CN1282741C - 核酸扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了由化学修饰而可逆失活的热稳定性酶,其特征在于,该化学修饰的热稳定性酶在温度低于约25℃时呈碱性pH的缓中水液中温育,导致酶活性在少于约20分钟内酶活性无明显增加,且其中所说的化学修饰的酶在配成25℃下约pH 8-9的缓冲水液中在大于约50℃的温度下温育,导致酶活性在少于约20分钟内酶活性至少增加两倍。该化学修饰的热稳定性酶可以用于扩增核酸,该失活酶的活性通过在扩增反应前或作为扩增反应的部分在增高的温度下温育反应混合物而恢复。
Description
本发明一般地说涉及核酸化学领域,更具体地说,涉及扩增核酸序列的方法和减少非特异性扩增的方法。
扩增核酸序列的聚合酶链反应(PCR)是本领域熟知的,并公开于美国专利U.S.4,683,202;4,683,195和4,965,188中。生产商如Perkin Elmer,Norwalk,CT,出售PCR试剂并公开其PCR方案。
在PCR扩增的每次循环中,一双链靶序列被变性,引物退火于变性靶序列的每条链上,并且引物通过DNA聚合酶的作用而延伸。扩增的特异性决于引物杂交的特异性。选用与存在于靶核酸序列每一链的3′末端上的序列互补或基本上互补的引物。在用于典型PCR的高温度下,引物只与期望的靶序列杂交。然而,典型地是在室温下装配扩增反应混合物,大大低于需要确保引物杂交特异性的温度。在这种较不严紧的条件下,引物可能非特异性地结合于其它只部分互补的核酸序列(或者甚至结合于其它引物)并起始非所需延伸产物的合成,该产物可以与靶序列一起扩增。非特异性引物延伸产物的扩增可以与所需靶序列的扩增竞争,并且可以明显降低所需序列的扩增效力。由非特异性扩增引起的问题在Chou et al.,1992,Nuclei Acids Research20(7):1717-1723中作了进一步的讨论。
非特异性扩增可以通过减少由反应开始前结合于非靶序列的引物形成的延伸产物而减少。在一种称作“热起始”方案的方法中,从反应混合物中减除一或多种关键性试剂,直至温度升至足以提供需要的杂交特异性。在这种方式中,在反应条件不能确保特异性引物杂交的时期,反应混合物不能支持引物延伸。
热起始法可以通过在起始高温温育步骤之后,打开反应试管,加入缺失试剂而手工进行。然而,手工热起始法是费工的且增加污染反应混合物的危险。采用热易变性材料如蜡来分离或隔绝反应组分的热起始法描述于美国专利U.S.5,411,876和Chou等1992同上的文献中。在这些方法中,高温预反应温育熔融热易变性材料,由此让试剂混合。
其它的减少由反应开始前结合于非靶序列的引物形成延伸产物的方法依赖于采用一种热可逆性方式非共价结合于DNA聚合酶的化合物来抑制DNA聚合酶。美国专利U.S.5,338,671描述了应用对热稳定DNA聚合酶有特异性的抗体来抑制DNA聚合酶活性。这些抗体必须在装配反应混合物前在室温下缓冲液中与DNA聚合酶一起温育,以使形成抗体-DNA聚合物复合物。抗体抑制DNA聚合酶的活性由高温预反应温育使其失活。此方法的缺点是生产对DNA聚合酶有特异性的抗体是昂贵和费时的,特别是大量生产时。再则,向反应混合物加入抗体可能需要重新设计扩增反应。
扩增产物的形成也可以由添加以热可逆方式非共价结合于引物的化合物来抑制,由此防止引物杂交于任何序列。靶序列或其它。例如,加入反应混合物的单链结合蛋白会结合引物,由此防止引物杂交和抑制引物延伸。采用基因32蛋白改善PCR产物产率的方法描述于Schwarz et al.,1990,NucleicAcids Research 18(4):10中。
非特异扩增可以通过降解由反应开始前结合于非靶序列的引物形成的延伸产物而减少。如采用描述于U.S.5,418,149和WO 92/01814中的方法。降解新合成的延伸产物可以通过掺入反应混合物dUTP和UNG,并在进行扩增反应前在45-60℃下温育反应混合物而取得。此方法的缺点是延伸产物的降解和延伸产物的形成竞争,非特异性引物延伸产物的消除很可能是较不完全的。
本领域熟练技术人员所掌握的分子生物学、蛋白质化学和核酸化学的常规技术在文献中作了充分的阐述。参见例如,Molecular Cloning-ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NewYork(Sambrook et al.,1989);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984);Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames and S.J.Higgins,eds.,1984);ChemicalReagents for Protein Modification(CRC Press);和系列丛书,Methods inEnzymology(Academic Press,Inc.)。上下文中提到的所有专利、专利申请和公开文献均引入本文,一并作为参考。
本发明提供了采用基于引物的扩增反应来扩增核酸的方法和试剂,如本文所附的权利要求所限定的。这些方法和试剂提供了解决非特异性扩增问题的简单和经济的手段。这些方法采用一种可逆失活的热稳定性酶,它可以通过在提高的温度下在扩增反应混合物中温育而再活化。由于反应混合物直到反应混合物的温度提高到确保引物杂交特异性时才支持引物延伸,因此非特异性扩增被极大地减少了。
本发明的一个方面涉及可逆失活的热稳定性酶,该酶由催化引物延伸反应的热稳定性酶和修饰试剂间的反应而产生。该反应导致酶活性明显,优选基本上完全降低。在碱性pH缓冲水液中在低于约25℃的温度下温育该修饰过的酶,在少于约20分钟时内酶活性基本上没有增加。在配制成25℃下pH8-9的缓冲水液中在大于约50℃的温度下温育该修饰过的酶,导致在少于约20分钟时引物延伸活性至少增加两倍。本发明的可逆失活的热稳定性酶,在其活性状态,或是催化引物延伸,或是发生引物延伸所必需的。优选的酶包括热稳定性的DNA聚合酶和连接酶。
优选的修饰试剂是下列通式的二羧酸酐:
其中R1和R2是氢或有机基,它们可以相连,或者是下列通式的二羧酸酐:
其中R1和R2是有机基,它们可以相连,且氢是顺式的。有机基可以通过碳-碳键或经碳-杂原子键如碳-氧、碳-氮、碳-硫键直接与环相连。有机基也可以相互连接而形成环结构,如在例如3,4,5,6-四氢邻苯二甲酸酐中。
优选的试剂包括马来酐;取代的马来酐如柠康酐,顺式乌头酐,和2,3-二甲基马来酐,外-顺式-3,6-内氧代-Δ4-四氢邻苯二甲酸酐;和3,4,5,6-四氢邻苯二甲酸酐。特别是优选使用柠康酐和顺式乌头酐来制备用于PCR扩增中可逆失活的DNA聚合酶。
本发明的另一方面涉及用本发明可逆失活的热稳定性酶进行核酸扩增反应的方法。本发明提供了扩增样品中所含靶核酸的方法,包含如下步骤:
a)使样品与含有互补于靶核酸的引物和修饰过的热稳定性酶的扩增反应混合物接触,其中该修饰过的热稳定性酶由催化引物延伸反应的热稳定性酶和修饰试剂的混合物反应而产生,其中反应是在低于约25℃的温度下在碱性pH下进行的,该反应导致对酶的化学修饰,它使酶活性基本上完全失活,且其中该修饰过的酶在配制成25℃下pH8-9的缓冲水液中在大于约50℃的温度下温育,导致在少于约20分钟内酶活性至少增加两倍;和
b)在大于约50℃的温度下,温育步骤(a)所得的混合物一段足以再活化此酶且使引物延伸产物形成的时间。
作为优选的方法,本发明提供了扩增样品中所含的靶核酸的方法,包含:
a)使样品与含有互补于靶核酸的引物和修饰过的热稳定性酶的扩增反应混合物接触,其中该修饰过的热稳定性酶是通过热稳定性酶和下列通式的二羧酸酐的混合物反应而产生,该反应导致酶活性基本上完全失活;
其中R1和R2是氢或有机基,它们可以相连,或者
其中R1和R2是有机基,它们可以相连,且氢是顺式;和
b)在大于约50℃的温度下,温育步骤(a)所得的混合物一段足以再活化此酶且使引物延伸产物形成的时间。
这些方法的优选实施方案采用用优选修饰试剂修饰过的可逆地被修饰的酶。在本发明的一些实施方案中,温育步骤-步骤(b)是在扩增反应开始前进行的。在另一些实施方案中,导致酶再活化的温育是扩增方法中的一个完整步骤。例如,在每一PCR循环中进行的变性步骤可以同时有再活化修饰过的DNA聚合酶的功能。
在本发明的优选实施方案中,扩增反应是聚合酶链反应(PCR),且采用可逆失活的热稳定性DNA聚合酶。在进行扩增反应前,在高于扩增反应退火温度的温度下温育反应混合物。由此,DNA聚合酶在直至高于确保扩增反应特异性的温度之前是失活的,因此减少了非特异性扩增。
本发明的另一方面涉及扩增反应混合物,这些混合物含有与进行扩增反应的试剂在一起的本发明可逆失活的热稳定性酶。在优选实施方案中,扩增反应混合物含有进行PCR的核苷酸引物。
本发明的另一方面涉及包含本发明可逆失活的热稳定性酶和一或多种扩增试剂的试剂盒。
图1显示柠康酐、顺式乌头酐和2,3-二甲基马来酐的结构,以及柠康酐和赖氨酸间的反应。
图2显示如实施例4所描述的采用柠康酰化的Taq DNA聚合酶进行扩增反应的结果。
图3显示如实施例6所描述的采用柠康酰化的DNA聚合酶进行扩增反应的结果。
图4显示如实施例9所描述的采用柠康酰化和顺式一乌头酰化的DNA聚合酶进行扩增时变化预反应温育时间的结果。
图5显示如实施例10所描述的采用柠康酰化和顺式一乌头酰化的DNA聚合酶进行扩增时变化扩增循环次数的结果。
为了帮助理解本发明,下文中对几个术语作了定义。
术语“核酸”和“寡核苷酸”是指要检测的引物、探针和寡聚物片断,且应当属于聚脱氧核糖核苷酸(含2-脱氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含D-核糖)和任何其它类型的嘌呤或嘧啶碱基或者修饰过的嘌呤或嘧啶碱基N糖苷的聚核苷酸。术语“核酸”和“寡核苷酸”所指长度上并无有意的区分,且这些术语可相互交换使用。这些术语只是指分子的一级结构。因而,这些术语包括双链和单链DNA,以及双链和单链RNA。寡核苷酸可以通过任何适合的方法制备。合成方法的综述提供于Goodchild,1990,BioconjugateChemistry
1(3):165-187。
术语“杂交”是指两条单链核酸由于互补碱基配对而形成的双链体结构。杂交可以在完全互补的核酸链间或含少量不匹配区域的“基本上互补”的核酸链间进行。只有完全互补的核酸链才能杂交的条件称作“严紧杂交条件”或“序列特异性杂交条件”。基本上互补序列的稳定双链体可以在较不严紧的杂交条件下获得。核酸技术领域的熟练技术人员经验性地根据一些参数包括例如寡核苷酸的长度和碱基对浓度、离子强度和不匹配碱基对的发生率,按照现有技术提供的指导(参见例如Sambrook等,1989,同上),可以确定双链体的稳定性。
通常,严紧杂交条件选择为在特定离子强度和pH下,低于特异性序列的热熔融点(Tm)约0.5℃。Tm是50%碱基对解离的温度(在限定的离子强度和pH下)。杂交条件严紧度的放松会使序列不匹配可被忍受;可忍受的不匹配程度可以由杂交条件的适当调节来控制。
术语“引物”是指寡核苷酸,无论是天然的或合成的,只要它能够在诱导合成互补于核酸链的引物延伸产物的条件下,即在适宜的缓冲液中和在适合的温度下有四种不同核苷三磷酸和聚酶(即DNA聚合酶或逆转录酶)存在的条件下,可作为DNA合成的起始点。寡核苷酸类似物,如“肽核酸”,可以作为引物并包含于本文所用的术语“引物”的含义内。引物优选是单链寡脱氧核糖核苷酸。引物的适宜长度取决于想要的引物用途,但典型地是6至50个核苷酸的范围。短引物分子通常需要较冷的温度以形成与模板足够稳定杂交的复合体。引物不需要反映模板核酸的确切序列,但必需充分互补以使之与模板杂交。
本文中所用的术语“引物延伸”是指采用引物作起始点聚合单个核苷三磷酸而导致DNA合成,和指将附加的寡核苷酸与引物连接以延伸引物。如本文中所采用的,术语“引物延伸”旨在包含两个寡核苷酸连接以形成一更长的可作为以后的扩增循环的靶的产物。如本文中所采用的,术语“引物”旨在包含用于连接介导的扩增方法中的通过在邻近位置杂交连接第二个寡核苷酸而延伸的寡核苷酸。
引物可以掺有附加的特征,这些特征可用来检测或固定引物,但不改变引物的基本性质即作为DNA合成起始点的性质。例如,引物在5′末端可以含有不与靶核酸杂交的附加核酸序列,但它有利于扩增产物的克隆。充分与杂交模板互补的引物区域在本文中称作杂交区。
术语“靶区”和“靶核酸”是指待扩增的核酸区域或亚序列。引物杂交位点可以称作为引物杂交的靶区。
如本文中所采用的,如果存在于寡核苷酸和靶序列间的不匹配数目少于存在于寡核苷酸和可能存在于样品中的非靶序列间的不匹配数目,则该寡核苷酸引物对靶序列是“特异性”的。只有当存在的不匹配数目不多于存在于寡核苷酸和靶序列间的不匹配数时,才可以在形成稳定双链体的条件下选择杂交条件。在这些条件下,寡核苷酸只能与靶序列形成稳定双链体。因此,在合适的严紧扩增条件下使用靶特异性引物确保了含有靶引物结合位点的那些靶序列的特异性扩增。采用序列特异性扩增条件确保了含有确切互补引物结合位点的那些靶序列的特异性扩增。
术语“非特异性扩增”是指非靶序列的核酸序列的扩增,它是由于引物与非靶序列的序列杂交,然后作为引物延伸的底物而致。引物与非靶序列的杂交称作“非特异性杂交”,且可以出现于较低温度,较低严紧度的预反应条件中。
术语“热稳定性酶”是指对热相对稳定的酶。热稳定性酶可以耐受用于除去修饰剂基团的高温温育,典型地高于50℃,而不会遭受不可逆的活性损失。可用于本发明方法的修饰过的热稳定性酶包括热稳定性的DNA聚合酶和热稳定性的连接酶。
术语“热稳定性DNA聚合酶”是指对热相对稳定的且催化核苷三磷酸聚合以形成与靶序列核酸链之一互补的引物延伸产物的酶。该酶在引物3′末端起始合成并朝向模板5′末端进行直至合成结束。纯化的热稳定性DNA聚合酶描述于U.S 4,889,818;U.S.5,352,600;U.S.5,079,352;WO 91/09950;WO 92/03556;WO 92/06200;WO 92/06202;U.S.5,491,086;WO 92/09689和U.S.5,210,036中。
本文中从生物体“衍生”的酶是指从生物体纯化的酶或从生物体纯化的酶的重组体,且包括其中氨基酸序列业已采用分子生物学技术修饰过的酶。
本文所采用的术语“可逆失活”,是指通过与导致酶共价修饰(也称作化学修饰)的化合物反应而已被失活的酶,其中该修饰化合物在适宜条件下是可除去的。导致除去修饰剂化合物的反应不必是修饰反应的逆转。只要有一种反应可去除修饰化合物和恢复酶功能,则该酶就被认为是可逆失活。
术语“反应混合物”是指含有需要进行给定反应的试剂的溶液。“扩增反应混合物”,是指含有需要进行扩增反应试剂的溶液,典型地含有于合适缓冲液中的寡核苷酸引物和DNA聚合酶或连接酶。“PCR反应混合物”典型地含有于合适缓冲液中的寡核苷酸引物、热稳定性DNA聚合酶、dNTP和二型地含有于合适缓冲液中的寡核苷酸引物、热稳定性DNA聚合酶、dNTP和二价金属阳离子。如果反应混合物含有需要确保反应的所有试剂,则称之为完全反应混合物,如果它只含有一部分需要的试剂,则称之为不完全反应混合物。本领域熟练技术人员可以理解,反应组分通常是分开的贮藏溶液,它们分别含有总组分的一个部分,为的是方便、贮藏稳定性的原因,且可允许依据应用独立调节各组分的浓度,且另外,这些反应组分在反应前进行组合,以形成完全反应混合物。
本发明的方法涉及采用热激活热稳定性酶进行的扩增反应,其中需要该活性酶进行引物延伸。在激活该酶的高温温育前,扩增反应混合物不支持引物延伸且无非特异性或其它延伸产物形成。在激活该酶的高温温育之后,扩增反应保持在确保反应特异性的提高温度下。因此,反应延伸产物只在确保扩增特异性的条件下形成。
在本发明的方法中,该热激活酶,在其活性状态时,催化引物延伸反应。在用于典型扩增反应时,例如PCR中,该热激活热稳定性酶在其活性状态具有DNA聚合酶活性。在用于连接酶介导的扩增体系时,该热激活热稳定性酶在其活性状态具有DNA连接酶活性。
在连接酶介导扩增体系中,“延伸产物”是通过将第一寡核苷酸(本文包含于术语“引物”中)与第一寡核苷酸3′末端附近部分杂交的第二寡核苷酸连接。该第二寡核苷酸可能紧接着引物的相邻部分杂交,在这种情况下只需连接,或可能在离引物一或多个碱基对远处杂交,在这种情况下,在连接前需要聚合酶活性延伸引物。在两种情况下,与靶DNA相邻区域杂交的两个寡核苷酸的连接在本文中均包含于术语“引物延伸”中。
本发明的可逆性失活热稳定性酶由酶和修饰试剂间的反应而产生,该反应导致该酶的可逆的化学修饰,导致酶活性全部丧失或几乎全部丧失。修饰是由修饰基团与该蛋白质共价相连形成的。选用的修饰化合物可使该修饰在提高的温度下在扩增反应缓冲液中温育而逆转。合适的酶和修饰基团描述于下文。
在活性状态下具有DNA聚合酶活性的可逆性失活酶是从热稳定性DNA聚合酶制备的。可用于扩增反应的热稳定性DNA聚合酶是本领域所熟知的,且可以由许多来源制备,如来自栖热菌属(Thermus)、栖热袍菌属(Thermotoga)、热球菌属(Thermococcus)、热网菌属(Pyrodictium)、火球菌属(Pyrococcus)和栖热腔菌属(Thermosipho)菌种的嗜热真细菌或古细菌。已从其中得到用于PCR扩增的热稳定性DNA聚合酶的代表性菌种包括水生栖热菌(Thermus aquaticus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum)、Pyrodictiumabyssi和非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)。热稳定性DNA聚合酶描述于U.S.4,889,818;U.S.5,352,600;U.S.5,079,352;WO 91/09950;WO92/03556;WO 92/06200;WO 92/06202;U.S.5,491,086;WO 92/09689和U.S.5,210,036中。热稳定性DNA聚合酶可从Perkin Elmer,Norwalk,CT购得。
适合于其它扩增方法如连接酶介导扩增的可逆失活热稳定性酶,可由描述于下列引述的描述各种扩增方法的参考文献中的热稳定性酶来制备。
本发明的方法不限于使用例举的酶。例如,任何描述于文献中的用于扩增反应的热稳定性DNA聚合酶都可以按本文所述加以修饰而产生适于用在本发明方法中的可逆失活酶。通常,任何酶只要它催化引物延伸,或出现引物延伸所需要的,且有足以耐受再活化温育的高温而不变成不可逆失活的热稳定性,且可以按本文所述的加以修饰而产生可逆失活酶,均可以用于本发明的方法。依据本发明的指引,本领域熟练技术人员将能够对任何给定的酶优化出修饰反应和扩增反应条件。
在本发明优选实施方案中,热稳定性酶的可逆失活通过由化学修饰赖氨酸残基的ε-氨基可逆封闭赖氨酸残基而进行。修饰在蛋白质的活性区上的赖氨酸导致蛋白质失活。此外,修饰在活性区外的赖酸会通过立体相互作用或构型变化而对蛋白失活起作用。文献中业已对与氨基基团以可逆方式反应的许多化合物作了描述。例如,氨基基团有以下可逆修饰:三氟乙酰化(参见Goldberger and Anfinsen,1962,Bichemistry 1:410),脒化(参见Hunter and Ludwig,1962,J.Amer.Chem.Soc.84:3491),马来酰化(参见Bulteret al.1967,Biochem.J.103:78),乙酰乙酰化(参见Marzotto et al.,1967.Biochem.Biophys.Res.Commun.26:517和Marzotto et al.,1968,BiochemBiophys.Acta 154:450),四氟琥珀酰化(参见Braunitzer et al.,1968,Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem.349:265),和柠康酰化(参见Dixon and Perham,1968,Biochem.J.109:312-314;和Habeeb and Atassi,1970,Biochemistry9(25):4939-4944)。
其中R1和R2是氢或有机基,它们可以相连,或
其中R1和R2是有机基,它们可以相连,且氢是顺式。有机基可以通过碳-碳键或经碳-杂原子键如碳-氧、碳-氮或碳-硫键直接与环连接。有机基也可以相互连接以形成环结构,如在例如3,4,5,6-四氢邻苯二甲酸酐中。
二羧酸酐与蛋白质的氨基基团反应,得到相应的酰化产物,如图1中所示的柠康酐。人们相信上述二羧酸酐的可逆性由顺式碳-碳双键或顺式氢的存在而提高,顺式构型保持空间取向上的酰化残基的末端羧基适于与酰胺基相互作用,且随后去酰化。酰化和去酰反应的可能机理描述参见Palacian et al.,1990,Mol.Cell.Biochem.97:101-111。其它取代基可相似地限制酰化产物中的酰基部分的2,3键旋转,且预期这些化合物在本发明方法中有功用。
优选试剂的实例包括马来酐;取代的马来酐如柠康酐、顺式乌头酐和2,3-二甲基马来酐;外-顺式-3,6-内氧代-Δ4-四氢邻苯二甲酸酐;和3,4,5,6-四氢邻苯二甲酸酐。这些试剂可从例如Aldrich Chemical Co.(Milwaukee,WI),Sigma Chemical Co.(St.Louis,MO)或Spectrum Chemical Mfg.Corp(Gardena,CA)购得。采用取代的马来酐试剂柠康酐和顺式乌头酐修饰热稳定性DNA聚合酶在实施例中作了描述。
采用上述试剂酰化的氨基基团的相对稳定性以下列顺序降低:马来酐;外-顺式-3,6-内氧代-Δ4-四氢邻苯二甲酸酐;柠康酐;3,4,5,6-四氢邻苯二甲酸酐;顺式乌头酸酐;和2,3-二甲基马来酸酐(参见Palacian等,同上)。如实施例中描述的,用具体试剂修饰的酶的最适激活温育条件可通过实验确定。
美国专利5,262,525描述了化学修饰蛋白质的方法,这些方法采用了由马来酐和一种二烯烃的狄尔斯-阿德耳反应制备的二羧酸酐化合物。描述于U.S.5,262,525中的具有本文特定的稳定性的化合物可能适于本发明。
本发明的方法不限于列举的修饰化合物或者通过化学修饰赖氨酸残基而修饰蛋白质。文献中描述的可与蛋白质反应而引起酶活性全部或几乎全部可逆丧失的任何化合物均适于制备可逆失活酶,其中该修饰是通过在提高的温度下在扩增反应缓冲液中温育而可逆。当可逆修饰蛋白质的新的化合物出现时,这些化合物也将适用于本发明的方法。由此,制备本发明的经修饰的热稳定性酶的化合物包括满足下列性能的化合物:
1)与催化引物延伸的热稳定性酶反应,导致酶明显失活;
1)在室温或低于室温(25℃)的温度下约pH8-9的缓冲水液中温育所得的修饰过的酶,导致在少于约20分钟的时间内酶活性无明显增加;且
3)将所得的修饰过的热稳定性酶,在室温下配制的约pH8-9的扩增反应缓冲液中,在高于约50℃的增高的温度下温育,导致在少于约20分钟的时间内酶活性至少增加两倍。
具体的修饰化合物的适用性可以按照本文提供的指引用常规实验确定。测定上述性能、由修饰蛋白质所致的酶活性的衰减程度和随后在提高的温度下在扩增反应混合物中温育后酶活性恢复程度的实验方法,描述于实施例中。
可逆失活热稳定性酶的制备
蛋白质上的赖氨酸残基化学修饰是以此残基的ε-氨基作为亲核反应的能力为基础的。此非质子化氨基是反应体,它在碱性pH下是有利的。修饰反应是在pH8.0至9.0的缓冲水液中在室温或低于室温(25℃)的温度下进行的。温育12-24小时后,反应基本完成。适合的反应条件是本领域所熟知的并在实施例中作了进一步的描述。
二羧酸酐易与水反应得到相应的酸。因此,大部分试剂在修饰蛋白质氨基基团期间水解。水解的速率随pH而增加。水解增加出现在pH约大于9时,可以导致蛋白质的亚优化酰化。
通常,在酰化反应中所用的修饰试剂摩尔数相对于蛋白质的要过剩。修饰试剂对酶的最佳摩尔比率取决于所用的试剂且可通过实验确定。例如,Taq DNA聚合酶通过与20倍或更多摩尔剩余量的柠康酐反应而基本上完全失活(<原活性的5%)。如实施例中所描述的导致酶基本上完全失活的修饰剂的最小摩尔比率可以通过与系列稀释的修饰剂试剂进行失活反应来测定。
在本发明的方法中,酶完全失活不是必需的,只要酶明显失活即可。如本文所采用的,如果与修饰剂反应后,酶活性少于原活性的约50%,则酶明显失活。非特异性扩增的降低可以采用明显失活的酶来获得。按照本文提供的指引,反应中的修饰剂与酶的摩尔比可以通过实验选择以使酶基本上完全失活或是明显失活。适合的摩尔比提供于实施例中。未例举的使酶失活的合适反应条件可按照本文给出的指引通过常规实验来确定。
本发明热失活酶的一个重要方面是其贮藏稳定性。通常,描述于本文中化合物在一段较长的时期内是稳定的,这便消除了在每次使用前即刻制备的需要。例如,发现柠康酰化的Taq DNA聚合酶在保存于25℃下至少四周保持失活。推荐的贮藏条件随所用的修饰剂而变化,但通常失活酶制剂应当贮存在室温或低于室温(25℃),优选冷藏保存。特别是,较不稳定的修饰过的酶,如用2,3-二甲基马来酐修饰的那些酶,应当冷藏保存。
本发明的方法涉及含有可逆失活热稳定性酶的反应混合物的应用和将此反应混合物在扩增反应前或作为扩增反应的一个完整部分进行高温温育。高温温育导致氨基基团去酰化并恢复酶活性。
修饰过的氨基基团去酰化是温度增加和同时发生的pH降低两者的结果。典型的扩增反应是在室温下配制成pH为8.0-9.0的Tris-HCl缓冲液中进行的。在室温下,碱性反应缓冲液条件有利于氨基基团的酰化形式。虽然反应缓冲液的pH调节至室温下pH8.0至9.0,Tris-HCl反应缓冲液的pH随着温度增加而降低。因此,反应缓冲液的pH在进行扩增,特别是在进行活化温育的增高的温度下降低。反应缓冲液pH的降低有利于氨基基团去酰化。
由于高温反应条件而出现pH变化取决于所用的缓冲液。用于生物反应中的各种缓冲液的pH温度依赖性报道于Good et al.,1966,Biochemistry5(2):467-477中。对于Tris缓冲液而言,pKa的变化,即缓冲范围的中点pH,与温度的关系见下式:ΔpKa/℃=-0.031。例如,在25℃配制的Tris-HCl缓冲液,当升至90℃进行活化温育时pKa下降2.17。
虽然扩增反应典型地是在Tris-HCl缓冲液中进行的,扩增反应也可以在pH随温度有较小或较大变化的缓冲液中进行。取决于所用的缓冲液,更稳定或较不稳定的修饰过的酶可能是合意的。例如,采用产生较不稳定的修饰过的酶的修饰试剂会使在缓冲液pH较小变化的情况下即可恢复足够的酶活性。如上文所提供的,通过实验比较各种试剂修饰的酶的相对稳定性,指导选择适合用于具体缓冲液的修饰过的酶。
本发明方法中,激活修饰过的酶是通过在等于或高于用于扩增反应中的确保扩增特异性的引物杂交(退火)温度的温度下进行温育而获得的。恢复酶活性所需的温育时间长短取决于温度和反应混合物的pH和酶的酰化氨基基团的稳定性,而该稳定性取决于制备修饰酶制剂中的修饰试剂。可采用很宽范围的温育条件,通过实验可确定各反应的最佳条件。通常,温育是在扩增反应缓冲液中在大于约50℃的温度下进行约10秒和约20分钟之间。未列举的酶再活化的或未列举的反应混合物的最佳温育条件,可以按本文提供的指引通过常规实验确定。
在优选实施方案中,PCR扩增是用可逆失活热稳定性DNA聚合酶进行的。用于PCR扩增的退火温度典型地是约55-75℃,且预反应温育是在等于或高于退火温度的温度下进行的,优选大于约90℃的温度。扩增反应混合物优选是在约90-100℃温育大约12分钟,以在温度循环之前再活化DNA聚合酶。典型的PCR扩增的合适的预反应温育条件描述于实施例中,随着预反应温育条件不同而不同的扩增效果亦一同描述于实施例中。
典型PCR扩增中的第一步骤由双链靶核酸的热变性组成。样品核酸热变性所需的确切条件取决于样品核酸的长度和组成。典型地,在90-100℃温育约10秒钟至约4分钟,对使样品核酸完全变性是有效的。起始变性步骤可以用作预反应温育以再活化DNA聚合酶。然而,根据起始变性步骤的时间长度和温度,和用于失活DNA聚合物的修饰剂,DNA聚合酶活性的恢复可能是不完全的。如果需要酶活性最大程度地恢复,可能要延长预反应温育,或另一种选择是,可以增加扩增循环的次数。
本发明优选实施方案中,选用的修饰过的酶和起始变性条件,使得在起始温育步骤期间只有一部分可恢复的酶活性得到恢复。随后的PCR循环,每次循环都涉及一个高温变性步骤,导致酶活性进一步恢复。因此,酶活性的活化被搁置在起始扩增循环之后。已观察到DNA聚合酶活性的“缓释”进一步降低非特异性扩增。已知过量的DNA聚合酶对非特异扩增起作用。本发明方法中,在扩增的起始阶段,当靶序列数量低时,存在的DNA聚合酶活性量就低,这便降低所形成的非特异延伸产物的量。最高DNA聚合酶活性呈现在扩增的较后阶段,此时靶序列的数量高,从而保证了高的扩增产率。如果需要,扩增循环的次数可以增加,以补偿初始循环的较低的DNA聚合酶活性量。变化扩增循环次数的扩增效果显示于实施例中。
本发明方法的优点是,这些方法在初始制备反应混合物后,无需再处理反应混合物。因此,这些方法可理想地用于自动扩增体系和原位扩增方法中,这些方法中初始变性步骤后添加试剂或使用蜡屏障是不方便的或不可行的。
本发明方法特别适于减少PCR中非特异扩增。然而,本发明不限于任何特定的扩增体系。本发明的可逆失活酶可用于任何使用热稳定性酶和依赖反应温度来获得扩增特异性的以引物为基础的扩增体系。本发明可以应用于使用热稳定性酶的等温扩增体系。只需在增高的温度下短暂温育来恢复酶活性。为恢复酶活性将反应混合物进行高温温育后,将反应在适宜反应温度下进行。
除PCR(U.S.4,683,195;4,683,202和4,965,188)外的其它扩增方法包括,但不限于下列:连接酶链反应(LCR,Wu and Wallace,1989,Genomics 4:560-569和Barany,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:189-193),聚合酶连接酶链反应(Barany 1991,PCR Methods and Applic.1:5-16);Gap-LCR(PCT专利公开WO 90/01069);修复链反应(欧洲专利申请EP-439,182A2),3SR(Kwoh et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:1173-1177;Guatelli et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874-1878;PCT专利申请公开WO92/08800)和NASBA(U.S.5,130,238)。本发明不限于任何特定的扩增体系。随着其它体系的开发,那些体系亦会受益于本发明的实施。关于扩增体系最新综述公开于Abramson and Myers,1993,Current Opinion in Biotechnology 4:41-47中。
适于每一种扩增反应的样品制备方法在现有技术中已有描述(参见,例如,Sambrook等,同上,和上面引述的描述扩增方法的参考文献)。制备靶序列PCR扩增样品的简单和迅速的方法描述于Higuchi,1989,PCRTechnology(Erlich ed.,Stockton Press,New York)和PCR Protocols,Chapters 18-20(Innis et al.,ed.,A cademic Press,1990)。本领域熟练技术人员能够选择和通过实验优化适合的方案。
检测扩增产物的方法已在文献中作了详尽的描述。标准方法包括用凝胶电脉或用寡核苷酸探针杂交来分析。检测探针和扩增的核酸间形成的杂交物可用各种形式包括斑点印迹测定形式和反相斑点印迹测定形式进行(参见Saiki et al.,1986,Nature 324:163-166;Saiki et al.,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:6230;PCT专利申请WO 89/11548;美国专利5,008,182和5,176,775;PCR Protocols:A Guide to Methods and Application(ed.Innis et al.,AcademicPress,San Diego,CA):337-347。采用微孔板的反相斑点印迹方法描述于美国未审专利申请141,355(与EP-A-420260同族);U.S.5,232,829;Loeffelholz et al.,1992,J.Clin.Microbiol.30(11):2847-2851;Mulder et al.,1994,J.Clin.Microbiol.32(2):292-300;和Jackson et al.,1991,AIDS 5:1463-1467。
称作5′-核酸酶测定法的另一种合适的测定方法描述于U.S.5,210,015和Holland et al.,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7276-7280中。在此5′-核酸酶测定法中,引物延伸的同时,标记探针被DNA聚合酶(例如Taq DNA聚合酶)的5′至3′核酸外切酶活性降解。探针分解产物的检测表明在探针和靶DNA间出现了杂交并出现了扩增反应。U.S.5,491,063(与EP-A-699,768同族)和EP-A-713,921描述了检测伴随扩增出现的探针降解的改进方法。
通过监测反应混合物中双链DNA总量增加来检测核酸扩增的另一替代方法描述于Higuchi et al.,1992,Bio/Technology 10:413-417;Higuchi et al.,1993,Bio/Technology 11:1026-1030和欧洲专利公开NO.487,218和512,334中。双链靶DNA的检测依赖于当结合于双链DNA时溴化乙啶(EtBr)和其它DNA结合标记物显现的荧光的增加。由于靶序列合成所致的双链DNA的增加会导致可检测的荧光增加。此方法的问题是,非靶序列合成,即非特异扩增也导致荧光增加,这就干扰了靶序列合成所产生的荧光增加的测定。因此,本发明方法特别有用,因为其减少非特异扩增,由此使由非靶序列的扩增所产生的荧光增加减至最小。
本发明也涉及试剂盒,即包含实施本发明方法的有用成分的多容器装置。一个有用的试剂盒含有可逆失活热稳定性酶和一或多种进行扩增反应的试剂如寡核苷酸引物、底物核苷三磷酸、辅助因子和一种适宜的缓冲液。
下文给出的本发明实施例只为说明性的目的而非限制本发明的范围。对本领域普通熟练技术人员而言,通过阅读上文和下列实施例,在实施例之后的权利要求范围内的本发明多种实施方案将是显而易见的。
实施例1
聚合酶活性测定
下文实施例中描述的DNA聚合酶活性的所有测定均采用下列DNA聚合酶活性测法进行。此测定法基本上描述于Lawyer et al.,1989,J.Biol.Chem.264:6427-6437,和AmpliTaqR DNA聚合酶产品说明(Perkin Elmer,Norwalk,CT),两文均引入本文作为参考。
一个单位的酶活性定义为在74℃温育10分钟,每30分钟将10nmoldNTP掺入酸不溶物质的量。由于修饰过的酶的不稳定性,在50℃下测定活性并归一至也已在74℃测定的标准Taq DNA聚合酶溶液。反应在含下列试剂的50μl体积中进行:
25mM TAPS(Tris-(羟甲基)-甲基-氨基-丙磺酸钠盐),pH9.3(室温下);
50mM KCl;
2mM MgCl2;
1mM β-巯基乙醇;
dATP、dGTP和dTTP各200μM;
100μM[α-32P]-dCTP(0.05-0.1Ci/nmol);
活化鲑精DNA。
实施例2
Taq DNA聚合酶的柠康酰化
此实施例描述用柠康酐修饰Taq DNA聚合酶。柠康酰化Taq DNA聚合酶活性的测定描述于下文的实施例3中,此测定指示出获得此DNA聚合酶活性完全失活所需的修饰剂与酶在失活反应中的摩尔比。
Taq DNA聚合物(AmpliTaqR,Perkin Elmer,Norwalk CT)以1.3mg/ml的初始浓度使用。在初始试验中,Taq DNA聚合酶对1000倍过量体积的0.1M硼酸钠在pH8.63下渗析。发现此步骤不是关键的且在以后的试验中,将TaqDNA聚合物直接用于Tris缓冲液(50mM Tris-HCl,1mM EDTA,65mM KCl,pH7.5)而无需对硼酸钠渗析。
柠康酐(11.06M)可以购得(Aldrich,Milwaukee,WI)。柠康酐的起始溶液通过将11.06M柠康酐用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)稀释100倍而产生。
用DMF重复地2倍稀释产生柠康酐溶液的稀释液系列用于一组修饰反应。对于系列中的每种溶液,将4μl稀释的柠康酐溶液加入400μl Taq DNA聚合酶溶液(用硼酸钠渗析)中,产生含柠康酐对Taq DNA聚合酶的摩尔比大概为80/1、40/1、20/1和10/1的溶液。将溶液在4℃下温育过夜以失活TaqDNA聚合酶。如本文所采用的,在反应中用N倍摩尔过量的修饰剂修饰过的酶称作NX酶。因此,所得的柠康酰化Taq DNA聚合酶在本文中称作80X、40X、20X和10X Taq DNA聚合酶。
另外的修饰反应采用柠康酐与Taq DNA聚合酶(无硼酸钠渗析)为大约80X、160X和240X摩尔比进行。160X和240X比率通过用DMF(N,N二甲基甲酰胺)合适地调节11.06M柠康酐的初始稀释液而产生。例如,对于最终的160X比率,将11.06柠康酐用DMF稀释1/50,并且将4μl所得的柠康酐起始溶液加入到400μl Taq DNA聚合酶溶液中。所得的柠康酰化TaqDNA聚合酶在本文中称作240X、160X和80X Taq DNA聚合酶。
实施例3
采用柠康酐失活和热恢复DNA聚合酶的活性
此实施例描述在柠康酰化的Taq DNA聚合酶用热温育再活化前和后来测定实施例2的柠康酰化Taq DNA聚合酶的活性。pH对柠康酰化的TaqDNA聚合酶热再活化后恢复的活性量的作用也作了测定。
柠康酰化Taq DNA聚合酶的样品用由10mM Tris-HCl、100mMKCl、2mM MgCl2、0.5%吐温20、0.5%NP-40、16%甘油组成的缓冲液稀释200倍。该缓冲液pH在室温下为8.25。柠康酰化Taq DNA聚合酶的稀释样品在90℃温育20分钟或保持在室温下作对照。处理之后,样品用酶稀释缓冲液(25mM Tris-HCl、50mM KCl、1mM β-硫基乙醇、0.5%TweenTM20、0.5%NP-40、0.1%明胶)稀释5倍,并如实施例1中描述测定活性。处理后的DNA聚合酶活性如下所示。摩尔比是指用于修饰反应的柠康酐与Taq DNA聚合酶的摩尔比。每一活性是由重复样品测定的两个活性的平均值。
摩尔比对照 | 活性(对照的%) | |
未加热100 | 90℃温育 | |
80X40X20X10X | 003.738 | 16283863 |
用大于20倍摩尔过量的柠康酐获得Taq DNA聚合酶的完全失活。完全失活的Taq DNA聚合酶在90℃温育20分钟后,最少恢复16%的活性。
虽然采用40X柠康酰化Taq DNA聚合酶比采用80X柠康酰化Taq DNA聚合酶恢复更多的酶活性,但在商业化试剂盒中采用80X(或更高)柠康酰化Taq DNA聚合酶以允许更高的处理耐受性可能会更可行。
采用在室温下调节至pH7.75的缓冲液进行同样的试验,结果如下所示。
摩尔比对照 | 活性(对照的%) | |
未加热100 | 90℃温育 | |
80X40X20X10X | 003.535 | 61677077 |
在较低pH下恢复的DNA聚合酶活性量更大。
80X和160X Taq DNA聚合酶(未经硼酸钠渗析)的活性在热温育再活化前和后用基本如前所述方法进行测定。用于温育的缓冲液pH为室温下8.0。结果如下所示。每一活性是由重复样品测定的两个活性的平均值。
摩尔比对照 | 活性(对照的%) | |
未加热100 | 90℃温育 | |
160X80X | 00 | 1929 |
pH对再活化的作用可通过比较采用80X Tap DNA聚合酶在不同pH下的三种再活化所恢复的活性来进一步见证。上面的数据表明,甚至当修饰反应中采用高摩尔过量的修饰剂时,酶活性也可恢复。
实施例4
采用柠康酰化Taq DNA聚合酶的PCR扩增
此实施例描述了在PCR扩增中实施例2中描述的柠康酰Taq热稳定性DNA聚合酶的应用。
PCR方案
扩增反应系采用实施例2中描述的240X修饰过的Taq DNA聚合酶的1/20、1/40和1/80稀释液进行的。稀释液用由20mM Tris-HCl、pH8.0(室温下)、100mM KCl、0.1mM EDTA(乙二胺四乙酸)、1mMDTT(二硫苏糖醇)、50%甘油、0.5%吐温20、0.5%Nonidet P40(AmpliTaqR贮藏缓冲液,Perkin Elmer,Norwalk,CT)组成的缓冲液制成。为作比较,扩增也采用未修饰过的TaqDNA聚合酶的1/10、1/20、1/40和1/80稀释液进行。
克隆的HTLV-I基因组序列列采用引物SK432和SK111扩增。该引物序列提供于U.S.5,418,149中。引入本文作为参考。PCR是在下列条件下在100μl反应体积中进行的。
反应混合物:
30拷贝的HTLV-IDNA模板
10mM Tris,pH8.3
50mM KCl
引物各0.5μM
200μM dATP、dCTP和dGTP
400μM dUTP
0.5μl柠康酰化Taq DNA聚合酶溶液
2.5mM MgCl2
1ng hpDNA
1单位UNG(Perkin Elmer,Norwalk,CT)
热循环简况:
预反应温育: (90℃,10分钟)
2次循环 变性 98℃,1分钟
退火/延伸 60℃,2分钟
38次循环 变性 94℃,1分钟
退火/延伸 60℃,1分种
终温育: 60℃,7分钟
扩增产物通过采用1X TBE(0.089M Tris,0.089M硼酸、0.0025M EDTA二钠盐)电泳缓冲液的4%琼脂糖凝胶电泳作分析。电泳在100伏下进行大约2小时。溴化乙锭(0.5μg/ml)在电泳后加入以着色任何存在的DNA。凝胶用1X TBE脱色,且用UV照射显现溴化乙锭着色的DNA带。
终温育: 60℃,7分钟
扩增产物通过采用1X TBE(0.089M Tris,0.089M硼酸、0.0025M EDTA二钠盐)电泳缓冲液的4%琼脂糖凝胶电泳作分析。电泳在100伏下进行大约2小时。溴化乙锭(0.5μg/ml)在电泳后加入以着色任何存在的DNA。凝胶用1X TBE脱色,且用UV照射显现溴化乙锭着色的DNA带。
结果
结果显示于图2中。相应于扩增的靶序列带被标明。显示在凝胶上的不对应于扩增的靶序列带的带相应于由非靶序列的非特异扩增产生的产物。采用柠康酰化Taq DNA聚合酶(标记的Tag,HS)的扩增效果,可以通过比较产生带的类型和各泳道内的强度见到。由于扩增非特异性产物与扩增靶序列竞争,扩增靶序列的增加进一步表明非特异扩增的减少。因此,每一泳道内产物相对量的变化以最好方式表明了预反应处理对非特异性扩增的作用。
采用未修饰过的Taq DNA聚合酶扩增导致非特异性扩增产物占主要地位。采用柠康酰化Taq DNA聚合酶导致相应于扩增的靶序列的带强度明显增加,并且相应于非特异性扩增产物的带强度明显降低。数据表明,采用可逆失活DNA聚合酶PCR扩增明显降低了非特异性扩增,且明显增加了所需靶序列扩增的量。
实施例5
其它的柠康酰化热稳定性DNA聚合酶
此实施例描述了除上述Taq DNA聚合酶外的几种其它热稳定性DNA聚合酶的柠康酰化。对下列热稳定性DNA聚合酶作了修饰:
1)来源于嗜热栖热菌的热稳定性DNA聚合酶(rTth,Perkin Elmer,Norwalk,CT),如WO 91/09950(引入本文作为参考)中描述的.
2)来源于海栖热袍菌的突变热稳定性DNA聚合酶(UlTmaTM,PerkinElmer,Norwalk,CT),如WO 92/03556(引入本文作为参考)中描述的。
3)来源于水生栖热菌的热稳定性DNA聚合酶的突变体形式,它缺少3′至5′核酸外切酶活性,如WO 92/06200/(引入本文作为参考)中描述的。此酶在本文中称作Taq CS或AmpliTaqR CS。
对于上面三种DNA聚合酶的每一种,起始溶液以大概200单位/μl的浓度制备。为了比较,1.3mg/ml Taq DNA聚合酶,如前面实施例中采用的,性DNA聚合酶。
PCR方案
扩增采用修饰过的DNA聚合酶稀释液进行。稀释液用由20mM Tris-HCl、pH8.0(室温下)、100mMKCl、0.1mMEDTA(乙二胺四乙酸)、1mMDTT(二硫苏糖醇)、50%甘油、0.5%TweenTM 20,0.5%Nonidet P40(AmpliTaqR贮藏缓冲液,Perkin Elmer,Norwalk,CT)组成的缓冲液制成。
用引物SK 145和SK 431(Perkin Elmer,Norwalk,CT)扩增HIV-1基因组序列。引物SK 145和SK 431描述于U.S.5,481,149和下列科学公开出版物:Sk 145描述于Kwok et al.,1990,Nucleic Acids Res.18:999-1005;SK431描述于Jackson et al.,1991,AIDS 5:1463-1467中。PCR是在下列反应条件下在100μl反应体积中进行的。
反应混合物:
100拷贝的HIV-1DNA模板
10mM Tris,pH 8.3
50mM KCl
各引物0.5μM
200μM dATP、dCTP和dGTP
400μM dUTP
0.5μl DNA聚合酶溶液
2.5mM MgCl2
1μg hpDNA
1单位UNG(Perkin Elmer,Norwalk,CT)
热循环简况:
预反应温育: (95℃,12分钟)
38次循环 变性 94℃,1分钟
退火/延伸 60℃,1分种
终温育: 60℃,7分钟
预反应温育步骤也作为起始变性步骤。起始变性步骤常规地用于典型的扩增反应,以确保双链靶体的完全变性。PCR的每一循环用94℃持续1分钟的变性步骤开始。因此,紧接着在95℃进行起始预反应温育12分钟之后,在第一次循环的变性步骤期间,将反应混合物在94℃下温育1分钟。
扩增产物通过采用1X TBE(0.089M Tris、0.089M硼酸、0.0025MEDTA二钠盐)电泳缓冲液的琼脂糖凝胶电泳(100ml 3% NuSieveR和0.5%SeaChemR作分析。电泳在100伏下进行大约1小时。溴化乙锭(0.5μg/ml)在电泳后加入以着色任何存在的DNA。凝胶用1X TBE脱色,且用UV照射显现溴化乙锭着色的DNA带。
采用柠康酰化DNA聚合酶扩增
描述于实施例5中的柠康酰化DNA聚合酶稀释液(1/10、1/20、1/40和1/80)和描述于实施例2中的240X柠康酰化Taq DNA聚合酶用于扩增HIV-1核酸,并且用琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物。为作比较,采用未修饰过的Taq DNA聚合酶稀释液进行扩增。
结果示于图3中。相应于扩增靶序列的带被指明。显示在凝胶上的不对应于扩增的靶序列带的带相应于由非靶序列的非特异扩增产生的产物。采用柠康酰化Taq DNA聚合酶的扩增效果,可以通过比较产生带的类型和各泳道内的强度见到。由于扩增非特异性产物与扩增靶序列竞争,扩增靶序列的增加进一步表明非特异性扩增的减少。因此,每泳道内产物相对量的变化以最好的方式表明了预反应处理对非特异性扩增的作用。
采用未修饰过的酶稀释水平的Taq DNA聚合物扩增导致主要是非特异性的扩增产物。采用柠康酰化Taq DNA聚合酶,除1/80稀释外的所有样品导致相应于扩增靶序列的带增强,且相应于非特异扩增产物的带的强度明显降低。该数据表明,采用可逆失活DNA聚合酶PCR扩增明显降低了非特异性扩增,且明显增加了所需的靶序列扩增的量。
应用柠康酰化的UlTma、Taq CS,和rTth DNA聚合酶也导致比扩增中采用未修饰过的Taq DNA聚合酶更大产量的特异性扩增产物,且与之同时非特异性扩增产物的量减少。该结果证实本发明方法可用于一般的热稳定性DNA聚合酶。
应当指出,虽然结果证实了本发明的功能性,但采用柠康酰化的Taq、UlTma、Taq CS和rTth DNA聚合酶获得的结果不是直接可比的,因为各DNA聚合酶的优化修饰条件不可比。具体地说,虽然各DNA聚合酶的起始溶液含有相同的单位/ml数,但溶液的摩尔浓度未确定,从而各修饰反应中的柠康酐摩尔过剩量未确定。熟练技术人员可以理解,采用本文描述的方案,最佳修饰条件可以通过实验确定。
实施例7
顺式乌头酰化的DNA聚合酶
此实施例描述用顺式乌头酐修饰Taq DNA聚合酶。
采用顺式乌头酐修饰基本上如实施例2中描述的进行,主要不同是因为顺式乌头酐以粉剂而不是液体出售。Taq DNA聚合酶(AmpliTaqR,PerkinElmer,Norwalk,CT)的Tris缓冲液(50mM Tris-HCl,1mM EDTA,68mMHCl、pH7.5)溶液以1.3mg/ml的起始浓度使用。顺式乌头酐(Aldrieh,Milwaukee,WI)的起始溶液通过将20mg顺式乌头酐溶于1ml 100%乙醇而制成。
将10或20μl顺式乌头酐溶液加入到1000μl Taq DNA聚合酶溶液中,产生含有顺式乌头酐与Taq DNA聚合酶的摩尔比为大约90/1和180/1的溶液。溶液在4℃温育过夜以失活Taq DNA聚合酶。
采用顺式乌头酰化Taq DNA聚合酶扩增和采用柠康酰化Taq DNA聚合酶的扩增之比较在下文中作了描述。
实施例8
采用顺式乌头酐失活和热恢复DNA聚合酶活性
实施例7中制备的90X和180X顺式乌头酰化Taq DNA聚合酶的活性基本上如上文实施例3中描述的在再活化前和后用热温育来测定。温育期间缓冲液pH为8.0。结果如下。每一活性是由重复样品测定的两个活性的平均值。
摩尔比对照 | 活性(对照的%) | |
未加热100 | 90℃温育 | |
180X90X | 03 | 50118 |
此结果与实施例3的结果相比表明,顺式乌头酰化比柠康酰化更易逆转。为完全失活DNA聚合酶需要较高的摩尔过剩量的顺式乌头酐,且高温温育后更多的活性得到恢复。用90倍摩尔过剩量的顺式乌头酐修饰接着用热再活化后测得的活性大于100%的原因仍不清楚,但可能是活性试验中不精确所致或可能反映DNA聚合酶的实际修饰。
实施例9
预反应温育时间的作用
此实施例描述预反应温育时间对所得产物量的作用。
扩增采用如上描述所制备的柠康酰化和顺式乌头酰化Taq DNA聚合酶来进行。对于每组扩增条件,采用80倍和160倍摩尔过量的柠康酐,和90倍和180倍过量的顺式乌头酐修饰的Taq DNA聚合酶。扩增是采用实施例6中描述的HIV-1模式体系进行的,但起始预反应温育有变化。对于每种酶制剂,扩增采用预反应温育12、6、3和0分钟进行。
如上所提到的,预反应温育步骤也作为起始变性步骤。PCR的每一循环开始于变性步骤。紧接着在95℃进行起始预反应温育12、6、3或0分钟后,在第一次循环的变性步骤期间,将反应混合物在94℃下温育1分钟。因此,即使未使用预反应温育,在起始循环的变性步骤期间,酶活性也能得以恢复。
扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析。结果示于图4中。相应于靶序列扩增的带被指明。显示在凝胶上的除相应于靶序列扩增的带是由非靶序列的非特异性扩增产生的产物。
结果显示,采用顺式乌头酰化DNA聚合酶,所有预反应温育时间均导致强的相应于扩增产物的带。无预反应温育进行的扩增导致几乎与用长的预反应温育扩增得到一样多的产物。
相反,结果显示,采用柠康酰化DNA聚合酶,需要至少3分钟的预反应温育以获得最大量的扩增产物。无预反应温育的扩增导致明显较少的扩增产物。结果表明,顺式乌头酰化DNA聚合酶的活性恢复比柠康酰化DNA聚合确的要快。
实施例10
循环次数的作用
此实施例描述增加循环次数对补偿短的预反应温育时间的作用。
扩增采用Taq DNA聚合酶进行,该Taq DNA聚合酶用80倍和160倍摩尔过量的柠康酐、和90倍和180倍摩尔过量的顺式乌头酐修饰。扩增基本上按上面描述的用描述于实施例6中的HIV-1模式体系进行,除了起始预反应温育和循环次数有所变化。对于每种酶制剂,扩增采用下列条件进行:
预反应温育 扩增循环
12分钟80℃ 60
0 60
0 48
0 43
0 39
扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析,结果示于图5中。结果显示,增加循环次数可以补偿由于未采用预反应温育时DNA聚合酶活性的不完全再活化导致的扩增效力损失。
对于每种DNA聚合酶,增加扩增循环次数导致扩增产物增加。当采用顺式乌头酰化Taq DNA聚合酶时,该效果最小,如实施例9中所示,使用顺式乌头酰化Taq DNA聚合酶时,几乎不需要任何预反应温育。
Claims (29)
2.权利要求1的化学修饰的热稳定性酶,它是利用修饰试剂产生的,其中所述的修饰试剂选自马来酐;外-顺式-3,6-内氧代-Δ4-四氢邻苯二甲酸酐;柠康酐;3,4,5,6-四氢邻苯二甲酸酐;顺式乌头酐;或2,3-二甲基马来酐。
3、权利要求1或2的化学修饰的热稳定性酶,它是通过反应而产生的,其中所述修饰试剂的用量比所述混合物中的热稳定性酶超过20倍摩尔过量。
4、权利要求1或2的化学修饰的热稳定性酶,其中所述的热稳定性酶是由水生栖热菌(
Thermus
aquaticus)得到的热稳定性DNA聚合酶,且其中所述的修饰试剂是柠康酐。
5、权利要求1或2的化学修饰的热稳定性酶,其中所述的热稳定性酶是由嗜热栖热菌(
Thermus
thermophilus)得到的热稳定性DNA聚合酶,且其中所述的修饰试剂是顺式乌头酐。
6、权利要求3的化学修饰的热稳定性酶,其中所述的热稳定性酶是由水生栖热菌(
Thermus
aquaticus)得到的热稳定性DNA聚合酶,且其中所述的修饰试剂是柠康酐。
7、权利要求3的化学修饰的热稳定性酶,其中所述的热稳定性酶是由嗜热栖热菌(
Thermus
thermophilus)得到的热稳定性DNA聚合酶,且其中所述的修饰试剂是顺式乌头酐。
8.权利要求1的通过化学修饰的热稳定性酶,其中该化学修饰的热稳定性酶在温度低于约25℃的碱性pH缓冲水溶液中温育后,导致酶活性在少于约20分钟内无明显增加,且其中该化学修饰的酶在25℃配成约pH8-9的缓冲水溶液并在大于约50℃的温度中温育后,导致酶活性在少于约20分钟内至少增加两倍。
9.权利要求8的化学修饰的热稳定性酶,它是利用修饰试剂产生的,其中所述的修饰试剂选自马来酐;外-顺式-3,6-内氧代-Δ4-四氢邻苯二甲酸酐;柠康酐;3,4,5,6-四氢邻苯二甲酸酐;顺式乌头酐;或2,3-二甲基马来酐。
10、权利要求8或9的化学修饰的热稳定性酶,它是通过反应而产生的,其中所述修饰试剂的用量比所述混合物中的热稳定性酶超过20倍摩尔过量。
11、权利要求8或9的化学修饰的热稳定性酶,其中所述的热稳定性酶是由水生栖热菌(
Thermus
aquaticus)得到的热稳定性DNA聚合酶,且其中所述的修饰试剂是柠康酐。
12、权利要求8或9的化学修饰的热稳定性酶,其中所述的热稳定性酶是由嗜热栖热菌(
Thermus thermophilus)得到的热稳定性DNA聚合酶,且其中所述的修饰试剂是顺式乌头酐。
13、权利要求9的化学修饰的热稳定性酶,其中所述的热稳定性酶是由水生栖热菌(
Thermus
aquaticus)得到的热稳定性DNA聚合酶,且其中所述的修饰试剂是柠康酐。
14、权利要求9的化学修饰的热稳定性酶,其中所述的热稳定性酶是由嗜热栖热菌(
Thermus thermophilus)得到的热稳定性DNA聚合酶,且其中所述的修饰试剂是顺式乌头酐。
15、权利要求1或8的化学修饰的热稳定性酶,其中被可逆失活的酶活性是热稳定性DNA聚合酶活性,且其中所述的化学修饰的酶是由水生栖热菌、嗜热栖热菌(
Thermus thermophilus)或海栖热袍菌(
Thermotoga
maritima)的热稳定DNA聚合酶通过可逆失活所得到的。
16、权利要求15的化学修饰的热稳定性酶,它是利用修饰试剂产生的,其中所述的修饰试剂选自马来酐;外-顺式-3,6-内氧代-Δ4-四氢邻苯二甲酸酐;柠康酐;3,4,5,6-四氢邻苯二甲酸酐;顺式乌头酐;或2,3-二甲基马来酐。
17、权利要求15的化学修饰的热稳定性酶,它是通过反应而产生的,其中所述修饰试剂的用量比所述混合物中的热稳定性酶超过20倍摩尔过量。
18、权利要求15的化学修饰的热稳定性酶,其中所述的热稳定性酶是由水生栖热菌(
Thermus
aquaticus)得到的热稳定性DNA聚合酶,且其中所述的修饰试剂是柠康酐。
19、权利要求15的化学修饰的热稳定性酶,其中所述的热稳定性酶是由嗜热栖热菌(
Thermus thermophilus)得到的热稳定性DNA聚合酶,且其中所述的修饰试剂是顺式乌头酐。
20、权利要求16的化学修饰的热稳定性酶,它是通过反应而产生的,其中所述修饰试剂的用量比所述混合物中的热稳定性酶超过20倍摩尔过量。
21、权利要求16的化学修饰的热稳定性酶,其中所述的热稳定性酶是由水生栖热菌(
Thermus
aquaticus)得到的热稳定性DNA聚合酶,且其中所述的修饰试剂是柠康酐。
22、权利要求16的化学修饰的热稳定性酶,其中所述的热稳定性酶是由嗜热栖热菌(
Thermus thermophilus)得到的热稳定性DNA聚合酶,且其中所述的修饰试剂是顺式乌头酐。
23、权利要求17的化学修饰的热稳定性酶,其中所述的热稳定性酶是由水生栖热菌(
Thermus
aquaticus)得到的热稳定性DNA聚合酶,且其中所述的修饰试剂是柠康酐。
24、权利要求17的化学修饰的热稳定性酶,其中所述的热稳定性酶是由嗜热栖热菌(
Thermus thermophilus)得到的热稳定性DNA聚合酶,且其中所述的修饰试剂是顺式乌头酐。
26.权利要求25的方法,其中所述的试剂是具有下列通式的二羧酸酐
其中R1和R2是有机基,它们相连,且氢是顺式。
27、一种通过热稳定性酶催化的引物延伸反应扩增靶核酸样品的方法,包含下列步骤:
a)使所述样品与含有所述引物和权利要求1至24之任一项的化学修饰的热稳定性酶的扩增反应混合物接触;和
b)将步骤(a)的所得混合物在高于约50℃的温度中温育,温育所花的时间足以使所述化学修饰的热稳定性酶再活化并能形成引物延伸产物。
28、一种核酸扩增反应混合物,包含一对引物以及权利要求1至24之任一项的化学修饰的热稳定性酶。
29、一种进行核酸扩增链反应的试剂盒,其包含按照权利要求1至24之任一项的化学修饰的热稳定性酶。
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