化学结构式确认如下。这些化合物可包括任何适用的二价阴离子，或两个一价阴离子。其中优选的是碘化物。化合物A：
Figure C9510651500311
化合物B：化合物C：化合物D：
Figure C9510651500314
化合物E：化合物F：化合物G：化合物H：
Figure C9510651500324
                                          表1
  化合物        商品名     Kb*
    A     PO-PRO-1     3.6×104
    B     PO-PRO-3     NA**
    C     BO-PRO-1     5.8×104
    D     BO-PRO-3     8.7×104
    E     YO-PRO-1     1.5×105
    F     YO-PRO-3     6×104
    G     TO-PRO-1     3.6×105
    H     TO-PRO-3     1.1×105
**NA＝未给出
表中的Kb值是将Molecular Probes，Inc.产品目录第224页报告的分配系数(Kp)除去水的摩尔浓度55而计算出来的。
用于本发明实践中的荧光染料的量将根据特定染料而异，因为各染料的结合常数和发光强度，以及估计存在的靶核酸的量均有所不同。但一般说来，该量至少约为10-9摩尔浓度，更好是大约10-8至10-5摩尔浓度。实际的上限为约10-5摩尔浓度，但本发明并不限于此。本段所用的，“约”是指10％的变化。可将染料用在含少量水可溶的有机溶剂，如二甲亚砜的水溶液中提供。
可以在任何适宜的温度，但优选的是在室温完成荧光染料和扩增靶核酸的接触。染料和核酸之间的反应可以花几分钟甚至数小时来完成，但特定的检测中，较长或较短的时间都可以用。
下列实施例用以说明本发明的实践，但不意味着以任何方式进行限制。所有百分比均是重量的，除非另有说明。
实施例的材料和方法：
用于实施例1和2的引物具有下列与HIV-I DNA gag区互补的序列：SEQ ID NO：1：5′-X-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-3′SEQ ID NO：2：5′-X-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-3′
用于实施例3的引物具有下列与HIV-1 DNAgag区互补的序列：SEQ ID NO：3：5′-X-AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAA-3′SEQ ID NO：4：5′-X-CCTGCTATGT CACTTCCCCT TGGTTCTCTC-3′
在上述引物中，X代表使用US-A-4,962,029(Levenson etal)中描述的技术通过2个氨基四甘醇间隔基连接到寡核苷酸上的生物素基(biotinyl)部分。
用于实施例1和2以及实施例3的试验中的捕获探针分别具有下列序列：SEQ ID NO：5：5′-ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG
         TATAGCCCTA C-3′SEQ ID NO：6：5′-GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAGAAT-3′
这些探针共价连接到聚合物颗粒(平均直径1μm)上，该颗粒用常用的乳化聚合技术，从聚[苯乙烯-共(co)-3-(P-乙烯基苄硫基)丙酸](重量百分数95∶5，平均直径1μm)制备。所述粒子在水中的悬液用2-(N-吗啉代)乙基磺酸缓冲液(0.1M pH6)洗涤，并悬浮至含约10％的固体。一个洗涤过的颗粒样品(3.3ml)用缓冲溶液(0.1M)，与1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳化二亚胺盐酸化物(2.1ml，84mg/ml水)和探针(983μl，44.44oD/ml nanopure水混合)稀释成含3.33％的固体。所形成的悬液在间歇搅拌下在50℃水溶中加热2小时，离心。然后，颗粒用含有乙二胺四乙酸二钠盐(0.0001M)的三(羟甲基)氨基烷缓冲液(0.01M，pH8)洗涤三次，并再悬浮其中成4％固体。探针在颗粒上的最终浓度是约75％。
在稀释成含2％的固体后，捕获剂在缓冲剂中与聚合物粘结剂(0.2％)混合，置于实施例2中描述的袋状物中，所述粘结剂由聚[甲基丙烯酸酯-共-丙烯酰胺基-2-甲基丙烷磺酸钠-共-2-乙酰基乙酰氧乙基异丁烯酸酯](重量百分数90∶4∶6)在缓冲液中形成的。
采用常规方法获得来源于水生栖热菌的重组DNA聚合酶。
从Molecular Probes Inc.获得在10％二甲亚砜中的YO-PRO-1、YOYO-1、BO-RPO-1、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TOTO-1和TOTO-3荧光染料。
从Sigma Chemial获得甘油和三(羟甲基)氨基甲烷缓冲液。
HIV-I靶DNA是从HUT 78/HIV AAV细胞(从Bernie Poiesz ofSyracuse university获得)中获得的，每个细胞含有约1个HIV-1拷贝。
用于实施例2中的白染料分散剂含有琼脂糖(0.5％)、4，5-二(4-二甲氨基苯基)-2-(4-羟基-3-甲氧苯基)咪唑白染料250μM、二亚乙基三胺五乙酸(100μM)、4′-羟基N-乙酰苯胺(5mM)、聚乙烯吡咯烷酮(112mM)、一元一水合磷酸钠(10mM)。
用于实施例2中的共轭物溶液含有从商业上获得的(ZymedLaboratories Inc.，酶对抗生蛋白链菌素比率2∶1)抗生蛋白链菌素和辣根过氧化物酶的共轭物(126μl/l、总蛋白1.25g)、酪蛋白(0.5％)和硫柳汞(0.5％)，所述轭合物在3-(4-吗啉代)丙烷磺酸缓冲液(0.1M)中。
用于实施例2中的洗液含有氯化钠(373mM)、乙二胺四乙酸二钠盐(2.5mM)、癸基硫酸钠(38mM)和乙基汞基硫代水杨酸钠(25μM)，它们在一元一水合物磷酸钠缓冲液(25mM pH7.4)中。
剩下的试剂和材料用商业途径获得或用常规方法在EastmanKodak公司制备的。实施例1  检测扩增的HIV-I DNA
本实施例说明检测由PCR扩增的HIV-I DNA。
最终PCR反应混合物含有引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2(各0.4μM)、氯化镁(10mM)、各种dATP、dCTP、dGTP和dTTP(各1.5mM)、三(羟甲基)氨甲烷缓冲剂(10mM pH8)、乙二胺四乙酸(0.1mM)、氯化钾(50mM)、DNA聚合酶(160单位/ml)和Kodak Ultrapure人DNA(0.22μg/μl)、甘油(7.5％)。
上面指明的YO-RPO-1染料(10μM)、化合物E用三(羟甲基)氨基甲烷盐酸化物(10mM)和乙二胺四乙酸(1mM)缓冲液稀释的方法从在二甲亚砜(1mM)中的贮存溶液制备。缓冲过的溶液加入到反应混合物中以提供1μM的染料浓度。
靶HIV-1 DNA(10个拷贝/μl)样品(200μl)的PCR扩增用Ericomp热循环器(thermal)和下列PCR方案在微管(microfugetubes)(0.5ml)中进行。
1.在95℃下预热15秒以变性，
2.每个循环为：在63.5℃下引发和延伸40秒钟，在95℃下变性15秒钟，
3.在95℃下最终变性60秒钟。
除了DNA聚合酶外，所有试剂均与上述提到的缓冲溶液混合。形成的混和物等分到两个微管(1672μl/管)。将缓冲溶液(220μl)加入到一支不含荧光染料的管(样品A)中。将YO-PRO-1染料贮存溶液(220μl)加入到第二支管(样品B)中，然后将DNA聚合酶(88μl)和靶核苷酸(220μl)加到每个样品中。每个样品中的内含物分成各200μl的10个等分样，放入不同的微管，然后按以上描述的PCR。分别在0、5、10、15、20、25、30、40和45个循环后，打开一个管，然后在稀释后(100μl)反应混合物与3900μl染料溶液混和，浓度为1μM，给出在荧光计比色池中的4ml的最终液体体积)。在商业上购得的Perkin-Elmer LS-5B荧光分光光度计(激发波长491nm，发射波长509nm)上测定那一管内含物的荧光。
这些测定结果显示在附图中，该附图是描绘荧光强度对PCR循环数的曲线图。曲线1代表样品A的结果，在样品A中，开始时不存在染料，但当在特定数量的PCR周期后除去样品时向其中加入了染料。曲线2代表样品B的结果，其中，全部扩增过程中都存在染料。
可以看出，即使存在于扩增过程全过程中，YO-PRO-1染料的存在对PCR并没有不利影响。本底荧光几乎持恒定在7至9个荧光单位直到第30个PCR循环。在这一点，荧光开始增加直到45个PCR循环后达到约20个荧光单位。这明显区别于开始的本底信号。实施例2  比较实施例
将本发明的方法与本发明范围之外的扩增和检测方法进行比较，使用YOYO-1(1μM最终浓度)，一个四价荧光染料，在以上所述的缓冲溶液中进行。该染料具有以下结构式：
扩增使用例如在美国专利5,229,297(Schnipelsky et al)中描述的那些自含化学袋状物中进行。那些袋状物含有捕获探针SEQID NO：5，该探针连接到固定在检测通道中的颗粒上，在检测通道处可发生反应。
袋状物装有如下试剂：
将实施例1的PCR反应混和物(除DNA聚合酶外)制成5472μl体积。将所形成的混和物等分到管A、B和C(各1824μl)中，分别代表样品A、B和C。
管A中的样品用缓冲液(220μl)稀释，在无任何荧光染料的情况下进行扩增。在扩增的终止时加入染料以便对所形成产物的做数量检测。
除了PCR试剂外，在管B中的样品还含有在扩增前就已加入的(220μl 10μM溶液)YOYO-1荧光染料(0.1μM)。
管C中的样品也含有在扩增前就已加入的(220μl 10μM溶液)YO-PRO-1荧光染料(0.1μM)。
然后，将DNA聚合酶(88μl)和靶HIV-1 DNA靶核苷酸(220μl)加到每一管中，三管中每一个的内含物用于填充八个袋状物的PCR试剂间。
采用与实施例1相同的方法进行扩增。PCR方案采用热循环器按以下类似地进行40个循环：
1)在95℃预热变性60秒钟，
2)进行下列每一循环：在63.5℃下引发和延伸40秒钟，在95℃下变性10秒钟。
3)在95℃下最终变性60秒钟。
用三种方法检测扩增的结果：(1)以0分(无信号)到10分(最高信号强度)肉眼估价的颜色染料得分，(2)溴化乙锭染色的电泳凝胶。和(3)在商业上购得的Perkin Elmer荧光计上测得的荧光。
上面提到的颜色得分是使用在袋状物中的固定的捕获探针获得的，用该探针在42℃保温5分钟期间扩增的靶子杂交。固定化的靶子在30℃与共轭物溶液(上面阐明的)接触1分钟。接着在55℃下接触洗液1分钟。在30℃下加入白染料溶液，在30℃保温2分钟后观察形成的颜色信号。
使用商业上可购得的NuSieve 1.5％Seakem Agarose 1％凝胶(改成2.5％琼脂)进行电泳和溴化乙锭染色。样品在常规的TBE缓冲剂(4μl/100μl)中用于凝胶上。
使用每种检测方法对每一样品进行三次重复试验。每一检测方法的平均结果如下：从白染料的颜色得分
         样品                          平均颜色得分
          A                                 5.3
          B                                 0
          C                                 6
这些结果表明，扩增没有因样品C中存在的YO-PRO-1染料而受到不利影响。然而样品B中YOYO-1染料的存在抑制扩增。样品A用作阳性对照。电泳结果
         样品                         阳性/阴性  胶带
          A                           4个带中4个阳性
          B                           5个带中5个阴性
          C                           5个带在5个阳性
这些结果与上面提到的颜色得分相一致，样品A再次用作阳性对照。用于样品B中的YOYO-1染料阻止圹增，而样品C中的YO-PRO-1染料允许扩增进行。
使用Perkin-Elmer LS-5B荧光计产生荧光信号，对两种染料都采用下列波长：
激发                   491nm
发光                   509nm
将每一种扩增产物的混合物稀释100倍，成为每一染料溶液(1μM终浓度)。本底信号从扩增试剂混和物和每一种染料的混和物获得。结果显示如下：荧光结果
            样品                      荧光单位
          本底(YOYO-1)                  0.09
          本底(YO-PRO-1)                0.03
          样品A*                        3.6，3.7，3.4，3.0
样品A**                       7.1，6.6，6.0，6.0
样品B                         1.5，1.5，1.5，1.4，1.4
样品C                         3.7，3.5，3.6，3.2，2.8
*扩增后加入YO-PRO-1
**扩增后加入YOYO-1
这些结果表明，尽管YOYO-1提供高的核苷酸染色，但它在扩增中不能使用，因为它显著地抑制扩增过程。YO-PRO-1给出较低的全面的信号，但它在扩增中可以包括在试剂混和物中。
进行了其它扩增和检测实验，但以上描述的扩增方案进行了下列修改：(a)采用60个循环，(b)在每一循环中增加变性时间至20秒钟，或(c)增加引发/延伸步骤至60秒钟。在这些方案的变化中，仅(a)显示出在YOYO-1存在下产生任何的可检测的差异。所述差异很小，可由荧光检测出，但不能被凝胶电泳或颜色信号检出。实施例3   荧光染料的进一步比较
也进行了类似实施例2中的那些扩增试验，以估价几种其它常用荧光染料染色剂的用处。
在这些实验中，使用了上述描述的引物如SEQ ID NO：3和SEQID NO：4，以及所描述的探针如SEQ ID NO：6。给出颜色得分以证实在给出的实验中发生或不发生扩增。除了所有扩增样品与YOYO-1溶液(0.1μM)混合，以给出普通最低阈值信号外，按实施例2描述的方法检测荧光。
发现在本发明的实际中有用的荧光染料是YO-PRO-1(化合物E)、BO-PRO-1(化合物C)、TO-PRO-1(化合物G)和TO-PRO-3(化合物H)。由于从抑制PCR而无用的染料是YOYO-1(如上阐述)和如下所述的那些：
下列表II列出了这一实施例中进行染料试验的荧光信号和“KC”值。它显示出那些具有20或小于20的“KC”值的染料所给出可接受的荧光信号。
                      表II染料                      荧光信号                “KC”值BO-PRO-1                    19.6                     3.2TO-PRO-3                    15.5                     6.2YO-PRO-1                    16                       8.2TO-PRO-1                    8.32                     20TOTO-3                      8.45*                    25YOYO-1                      2.18                     60TOTO-1                      2.70                     110
*TOTO-3在一个实验中给出高的荧光信号，但它们难获得可重复的结果，而从其它染料得到的结果是可重复的，因此，相信TOTO-3的所提到的值是低的。
在特别地参考了其优选的实施例的情况下本发明得到了详细描述。但须明白，变化或修改可能落在本发明的精神和范围内。
                         序列表(1)一般资料(i)申请人JOHN W.H.SUTHERLAND
                DAVID R.PATTERSON(ii)使用荧光染料和试剂盒试验检测双链核苷酸的同相方法(iii)序列数6(iv)通讯地址(A)收件人：Eastman Kodak Company
         Patent Legal Staff(B)街：    343 State street(C)城市：  Rochester(D)州：    New york(E)国家：  U.S.A.(F)ZIP：   14650-2201(v)  计算机可读形式：(A)媒介类型：Diskette，3.5英寸，
           1.44 MB storage(IBM)(B)计算机：  IBM PS/2(C)操作系统：MS-DOS Version 3.3(D)软件：    PC-8(Word for Windows 2.0)(vi)目前的申请资料：(A)申请号：待指定(B)申请日：待指定(C)分类号：待指定(vii)在先申请资料：无(viii)代理人/代理机构信息：(A)姓名：Tucker，J.Lanny
(B)登记号：27,678
(C)参考/摘要号：69807(ix)  电讯信息：
(A)电话：(716)722-9332
(B)传真：(716)477-4646(2)SEQ ID NO：1的资料：(i)  序列特点
(A)长度：28个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链数：单
(D)拓扑结构：线性(ii)  分子类型：用于HIV-1 DNA的引物，(iii)假拟的：无(iv)反义：无(vi)有机体来源：合成法制备(vii)立即来源：相同(x)  出版信息：US-A-5,147,777(xi) 序列描述：SEQ ID NO：1
   5′-ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAAT-3′(3)SEQ ID NO：2的资料：(i)  序列特点：
(A)长度：28个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链数：单
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：HIV-1 DNA的引物(iii)假拟的：无(iv)反义：无(vi)有机体来源：合成法制备(vii)立即来源：相同(x)  出版信息：US-A-5,147,777(xi) 序列描述：SEQ ID NO：2
5′-TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC-3′(4)SEQ ID NO：3的资料：(i)  序列特点：
(A)长度：28个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链数：单
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：HIV-1 DNA引物(iii)假拟的：无(iv)反义：无(vi)有机体来源：合成法制备(vii)立即来源：相同(x)  出版信息：未知(xi)  序列描述：SEQ ID NO：3
5′-AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAA-3′(5)SEQ ID NO：4的资料：(i)  序列特点：(A)长度：30个核苷酸(B)类型：核酸(C)链数：单(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：HIV-1 DNA引物(iii)假拟的：无(iv)反义：无(vi)有机体来源：合成法制备(vii)立即来源：相同(x)  出版信息：未知(xi) 序列描述：SEQ ID NO：4
5′-CCTGCTATGT CACTTCCCCT TGGTTCTCTC-3′(6)SEQ ID NO：5的资料：(i)  序列特点：
(A)长度：41个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)股数：单
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：HIV-I DNA探针(iii)假拟的：无(iv)反义：无(vi)有机体来源：合成法制备(vii)立即来源：相同(x)  出版信息：US-A-5,147,777(xi) 序列描述：SEQ ID NO：5
5′-ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C-3′(7)SEQ ID NO：6的资料：(i)  序列特点：
(A)长度：28个核苷酸
(B)类型：核酸
(C)链数：单
(D)拓扑结构：线性(ii)分子类别：HIV-1 DNA探针(iii)假拟的：无(iv)反义：无(vi)有机体来源：合成法制备(vii)立即来源：相同(x)  出版信息：未知(xi) 序列描述：SEQ ID NO：6
5′-GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAGAAT-3′

Claims (20)

1.一种检测双链靶核酸的同相方法，包括以下步骤：
(A)扩增双链靶核酸，
(B)使所形成的扩增过的双链靶核酸与荧光染料接触，当所述染料结合到所述双链靶核酸上时，与其结合到所述双链靶核酸的单链上产生的信号或者染料在其自由状态下产生的信号相比较，能显示出可检测的信号，和
(C)检测或监测所述可检测的信号，以测定所述双链靶核酸的存在或数量，
其中，所述荧光染料是不对称花青染料，具有大约为20或更小的KC值，其中“大约”是指10％的变化，与双链核酸的结合常数(Kb)从约1×104至5×105(摩尔浓度-1)，具有结构式I所代表的结构：其中X是-S-、-O-、-Se-、＝CH-或-NR1-Y是-CH＝CH-，
R是1至6个碳原子的烷基，
R1是氢或1至6个碳原子的烷基，
R2和R6分别是1至10个碳原子的亚烷基，
R3、R4和R5分别是1到6个碳原子的烷基，
Z1包括构成5或6员杂环必需的碳原子和杂原子，
Z2包括构成5或6员芳环必需的碳原子和杂原子，
Q是酸阴离子，
n是0、1或2，
m、p和q分别是0或1，条件是p和q不相同，
r是1或2，和
t是0、1或2，
其中所述的检测或监测在所述扩增过的双链靶核酸不与捕获探针杂交的情况下进行。
2.权利要求1的方法，其中X是-S-或-O-，R是1到3个碳原子的烷基、R1是氢或1到3个碳原子的烷基、R2是1到4个碳原子的亚烷基、R3、R4和R5分别是1到3个碳原子的烷基，Z1包括构成苯并噁唑鎓或苯并噻唑鎓环必需的碳原子，Z2包括构成苯并环必需的碳原子，n是0或1，t是0或1，并且p和q中至少1个但非两者都是1。
3.权利要求2的方法，其中R是甲基或乙基，R2是3个碳原子的亚烷基，R3、R4和R5每一个都是甲基，p是0、q是1，且t是0。
4.权利要求1的方法，其中所说的荧光染料是化合物A、B、C、D、E、F、G或H：化合物A：化合物B：化合物C：化合物D：
Figure C9510651500044
化合物E：
Figure C9510651500051
化合物F：化合物G：化合物H：
5.权利要求1的方法，其中所说的扩增步骤A)采用聚合酶链反应进行。
6.一种检测双链靶核酸扩增的方法，包括以下步骤：
(A)在荧光染料存在下扩增双链核酸，当所述染料结合到所述双链靶核酸上时，与其结合到所述双链靶核酸单链上产生的信号或者染料在其自由状态下产生的信号两者比较，能显示出可检测的信号，和
(B)检测或监测所述可检测的信号，以测定所述双链靶核酸的存在或数量，
其中，所述荧光染料是不对称花青染料，具有大约为20或更小的KC值，其中“大约”是指10％的变化，与双链核酸的结合常数(Kb)从约1×104至5×105(摩尔浓度-1)，具有结构式I所代表的结构：
其中X是-S-、-O-、-Se-、＝CH-或-NR1-
Y是-CH＝CH-，
R是1到6个碳原子的烷基，
R1是氢或1到6个碳原子的烷基，
R2和R6分别是1到10个碳原子的亚烷基，
R3、R4和R5分别是1到6个碳原子的烷基，
Z1包括构成5或6员杂环必需的碳原子和杂原子。
Z2包括构成5或6员芳环必需的碳原子和杂原子，
Q是酸阴离子，
n是0、1或2，
m、p和q分别是0或1，条件是p和q不相同，
r是1或2，和
t是0、1或2，
其中所述的检测或监测在所述扩增过的双股靶核酸不与捕获探针杂交的情况下进行。
7.权利要求6的方法，其中X是-S-或-O-，R是1到3个碳原子的烷基、R1是氢或1到3个碳原子的烷基、R2是1到4个碳原子的亚烷基、R3、R4和R5分别是1到3个碳原子的烷基，Z1包括构成苯并噁唑鎓或苯并噻唑鎓环必需的碳原子，Z2包括构成苯并环必需的碳原子，n是0或1，t是0或1，并且p和q中至少一个但非两者都是1。
8.权利要求7的方法，其中R是甲基或乙基，R2是3个碳原子的亚烷基，R3、R4和R5每一个都是甲基，p是0，q是1，且t是0。
9.权利要求6的方法，其中所说的荧光染料是化合物A、B、C、D、E、F、G或H：化合物A：
Figure C9510651500081
化合物B：化合物C：
Figure C9510651500083
化合物D：化合物E：化合物F：化合物G：
Figure C9510651500093
化合物H：
Figure C9510651500094
10.权利要求6的方法，其中所说的扩增步骤A)采用聚合酶链反应进行。
11.权利要求6的方法，其中所说的荧光染料以至少约10-9M的浓度存在。
12.权利要求6的方法，其中所说的可检测信号是发光强度的增加。
13.一种双链靶核酸同相扩增和检测的试验试剂盒，在同一个或分离的包装中含有：
1)一种荧光染料，当所述染料结合到所述双链靶核酸上时，与其结合到所述双链靶核酸的单链上产生的信号或者染料在其自由状态下产生的信号两者比较，能显示出可检测的信号，
其中所述荧光染料是不对称花青染料，具有大约为20或更小的KC值，其中“大约”是指10％的变化，与双链核酸的结合常数(Kb)从约1×104到5×105(摩尔浓度-1)，具有结构式(I)所代表的结构：
Figure C9510651500101
其中X是-S-、-O-、-Se-、＝CH-或-NR1-，
Y是-CH＝CH-
R是1到6个碳原子的烷基，
R1是氢或1到6个碳原子的烷基，
R2和R6分别是1到10个碳原子的亚烷基，
R3、R4和R5分别是1到6个碳原子的烷基，
Z1包括构成5或6员杂环必需的碳原子和杂原子，
Z2包括构成5或6员芳环必需的碳原子和杂原子，
Q是酸阴离子，
n是0、1或2，
m、p和q分别是0或1，条件是p和q不相同，
r是1或2，和
t是0、1或2，和
2)至少一种扩增试剂。
14.权利要求13的试验试剂盒，其中所说的扩增试剂是PCR试剂，所说的PCR试剂和所说的荧光染料在同一包装中。
15.权利要求14的试验试剂盒，其中所说的PCR试剂是一种靶核苷酸引物、一种热稳定性的DNA聚合酶、一种dNTP或一种DNA聚合酶辅因子。
16.权利要求15的试验试剂盒，其中所有所说的PCR试剂在同一种缓冲反应混合物中。
17.权利要求15的试验试剂盒，还含有用于进行靶核酸扩增和检测的反应容器。
18.权利要求15的试验试剂盒，其中X是-S-或-O-，R是1到3个碳原子的烷基，R1是氢或1到3个碳原子的烷基，R2是1到4个碳原子的亚烷基，R3、R4和R5分别是1到3个碳原子的烷基，Z1包括构成苯并噁唑鎓或苯并噻唑鎓环必需的碳原子，Z2包括构成苯并环必需的碳原子，n是0或1，t是0或1，并且p和q中至少一个但非两者都是1。
19.权利要求18的试验试剂盒，其中R是甲基或乙基，R2是3个碳原子的亚烷基，R3、R4和R5每一个都是甲基，p是0，q是1，且t是0。
20，权利要求15的试验试剂盒，其中所说的荧光染料是化合物A、B、C、D、E、F、G或H：
化合物A：
Figure C9510651500121
化合物B：
化合物C：
Figure C9510651500123
化合物D：化合物E：化合物F：
Figure C9510651500133
化合物G：化合物H：
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