JP6924496B2 - ワンステップ逆転写テンプレートスイッチpcr - Google Patents
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Description
[1]改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いてRNAの少なくとも一部の領域を増幅する核酸の増幅方法であって、
核酸の増幅反応は、RNAを鋳型とする逆転写工程a)と、工程a)で合成されたcDNAにテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを付加するテンプレートスイッチング工程b)と、
工程b)で合成されたテンプレートスイッチcDNAを鋳型とするPCRによるDNA増幅工程c)、からなり、前記工程a)〜c)は同一の反応系において一段階で行われ、
該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、当該改変により逆転写工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、DNA増幅工程c)ではプライマー機能の阻害が解除されることを特徴とする、核酸の増幅方法。
[2]以下の工程:
1)i)テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド、ii)該テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマー、及び改変オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット、並びにiii)鋳型RNA、を含む、該鋳型RNAをcDNAにテンプレートスイッチング逆転写するため、及び該cDNAの少なくとも一部の領域をPCR増幅するために必要な全ての試薬(但し、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを除く)を含む、組成物を提供すること;
2)1)で提供された組成物を、逆転写が進行可能な温度でインキュベートすることにより、該鋳型RNAから、アンカー配列に相補的なヌクレオチド配列が3’末端に付加されたcDNAを生成し、該cDNAを含む反応混合液を得ること;及び
3)2)で得られた反応混合液を、PCRが進行可能な複数回の熱サイクリングプロトコールに付すことにより、該cDNAを鋳型として、前記プライマーセットにより挟まれた領域が増幅された核酸を得ること
を含む、改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いてRNAの少なくとも一部の領域を増幅する核酸の増幅方法であって、
該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、当該改変により逆転写におけるプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、且つ該逆転写の結果、又はPCRの初期熱変性処理によって、プライマー機能の阻害が解除される、方法。
[3]1)で提供される組成物が、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを更に含む、[2]記載の方法。
[4]改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、[1]〜[3]のいずれかに記載の方法。
[5]該改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、[4]記載の方法。
[6]プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAにハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、[5]記載の方法。
[7]逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの濃度が40nM以下である、[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]PCRの熱サイクリングの回数が40回以上である、[1]〜[7]のいずれか記載の方法。
[9]i)テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド;並びに
ii)該テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマー、及び改変オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを含む、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを実施するための、キットであって、
該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、当該改変により逆転写におけるプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、且つ該逆転写の結果、又は熱変性処理により、該逆転写の産物を鋳型とするPCRにおけるプライマー機能を獲得する、キット。
[10]i)のオリゴヌクレオチド、及びii)のプライマーセットを、両者の混合物を含む組成物として含む、[9]記載のキット。
[11]更に、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含む、[9]又は[10]記載のキット。
[12]逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含まない、[9]又は[10]記載のキット。
[A1] 対象RNAの少なくとも一部の領域を増幅する方法であって、該方法は、
a)該対象RNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドおよび該対象RNAに対応する核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、
b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、該cDNAの少なくとも一部の領域を増幅する工程と
を含み、
該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーを含む、方法。
[A2] 対象RNAの少なくとも一部の領域に基づいて増幅された核酸試料を生産する方法であって、該方法は、
a)該対象RNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドおよび該対象RNAに対応する核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、
b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供する工程と
を含み、
該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーを含む、方法。
[A3] 前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、必要に応じて、前記テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含む、[A1]または[A2]に記載の方法。
[A4] 前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まない、[A3]に記載の方法。
[A5] 前記逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、前記混合物中に、約40nM以下の終濃度で、または前記改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下のモル比で含む、[A1]〜[A4]のいずれか一項に記載の方法。
[A6] 前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、[A1]〜[A5]のいずれか一項に記載の方法。
[A7] 前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、[A1]〜[A6]のいずれか一項に記載の方法。
[A8] プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAにハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、[A7]記載の方法。
[A9] 対象RNAの少なくとも一部の領域を増幅するためのキットであって、該キットは、
i)逆転写に必要な試薬と、
ii)テンプレートスイッチに必要な試薬と、
iii)改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬と
iv)必要に応じて、使用説明書
を含み、
i)〜iii)の試薬および該改変オリゴヌクレオチドプライマーが反応開始時においてすべて反応系において混合されていることを特徴とし、該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写が生じる条件下でプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件下でプライマー機能の阻害が解除されるように設計される、キット。
[A10] 前記テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、必要に応じて、該テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含む、[A9]に記載のキット。
[A11] 前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まない、[A10]に記載のキット。
[A12] 前記逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、約40nM以下の終濃度で、または前記改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下のモル比で使用されることを特徴とする、[A9]〜[A11]のいずれか一項に記載のキット。
[A13] 前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、[A9]〜[A12]のいずれか一項に記載のキット。
[A14] 前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、[A9]〜[A13]のいずれか一項に記載のキット。
[A15] プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAにハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、[A14]に記載のキット。
[A16] 改変オリゴヌクレオチドプライマーを含む、対象RNAの少なくとも一部の領域を増幅するための組成物であって、該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写が生じる条件下でプライマー機能の一部が阻害されており、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件でプライマー機能の阻害が解除されるように設計されており、プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAにハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、組成物。
[A17] 前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、[A16]に記載の組成物。
[A18] 前記組成物は、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチPCRにおいて使用されるものである、[A16]または[A17]に記載の組成物。
2)人工塩基を含むプライマーによって逆転写反応段階ではプライマーとして機能を阻害する。
(1)熱不安定性修飾基を含む、オリゴヌクレオチドプライマー
(2)同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取ることで分子内ヘアピンループ形成し、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列がマスクされた構造を呈する、オリゴヌクレオチドプライマー
(3)人工塩基を含む、オリゴヌクレオチドプライマー
以下各態様について詳述する。
(1)熱不安定性修飾基を含む、オリゴヌクレオチドプライマー
本態様においては、オリゴヌクレオチドプライマーが熱不安定性修飾基を含むことにより、修飾ヌクレオチドプライマーは、これがハイブリダイズしたポリヌクレオチドに沿って鎖を伸長することができず、すなわち,酵素の阻害により,または標的核酸へのハイブリダイゼーションの低下により、伸長可能ではない。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプライマーの1又はそれ以上のヌクレオチド間結合又は3’末端ヒドロキシル基に、熱不安定性修飾基が置換する。したがって,鎖伸長は,修飾または修飾されたヌクレオチドが除去されないかぎり,そして除去されるまで,実質的な程度では生じない。該修飾基は熱不安定性であるが、PCR増幅における最初の変性温度(例えば、約80−105℃、好ましくは約85−100℃、より好ましくは約90−96℃(例、95℃))に到達するまでは、殆ど解離しないため、逆転写におけるプライマー機能の一部又は全部が阻害される。最初の変性温度に到達すると、修飾オリゴヌクレオチドプライマーからの修飾基の部分的または完全な解離が熱的に誘導され、修飾オリゴヌクレオチドプライマーは対応する未修飾オリゴヌクレオチドプライマーに変換される。未修飾オリゴヌクレオチドプライマーは,活性状態のホスホジエステル結合を有し,ポリメラーゼによる伸長が可能である。
(1-1) 3’末端のヒドロキシル基が、熱不安定性修飾基に置換された修飾オリゴヌクレオチドプライマー(US patent No. 8133669)
一態様において、該修飾オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端に含まれる該修飾基は、
Z10は、O、S、およびSeからなる群から選択され;
各R7、各R8、各R9、および各R10は、水素、直鎖状または分枝鎖状であり、置換されていてもよい、1〜20個の炭素原子、好ましくは1〜10個の炭素原子、好ましくは1〜6個の炭素原子を有するヒドロカルビル基からなる群から独立に選択され、
該ヒドロカルビルは、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群から選択される少なくとも1個の置換基を包含していてもよい、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり;
各X6、各X7、各X8、および各X9は、アシル、アシルオキシ、アルケニル、アルケニルアリール、アルケニレン、アルキル、低級アルキル、アルキレン、アルキニル、アルキニルアリール、アルコキシ、低級アルコキシ、アルキルアリール、アルキルカルボニルアミノ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アルキルチオ、アルキニレン、アミド、アミジノ、アミノ、アリールアルキニル、アラルキル、アロイル、アリールアルキル、アリール、アリールカルボニルアミノ、アリーレン、アリールオキシ、アリールスルホニルアミノ、カルバメート、ジチオカルバメート、シクロアルケニル、シクロアルキル、シクロアルキレン、グアニジニル、ハロ、ハロゲン、ヘテロアリール、ヘテロアリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、ヘテロ環、ヘテロ環、ヒドロカルビル、ヒドロカルビル、ヒドロカルビルカルボニル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルカルボニルオキシ、ヒドロカルビレン、オルガノスルフィニル、ヒドロキシル、オルガノスルフィニル、オルガノスルホニル、スルフィニル、スルホニル、スルホニルアミノ、およびスルフリルからなる任意の置換または非置換の基から独立に選択され;
各X10は、O、S、Se、NR11、N-OR11、およびCR11R12からなる群から独立に選択され;各R11および各R12は、アシル、アシルオキシ、アルケニル、アルケニルアリール、アルケニレン、アルキル、低級アルキル、アルキレン、アルキニル、アルキニルアリール、アルコキシ、低級アルコキシ、アルキルアリール、アルキルカルボニルアミノ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アルキルチオ、アルキニレン、アミド、アミジノ、アミノ、アリールアルキニル、アラルキル、アロイル、アリールアルキル、アリール、アリールカルボニルアミノ、アリーレン、アリールオキシ、アリールスルホニルアミノ、カルバメート、ジチオカルバメート、シクロアルケニル、シクロアルキル、シクロアルキレン、グアニジニル、ハロ、ハロゲン、ヘテロアリール、ヘテロアリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、ヘテロ環、ヘテロ環、ヒドロカルビル、ヒドロカルビル、ヒドロカルビルカルボニル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルカルボニルオキシ、ヒドロカルビレン、オルガノスルフィニル、ヒドロキシル、オルガノスルフィニル、オルガノスルホニル、スルフィニル、スルホニル、スルホニルアミノ、およびスルフリルからなる任意の置換または非置換の基から独立に選択され;
各Y1は、O、S、Se、NR6、N-OR6、およびCR6R7からなる群から独立に選択される]
からなる群から選択されるいずれかの基である。
Z3は3’-O-オリゴヌクレオチジル残基、またはオリゴヌクレオチドプライマーであり、
Bは、置換もしくは非置換のプリンもしくはピリミジン、その任意のアザ誘導体もしくはデアザ誘導体、または核酸ポリメラーゼにより認識可能であることが好ましい、任意のNTP類似体による任意の「ユニバーサル塩基」もしくは「縮重塩基」から選択され;
Aは、O、S、Se、CR1R2、およびNR1からなる群から選択され;
各R1および各R2は、H、F、Cl、Br、I、OR3、SR3、NR3R4、C(Y)R5、ならびに置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキルからなる群から独立に選択され、
任意の置換基は各々、場合によって、1つまたは複数のヘテロ原子を含有する可能性があり;
各Yは、O、S、Se、CR1R2、およびNR1からなる群から独立に選択され;
各R3および各R4は、H、または置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のアラルキルからなる群から独立に選択され、
任意の置換基は各々、場合によって、1つまたは複数のヘテロ原子を含有する可能性があり;
各R5は、H、F、Cl、Br、OR3、SR3、NR3R4、ならびに置換または非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のアラルキルからなる群から独立に選択され、
任意の置換基は各々、場合によって、1つまたは複数のヘテロ原子を含有する可能性があり;
X4は、R1、F、Cl、Br、I、OR3、SR3、SeR3、NR3R4、NR3OR3、NR3-NR3R4、CN、N3、C(Y)R5、NO2、CN、およびSSR3からなる群から独立に選択され;
X5は、O、S、Se、NR6、N-OR6、およびCR6R7からなる群から選択され;
Y1は、O、S、Se、NR6、N-OR6、CR6R7、およびC(Y)からなる群から選択され;
各R6および各R7は、水素、また、直鎖状または分枝鎖状であり、置換されていてもよい、
1〜20個の炭素原子、好ましくは1〜10個の炭素原子、好ましくは1〜6個の炭素原子を有するヒドロカルビル基からなる群から独立に選択され、
該ヒドロカルビルは、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群から選択される少なくとも1個の置換基を包含していてもよい、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり;
X5およびY1は各々、場合によって、式IBで示されるNTP分子のX4、X5、Z3、A、W、またはB部分に対して、適切な原子または原子群を介して共有結合する可能性がある]
で表される化合物である。
(1-2) 1又はそれ以上のヌクレオチド間結合において熱不安定性修飾基を含む修飾オリゴヌクレオチドプライマー(US patent No. 8361753)
1つの態様においては、該修飾オリゴヌクレオチドプライマー中の修飾基は、式I:
Lは、1−10個の炭素原子、好ましくは2−5個の炭素原子、より好ましくは3−4個の炭素原子、さらにより好ましくは4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基であり;
Xは、O、S、S(O)、S(O)2、C(O)、C(S)またはC(O)NHであり;および
R1は、水素または1−20個の炭素原子、好ましくは1−10個の炭素原子、より好ましくは1−6個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり;好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、これは任意に、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよい]
の化合物を含む。
Lは、1−10個の炭素原子、好ましくは2−5個の炭素原子、より好ましくは3−4個の炭素原子、さらにより好ましくは4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基であり;および
R1は水素または1−20個の炭素原子、好ましくは1−10個の炭素原子、より好ましくは1−6個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり;好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、これは任意に、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよい]
の化合物を提供する。
kは0−2の整数であり;
Lは、1−10個の炭素原子、好ましくは2−5個の炭素原子、より好ましくは3−4個の炭素原子、さらにより好ましくは4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基であり;および
R1は、水素または1−20個の炭素原子、好ましくは1−10個の炭素原子、より好ましくは1−6個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり;好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、これは任意に、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよい]
の化合物を提供する。
Lは、1−10個の炭素原子、好ましくは2−5個の炭素原子、より好ましくは3−4個の炭素原子、さらにより好ましくは4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基であり;および
R1は、水素または1−20個の炭素原子、好ましくは1−10個の炭素原子、より好ましくは1−6個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり;好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、これは任意に、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよい]
の化合物を提供する。
Lは、1−10個の炭素原子、好ましくは2−5個の炭素原子、より好ましくは3−4個の炭素原子、さらにより好ましくは4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり;および
各R1は、独立して、水素または1−20個の炭素原子、好ましくは1−10個の炭素原子、より好ましくは1−6個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり;好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、これは任意に、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよい]
の化合物を提供する。
(N-アセチル-N-メチル)アミノエチルが挙げられる(下記に示す):
別の態様において、修飾基は式II:
Lは、1−10個の炭素原子、好ましくは2−5個の炭素原子、より好ましくは3−4個の炭素原子、さらにより好ましくは4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり;および
R2は、水素、シアノ、または5−10個の原子を有する任意に置換されていてもよい炭素環、複素環、アリールまたはヘテロアリールである]
の化合物を提供する。
別の態様において、修飾基は式III:
LaおよびLbは、それぞれ独立して、単結合、または1−8個の炭素原子、好ましくは2−5個の炭素原子、より好ましくは3−4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基から選択され;
Aは、O、S、S(O)、S(O)2、Se、CR3R4、NR3、C(O)、C(S)またはCNR3であり;
Bは、C(O)R3、C(S)R3、C(O)NR3R4、OR3またはSR3であり;および
R3およびR4は、それぞれ独立して、水素または1−20個の炭素原子、好ましくは1−10個の炭素原子、好ましくは1−6個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり;好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、これは任意に、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよい]
の化合物を提供する。
La、LbおよびLcは、それぞれ独立して、単結合、または1−8個の炭素原子、好ましくは2−5個の炭素原子、より好ましくは3−4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基から選択され;
Dは、O、S、S(O)、S(O)2、CR5R6、またはNR5であり;
Eは、O、S、S(O)、S(O)2、CR5R6、またはNR6であり;
Fは、水素、C(O)R7、C(S)R7、C(O)NR7R8、OR7またはSR7であり;
R5およびR6は、それぞれ独立して、水素、アリール、アルキル、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、またはアミノであってもよく、またはR5およびR6は、一緒になって、5−10個の原子からなり、D、R5、R6、EおよびLbを含む単環または二環を形成してもよく、ただし、R5およびR6が一緒になって環を形成する場合、nは0−2であり;および
R7およびR8は、それぞれ独立して、アリール、アルキル、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アミド、任意に置換されていてもよいシクロアルキル、任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、任意に置換されていてもよいアリール、任意に置換されていてもよいアリールオキシ、または任意に置換されていてもよいヘテロアリールから選択される]
の化合物を提供する。
1つの態様において、修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、構造I:
Nucはプライマー配列中のヌクレオシドであり;
UおよびZは、独立して、O、S、Se、NR9、またはCR9R10であり;
R9およびR10は、それぞれ独立して、水素、または1−10個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビルであり;好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、それぞれは独立して、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アミドまたは検出可能な標識から選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよく;
Yは、O、SまたはSeであり;
Wは、Qが熱的に切断されることを可能とする任意の化学成分、例えばO、S、S(O)、S(O)2、Se、C(O)、C(S)、C(O)NH、C(N)H、NH、-C(=NR11)-またはNR9であり;
R11は、水素または1−10個の炭素原子、好ましくは1−6個の炭素原子を有する任意に置換されていてもよいヒドロカルビルであり;好ましくは、R11は、H、アルキルまたは低級アルキルであり;および
Qは1またはそれ以上の熱切断性基を含む修飾基である]
の修飾骨格を有する。
(2)同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取ることで分子内ヘアピンループを形成し、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列がマスクされた構造を呈する、オリゴヌクレオチドプライマー
該態様においては、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取ることで分子内ヘアピンループを形成する。当該相補領域は、1又はそれ以上のオリゴヌクレオチドで構成される第1の配列と、それに対して1又はそれ以上の相補的なオリゴヌクレオチドを含む第2の配列の組みを指す。
(3)人工塩基を含む、オリゴヌクレオチドプライマー
該態様の改変オリゴヌクレオチドプライマーは、人工塩基(非天然塩基)を含むので、該改変オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列の相補配列が、鋳型RNA(人工塩基を含まない鋳型RNA)中に実質的に存在しない。そのため、鋳型RNAへの該改変オリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーションが抑制されているので、逆転写におけるプライマー機能の一部又は全部が阻害されることになる。一態様において、該改変オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端の15塩基のうち、1塩基以上、好ましくは、3塩基以上、5塩基以上、10塩基以上、12塩基以上、好ましくは15塩基全てが、人工塩基である。好ましい態様において、該改変オリゴヌクレオチドプライマーの最も3’末端の塩基が、人工塩基である。
i)テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド、
ii)該テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマー、及び上記改変オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット、並びに
iii)鋳型RNA
を含む、該鋳型RNAをcDNAにテンプレートスイッチング逆転写するため、及び該cDNAの少なくとも一部をPCR増幅するために必要な全ての試薬(但し、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを除く)を含む、組成物が提供される。
・逆転写酵素(RNA依存性DNAポリメラーゼ)
・耐熱性DNAポリメラーゼ(DNA依存的DNAポリメラーゼ)
・dNTPs混合物
cDNAの3’末端にRT付加配列を形成するため、使用する逆転写酵素はターミナルトランスフェラーゼ活性を有する。ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素としては、Moloney Murine Leukemia Virus由来の逆転写酵素(MMLV RT)等が挙げられるが、これらに限定されない。ターミナルトランスフェラーゼ活性は、好ましくは、シトシンリッチな短い配列(例、CC、CCC、CCCC)を、合成したcDNAの3’末端に付加する活性である。
i)テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド;並びに
ii)該テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマー、及び改変オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット
を含む、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを実施するための、キットであって、
該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、当該改変により逆転写におけるプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、且つ該逆転写の結果、又は熱変性処理により、該逆転写の産物を鋳型とするPCRにおけるプライマー機能を獲得する、キットをも提供する。
Block primer: GAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAATCTC(配列番号1)
RT primer: AAGCACACGAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAA(配列番号2)
Template switch Oligo (3’の3塩基はRNA):AAGCAGTGGTATACCCGCAGAGTACATrGrGrG(配列番号3)
Block primer及びRT primerは、マウスTCRβ鎖の定常領域に特異的なリバースプライマーである。全配列がTCRβmRNAにハイブリダイズするように設計されている。RT primerは3’側に4塩基分、nestedに設計されている。またRT primerは、5’側を8塩基伸ばし、affinityを高くしている。これらのプライマーを用いて逆転写テンプレートスイッチングPCRを行うことにより、TCRβ鎖をコードするmRNAの定常領域から5’末端までを増幅することができる。増幅される領域には、抗原認識部位を含む再構成されたVDJや非翻訳領域などが含まれる。従って、T細胞集団から採取したtotal RNAを鋳型として、これらのプライマーを用いて逆転写テンプレートスイッチングPCRを行うことにより、TCRβ鎖の抗原認識部位や非翻訳領域などのcDNAライブラリーを構築することができる。また、セルソーター等によりソートしたシングルセルのT細胞をそのまま鋳型として用いれば(細胞内のRNAが鋳型となる)、個々の細胞のTCRβ鎖の抗原認識部位を特異的に増幅し、その配列を決定することができる。
以下のTotal RNA濃度、ブロックプライマー濃度、及びRTプライマー濃度の条件で、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを行った。
以下の細胞数、ブロックプライマー濃度、及びRTプライマー濃度の条件で、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを行った。PCRのサイクル数は48とした。
シングルセルのマウスT細胞に、直接ワンステップで反応溶液を加え、ダイレクトワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを行った。PCRのサイクル数は56とした。
PCR増幅のサイクル数を種々変動させた(サイクル数:38、40、42及び44)。Block primer濃度は0.4μM、RT primer濃度は0.002nMとした。
以下のTotal RNA濃度、ブロックプライマー濃度、及びRTプライマー濃度の条件で、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを行った。PCRのサイクル数は42回とした。
本試験例では、単一の制御性T細胞からTCRα鎖の抗原認識部位を特異的に増幅した。
Block primer:GAGGATCTTTTAACTGGTACACAGCAGGTTCTG(配列番号4)
RT primer: CGG TGA ACA GGC AGA GGG TG(配列番号5)
Template switch Oligo(3'末端から1つ目はLNA, 二つ目と三つ目はRNA):AAGCAGTGGTATACCCGCAGAGTACATrGrG(L)G(配列番号3)
Block primer及びRT primerは、マウスTCRα鎖の定常領域に特異的なリバースプライマーである。これらのプライマーを用いて逆転写テンプレートスイッチングPCRを行うことにより、TCRα鎖をコードするmRNAの定常領域から5’末端までを増幅することができる。増幅される領域には、抗原認識部位を含む再構成されたVDJや非翻訳領域などが含まれる。従って、T細胞集団から採取したtotal RNAを鋳型として、これらのプライマーを用いて逆転写テンプレートスイッチングPCRを行うことにより、TCRβ鎖の抗原認識部位や非翻訳領域などのcDNAライブラリーを構築することができる。また、セルソーター等によりソートしたシングルセルのT細胞をそのまま鋳型として用いれば(細胞内のRNAが鋳型となる)、個々の細胞のTCRα鎖の抗原認識部位を特異的に増幅し、その配列を決定することができる。
Claims (20)
- 対象RNAの少なくとも一部の領域を増幅する方法であって、該方法は、
a)該対象RNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドおよび該対象RNAに対応する核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、
b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、該cDNAの少なくとも一部の領域を増幅する工程と
を含み、
該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーを含む、方法。 - 対象RNAの少なくとも一部の領域に基づいて増幅された核酸試料を生産する方法であって、該方法は、
a)該対象RNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドおよび該対象RNAに対応する核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、
b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供する工程と
を含み、
該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーを含む、方法。 - 前記逆転写、前記テンプレートスイッチ、および前記ポリメラーゼ連鎖反応が、同一反応系で行われることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- 前記混合物にさらなる試薬を添加することなく、前記逆転写、前記テンプレートスイッチ、および前記ポリメラーゼ連鎖反応が、行われることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、必要に応じて、前記テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まない、請求項5に記載の方法。
- 前記逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、前記混合物中に、約40nM以下の終濃度で、または前記改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下のモル比で含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAにハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、請求項9記載の方法。
- 対象RNAの少なくとも一部の領域を増幅するためのキットであって、該キットは、
i)逆転写に必要な試薬と、
ii)テンプレートスイッチに必要な試薬と、
iii)改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬と
iv)必要に応じて、使用説明書
を含み、
i)〜iii)の試薬および該改変オリゴヌクレオチドプライマーが反応開始時においてすべて反応系において混合されていることを特徴とし、該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写が生じる条件下でプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件下でプライマー機能の阻害が解除されるように設計される、キット。 - 前記テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、必要に応じて、該テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項11に記載のキット。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まない、請求項12に記載のキット。
- 前記逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、約40nM以下の終濃度で、または前記改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下のモル比で使用されることを特徴とする、請求項11〜13のいずれか一項に記載のキット。
- 前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、請求項11〜14のいずれか一項に記載のキット。
- 前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項11〜15のいずれか一項に記載のキット。
- プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAにハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、請求項16に記載のキット。
- 前記キットは、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチPCRにおいて使用されるものである、請求項11〜17のいずれか一項に記載のキット。
- 改変オリゴヌクレオチドプライマーを含む、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチPCRにおいて対象RNAの少なくとも一部の領域を増幅するための組成物であって、該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写が生じる条件下でプライマー機能の一部が阻害されており、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件でプライマー機能の阻害が解除されるように設計されており、プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAにハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、組成物。
- 前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、請求項19に記載の組成物。
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