CN107312762B - 一种化学修饰ung酶及其修饰方法和应用 - Google Patents

一种化学修饰ung酶及其修饰方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107312762B
CN107312762B CN201710491119.7A CN201710491119A CN107312762B CN 107312762 B CN107312762 B CN 107312762B CN 201710491119 A CN201710491119 A CN 201710491119A CN 107312762 B CN107312762 B CN 107312762B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ung enzyme
enzyme
anhydride
ung
chemically modified
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710491119.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107312762A (zh
Inventor
胡振新
谭卓
郜安国
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suzhou Jingrui Biotechnology Co., Ltd
Original Assignee
Suzhou Clickgene Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suzhou Clickgene Biotechnology Co ltd filed Critical Suzhou Clickgene Biotechnology Co ltd
Priority to CN201710491119.7A priority Critical patent/CN107312762B/zh
Publication of CN107312762A publication Critical patent/CN107312762A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107312762B publication Critical patent/CN107312762B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2497—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing N- glycosyl compounds (3.2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/02—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2) hydrolysing N-glycosyl compounds (3.2.2)
    • C12Y302/02027—Uracil-DNA glycosylase (3.2.2.27)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种化学修饰UNG酶，所述化学修饰UNG酶是由酸酐修饰的UNG酶。所述化学修饰UNG酶能在某一温度或以下不表现酶活性，而在特定温度下孵育一段时间后去修饰可以恢复正常活性，从而实现活性可控。本发明还提供一种用酸酐修饰UNG酶的方法、以及所述化学修饰UNG酶的应用。本发明的用酸酐修饰UNG酶的方法，可以制备的化学修饰UNG酶。所述化学修饰UNG酶用于EMA(多酶介导的核酸常温扩增)或其它核酸等温扩增方法中，可防止扩增产物污染反应体系和环境，耗时短，操作简单，活性可控。

Description

一种化学修饰UNG酶及其修饰方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种化学修饰UNG酶及其修饰方法、在核酸扩增中的应用。
背景技术
PCR是一种极灵敏的扩增技术，易受污染的影响，小量的外源DNA污染就可以与目的模板一起被扩增，从而影响扩增结果和判断。当前一次扩增产物由于误操作(主要是以气溶胶的形式)而进入新的扩增反应时，会发生共同来源的污染，这称之为残余污染；从其他样品中纯化的DNA或克隆的DNA也会是污染源。
由于扩增产物的量大且非常容易以气溶胶的形式扩散，即使实验室严格分区，也难免因为误操作而受到污染。为保证PCR结果的准确性，要预防非特异性PCR扩增和污染。常用的措施是使用UNG酶(Uracil-N-Glycosylase)(也称为UDG，Uracil-DNA Glycocasylase，以下简称为UNG酶)和Taq酶热启动。
UNG酶是克隆有Uracil-N-Glycosylase基因的大肠杆菌经诱导表达后，再经三次过柱纯化分离出来的重组蛋白。UNG酶的作用原理是选择性水解断裂含有dUMP的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除。本发明所用的UNG酶是Thermus aquaticus在大肠杆菌中表达的，最佳活性温度为50-65℃，95℃下10分钟灭活。
UNG酶防污染技术原理是在扩增过程中以脱氧尿苷(dUTP)代替脱氧胸苷(dTTP)，或者以一定比例把dUTP加入到dNTP中，从而得到含有dUMP的扩增产物。尿苷酶(UNG)能特异地破坏含有dUMP的DNA产物，使之不能作为扩增模版，但对天然的不含dUMP的核酸不起作用。故只要在扩增反应前加入UNG酶，就可以破坏过往扩增反应残余的含有d-UMP的DNA，但对不含d-UMP的目标DNA不起作用，从而使目标DNA得到扩增。随后将UNG酶高温灭活，再进行扩增。这样就可以有效地防止实验室内扩增产物的残余污染，避免假阳性的出现。
现有技术将UNG酶运用于PCR扩增防污染，在PCR开始前增加30℃～37℃的保温步骤，UNG酶即可将反应体系中已有的dUMP的DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这一步骤的条件下DNA链断裂，消除由于污染DNA产生的扩增。这个处理对PCR有效，但是却无法用于等温或常温扩增。由于UNG酶在一定温度范围内(30℃-90℃)均有活性，在PCR扩增的时候，dUTP掺入扩增产物过程中，UNG酶会切除该碱基，影响最终扩增效率，因此在普通PCR开始之前，必须有一步热处理使UNG变性而失活。变性的温度要求较高(95℃左右)，而等温反应的酶在这样温度下会失活。同时，PCR防污染体系在扩增检测之前，增加了检测的时间，虽然高温下，UNG酶会变性失活，但是也有报道提示残留的UNG酶活性会干扰后续的扩增检测。
恒温扩增的防污染的方法如美国专利(专利号US 8945845 B2)披露的需要开管加入UNG酶，然后加入反应试剂和UNG酶抑制剂，需要开管两次，增加了实验操作步骤和核酸泄漏风险，延长检测时间。
发明内容
针对以上问题，本发明的目的是提供一种化学修饰UNG酶、化学修饰方法以及化学修饰UNG酶的应用。这种化学修饰UNG酶能在低于某一温度下不表现酶活性，而在该温度以上孵育一段时间后去修饰就可以恢复正常活性，从而实现活性可控。该化学修饰UNG酶应用于常温或等温扩增中，可建立核酸常温或等温扩增的防污染体系，耗时短，操作简单，有效清除残余污染。
为达到以上技术目的，本发明的技术方案是，一种化学修饰UNG酶，所述化学修饰UNG酶是用酸酐修饰的UNG酶。
优选的，所述用于化学修饰UNG酶的酸酐是柠康酸酐、马来酸酐或者马来酸酐的衍生物。
优选的，所述马来酸酐的衍生物是其2’位、3’位具有官能取代物，或者2’3’位同时具有官能取代物，如2，3-二甲基马来酸酐。
所述化学修饰UNG酶的酸酐具有以下结构式：
Figure BDA0001330512220000031
其中，R1、R2可以为H、CH3、CH3CH2，或F，Cl。但R1、R2不限于这些基团。
优选的，所述化学修饰UNG酶具有45℃-70℃的热启动温度。
柠康酸酐、马来酸酐或其衍生物能与UNG酶的赖氨酸中的氨基进行反应，使赖氨酸残基的净电荷发生改变，失去活性。通过控制修饰的条件，能保证UNG酶在某一温度或以下不表现酶活性，而在特定温度下孵育一段时间后去修饰，UNG酶即恢复正常活性。
本发明采用不同的酸酐及不同的酸酐量修饰UNG酶，可以使UNG酶在正常扩增时(37℃-42℃)无活性，通过升温处理(45℃-70℃)5-10min后，化学修饰UNG酶有活性从而能降解扩增产物。
本发明还提供一种化学修饰UNG酶的方法，所述方法包括以下步骤：UNG酶预冷→化学修饰→修饰酶纯化→收集纯化酶。
具体的，所述化学修饰UNG酶的方法包括以下步骤：
1)、UNG酶预冷：将UNG酶于冰上静置；
2)、化学修饰：于冰上向UNG酶中加入用于修饰的酸酐，再加入NaOH并维持pH在7.5-9.0之间；
3)、修饰酶纯化：将上步所得UNG酶转移至透析袋并加入Tris-KAc溶液后封口，放入4℃的Tris(pH7.5-9.0)和KAc溶液中透析；或将上步所得UNG酶通过G-25分子筛纯化；
4)、收集纯化酶，将经过透析或纯化的酶收集，离心除去不溶沉淀，取上清分装，即是以酸酐修饰的UNG酶。
优选的，所述用于修饰的酸酐是柠康酸酐、马来酸酐或者马来酸酐的衍生物。
优选的，所述化学修饰UNG酶具有45℃-70℃的热启动温度。
本发明还提供一种化学修饰UNG酶的应用，所述化学修饰UNG酶用于核酸常温扩增或等温扩增中降解扩增产物；所述化学修饰UNG酶是由柠康酸酐、马来酸酐或者马来酸酐的衍生物修饰的UNG酶；
本发明还提供一种EMA防污染扩增反应体系，每10μl所述EMA防污染扩增反应体系包括4mM巯基乙醇，50μM dNTPs，1mM ATP，20nM真核DNA扩增环状复合物，40nM增殖细胞核抗原，20nM polδ复合酶，0.4μM真核DNA复制蛋白A，20nM T4噬菌体紫外敏感蛋白1，20nM T4噬菌体紫外敏感蛋白2，200nM正反向引物，DNA模板，200μM dUTP，10ng/ul化学修饰UNG酶。
常温核酸扩增技术(Enzymes-Mediated-Amplification，EMA)，以下简称EMA技术，是一种新型核酸扩增技术(参见专利CN104059905)，EMA技术利用DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶及其他辅助因子，可达到在一定温度范围内(30-42℃)、30分钟内使目的DNA片段扩增数百万倍。该方法操作简单、扩增时间短、仪器要求低，非常适合用于疾病的快速诊断。
在现有技术中，UNG酶无法应用于常温扩增体系的污染防控，因为常温扩增没有95℃变性和热启动这一步骤，UNG酶没有经热处理而变性失活，会影响扩增效果，使扩增结果难以判定。本发明的经化学修饰的UNG酶能在某一温度(如45℃或70℃)及以下不表现酶活性，而在特定温度或以上孵育一段时间后去修饰就可以恢复正常活性，而且此特定温度大大低于95℃，使本发明所述化学修饰UNG酶可应用于常温或等温扩增中，使核酸常温或等温扩增防污染扩增体系，耗时更短，操作简单，清晰判定结果。
本发明选择柠康酸酐、马来酸酐及其衍生物对UNG酶进行化学修饰，柠康酸酐、马来酸酐及其衍生物的化学构象，保证了UNG酶在被这些酸酐修饰之后，在升温或者降低pH值的情况下，可以进行脱酸酐的反应，从而使因修饰而失活的UNG酶恢复活性。而如果用其他的酸酐如醋酸酐修饰，则需要破坏性(高温，强酸或强碱性)的条件，才能脱去修饰。
进一步的，本发明还可以通过加入酸酐的量来调整UNG酶的脱修饰温度，从而实现UNG酶活性的可控性。用不同量的酸酐进行修饰，可以导致UNG酶的赖氨酸中的ε-氨基修饰的比例不同，从而使脱修饰反应条件不同。修饰程度低，则脱羧反应需要的温度低；修饰程度高，则脱羧反应需要的温度高。修饰UNG酶所需要的酸酐的量不同，对反应时所需要的温度不同，如在0.5mg/ml的UNG酶浓度下，加入10ul的酸酐，所得的酶可以在45℃温度激活，而加入20ul的酸酐，则需要在70℃激活。这样就实现了UNG酶活性在温度上的可控，使本发明所述的UNG酶具有更广泛的应用性，不仅可以用于核酸常温扩增，还可用于其他等温扩增技术，如LAMP、CPA、STA、RPA、NEAR等。
本发明还提供一种化学修饰UNG酶的方法，所述方法具体包括以下步骤：
1)、UNG酶预冷：浓度为0.1-1.0mg/ml的1.0ml UNG酶于冰上静置30分钟；
2)、化学修饰：于冰上向UNG酶加入1.0μl0.1-1.0M用于修饰的酸酐，加1.0μl0.1-1.0M NaOH并维持pH在7.5-9.0之间；柠康酸酐和NaOH的加入总量在40μL；
3)、修饰酶纯化：将上步所得UNG酶转移至透析袋并加入3mLTris-KAc溶液后封口，放入4℃500ml的30mM Tris(7.5-9.0)，50mM KAc溶液中透析2-3次；或将上步所得UNG酶通过G-25分子筛纯化；
4)、收集纯化酶，将经过透析或纯化的酶收集，离心除去不溶沉淀，取上清分装，即为酸酐修饰的UNG酶。
所得到的化学修饰UNG酶具有优选45℃-70℃的热启动温度。
酸酐修饰UNG酶的过程中对pH值的要求较高，在高pH条件下，有利于修饰作用，但是容易导致酶变性失活，而低pH值导致脱羧反应，因此本发明中化学修饰的pH维持在7.5-9.0之间。
本发明中部分术语如：真核DNA扩增环状复合物、增殖细胞核抗原(ProliferatingCell Nuclear Antigen简称PCNA)、pol δ复合酶、真核DNA复制蛋白A(RPA，replicationprotein A)、T4噬菌体紫外敏感蛋白1、T4噬菌体紫外敏感蛋白2，均参见中国专利CN104059905。
本发明的有益效果在于：
1)本发明用柠康酸酐、马来酸酐或其衍生物修饰耐热的UNG酶，使其热处理温度大大降低，从而可以应用于核酸常温扩增中。
2)本发明可以通过加入酸酐的量的不同来控制UNG酶活性以及反应所需的温度，从而实现UNG酶在温度上的可控性，这样不仅可以应用于30-42℃的核酸等温扩增，也可以应用于温度更高比如60-65℃基于Bst DNA聚合酶的等温扩增。
3)本发明可以在闭管的情况下，通过调整温度达到程序性降解反应产物。而本发明可以闭管调整温度达到程序性降解反应产物，减少了实验操作步骤，节省成本，方便使用，加快了检测效率。
4)本发明可以通用于其他等温扩增技术，如LAMP，CPA，STA，RPA，NEAR或其它等温扩增等技术，延展性较好。
附图说明
图1是实施例1的扩增结果检测图。
图2是实施例4的扩增结果比较图。
图3是实施例4不同热处理温度下的处理结果比较图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本发明限定的范围内。
实施例1，一种柠康酸酐修饰的UNG酶
用柠康酸酐化学修饰UNG酶的步骤如下：
1)、UNG酶预冷：1.0ml UNG酶(浓度为0.1-1.0mg/ml)于冰上静置30分钟；
2)、化学修饰：于冰上向UNG酶中加入1.0μl0.1-1.0M柠康酸酐，加1.0μl0.1-1.0MNaOH并维持pH在7.5-9.0之间；柠康酸酐和NaOH的加入总量不超过40ul；
3)、修饰酶纯化：将上步所得UNG酶转移至透析袋并加入3.0ml配制好的Tris-KAc溶液后封口，放入4℃、500ml的30mMTris(pH7.5-9.0)、50mM KAc溶液中透析2-3次；
4)、收集透析酶，离心除去不溶沉淀，取上清分装备用，即得到柠康酸酐修饰的UNG酶。
实施例2，一种马来酸酐修饰的UNG酶
用马来酸酐修饰UNG酶的步骤如下：
1)、UNG酶预冷：1.0ml UNG酶(浓度为0.1-1.0mg/ml)于冰上静置30分钟；
2)、化学修饰：于冰上向UNG酶中加入1.0μl0.1-1.0M马来酸酐，加1.0μl0.1-1.0MNaOH并维持pH在7.5-9.0之间；马来酸酐和NaOH的加入总量不超过40ul；
3)、修饰酶纯化：将UNG酶转移至透析袋并加入3.0ml配制好的Tris-KAc溶液后封口，放入4℃、500ml的30mM Tris(pH7.5-9.0)，50mM KAc溶液中透析2-3次；
4)、收集透析酶，离心除去不溶沉淀，取上清分装备用，即得到马来酸酐修饰的UNG酶。
实施例3，将柠康酸酐修饰UNG酶应用于EMA实验中
常温核酸扩增技术(Enzymes-Mediated-Amplification，EMA)，简称EMA技术，是一种新型核酸扩增技术(参见专利CN 104059905A)，EMA技术利用DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、DNA聚合酶及其他辅助因子，可达到在一定温度范围内(30～42℃)、30分钟内使目的DNA片段扩增数百万倍。该方法操作简单、扩增温度低、扩增时间短、仪器要求低、非常适合用于疾病的快速诊断。
本发明的化学修饰UNG酶可用于核酸常温扩增或等温扩增中降解扩增产物。
本实施例所用柠康酸酐修饰的UNG酶是在0.5mg/ml的UNG酶浓度下，加入20ul柠康酸酐所得的柠康酸酐修饰UNG酶。制备步骤：
1)、UNG酶预冷：1.0ml UNG酶(浓度为0.5mg/ml)于冰上静置30分钟；
2)、化学修饰：于冰上向UNG酶中加入20μl的柠康酸酐，加1.0μlNaOH并维持pH在7.5-9.0之间；
3)、修饰酶纯化：将上步所得UNG酶转移至透析袋并加入3.0ml配制好的Tris-KAc溶液后封口，放入4℃、500ml的30mMTris(pH7.5-9.0)、50mM KAc溶液中透析3次；
4)、收集透析酶，离心除去不溶沉淀，取上清分装备用，即得到柠康酸酐修饰UNG酶。
EMA反应体系配制：
10μL EMA扩增反应体系包括4mM巯基乙醇，50μM dNTPs，1mM ATP，20nM真核DNA扩增环状复合物，40nM增殖细胞核抗原，20nM pol δ复合酶，0.4μM真核DNA复制蛋白A，20nMT4噬菌体紫外、敏感蛋白1，20nM T4噬菌体紫外敏感蛋白2，200nM正反向引物，DNA模板，200μM dUTP，10ng/ul柠康酸酐修饰UNG酶。
EMA反应程序：37℃扩增45min，升温至70℃处理5min。
对比实验1：EMA反应体系与实施例3相同；EMA反应程序：37℃扩增45min。
对比实验2：EMA反应体系：10μL EMA扩增反应体系包括4mM巯基乙醇，50μM dNTPs，1mM ATP，20nM真核DNA扩增环状复合物，40nM增殖细胞核抗原，20nM pol δ复合酶，0.4μM真核DNA复制蛋白A，20nM T4噬菌体紫外敏感蛋白1，20nM T4噬菌体紫外敏感蛋白2，200nM正反向引物，DNA模板，200μM dUTP。
对比实验2的EMA反应程序与实施例3相同：37℃扩增45min，升温至70℃处理5min。
结果：实施例3与对比实验1、2的扩增产物电泳检测结果如图1所示，可见实施例3的经37℃扩增45min后升温至70℃处理5min的扩增产物被完全降解，而对比实验1没有70℃升温处理的扩增效率跟对比实验2不加修饰UNG酶的效率基本一样，均可见扩增产物，表明升温至70℃后柠康酸酐修饰UNG酶发挥降解作用，将扩增产物全部降解。这样处理后，在常温扩增结束时就很方便自然地降解了污染物，不需要再采用特别的程序和步骤去消除污染，能够有效简单地防止实验室扩增产物的污染。
实施例4，柠康酸酐不同修饰条件导致不同温度激活修饰后的UNG酶
本发明还可以通过加入酸酐的量来调整UNG酶的脱修饰温度，从而实现UNG酶活性的可控性。
EMA反应体系配制：
10μL EMA扩增反应体系包括4mM巯基乙醇，50μM dNTPs，1mM ATP，20nM真核DNA扩增环状复合物，40nM增殖细胞核抗原，20nM pol δ复合酶，0.4μM真核DNA复制蛋白A，20nMT4噬菌体紫外、敏感蛋白1，20nM T4噬菌体紫外、敏感蛋白2，200nM正反向引物，DNA模板，200μM dUTP，10ng/ul柠康酸酐修饰的UNG酶。
A为在0.5mg/ml的UNG酶浓度下，加入10ul的柠康酸酐：按照前述柠康酸酐化学修饰UNG酶的方法和步骤操作，所得的柠康酸酐修饰UNG酶加入EMA反应体系进行EMA扩增。A-1EMA反应程序：37℃(或42℃)扩增45min(或30min)。A-2EMA反应程序：37℃(或42℃)扩增45min(或30min)，升温至45℃处理5min。
B是在0.5mg/ml的UNG酶浓度下，加入20ul的柠康酸酐：按照前述柠康酸酐化学修饰UNG酶的方法和步骤操作，所得的柠康酸酐修饰UNG酶加入EMA反应体系进行EMA扩增。B-1EMA反应程序：37℃(或42℃)扩增45min(或30min)。B-2EMA反应程序：37℃(或42℃)扩增45min(或30min)，升温至70℃处理5min。
结果判定：扩增产物电泳检测结果如图2所示，可见A-1体系未经45℃升温处理，其扩增产物仍保留，A-2体系中的扩增产物在经45℃处理后完全降解；B-1体系未经70℃升温处理，其扩增产物仍保留，B-2体系中的扩增产物在70℃处理后完全降解。说明加入不同量的柠康酸酐所得到的柠康酸酐修饰UNG酶的热处理温度要求不同，表明通过控制修饰条件，可以达到控制UNG酶热启动的温度。
修饰充分的UNG酶在反应后，呈现出温度依赖的修饰活性，其在不同温度处理后的扩增产物电泳结果如图3所示，从1～6(未处理、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃)都可见扩增产物条带，在升温70℃、5分钟(第7)后，产物降解至电泳检测不出的水平。这也体现了可通过温度控制本发明参与的扩增实验。
本发明用柠康酸酐、马来酸酐或其衍生物修饰UNG酶，使其热处理温度大大降低，从而可以应用于核酸常温扩增中。本发明可通过控制修饰的条件，保证得到的化学修饰UNG酶在某一温度或以下不表现酶活性，而在特定温度下孵育一段时间后去修饰，使得UNG酶恢复正常活性。
本发明的用酸酐修饰UNG酶的方法，简单便于操作，得到的化学修饰UNG酶，活性可控。用于EMA扩增中，可使整个EMA防污染扩增体系耗时短，操作简单，可以清晰判断结果。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种化学修饰UNG酶，其特征在于，所述化学修饰UNG酶是用酸酐修饰的UNG酶；
所述酸酐是马来酸酐或者位于烯键的两个碳原子上的R1、R2官能团被其他官能取代物取代的马来酸酐衍生物；
所述化学修饰UNG酶的酸酐具有以下结构式：
Figure FDA0002493386970000011
其中，R1、R2可以为H、CH3、CH3CH2，或F、Cl；
所述化学修饰UNG酶具有45℃-70℃的热启动温度。
2.如权利要求1所述的化学修饰UNG酶，其特征在于，所述酸酐是柠康酸酐，其R1＝H，R2＝CH3。
3.一种化学修饰UNG酶的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)、UNG酶预冷：将UNG酶于冰上静置；
2)、化学修饰：于冰上向UNG酶中加入用于修饰的酸酐，再加入NaOH并维持pH在7.5-9.0之间；
3)、修饰酶纯化：将上步所得UNG酶转移至透析袋并加入Tris-KAc溶液后封口，放入4℃的pH7.5-9.0的Tris和KAc溶液中透析；或将上步所得UNG酶通过G-25分子筛纯化；
4)、收集纯化酶，将经过透析或纯化的酶收集，离心除去不溶沉淀，取上清分装，即是以酸酐修饰的UNG酶；
所述酸酐是马来酸酐或者位于烯键的两个碳原子上的R1、R2官能团被其他官能取代物取代的马来酸酐衍生物；
所述化学修饰UNG酶的酸酐具有以下结构式：
Figure FDA0002493386970000021
其中，R1、R2可以为H、CH3、CH3CH2，或F、Cl。
4.一种权利要求1所述的化学修饰UNG酶的应用，其特征在于，所述化学修饰UNG酶用于核酸常温扩增或等温扩增中降解扩增产物；所述酸酐是马来酸酐或者位于烯键的两个碳原子上的R1、R2官能团被其他官能取代物取代的马来酸酐衍生物；
所述化学修饰UNG酶的酸酐具有以下结构式：
Figure FDA0002493386970000022
其中，R1、R2可以为H、CH3、CH3CH2，或F、Cl；
所述化学修饰UNG酶具有45℃-70℃的热启动温度。
5.一种EMA防污染扩增反应体系，其特征在于，每10μl所述EMA防污染扩增反应体系包括4mM巯基乙醇，50μM dNTPs，1mM ATP，20nM真核DNA扩增环状复合物，40nM增殖细胞核抗原，20nM polδ复合酶，0.4μM真核DNA复制蛋白A，20nM T4噬菌体紫外敏感蛋白1，20nM T4噬菌体紫外敏感蛋白2，200nM正反向引物，DNA模板，200μM dUTP，10ng/ul权利要求1所述的化学修饰UNG酶。
CN201710491119.7A 2017-06-23 2017-06-23 一种化学修饰ung酶及其修饰方法和应用 Active CN107312762B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710491119.7A CN107312762B (zh) 2017-06-23 2017-06-23 一种化学修饰ung酶及其修饰方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710491119.7A CN107312762B (zh) 2017-06-23 2017-06-23 一种化学修饰ung酶及其修饰方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107312762A CN107312762A (zh) 2017-11-03
CN107312762B true CN107312762B (zh) 2020-08-11

Family

ID=60180110

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710491119.7A Active CN107312762B (zh) 2017-06-23 2017-06-23 一种化学修饰ung酶及其修饰方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107312762B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1151437A (zh) * 1995-08-25 1997-06-11 霍夫曼-拉罗奇有限公司 核酸扩增方法
JP2003199592A (ja) * 2001-12-03 2003-07-15 F Hoffmann La Roche Ag インビトロｄｎａ合成および増幅のための可逆的に修飾された熱安定酵素
CN105008928A (zh) * 2012-12-20 2015-10-28 霍夫曼-拉罗奇有限公司 热稳定的dna聚合酶的表征
CN106367494A (zh) * 2016-08-30 2017-02-01 广州维伯鑫生物科技有限公司 一种rt‑pcr一步法扩增试剂盒抗产物污染的方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1151437A (zh) * 1995-08-25 1997-06-11 霍夫曼-拉罗奇有限公司 核酸扩增方法
JP2003199592A (ja) * 2001-12-03 2003-07-15 F Hoffmann La Roche Ag インビトロｄｎａ合成および増幅のための可逆的に修飾された熱安定酵素
CN105008928A (zh) * 2012-12-20 2015-10-28 霍夫曼-拉罗奇有限公司 热稳定的dna聚合酶的表征
CN106367494A (zh) * 2016-08-30 2017-02-01 广州维伯鑫生物科技有限公司 一种rt‑pcr一步法扩增试剂盒抗产物污染的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
耐热TaqDNA聚合酶的酸酐修饰及其在降低PCR非特异性扩增中的应用评价;周晓薇 等;《浙江农业学报》;20110525;第23卷(第3期);第500-505页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107312762A (zh) 2017-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101870311B1 (ko) 핫스타트 역전사반응 또는 핫스타트 역전사 중합효소 연쇄반응용 조성물
CA2970048C (en) Stable reaction mixtures for nucleic acid amplification
JP2014511701A (ja) 改良された活性を有するｄｎａポリメラーゼ
JP2015500022A (ja) 改善された活性を有するｄｎａポリメラーゼ
WO2016052619A1 (ja) 核酸の増幅方法
US20020172972A1 (en) Use of a selectively inactivatable enzyme to digest contaminating nucleic acid
Barnes et al. A single amino acid change to Taq DNA polymerase enables faster PCR, reverse transcription and strand-displacement
Okano et al. High sensitive RNA detection by one-step RT-PCR using the genetically engineered variant of DNA polymerase with reverse transcriptase activity from hyperthermophilies
CN107312762B (zh) 一种化学修饰ung酶及其修饰方法和应用
EP1769240B1 (en) Purification methods and uses thereof
WO2021221109A1 (ja) Ｒｎａウイルスの検出方法
WO2024031801A1 (zh) 光响应型核酸适配体、光启动dna聚合酶及应用
CN104059905B (zh) 室温扩增dna的方法
CN112280832A (zh) 一种免抽提的核酸检测方法及试剂盒
JPH1084954A (ja) 酵素を熱活性化する方法
Wei et al. Physical and functional interaction between archaeal single-stranded DNA-binding protein and the 5′–3′ nuclease NurA
JPWO2008146649A1 (ja) 酵素含有ゲル及び核酸の増幅キット
JP2005218439A (ja) 核酸検出用チップ
JP4216165B2 (ja) 酵素を熱活性化する方法
JP3709471B2 (ja) 酵素を熱活性化する方法
WO2023246733A1 (en) Methods and systems for nucleic acid detection
JP2006051041A (ja) 酵素を熱活性化する方法
CN117004694A (zh) 一种防止核酸扩增产物所致气溶胶污染的体系和方法
JP6967214B2 (ja) 新規核酸合成法
JP2014171421A (ja) Ｄｎａ親和性物質含有組成物、ｄｎａ親和性物質の精製方法、ｄｎａ親和性物質含有組成物の製造方法およびｄｎａ親和性物質を精製するためのキット

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20211112

Address after: 215000 units 201 and 204, building A6, phase I, biomedical industrial park, 218 Xinghu street, Suzhou Industrial Park, Jiangsu Province

Patentee after: Suzhou Jingrui Biotechnology Co., Ltd

Address before: 215123 units 201 and 204, building A6, biological nano Park, 218 Xinghu street, Suzhou Industrial Park, Suzhou, Jiangsu Province

Patentee before: Suzhou dianjing Biotechnology Co., Ltd