CN109328235A - 一步逆转录模板转换pcr - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于更快、更容易，且具有高特异性地进行一步逆转录模板转换PCR的技术。本发明提供了使用经修饰的寡核苷酸引物扩增RNA的至少一部分区域的核酸扩增方法，所述核酸扩增方法的特征如下：核酸扩增反应包括逆转录步骤a)，其中RNA用作模板，模板转换步骤b)，其中将模板转换寡核苷酸加入到步骤a)中合成的cDNA中，和DNA扩增步骤c)，其中通过PCR进行DNA扩增，其中步骤b)中合成的模板转换cDNA用作模板；步骤a)至c)在同一反应体系中的单个阶段中进行；该经修饰的寡核苷酸在逆转录步骤a)中引物功能部分地封闭或完全地封闭，并在DNA扩增步骤c)中清除引物功能的封闭。

Description

一步逆转录模板转换PCR
技术领域
本发明涉及以一步进行逆转录模板转换PCR的技术。
背景技术
逆转录聚合酶链反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction；RT-PCR)作为一种使用RNA为模板扩增特定基因的方法，广泛用于基因工程领域。在RT-PCR中，首先使用逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)将RNA逆转录成cDNA，然后通过耐热DNA聚合酶扩增至该cDNA可检测水平。虽然这种反应组合通常分两步进行(每个反应使用一个单独的管并连续反应)，但正在开发通过改进逆转录酶或反应溶液成分来以一步完成该反应组合(在单个管中连续反应)的技术。
模板转换(Template Switching)是一种即使模板RNA的5'末端的序列是未知的或缺乏共有序列，也能使用RNA为模板进行RT-PCR扩增的技术。在模板转换中利用这样一种现象：当逆转录酶到达模板RNA的5'末端时，通过逆转录酶的末端转移酶活性将短的特异性序列(例如，莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus)来源的逆转录酶(MMLVRT)的富含胞嘧啶的短序列)自动添加到新合成的cDNA的3'末端。如果在逆转录时将在锚定序列的3'末端添加有与该短添加序列互补的序列的寡核苷酸(模板转换寡核苷酸)添加到体系中，则该模板转换寡核苷酸与合成的cDNA3'末端杂交以延伸用于逆转录酶的模板。由于逆转录酶转换模板继续cDNA合成到锚定序列的5'末端，将与锚定序列互补的序列添加到cDNA的3'末端。通过使用包含与模板RNA中的特定序列互补的序列的寡核苷酸DNA或在5'末端添加有特定已知序列的寡核苷酸DNA作为逆转录引物，新合成的cDNA在5'末端也具有已知序列，结果，新合成的cDNA(反义链)在5'末端和3'末端都将包含已知序列。因此，使用基于这些已知序列设计的引物组能够进行PCR扩增。
通过使用随机引物或含有与poly-(A)尾互补的oligo(dT)引物的逆转录，实现对应于具有poly-(A)尾的mRNA的cDNA的合成。在该反应中，从所有具有poly-(A)尾的mRNA合成cDNA，从而构建cDNA文库。同时，在逆转录中通过使用对特定基因特异的引物，可以仅特异性合成特定基因的cDNA。
需要一种用于以更高的特异性更快和更简单地进行逆转录模板转换PCR的技术，使得PCR可以应用于高通量操作。
同时，已经开发了各种热启动技术作为用于避免PCR中的副反应的技术。换句话说，进行PCR时，从制备反应溶液直到热循环仪的温度升高，PCR反应混合物暴露在室温至50℃的温度下。由于引物的Tm通常被设置为50℃以上，因此在该温度范围内不能充分展现引物的特异性。同时，聚合酶在该温度范围内展现出活性(尽管是弱活性)，导致以错误退火的引物为起点的延伸，成为引起各种副反应(引物二聚体、额外条带等)的原因。作为避免这种副反应的技术，正在开发与不耐热修饰基团结合的寡核苷酸引物(专利文献1和2，以及非专利文献1和2)。在该寡核苷酸引物中，在3'末端羟基或者一个以上的核苷酸间键有修饰基团取代。由于该修饰基团的保护，在PCR扩增中的第一个高温孵育期之前抑制DNA聚合酶介导的寡核苷酸引物延伸。由于存在修饰基团，引物在达到第一变性温度(在大多数情况下为95℃)之前是无活性的。在达到第一变性温度后，修饰基团脱离，从而成为能够通过聚合酶延伸的相应的未经修饰的寡核苷酸引物。
[引用列表]
[专利文献]
专利文献1：美国专利No.8133669
专利文献2：美国专利No.8361753
[非专利文献]
非专利文献1：Curr Protoc Nucleic Acid Chem.2009Sep；Chapter 4:Unit 4.35 1-17
非专利文献2：Nucleic Acids Res.2008Nov；36(20):e131
发明内容
[问题的解决方案]
本发明提供了一种用于更快和更简单地以高特异性进行逆转录模板转换PCR的技术。
在下文中更详细地描述本发明。发明人尝试了在逆转录模板转换PCR中，使用对特定基因特异的引物作为逆转录引物，并使用具有模板转换引物中的锚定序列的寡核苷酸和所述逆转录引物的组合作为用于PCR的引物组，来以一步(同一反应体系中的一个阶段)进行逆转录和PCR的反应组合。但是，在该方法中引起副反应。特别是，当模板RNA的拷贝数低且PCR循环数高时，这种趋势是显著的。引起副反应的可能原因包括：PCR的特异性仅依赖于逆转录引物；由于逆转录引物相对于模板RNA的拷贝数明显是过量的，逆转录引物非特异性地与模板RNA杂交，导致非特异性逆转录。
在此，在上述反应组合中，逆转录引物不仅在逆转录中用作引物，还在反应组合的PCR中用作引物，但对其改进，将使用不耐热修饰基团保护与逆转录引物相同的寡核苷酸的3'末端OH而失活的引物(下文中，失活的引物也称为封闭引物)作为PCR用的引物，并且减少加入的逆转录引物的量，由此成功地抑制了副反应。根据该方法，在逆转录中，逆转录引物和封闭引物与模板RNA杂交，其中封闭引物由于修饰基团的保护而不能促进逆转录，以至于逆转录仅从逆转录引物起始。即使封闭引物非特异性地与模板RNA杂交，也不产生逆转录产物。通过PCR扩增中的第一次高温孵育，修饰基团脱离封闭引物而转化为未修饰的引物时，可以促进延伸反应，从而进行PCR。令人惊讶的是，即使通过仅添加封闭引物而不添加未修饰的逆转录引物，以一步进行逆转录模板转换PCR，也可以实现高特异性的PCR扩增。
在基于这些发现的进一步研究之后，发明人完成了本发明。
换句话说，本发明包括以下内容：
[1]
一种扩增核酸的方法，该方法使用经修饰的寡核苷酸引物扩增RNA的至少一部分区域，
其中，核酸的扩增反应由下列步骤组成：逆转录步骤a)，使用RNA作为模板；模板转换步骤b)，将模板转换寡核苷酸添加到步骤a)中合成的cDNA；和DNA扩增步骤c)，通过使用步骤b)中合成的模板转换cDNA作为模板的PCR扩增，其中，步骤a)至c)在同一反应体系中的一个阶段中进行，
其中，该经修饰的寡核苷酸引物的特征在于，通过该修饰，引物功能在逆转录步骤a)中部分地封闭或完全地封闭，并且在DNA扩增步骤c)中清除引物功能的封闭。
[2]
一种扩增核酸的方法，该方法使用经修饰的寡核苷酸引物扩增RNA的至少一部分区域，包括如下步骤：：1)提供包含用于将模板RNA模板转换逆转录成cDNA以及用于PCR扩增该cDNA的至少一部分区域所需的所有试剂(不包括使逆转录开始的寡核苷酸引物)的组合物，包括i)模板转换寡核苷酸，ii)引物组，其由5'锚定寡核苷酸引物和经修饰的寡核苷酸引物组成，所述5'锚定寡核苷酸引物包含模板转换寡核苷酸中所包含的锚定序列的至少一部分，和iii)模板RNA；
2)在可进行逆转录的温度下孵育1)中提供的组合物，从而由所述模板RNA产生在3'末端添加有与锚定序列互补的核苷酸序列的cDNA，并获得包含该cDNA的反应混合物；和
3)将2)中得到的反应混合物经历多轮PCR可以进行的热循环方案，从而使用该cDNA作为模板，获得夹在所述引物组之间的区域扩增的核酸；
其中，经修饰的寡核苷酸引物，通过该修饰，在逆转录中引物功能部分地封闭或完全地封闭，并且通过该逆转录的结果或通过PCR的初期热变性处理，清除引物功能的封闭。
[3]
[2]所述的方法，其中，1)提供的组合物进一步包含使逆转录开始的寡核苷酸引物。
[4]
[1]-[3]中任一项所述的方法，其中，所述经修饰的寡核苷酸引物在同一经修饰的寡核苷酸引物的序列上具有一个或更多个互补区域，并且在PCR的初期热变性处理之前通过该互补区域具有转角结构，或包含不耐热的修饰基团。
[5]
[4]所述的方法，其中，该经修饰的寡核苷酸引物包含与所述模板RNA的一部分序列互补的核苷酸序列。
[6]
[5]所述的方法，其中，引物功能尚未被封闭的一部分的经修饰的寡核苷酸引物起到通过与模板RNA杂交而使逆转录开始的寡核苷酸引物的作用。
[7]
[1]-[6]中任一项所述的方法，其中，使逆转录开始的寡核苷酸引物的浓度为40nM以下。
[8]
[1]-[7]中任一项所述的方法，其中，PCR的热循环次数为40次以上。
[9]
一种用于进行一步逆转录模板转换PCR的试剂盒，包括：
i)模板转换寡核苷酸；和
ii)引物组，其由5'锚定寡核苷酸引物和经修饰的寡核苷酸引物组成，所述5'锚定寡核苷酸引物含模板转换寡核苷酸中所包含的锚定序列的至少一部分；
其中，通过该修饰，该经修饰的寡核苷酸引物的引物功能在逆转录中部分地封闭或完全地封闭，并且通过该逆转录的结果或通过热变性处理，获得在使用该逆转录产物作为模板的PCR中的引物功能。
[10]
[9]所述的试剂盒，以包含两者的混合物的组合物形式，包含i)的寡核苷酸和ii)的引物组的混合物。
[11]
[9]或[10]所述的试剂盒，进一步包含使逆转录开始的寡核苷酸引物。
[12]
[9]或[10]所述的试剂盒，其不包含使逆转录开始的寡核苷酸引物。
[A1]
一种扩增靶RNA的至少一部分区域的方法，所述方法包括以下步骤：
a)混合所述靶RNA、逆转录所需的试剂、模板转换所需的试剂和聚合酶链反应所需的试剂，并使混合物经历发生逆转录的条件以提供cDNA，所述cDNA包含模板转换寡核苷酸以及与所述靶RNA对应的核酸序列；和
b)使步骤a)中获得的cDNA经历发生聚合酶链反应的条件，以扩增所述cDNA的至少一部分区域；
其中，所述聚合酶链式反应所需的试剂包含经修饰的寡核苷酸引物，所述经修饰的寡核苷酸引物设计成在步骤a)中引物功能部分地封闭或完全地封闭，并设计成在步骤b)中清除引物功能的封闭。
[A2]
一种产生基于靶RNA的至少一部分区域扩增的核酸样品的方法，所述方法包括以下步骤：
a)混合所述靶RNA、逆转录所需的试剂、模板转换所需的试剂和聚合酶链反应所需的试剂，并使混合物经历发生逆转录的条件以提供cDNA，所述cDNA包含模板转换寡核苷酸以及与所述靶RNA对应的核酸序列；和
b)使步骤a)中获得的cDNA经历发生聚合酶链反应的条件；
其中，所述聚合酶链式反应所需的试剂包含经修饰的寡核苷酸引物，所述经修饰的寡核苷酸引物设计成在步骤a)中引物功能部分地封闭或完全地封闭，并设计成在步骤b)中清除引物功能的封闭。
[A3]
[A1]或[A2]所述的方法，其中，所述聚合酶链反应所需的试剂根据需要包含5'锚定寡核苷酸引物，所述5'锚定寡核苷酸引物含所述模板转换寡核苷酸中所包含的锚定序列的至少一部分。
[A4]
[A3]所述的方法，其中，所述聚合酶链反应所需的试剂不包含所述5'锚定寡核苷酸引物。
[A5]
[A1]-[A4]中任一项所述的方法，其中，所述逆转录所需的试剂包含使逆转录开始的寡核苷酸引物，并且所述使逆转录开始的寡核苷酸引物以约40nM以下的终浓度，或相对于所述经修饰的寡核苷酸引物约10分之1以下的摩尔比包含在所述混合物中。
[A6]
[A1]-[A5]中任一项所述的方法，其中，所述经修饰的寡核苷酸引物在同一经修饰的寡核苷酸引物的序列上具有一个或更多个互补区域，并且在PCR的初期热变性处理之前通过所述互补区域具有转角结构，或包含不耐热的修饰基团。
[A7]
[A1]-[A6]中任一项所述的方法，其中，所述经修饰的寡核苷酸引物包含与模板RNA的一部分序列互补的核苷酸序列。
[A8]
[A7]所述的方法，其中，引物功能尚未被封闭的一部分的经修饰的寡核苷酸引物起到通过与所述模板RNA杂交而使逆转录开始的寡核苷酸引物的作用。
[A9]
一种用于扩增靶RNA的至少一部分区域的试剂盒，所述试剂盒包括：
i)逆转录所需的试剂；
ii)模板转换所需的试剂；
iii)使用经修饰的寡核苷酸引物进行聚合酶链反应所需的试剂；和
iv)根据需要，用户手册；
其特征在于，在反应开始时，将所述i)至iii)的试剂和所述经修饰的寡核苷酸引物全部混合在反应体系中，其中，所述经修饰的寡核苷酸引物设计成在发生逆转录的条件下引物功能部分地封闭或完全地封闭，并设计成在发生聚合酶链反应的条件下清除引物功能的封闭。
[A10]
[A9]所述的试剂盒，其中，所述模板转换所需的试剂包含模板转换寡核苷酸，并且所述聚合酶链反应所需的试剂根据需要包含5'锚定寡核苷酸引物，所述5'锚定寡核苷酸引物含所述模板转换寡核苷酸中所包含的锚定序列的至少一部分。
[A11]
[A10]所述的试剂盒，其中，所述聚合酶链式反应所需的试剂不包含所述5'锚定寡核苷酸引物。
[A12]
[A9]至[A11]中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述逆转录所需的试剂包含使逆转录开始的寡核苷酸引物，并且所述使逆转录开始的寡核苷酸引物以约40nM以下的终浓度，或相对于所述经修饰的寡核苷酸引物约10分之1以下的摩尔比来使用。
[A13]
[A9]至[A12]中任一项所述的试剂盒，其中，所述经修饰的寡核苷酸引物在同一经修饰的寡核苷酸引物的序列上具有一个或更多个互补区域，并且在PCR的初期热变性处理之前通过所述互补区域具有转角结构，或包含不耐热的修饰基团。
[A14]
[A9]至[A13]中任一项所述的试剂盒，其中，所述经修饰的寡核苷酸引物包含与模板RNA的一部分序列互补的核苷酸序列。
[A15]
[A14]所述的试剂盒，其中，引物功能尚未被封闭的一部分的所述经修饰的寡核苷酸起到通过与所述模板RNA杂交而使逆转录开始的寡核苷酸引物的作用。
[A16]
一种用于扩增靶RNA的至少一部分区域的组合物，所述组合物包含经修饰的寡核苷酸引物，其中，所述经修饰的寡核苷酸引物设计成在发生逆转录的条件下引物功能部分地封闭或完全地封闭，并设计成在发生聚合酶链反应的条件下清除引物功能的封闭，其中，引物功能尚未被封闭的一部分的所述经修饰的寡核苷酸引物起到通过与模板RNA杂交而使逆转录开始的寡核苷酸引物的作用。
[A17]
[A16]所述的组合物，其中，所述经修饰的寡核苷酸引物在同一经修饰的寡核苷酸引物的序列上具有一个或更多个互补区域，并且在PCR的初期热变性处理之前通过所述互补区域具有转角结构，或包含不耐热的修饰基团。
[A18]
[A16]或[A17]所述的组合物，其中，所述组合物用于一步逆转录模板转换PCR。
在本发明中，前述一个或更多个前述特征除了作为明确示出的组合之外，旨在可提供进一步组合。根据需要通过阅读和理解以下详细描述，本领域技术人员将认识到本发明的进一步实施方案和优点。
[发明的有益效果]
根据本发明，可以预期逆转录模板转换PCR以一个步骤以高特异性进行。特别地，即使模板RNA的拷贝数低且PCR循环数高，也可以预期在抑制副反应的同时扩增特异性PCR产物。
附图说明
[图1]显示了在各种条件下，通过一步逆转录模板转换PCR扩增TCRβ链。箭头表示全长TCRβ链的条带。
[图2]显示了在各种条件下，通过一步逆转录模板转换PCR扩增TCRβ链。箭头表示全长TCRβ链的条带。
[图3]显示使用T细胞的单个细胞作为模板，通过一步逆转录模板转换PCR扩增TCRβ链。上侧箭头表示全长TCRβ链的条带。下侧箭头表示TCRβ链片段的条带。
[图4]显示了在各种条件下，通过一步逆转录模板转换PCR扩增TCRβ链。箭头表示全长TCRβ链的条带。
[图5]显示了在各种条件下，通过一步逆转录模板转换PCR扩增TCRβ链。箭头表示TCRβ链的靶序列的全长条带。
[图6]显示使用T细胞的单个细胞作为模板，通过一步逆转录模板转换PCR扩增TCRα链。箭头表示TCRα链的靶序列的全长条带。
具体实施方式
在下文中解释本发明。在整个说明书中，除非另外特别说明，否则单数表达应理解为包含其复数形式的概念。因此，除非另外特别说明，否则单数冠词(例如，在英语的情况下为“a”，“an”，“the”等)也应该理解为包含复数形式的概念。进一步地，除非另外特别说明，否则本文使用的术语应理解为以本领域常用的含义使用。因此，除非另外定义，否则本文使用的所有术语和科学技术术语具有与本发明所属领域的技术人员的一般理解相同的含义。在矛盾的情况下，本说明书(包括定义)优先。如本文所用，“约”进行数值意味着随后数值的±10％。
本发明涉及通过一步逆转录模板转换PCR扩增模板RNA的至少一部分区域的方法。
逆转录模板转换PCR是即使模板RNA的5'末端的序列是未知的或缺乏共有序列，也能使用RNA作为模板进行RT-PCR扩增的技术。逆转录模板转换PCR利用这样一种现象：当逆转录酶到达模板RNA的5'末端时，通过逆转录酶的末端转移酶活性将短的特异性序列自动添加到新合成的cDNA的3'末端。例如，莫洛尼鼠白血病病毒来源的逆转录酶(MMLV RT)将富含胞嘧啶的短序列(例如，CC、CCC或CCCC)添加到合成的cDNA的3'末端。如果含有在特定锚定序列(第一锚定序列)的3'末端添加有与该短添加序列互补的序列的核苷酸序列的寡核苷酸(模板转换寡核苷酸)在逆转录时被添加到体系中，，则通过添加到cDNA的3'末端的序列与添加到模板转换寡核苷酸的3'末端的序列的互补序列之间的相互作用，模板转换寡核苷酸与合成的cDNA的3'末端杂交，以延伸用于逆转录酶的模板。由于在到达模板RNA的5'末端后，逆转录酶将模板转换为模板转换寡核苷酸并向其5'末端继续cDNA合成，将与模板转换寡核苷酸锚定序列(第一锚定序列)互补的序列添加到cDNA的3'末端。通过使用包含与模板RNA中的特定序列互补的序列的寡核苷酸引物或添加至5'末端的具有特定锚定序列(第二锚定序列)的寡核苷酸引物(随机引物、oligo(dT)等)作为逆转录引物，新合成的cDNA在5'末端也具有已知序列。结果，通过使用包含含有该已知序列的寡核苷酸引物和含有所述第一锚定序列的至少一部分的寡核苷酸引物的引物组，可以使用新合成的cDNA作为模板进行PCR扩增。
在一些实施方案中，在模板RNA的5'末端侧的序列是已知的情况下，也可以不进行模板转换。
在本发明的方法中，逆转录模板转换PCR以“一步(一阶段)”进行。“一步逆转录模板转换PCR(RT-TS-PCR)”是指用于从逆转录反应中扩增核酸的方法，其特征在于具有逆转录、模板转换和PCR所需的所有试剂在反应开始时混合，并在相同的反应体系中推进反应而不添加额外的逆转录所需的试剂、模板转换所需的试剂或PCR扩增所需的试剂，并且优选不打开反应体系(例如，不添加试剂或不打开/关闭管子)。
换句话说，在本发明的方法中，核酸的扩增反应由下列步骤组成：逆转录步骤a)，使用RNA作为模板；模板转换步骤b)，将模板转换寡核苷酸添加到步骤a)中合成的cDNA；和DNA扩增步骤c)，通过使用步骤b)中合成的模板转换cDNA作为模板的PCR扩增，其中，所述步骤a)至c)在同一反应体系的一个阶段中进行。
在另一个实施方案中，本发明是扩增靶RNA的至少一部分区域的方法，该方法包括以下步骤：a)混合靶RNA、逆转录所需的试剂，和聚合酶链反应所需的试剂，并使混合物经历发生逆转录的条件，以提供cDNA，该cDNA含与靶RNA对应的核酸序列以及模板转换寡核苷酸，该混合根据需要包括混合模板转换所需的试剂；和b)使该混合物经历聚合酶链反应发生的条件，以扩增靶RNA的至少一部分区域，其中，聚合酶链式反应所需的试剂包含经修饰的寡核苷酸引物，其设计成在步骤a)中引物功能部分地封闭或完全地封闭，并设计成在步骤b)中清除引物功能的封闭。
此外，本发明提供了产生基于靶RNA的至少一部分区域扩增的核酸样品的方法，该方法包括以下步骤：a)混合靶RNA、逆转录所需的试剂，和聚合酶链反应所需的试剂，并使混合物经历发生逆转录的条件，该混合根据需要包括混合模板转换所需的试剂；和b)使该混合物经历聚合酶链反应发生的条件，其中，聚合酶链式反应所需的试剂包含经修饰的寡核苷酸引物，其设计成在步骤a)中引物功能部分地封闭或完全地封闭，并设计成在步骤b)中清除引物功能的封闭。
在又一个实施方案中，本发明是扩增靶RNA的至少一部分区域的方法，该方法包括以下步骤：a)混合靶RNA、逆转录所需的试剂、模板转换所需的试剂和聚合酶链式反应所需的试剂，并使混合物经历发生逆转录的条件，以提供cDNA，该cDNA含与靶RNA对应的核酸序列以及模板转换寡核苷酸；b)将步骤a)中得到的cDNA经历发生聚合酶链反应的条件，以扩增cDNA的至少一部分区域，其中，聚合酶链式反应所需的试剂包含经修饰的寡核苷酸引物，其设计成在步骤a)中引物功能部分地封闭或完全地封闭，并设计成在步骤b)中清除引物功能的封闭。
在又一个实施方案中，本发明是产生基于靶RNA的至少一部分区域扩增的核酸样品的方法，该方法包括以下步骤：a)混合靶RNA、逆转录所需的试剂、模板转换所需的试剂，以及聚合酶链式反应所需的试剂，并使混合物经历发生逆转录的条件，以提供cDNA，该cDNA含与靶RNA对应的核酸序列以及模板转换寡核苷酸的cDNA；b)将步骤a)中得到的cDNA经历发生聚合酶链反应的条件，其中，聚合酶链式反应所需的试剂包含经修饰的寡核苷酸引物，其设计成在步骤a)中引物功能部分地封闭或完全地封闭，并设计成在步骤b)中清除引物功能的封闭。
如果模板RNA的5'末端的序列是未知的或缺乏共有序列，则进行模板转换是有利的，因为可以将特定的锚定序列添加到模板RNA的5'末端。另一方面，如果模板RNA的5'末端侧的序列是已知的，则也可以不进行模板转换。
在一个实施方案中，模板转换所需的试剂可包含模板转换寡核苷酸。在又一个实施方案中，聚合酶链式反应所需的试剂可以包含也可以不包含5'锚定寡核苷酸引物，该5'锚定寡核苷酸引物含模板转换寡核苷酸中所包含的至少一部分锚定序列。如本文实施例中所证明的，模板转换寡核苷酸(TS-Oligo)也可以出乎意料地在PCR扩增中起到正向引物的作用。因此，聚合酶链式反应所需的试剂也可以不含5'锚定寡核苷酸引物，或者包含少于通常使用量的'锚定寡核苷酸引物。
令人惊讶的是，即使仅添加经修饰的寡核苷酸引物而不添加逆转录引物以进行逆转录PCR，也能够实现具有高特异性的PCR扩增。尽管不希望受任何理论的束缚，但是经修饰的寡核苷酸引物的一部分在逆转录反应时其功能未被封闭，以至于功能未被封闭的一部分的经修饰的寡核苷酸引物可以起到作为逆转录引物的作用，或者经修饰的寡核苷酸引物的功能在逆转录反应时被部分地封闭，使得功能被部分地封闭的经修饰的寡核苷酸引物可以以有限的能力起到作为逆转录引物的作用。因此，在一些实施方案中，逆转录所需的试剂也可以不包含使逆转录开始的寡核苷酸引物。即使含有，本发明中使用的使逆转录开始的寡核苷酸引物的量也可以比通常使用的量少。在一些实施方案中，在组合物中使逆转录开始的寡核苷酸引物的浓度为例如，约40nM以下、优选为约20nM以下、约10nM以下、约2.5nM以下、约2.0nM以下、约0.63nM以下、约0.2nM以下、约0.16nM以下、约0.02nM以下、约2.0pM以下、约0.2pM以下、或约0.02pM以下。在另一个实施方案中，在上述组合物中使逆转录开始的寡核苷酸引物相对于经修饰的寡核苷酸引物的摩尔比为约10分之1以下、优选为约20分之1以下、约40分之1以下、约160分之1以下、约200分之1以下、约635分之1以下、约2000分之1以下、约2500分之1以下、约20,000分之1以下、约200,000分之1以下、约2,000,000分之1以下、或约20,000,000分之1以下。
在本发明的方法中其特征在于，PCR中的至少一个寡核苷酸引物在逆转录中通过修饰引物功能被部分地封闭或完全地封闭，并且在PCR的核酸扩增步骤中清除引物功能的封闭。由此可以实现功能性区分处于相同的反应体系中的在PCR的核酸扩增阶段和逆转录反应阶段的各个阶段所使用的引物，并且使在各个反应阶段引物浓度显著差异。
用于封闭/清除引物功能的手段的实例包括以下方法。1)通过将引物设计成在逆转录反应阶段保留转角结构或者设计成包含不耐热修饰基团，在逆转录时封闭引物功能。
在逆转录反应后，通过热处理解除不耐热修饰基团的脱离或转角结构来清除引物功能的封闭。
2)包含人工碱基的引物在逆转录反应阶段封闭作为引物的功能。
逆转录反应的结果，通过逆转录反应从模板RNA合成cDNA，其中cDNA引入有与包含于引物的人工碱基形成一对的核酸，并使引物对人工核酸退火，从而清除引物功能的封闭。
在一步RT-PCR中，通常在逆转录起始时在反应体系内包括将模板RNA逆转录成cDNA所需的所有试剂和使用所得cDNA作为模板的PCR所需的所有试剂。由于PCR引物的Tm通常设定在50℃以上，因此在可进行逆转录的温度区域(例如，42℃)中可能不能充分展现引物的特异性。进一步地，由于模板的拷贝数在PCR中呈指数增长，因此所需的PCR引物浓度显著高于逆转录引物浓度。因此，在进行逆转录时，存在PCR引物对模板RNA错误退火而导致以此为起始点的非特异性逆转录，并最终产生非特异性PCR产物的风险。在本发明中，通过使用经修饰的寡核苷酸引物在PCR中作为反向引物，可以抑制非特异性逆转录，其中所述经修饰的寡核苷酸引物通过修饰使得在逆转录中的引物功能部分地封闭或完全地封闭，并且作为逆转录的结果或通过热变性处理，在使用逆转录产物作为模板进行PCR中获得引物功能。
如本文所用，“寡核苷酸”、“引物”或“寡核苷酸引物”通常是指单链多核苷酸。这可以是天然存在的或合成的。其通常是由约5至约50个核苷酸、更优选约10至约30个核苷酸，或更优选约15至约25个核苷酸的序列构成。寡核苷酸包括DNA、RNA和DNA/RNA嵌合体。
如本文所用，术语“正向引物”是指当RT-PCR中的模板RNA是正义链时与反义链退火的寡核苷酸引物。“反向引物”是指与正义链退火的寡核苷酸引物。
在一个实施方案中，用于本发明的经修饰的寡核苷酸引物包含与模板RNA的部分序列互补的序列。尽管对该部分序列的长度没有特别限制，但长度通常为10至40个碱基、优选15至30个碱基，以及更优选18至25个碱基。该部分序列可以是打算在模板RNA中扩增的区域的3'末端的部分序列。经修饰的寡核苷酸引物优选在其3'末端包含与模板RNA的部分序列互补的序列。经修饰的寡核苷酸引物还可以包含添加到与模板RNA的部分序列互补的序列的5'末端的序列。尽管添加的序列没有特别限制，但从避免非特异性杂交的观点来看，序列最佳地不包含与模板RNA的部分序列互补的序列。作为添加序列可举例特异性限制酶识别序列。尽管添加序列的长度没有特别限制，但优选较短的序列以避免非特异性杂交。添加序列的长度通常为1至50个碱基、优选1至30个碱基且更优选1至10个碱基。在一个实施方案中，经修饰的寡核苷酸引物由与模板RNA的部分序列互补的序列组成而不存在添加序列。
用于本发明的经修饰的寡核苷酸引物中的修饰的示例性实施方案包括以下：
(1)包含不耐热修饰基团的寡核苷酸引物；
(2)寡核苷酸引物，其在同一经修饰的寡核苷酸引物的序列上具有一个或更多个互补区域，并且在PCR的初期热变性之前，通过该互补区域具有转角结构，以向分子内形成发夹环，并呈现掩蔽与模板RNA的部分序列互补的序列的结构；
(3)包含人工碱基的寡核苷酸引物。
下面详细讨论每个实施方案。
(1)包含不耐热修饰基团的寡核苷酸引物
在该实施方案中，寡核苷酸引物包含不耐热的修饰基团，从而修饰的核苷酸引物不能沿着与其杂交的多核苷酸使链延伸，即由于酶封闭或与靶核酸的杂交减少而不能延伸。在优选的实施方案中，寡核苷酸引物的3'末端羟基或一个或更多个核苷酸间键有不耐热的修饰基团取代。因此，除非并且直到去除修饰或经修饰的核苷酸，否则链不会在实质程度上延伸。虽然修饰基团是不耐热的，但直到在PCR扩增中达到第一变性温度(例如，约80至105℃、优选约85至100℃、更优选约90至96℃(例如，95℃))之前，该基团几乎不解离，因此在逆转录中引物功能部分地封闭或完全地封闭。一旦达到第一变性温度，就会热诱导修饰基团从经修饰的寡核苷酸引物部分解离或完全解离，将经修饰的寡核苷酸引物转化为相应的未经修饰的寡核苷酸引物。未经修饰的寡核苷酸引物具有活性磷酸二酯键并且可以通过聚合酶延伸。
作为包含不耐热修饰基团的寡核苷酸引物的实例包括美国专利No.8133669中公开的不耐热修饰基团取代在3'末端的羟基的经修饰的寡核苷酸引物(所公开的内容通过引用并入本说明书，其程度相当于本说明书明确描述了其全部内容)，美国专利No.8361753中公开的在一个或更多个核苷酸间键中包含不耐热修饰基团的经修饰的寡核苷酸引物(所公开的内容通过引用并入本说明书，其程度相当于本说明书明确描述了其全部内容)等。
(1-1)经修饰的寡核苷酸引物，其3'末端处的羟基被不耐热修饰基团所取代(美国专利No.8133669)
在一个实施方案中，包含在该经修饰的寡核苷酸引物的3'末端的该修饰基团是选自下组的基团之一：
[化学式1]
其中，
Z10选自由O、S和Se组成的组；
每个R7、每个R8、每个R9和每个R10独立地选自，由氢，和可选取代的具有1-20个碳原子、优选1-10个碳原子，并且优选1至6个碳原子的直链或支链的烃基组成的组，其中，
烃基是烷基、烯基或炔基，其可包括选自由以下项组成的组的至少一个取代基：卤素、氧基、羟基、烷氧基、氨基、酰氨基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳氧基和杂芳基；
每个X6、每个X7、每个X8和每个X9独立地选自由以下项组成的任何取代或未取代的基团：酰基、酰氧基、烯基、烯基芳基、亚烯基、烷基、低级烷基、亚烷基、炔基、炔基芳基、烷氧基、低级烷氧基、烷基芳基、烷基羰基氨基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、烷基磺酰基氨基、烷基巯基、亚炔基、酰氨基、脒基、氨基、芳基炔基、芳烷基、芳酰基、芳基烷基、芳基、芳基羰基氨基、亚芳基、芳氧基、芳基磺酰基氨基、氨基甲酸酯、二硫代氨基甲酸盐/酯、环烯基、环烷基、环亚烷基、胍基、卤素(ハロ)、卤素(ハロゲン)、杂芳基、杂芳基羰基氨基、杂芳氧基、杂芳基磺酰基氨基、杂环、杂环、烃基、烃基、烃基羰基、烃基氧基羰基、烃基羰基氧基、亚烃基、有机亚磺酰基、羟基、有机亚磺酰基、有机磺酰基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰基氨基和硫酰基；
每个X10独立地选自由以下项组成的组：O、S、Se、NR11、N-OR11和CR11R12；
每个R11和每个R12独立地选自由以下项组成的任何取代或未取代的基团：酰基、酰氧基、烯基、烯基芳基、亚烯基、烷基、低级烷基、亚烷基、炔基、炔基芳基、烷氧基、低级烷氧基、烷基芳基、烷基羰基氨基、烷基亚磺酰基、烷基磺酰基、烷基磺酰基氨基、烷基巯基、亚炔基、酰氨基、脒基、氨基、芳基炔基、芳烷基、芳酰基、芳基烷基、芳基、芳基羰基氨基、亚芳基、芳氧基、芳基磺酰基氨基、氨基甲酸酯、二硫代氨基甲酸盐/酯、环烯基、环烷基、环亚烷基、胍基、卤素(ハロ)、卤素(ハロゲン)、杂芳基、杂芳基羰基氨基、杂芳氧基、杂芳基磺酰基氨基、杂环、杂环、烃基、烃基、烃基羰基、烃基氧基羰基、烃基羰基氧基、亚烃基、有机亚磺酰基、羟基、有机亚磺酰基、有机磺酰基、亚磺酰基、磺酰基、磺酰基氨基和硫酰基；以及
每个Y1独立地选自以下项组成的组：O、S、Se、NR6、N-OR6和CR6R7。
在优选的实施方案中，修饰基团选自以下项组成的组：O-(对甲苯)磺酸盐/酯；O-磷酸盐/酯；O-硝酸盐/酯；O-[4-甲氧基]-四氢吡喃基；O-[4-甲氧基]-四氢硫代吡喃基；O-四氢硫代吡喃基；O-[5-甲基]-四氢呋喃基；O-[2-甲基,4-甲氧基]-四氢吡喃基；O-[5-甲基]-四氢吡喃基；O-四氢吡喃基；O-四氢呋喃基；O-苯氧乙酰基；O-甲氧乙酰基；O-乙酰基；-O-C(O)-OCH3；-O-C(O)-CH2CH2CN；和O-C(S)-OCH3。在一些特别优选的实施方案中，修饰基团选自由以下项组成的组：O-甲氧基四氢吡喃基；O-四氢呋喃基；和O-四氢呋喃基。
在另一个实施方案中，经修饰的寡核苷酸引物是由式V表示的化合物：
[化学式2]
其中，
Z3是3'-O-寡核苷酸基或寡核苷酸引物；
B选自取代或未取代的嘌呤或嘧啶、其任何氮杂或脱氮衍生物，或任何NTP类似物的任何“通用碱基”或“简并碱基”，其优选可被核酸聚合酶识别；
A选自下组：O、S、Se、CR1R2和NR1；
每个R1和每个R2独立地选自由以下项组成的组：H、F、Cl、Br、I、OR3、SR3、NR3R4、C(Y)R5、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳基和取代或未取代的芳烷基，其中，任何取代基可各自视情况可选含有一个或更多个杂原子；
每个Y独立地选自由以下项组成的组：O、S、Se、CR1R2和NR1；
每个R3和每个R4独立地选自由以下项组成的组：H、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳基，和取代或未取代的芳烷基，其中，任何取代基可各自视情况可选含有一个或更多个杂原子；
每个R5独立地选自由以下项组成的组：H、F、Cl、Br、OR3、SR3、NR3R4、取代或未取代的烷基、取代或未取代的烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的芳基，和取代或未取代的芳烷基，其中，任何取代基可各自视情况可选含有一个或更多个杂原子；
X4独立地选自以下项组成的组：R1、F、Cl、Br、I、OR3、SR3、SeR3、NR3R4、NR3OR3、NR3-NR3R4、CN、N3、C(Y)R5、NO2、CN和SSR3；
X5选自以下项组成的组：O、S、Se、NR6、N-OR6和CR6R7；
Y1选自以下项组成的组：O、S、Se、NR6、N-OR6、CR6R7和C(Y)；
每个R6和每个R7独立地选自由氢和可选取代的具有1至20个碳原子、优选1至10个碳原子、优选1至6个碳原子的直链或支链的烃基组成的组，其中，
烃基是烷基、烯基或炔基，其可包括至少一个选自以下项组成的组的取代基：卤素、氧基、羟基、烷氧基、氨基、酰氨基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳氧基和杂芳基；以及
X5和Y1各自视情况可选地通过适当的原子或原子团共价连接到式IB中所示的NTP分子的X4、X5、Z3、A、W或B部分。
在式V的特定实施方案中，B是胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、氨基烯丙基尿嘧啶、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-7-甲基鸟嘌呤、7-脱氮-7-碘鸟嘌呤、7-脱氮-7-氨基烯丙基鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、5-硝基-胞嘧啶、5-氨基烯丙基-胞嘧啶、5-(生物素-16)-胞嘧啶、5-(荧光素-ll)-胞嘧啶、4-甲氨基-胞嘧啶和2-巯基-5-甲基尿嘧啶，或4-巯基-5-甲基尿嘧啶。
在式V的优选实施方案中，B是腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶。
在优选的实施方案中，经修饰的寡核苷酸引物是选自由以下项组成的组的化合物之一：
[化学式3]
1-1的经修饰的寡核苷酸引物可以通过美国专利No.8361753中描述的方法制备。
(1-2)经修饰的寡核苷酸引物，其在一个或更多个核苷酸间键中包含不耐热修饰基团(美国专利No.8361753)。
在一个实施方案中，经修饰的寡核苷酸引物中的修饰基团包含式I的化合物：
[化学式4]
-L-X-R1
其中，
L是可任意取代的具有1至10个碳原子、优选2至5个碳原子、更优选3至4个碳原子且还更优选4个碳原子的直链或支链的亚烃基；
X是O、S、S(O)、S(O)2、C(O)、C(S)或C(O)NH；和
R1是氢或可任意取代的具有1至20个碳原子、优选1至10个碳原子且更优选1至6个碳原子的直链或支链的烃基，其中，烃基优选为烷基、烯基或炔基，其可选地包括至少一个选自由以下项组成的组的取代基：卤素、氧基、羟基、烷氧基、氨基、酰氨基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳氧基和杂芳基。
在一个实施方案中，修饰基团提供式1a的化合物：
[化学式5]
其中，
L是可任意取代的具有1至10个碳原子、优选2至5个碳原子、更优选3至4个碳原子且还更优选4个碳原子的直链或支链的亚烃基；以及
R1是氢或可任意取代的具有1至20个碳原子、优选1至10个碳原子且更优选1至6个碳原子的直链或支链的烃基，其中，烃基优选为烷基、烯基或炔基，其可选地包括至少一个选自由以下项组成的组的取代基：卤素、氧基、羟基、烷氧基、氨基、酰氨基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳氧基和杂芳基。
式Ia的修饰基团的优选实施方案如下：
[化学式6]
4-氧-1-戊基
[化学式7]
5-氧-1-己基
[化学式8]
6-氧-1-庚基
[化学式9]
4-氧-1-己基
[化学式10]
5-甲基-4-氧-1-己基
[化学式11]
2-甲基-5-氧-己基
[化学式12]
1-乙基-4-氧-戊基
[化学式13]
1-甲基-4-氧-戊基
[化学式14]
1,1-二甲基-4-氧-戊基
[化学式15]
4-氧-1-辛基
[化学式16]
4-氧-1-十四烷基，以及
[化学式17]
4-氧-1-二十烷基。
在一个实施方案中，修饰基团提供式Ib的化合物：
[化学式18]
-L-S(O)k-R1
其中，
K是从0到2的整数；
L是可任意取代的具有1至10个碳原子、优选2至5个碳原子、更优选3至4个碳原子且还更优选4个碳原子的直链或支链的亚烃基；以及
R1是氢或可任意取代的具有1至20个碳原子、优选1至10个碳原子且更优选1至6个碳原子的直链或支链的烃基，其中，烃基优选为烷基、烯基或炔基，其可选地包括至少一个选自由以下项组成的组的取代基：卤素、氧基、羟基、烷氧基、氨基、酰氨基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳氧基和杂芳基。
在优选的实施方案中，式Ib的修饰基团是下面描述的4-甲巯基-1-丁基：
[化学式19]
在一个实施方案中，修饰基团提供式Ic的化合物：
[化学式20]
其中，
L是可任意取代的具有1至10个碳原子、优选2至5个碳原子、更优选3至4个碳原子且还更优选4个碳原子的直链或支链的亚烃基；以及
R1是氢或可任意取代的具有1至20个碳原子、优选1至10个碳原子且更优选1至6个碳原子的直链或支链的烃基，其中，烃基优选为烷基、烯基或炔基，其可选地包括至少一个选自由以下项组成的组的取代基：卤素、氧基、羟基、烷氧基、氨基、酰氨基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳氧基和杂芳基。
在优选的实施方案中，式Ic的修饰基团是下面描述的3-(N-叔丁基甲酰胺)-1-丙基：
[化学式21]
在一个实施方案中，修饰基团提供式Id的化合物：
[化学式22]
其中，
L是可任意取代的具有1至10个碳原子、优选2至5个碳原子、更优选3至4个碳原子且还更优选4个碳原子的直链或支链的亚烃基；以及
R1是氢或可任意取代的具有1至20个碳原子、优选1至10个碳原子且更优选1至6个碳原子的直链或支链的烃基，其中，烃基优选为烷基、烯基或炔基，其可选地包括至少一个选自由以下项组成的组的取代基：卤素、氧基、羟基、烷氧基、氨基、酰氨基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳氧基和杂芳基。
修饰基团式Id的优选实施方案的实例包括2-(N-甲酰基-N-甲基)氨乙基和2-(N-乙酰基-N-甲基)氨乙基(如下所述)：
[化学式23]
2-(N-乙酰基-N-甲基)氨乙基
在另一个实施方案中，修饰基团提供式II化合物：
[化学式24]
-L-R2
L是可任意取代的具有1至10个碳原子、优选2至5个碳原子、更优选3至4个碳原子且还更优选4个碳原子的直链或支链的亚烃基；以及
R2是氢、氰基或可选地具有5至10个原子的取代的碳环、杂环、芳基或杂芳基。
在一个优选的实施方案中，式II的修饰基团是下面描述的N-(2-羟乙基)-邻苯二甲酰亚胺：
[化学式25]
N-(2-羟乙基)-邻苯二甲酰亚胺
在另一个实施方案中，修饰基团提供式III化合物：
[化学式26]
-La-A-Lb-B
其中，
La和Lb各自独立地选自单键和可任意取代的具有单键或1至8个碳原子、优选2至5个碳原子、更优选3至4个碳原子的直链或支链的亚烃基；
A是O、S、S(O)、S(O)2、Se、CR3R4、NR3、C(O)、C(S)或CNR3；
B是C(O)R3、C(S)R3、C(O)NR3R4、OR3或SR3；
R3和R4各自独立地为氢或可任意取代的具有1至20个碳原子、优选1至10个碳原子且更优选1至6个碳原子的直链或支链的烃基，其中，烃基优选为烷基、烯基或炔基，其可选地包括至少一个选自由以下项组成的组的取代基：卤素、氧基、羟基、烷氧基、氨基、酰氨基、环烷基、杂环烷基、芳基、芳氧基和杂芳基。
在另一个实施方案中，修饰基团提供式IV化合物：
[化学式27]
-La-D-Lb-E-Lc-F
其中，
La、Lb和Lc各自独立地选自单键和可任意取代的具有单键或1至8个碳原子、优选2至5个碳原子且更优选3至4个碳原子的直链或支链的亚烃基；
D是O、S、S(O)、S(O)2、CR5R6或NR5；
E是O、S、S(O)、S(O)2、CR5R6或NR6；
F是氢、C(O)R7、C(S)R7、C(O)NR7R8、OR7或SR7；
R5和R6各自独立地为氢、芳基、烷基、卤素、氧基、羟基、烷氧基、芳氧基或氨基，或R5和R6可一起形成由5至10个原子组成的包含D、R5、R6、E和Lb的单环或二环，其中，如果R5和R6一起形成环，则n为0至2；以及
R7和R8各自独立地选自芳基、烷基、卤素、氧基、羟基、烷氧基、芳氧基、氨基、酰氨基，可任意取代的环烷基、可任意取代的杂环烷基、可任意取代的芳基、可任意取代的芳氧基，或可任意取代的杂芳基。
在其中R5和R6一起形成环的式IV化合物的一个实施方案中，修饰基团是如下所述的甲氧基甲基-环己基-1,3-基-乙基：
[化学式28]
甲氧基甲基-环己基-1,3-基-乙基
在一个实施方案中，经修饰的寡核苷酸引物具有结构I的修饰骨架：
[化学式29]
其中，
Nuc是引物序列中的核苷；
U和Z独立地为O、S、Se、NR9或CR9R10；
R9和R10各自独立地为氢或可任意取代的具有1至10个碳原子的直链或支链的烃基；其中，烃基优选为烷基、烯基或炔基，其可选地包括至少一个选自下组的取代基：卤素、氧基、羟基、烷氧基、芳氧基、氨基、酰氨基，或可检测标记；
Y为O、S或Se；
W是使Q能够热裂解的任何化学成分(诸如O、S、S(O)、S(O)2、Se、C(O)、C(S)、C(O)NH、C(N)H、NH、-C(＝NR11)-或NR9)；
R11为氢或可任意取代的具有1至10个碳原子、优选1至6个碳原子的烃基，其中，R11优选为H、烷基或低级烷基；以及
Q是包含一个或更多个可热裂解基团的修饰基团。
在一个实施方案中，修饰基团Q包含一个或更多个选自式I、Ia、Ib、Ic、Id、II、III和IV的可热裂解基团。
经修饰的寡核苷酸引物在至少一个核苷酸间键中包含上述修饰基团之一。经修饰的寡核苷酸引物优选在其3'末端包含一个或更多个上述修饰基团。经修饰的寡核苷酸引物优选在其3'末端最后6个核苷酸间键之一、优选的最后三个核苷酸间键之一中包含一个或更多个上述修饰基团。
在另一个实施方案中，寡核苷酸引物可包含在寡核苷酸引物的3'末端以2、3、4、5或6个连续的经修饰的核苷酸间键终止的序列。在又一个实施方案中，寡核苷酸引物可包含多个非连续的3'经修饰的核苷酸间键。经修饰的寡核苷酸引物的5'末端还可以具有包含经修饰的核苷酸间键的核苷酸序列。还在另一个实施方案中，还可以修饰寡核苷酸的所有核苷酸间键。
在另一个优选的实施方案中，经修饰的寡核苷酸引物在寡核苷酸引物的3'n核苷酸间键中包含修饰基团，其中，n是在3'末端处的核苷酸间键。还在另一个实施方案中，修饰基团存在于寡核苷酸的3'n-1、n-2、n-3或n-4核苷酸间键中。还在另一个实施方案中，寡核苷酸在位置n、n-1、n-2、n-3、n-4、n-5和n-6处具有2个或更多个的修饰基团；优选在位置n、n-1、n-2、n-3、n-4、n-5和n-6具有2个或更多个的修饰基团；优选在位置n、n-1、n-2、n-3、n-4、n-5和n-6具有3个或更多个的修饰基团；优选在位置n、n-1、n-2、n-3、n-4、n-5和n-6具有4个或更多个的修饰基团；优选在位置n、n-1、n-2、n-3、n-4、n-5和n-6具有5个或更多个的修饰基团；优选在位置n、n-1、n-2、n-3、n-4、n-5和n-6具有6个或更多个的修饰基团。
1-2的经修饰的寡核苷酸引物可以通过美国专利No.8361753中描述的方法制备。
(2)寡核苷酸引物，其在同一修饰寡核苷酸引物的序列上具有一个或更多个互补区域，并且在PCR的初期热变性之前，通过该互补区域具有转角结构，以形成分子间发夹环以呈现掩蔽与模板RNA的部分序列互补的序列的结构。
该实施方案在同样经修饰的寡核苷酸引物的序列上具有一个或多个互补区域，并且在PCR的初期热变性处理之前，通过互补区域具有转角结构，以形成分子间发夹环。该互补区域是指由一个或更多个寡核苷酸组成的第一序列和包含与其互补的一个或更多个寡核苷酸的第二序列的组合。
第一序列和第二序列的位置可以彼此相邻，也可以在第一序列和第二序列之间插入一个或更多个寡核苷酸来放置。如果第一序列或第二序列包含与模板RNA的一部分序列互补的序列，则与模板RNA的一部分序列互补的序列被第一和第二序列的互补键掩蔽。因此，在这种情况下，第一和第二序列的寡核苷酸的数量没有特别限制。
如果第一和第二序列不包含与模板RNA的一部分序列互补的序列，则与模板RNA的一部分序列互补的序列包含在第一序列和第二序列的寡核苷酸之间，并且分子间发夹环形成掩蔽与模板RNA的部分序列互补的序列。
由于掩蔽了与模板RNA的一部分序列互补的序列，因此在逆转录时其不能与模板RNA的相应部分的序列杂交，引物功能部分地封闭或完全地封闭。然而，由于发夹环结构在PCR扩增中的变性温度(例如，约55至105℃，优选约85至100℃，以及更优选约90至96℃(例如，95℃)等)下解离以暴露与模板RNA的一部分序列互补的序列，该序列可以在随后的配对温度下与cDNA中的相应部分的序列杂交(即，获得引物功能)。发夹环的环部分的长度通常为约5至25个碱基。环部分的核苷酸序列没有特别限制，只要可以形成分子间发夹环即可。
(3)包含人工碱基的寡核苷酸引物
该实施方案的经修饰的寡核苷酸引物包含人工碱基(非天然存在的碱基)，因此该经修饰的寡核苷酸引物的核苷酸序列的互补序列在模板RNA(模板RNA不含人工碱基)中实质上不存在。因此，抑制了经修饰的寡核苷酸引物与模板RNA的杂交，从而部分地封闭或完全地封闭了逆转录中的引物功能。在一个实施方案中，在经修饰的寡核苷酸引物的3'末端的15个碱基中的1个以上碱基、优选3个以上碱基、5个以上碱基、10个以上碱基、12个以上碱基，或优选所有15个碱基是人造碱基。在优选的实施方案中，该经修饰的寡核苷酸引物的大部分3'末端的碱基是人工碱基。
该实施方案中的经修饰的寡核苷酸引物与用于使逆转录开始的寡核苷酸引物组合使用，其中该寡核苷酸引物包括含经修饰的寡核苷酸引物的人工碱基的部分序列。包含人工碱基的部分序列的长度为10至40个碱基、优选15至30个碱基且更优选18至25个碱基。虽然没有特别限制，包含人工碱基的部分序列可以是，例如该经修饰的寡核苷酸引物的3'末端的部分序列。用于使逆转录开始的寡核苷酸引物包含与模板RNA的一部分序列互补的序列和包含前述人工碱基的部分序列，并且将包含人工碱基的部分序列添加至与模板RNA的一部分序列互补的序列的5'侧。模板RNA的部分序列的长度没有特别限制，但通常为10至40个碱基、优选15至30个碱基且更优选18至25个碱基。部分序列可以是模板RNA中所包含的打算扩增的区域的3'末端的部分序列。用于使逆转录开始的寡核苷酸引物优选在其3'末端包含与模板RNA的部分序列互补的序列。
当这种组合用于进行一步逆转录模板转换PCR时，在逆转录中合成了具有部分序列的cDNA，该部分序列包含添加到5'末端的经修饰的寡核苷酸引物的人工碱基。因此，含人工碱基的经修饰的寡核苷酸引物获得了在使用该cDNA作为模板的PCR中的引物功能。此外，可以进行使用所述cDNA作为模板、并且将经修饰的寡核苷酸引物作为引物之一的PCR扩增，由此特异性扩增目标区域。
人工碱基的实例包括但不限于Z碱基/F碱基(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997,94,105061；Nat.Struct.Biol.1998,5,950；Nat.Struct.Biol 1998,5,954)、Q碱基(J.Am.Chem.Soc.1999,121,2323)、异-G碱基/异-C碱基(J.Am.Chem.Soc.1989,111,8322)、2-硫代T(TS)碱基(Nucleic Acids Res.2005,33,5640)、P碱基/Z碱基(Nucleic AcidsRes.2007,35,4238)、PICS碱基(J.Am.Chem.Soc.1999,121,11585)、5SICS碱基/MMO2碱基/NaM碱基(J.Am.Chem.Soc.2009,131,14620)、2-氨基-6-二甲基氨基嘌呤(x)/2-氧代吡啶(y)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001,98,4922)、2-氨基-6-(2-噻吩基)嘌呤(s)(J.Am.Chem.Soc.2005,127,17286；Nucleic Acids Res.2005,33,129；Biotechniques2006,40,711)、咪唑啉-2-酮(z)(J.Am.Chem.Soc.2004,126,13298)、Ds碱基/Pa碱基(Nat.Methods 2006,3,729)、Pn碱基(J.Am.Chem.Soc.2007,129,15549)、Px碱基(NucleicAcids Res.2009,37,e14)、xA碱基、xT碱基(J.Am.Chem.Soc.2004,126,11826)、Im-N0碱基/Na-ON碱基、Im-ON碱基/Na-N0碱基(J.Am.Chem.Soc.2009,131,1644；和Angew.Chem.Int.Ed.2005,44,596)等。这些人工碱基可通过形成以下碱基对促进逆转录和/或PCR扩增：ZF碱基对、QF碱基对、异G-异C碱基对、A-TS碱基对、P-Z碱基对、PICS-PICS碱基对(自身互补)、5SICS-MMO2碱基对、5SICS-NaM碱基对、x-y碱基对，s-y碱基对、s-z碱基对、Ds-Pa碱基对、Ds-Pn碱基对、Ds-Px碱基对、xA-T碱基对、A-xT碱基对、Im-N0-Na-ON碱基对和Im-ON-Na-N0碱基对。
在下文中进一步详细地描述本发明的方法。
本发明的方法首先提供包含用于将模板RNA模板转换逆转录成cDNA和用于PCR扩增该cDNA的至少一部分所需的所有试剂(不包括使逆转录开始的寡核苷酸引物)的组合物，包含：
i)模板转换寡核苷酸，
ii)引物组，其由5'锚定寡核苷酸引物和经修饰的寡核苷酸引物组成，所述5'锚定寡核苷酸引物包含模板转换寡核苷酸中包含的锚定序列的至少一部分，以及
iii)模板RNA。
模板转换寡核苷酸包含锚定序列和与当逆转录酶已到达模板RNA的5'末端时通过逆转录酶的末端转移酶活性添加到新合成的cDNA的3'末端的序列互补的序列(也简称为RT添加序列)，并且锚定序列(第一锚定序列)被添加到RT添加序列的互补序列的5'末端。优选地，RT添加序列的互补序列位于模板转换寡核苷酸的3'末端。RT添加序列取决于逆转录酶的类型。例如，莫洛尼鼠白血病病毒来源的逆转录酶(MMLV RT)向合成的cDNA的3'末端添加短的富含胞嘧啶的序列(例如，CC、CCC，或CCCC)。因此，作为该富含胞嘧啶的序列的互补序列的短的富含鸟嘌呤的序列(例如，GG、GGG，或GGGG)被包含在模板转换寡核苷酸中作为RT添加序列的互补序列。锚定序列是指添加到寡核苷酸的5'末端的人工序列。锚定序列优选是在自然界中不存在的序列。锚定序列的长度没有特别限制，但通常为约10个碱基至100个碱基，且优选约15个碱基至约50个碱基。
模板转换寡核苷酸可以是DNA或RNA，或DNA/RNA嵌合体。为了在逆转录中有效地起模板作用，模板转换寡核苷酸最佳为RNA或DNA/RNA嵌合体，且更优选DNA/RNA嵌合体。在一个实施方案中，RT添加序列的互补序列的一部分是RNA，并且锚定序列的一部分是DNA或DNA/RNA嵌合体。模板转换寡核苷酸还起到下面解释的5'锚定寡核苷酸引物的作用。因此，在一些实施方案中，可以省略或添加少量5'锚定寡核苷酸引物。迄今为止尚不存在在同一反应体系中进行逆转录模板转换和PCR扩增的实例。本说明书的实施例首次证明了模板转换寡核苷酸起到PCR扩增的正向引物的作用。
5'锚定寡核苷酸引物包含上述模板转换寡核苷酸中包含的锚定序列(第一锚定序列)的部分或全部。锚定序列的部分或全部的长度通常为10至40个碱基、优选15至30个碱基，且更优选18至25个碱基。为了在PCR中起引物的作用，可以是DNA或DNA/RNA嵌合体，优选DNA。5'锚定寡核苷酸引物可以是PCR中的正向引物。
可以使用的模板RNA的实例包括但不限于mRNA、rRNA、tRNA、非编码RNA、化学合成的RNA等。mRNA、rRNA和tRNA可以源自任何细胞或组织。可以从利用细胞分选仪等获得的少量细胞/组织(例如，单细胞)中收集mRNA、rRNA和tRNA。mRNA、rRNA和tRNA可以是作为总RNA的一部分包含的形式。
该组合物包含用于将模板RNA模板转换逆转录成cDNA和用于PCR扩增cDNA的至少一部分所需的所有试剂(不包括使逆转录开始的寡核苷酸引物)的组合物。除了上述的模板转换寡核苷酸、引物组和模板RNA之外，试剂的实例包括以下。
*逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)
*耐热DNA聚合酶(DNA依赖性DNA聚合酶)
*dNTPs混合物
为了形成cDNA的3'末端的RT添加序列，使用的逆转录酶具有末端转移酶活性。具有末端转移酶活性的逆转录酶的实例包括但不限于莫洛尼鼠白血病病毒来源的逆转录酶(MMLVRT)。末端转录酶活性优选是向合成的cDNA的3'末端添加短的富含胞嘧啶的序列(例如，CC、CCC或CCCC)的活性。
耐热DNA聚合酶的代表性实例包括但不限于Taq、Tth、KOD、Pfu、Bst等。已经开发的可用于PCR的各种耐热DNA聚合酶，都可用于本发明。可用于PCR的耐热DNA聚合酶是本领域技术人员公知的，并且可由本领域技术人员适当地选择。
在一个实施方案中，组合物进一步包含使逆转录开始的寡核苷酸引物。由于包含与模板RNA的部分序列互补的序列，使逆转录开始的寡核苷酸引物与模板RNA杂交而使逆转录开始。该部分序列的长度没有特别限制，但通常为10至40个碱基、优选15至30个碱基且更优选18至25个碱基。使逆转录开始的寡核苷酸引物优选在其3'末端包含与模板RNA的部分序列互补的序列。可以将锚定序列(第二锚定序列)添加到与模板RNA的部分序列互补的序列的5'末端。第二锚定序列优选是天然不存在的序列。第二锚定序列的长度没有特别限制，但通常为约10个碱基至100个碱基、优选约15个碱基至50个碱基。第二锚定序列优选与第一锚定序列不同。在一个实施方案中，第二锚定序列包含人工碱基。在一个实施方案中，使逆转录开始的寡核苷酸引物不包含第二锚定序列。使逆转录开始的寡核苷酸引物是对特定基因特异的引物、与mRNA的poly-A尾结合的oligo dT引物，或随机引物(诸如随机六聚体引物)，但优选为对特定基因特异的引物。所述引物包含与编码目的基因的RNA(例如mRNA)的部分序列互补的序列。使逆转录开始的寡核苷酸引物是DNA或DNA/RNA嵌合体，优选DNA，使得引物可以在逆转录中起引物的作用。
在一个实施方案中，在模板RNA上的、使逆转录开始的寡核苷酸引物杂交的区域和经修饰的寡核苷酸引物杂交的区域至少部分地重叠。重叠杂交区域的长度没有特别限制，但通常为10个碱基或更多、优选15个碱基或更多且更优选18个碱基或更多。重叠杂交区域的长度例如可以是40个碱基或更少、30个碱基或更少，或25个碱基或更少。
在一个优选的实施方案中，经修饰的寡核苷酸引物杂交的模板RNA的区域的5'末端相比使逆转录开始的寡核苷酸引物杂交的模板RNA的区域的5'末端，更靠近模板RNA的5'侧(上游)。换句话说，设计两种引物以使得与模板RNA杂交的经修饰的寡核苷酸引物的3'末端相比使逆转录开始的寡核苷酸引物的3'末端，更靠近模板RNA的5'侧(上游)。通过以这种半嵌套位置关系设计两种引物，可以预期扩增特异性的改善。在这种情况下，使逆转录开始的寡核苷酸引物杂交的模板RNA的区域和经修饰的寡核苷酸引物杂交的模板RNA区域可以以半嵌套形式(semi-nested)的部分重叠放置，或以没有重叠的完全嵌套(full-nested)的形式放置。
当使逆转录开始的寡核苷酸引物杂交的模板RNA的区域与经修饰的寡核苷酸引物杂交的模板RNA的区域部分地重叠时，优选设计两个引物使得经修饰的寡核苷酸引物杂交的模板RNA区域的5'末端相比使逆转录开始的寡核苷酸引物杂交的模板RNA区域的5'末端，更靠近模板RNA的5'侧(上游)例如1至12个碱基，优选地，1、2、3、4或5个碱基(即，使得经修饰的寡核苷酸引物杂交的3'末端相比引发逆转录的寡核苷酸引物的3'末端，更靠近模板RNA的5'侧例如1至10个碱基，优选地，1、2、3、4或5个碱基)，但设计不限于此。
在另一个实施方案中，使逆转录开始的寡核苷酸引物杂交的模板RNA的区域与经修饰的寡核苷酸引物杂交的模板RNA的区域至少部分地重叠，并且使逆转录开始的寡核苷酸引物杂交的模板RNA的区域的5'末端与经修饰的寡核苷酸引物杂交的模板RNA的区域的5'末端相匹配。换句话说，经修饰的寡核苷酸引物的3'末端与使逆转录开始的寡核苷酸引物的3'末端在相同的位置与模板RNA杂交。
在一个实施方案中，使逆转录开始的寡核苷酸引物杂交的模板RNA的区域与经修饰的寡核苷酸引物杂交的模板RNA的区域是相同的。在该实施方案中，使逆转录开始的寡核苷酸引物可以是对应于经修饰的寡核苷酸引物的未经修饰的寡核苷酸引物。
在另一个实施方案中，经修饰的寡核苷酸引物在其3'末端包含使逆转录开始的寡核苷酸引物的部分序列。该部分序列的长度(下文中，也称为共有序列)没有特别限制，但通常为10个碱基或更多、优选15个碱基或更多且更优选18个碱基或更多。所述3'末端部分序列的长度例如可以是，40个碱基或更少、30个碱基或更少，或25个碱基或更少。在一个实施方案中，所述共有序列可以是使逆转录开始的寡核苷酸引物的3'末端的部分序列。在另一个实施方案中，所述共有序列的3'末端相比使逆转录开始的寡核苷酸引物的3'末端，更靠近5'侧至少1个碱基(例如，1至20个碱基、1至10个碱基，或1至8个碱基)。在一个实施方案中，所述共有序列是包含在使逆转录开始的寡核苷酸引物中的与模板RNA的部分序列互补的序列或其部分序列。在一个实施方案中，所述共有序列是第二锚定序列或其部分序列。在一个实施方案中，所述共有序列是使逆转录开始的寡核苷酸引物的部分序列，其跨越与模板RNA的部分序列互补的序列和第二锚定序列。在一个实施方案中，上述经修饰的寡核苷酸引物是包含人工碱基的寡核苷酸引物，并且使逆转录开始的寡核苷酸引物在5'末端包含含有人工碱基的第二锚定序列，并且共有序列是第二锚定序列或其部分序列。
如果上述化合物包含使逆转录开始的寡核苷酸引物，则寡核苷酸引物的浓度可以是足以引发逆转录的量。如果在逆转录中可以合成包含打算扩增的区域的cDNA的一个拷贝，则可以通过随后的PCR将其扩增至可检测的水平。因此，组合物(反应体系)仅需要包含至少一个拷贝、优选10个拷贝以上且更优选100个拷贝以上的使逆转录开始的寡核苷酸引物。如果使逆转录开始的寡核苷酸引物的浓度太高，则可以诱导由于非特异性杂交引起的副反应。在组合物中使逆转录开始的寡核苷酸引物的浓度为例如约40nM以下、优选约20nM以下、约10nM以下、约2.5nM以下、约2.0nM以下、约0.63nM以下、约0.2nM以下、约0.16nM以下、约0.02nM以下、约2.0pM以下、约0.2pM以下，或约0.02pM以下。
在另一个实施方案中，上述组合物不包含使逆转录开始的寡核苷酸引物。在该实施方案中，使用包含不耐热修饰基团并且包含与模板RNA的部分序列互补的序列的寡核苷酸引物作为上述经修饰的寡核苷酸引物。经修饰的寡核苷酸引物优选包含一个或更多个核苷酸间键或在3'末端包含不耐热修饰基团。包含在经修饰的寡核苷酸引物中的不耐热的修饰基团几乎不解离，直到在PCR扩增中到达第一变性温度(例如，约80至105℃、优选约85至100℃且更优选约90至96℃(例如，95℃))。同时，本发明人已发现，这样的不耐热的修饰基团在进行逆转录的温度(例如，45℃)略微离解，并且结果产生一个相应的未经修饰的寡核苷酸可以起到使逆转录开始的寡核苷酸引物的作用。
根据需要，上述组合物可包含缓冲液、盐(镁离子等)或RNA酶抑制剂。
包含在上述组合物中的模板转换寡核苷酸的浓度不受特别限制，只要可以实施本发明的方法，但是例如，约0.05至5.0μM，且优选0.1至1.0μM。
包含在上述组合物中的经修饰的寡核苷酸引物和5'锚定寡核苷酸引物的浓度等于常规PCR的引物浓度(诸如约0.1至1.0μM)。
可以包含在上述组合物中的其他成分(模板RNA、逆转录酶、耐热DNA聚合酶、dNTPs混合物、缓冲液、盐和RNA酶抑制剂)的浓度在现有技术的一步RT-PCR中是公知的。在本发明的上下文中使用的浓度也可以通过常规实验来优化。
接下来，将上面提供的组合物在可进行逆转录的温度下孵育。可进行逆转录的温度可以根据逆转录酶的种类适当调整，但通常为37℃～62℃，且优选为37℃～55℃。孵育时间可以在考虑模板RNA等的大小的同时适当调整，但通常为30秒～120分钟，且优选为5分钟～60分钟。通过孵育，组合物中包含的使逆转录开始的寡核苷酸引物或通过从经修饰的寡核苷酸引物解离不耐热修饰基团而产生的未经修饰的寡核苷酸引发逆转录以合成与模板RNA互补的cDNA(反义链)。在到达模板RNA的5'末端后，逆转录酶将模板转换为模板转换寡核苷酸并继续cDNA合成至其5'末端，从而产生在3'末端添加了与模板转换寡核苷酸的锚定序列互补的序列的单链cDNA(反义链)。
接下来，将包含所得cDNA的反应混合物进行PCR可以运行的多轮热循环方案。该热循环方案的一轮循环包括三个温度步骤，即变性(也称为热变性)、退火和延伸。变性没有特别限制，只要温度足以解离双链DNA即可。热变性温度的优选下限和上限分别为90℃和100℃。退火是使引物与解离的DNA退火的步骤。该步骤中的温度(退火温度)没有特别限制，但退火温度的下限优选为45℃，更优选为50℃。同时，上限优选为75℃，更优选为70℃。延伸是用DNA聚合酶合成互补链的步骤。此时的温度(延伸温度)没有特别限制，但优选的延伸温度的下限和上限分别为50℃和80℃。在该循环中，退火温度不超过延伸反应温度。退火和延伸可以在一个温度下进行，以将热循环方案配置为实质上两个温度步骤的循环。在这种情况下，退火和延伸温度的下限优选为50℃，更优选为55℃。同时，上限优选为70℃，更优选为65℃。每个步骤中的孵育时间的实例包括1秒至5分钟，但是本领域技术人员可以在考虑扩增产物的大小等的同时容易地确定合适的孵育时间。
在使反应混合物经受热循环方案之前，可以进行变性步骤(预孵育步骤)以使逆转录酶失活。变性温度没有特别限制，只要可以使逆转录酶失活即可，但优选的热变性温度的下限和上限分别为90℃和100℃。变性时间没有特别限制，只要可以使逆转录酶失活即可，但通常为1分钟至15分钟。
如果使用包含不耐热修饰基团的寡核苷酸引物作为经修饰的寡核苷酸引物，则在热循环方案的第一变性步骤或预孵育步骤中修饰基团与经修饰的寡核苷酸引物解离，并且转化为相应的未经修饰的寡核苷酸引物。未经修饰的寡核苷酸引物具有激活的磷酸二酯键并且可以通过聚合酶引发延伸。
在热循环的第一退火和延伸步骤中，将5'锚定寡核苷酸引物与在逆转录步骤中获得的单链cDNA(反义链)的3'末端存在的锚定序列互补的序列退火，导致通过聚合酶延伸，并且合成在5'末端添加有锚定序列(第一锚定序列)的cDNA(有义链)。结果，产生锚定序列被添加到有义链的5'末端的双链cDNA。
此外，随后对包含上述双链cDNA的反应混合物进行多轮热循环方案，以扩增夹在5'锚定寡核苷酸引物和经修饰的寡核苷酸引物之间的区域(即，从5'末端锚定序列到经修饰的寡核苷酸引物杂交的区域)。
可以考虑模板RNA等的量来适当地确定热循环的次数，例如20轮以上，优选30轮以上、40轮以上、45轮以上、50轮以上，或55轮以上。在常规的RT-PCR中，即使模板RNA拷贝数低(例如，单拷贝)，扩增反应在约40轮热循环后达到饱和。同时，在本发明的方法中(特别是当使用包含不耐热修饰基团的经修饰的寡核苷酸引物时)，即使在45轮以上、50轮以上，或55轮以上热循环后，扩增反应也不会达到饱和，可以进一步扩增。尽管不希望受任何理论的束缚，但是在本发明方法中(特别是当使用包含不耐热修饰基团的经修饰的寡核苷酸引物时)，与常规RT-PCR相比，可以更加抑制每轮热循环的扩增效率。因此，当要扩增的模板RNA的拷贝数低(例如，100拷贝以下、10拷贝以下，或单拷贝)时，或当使用从单个细胞中分离的RNA(特别是总RNA)作为模板RNA进行本发明的方法时，热循环的轮数优选为40轮以上、45轮以上、50轮以上，或55轮以上。
可以预期根据本发明的方法能够以一步进行具有高特异性逆转录模板转换PCR。逆转录模板转换PCR的特异性实质上可以仅通过反向引物确定，但是本发明可以通过使用上述经修饰的寡核苷酸引物作为反向引物以高特异性扩增目的基因。特别是当模板RNA的拷贝数低时(例如，当使用来自单个细胞的RNA作为模板时)，即使当PCR循环的数量高时，也可以预期在抑制了副反应的同时特异性PCR产物被扩增。因此，可以使用对抗原受体的恒定区(例如，抗体(重链或轻链)或T细胞受体(α链、β链、γ链或δ链))特异的反向引物作为上述经修饰的寡核苷酸引物，以在单细胞水平上进行抗原受体的抗原识别位点的序列分析。
本发明还提供了一种用于进行一步逆转录模板转换PCR的试剂盒，包含：
i)模板转换寡核苷酸；和
ii)引物组，其由5'锚定寡核苷酸引物和经修饰的寡核苷酸引物组成，所述5'锚定寡核苷酸引物包括模板转换寡核苷酸中所包含的锚定序列的至少一部分；
其中，该经修饰的寡核苷酸引物在逆转录中引物功能通过该修饰部分地封闭或完全地封闭，并且作为该逆转录的结果或通过初期热变性，在使用该逆转录产物作为模板的PCR中获得引物功能。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒进一步包含使逆转录开始的寡核苷酸引物。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒进一步不包含使逆转录开始的寡核苷酸引物。
本发明的试剂盒还可以包含进行一步逆转录模板转换PCR所需的其他试剂(例如，逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)、耐热DNA聚合酶(DNA依赖性DNA聚合酶)、dNTPs混合物、缓冲液、盐(镁离子等)或RNA酶抑制剂)。
试剂可以在密封在它们各自的单独容器中后包含在单个包装中，或者作为包含其一部分或全部的混合物的组合物提供。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含i)的寡核苷酸和ii)的引物组作为包含其混合物的组合物。
在一个实施方案中，该组合物进一步包含使逆转录开始的寡核苷酸引物。
在一个实施方案中，该组合物进一步不包含使逆转录开始的寡核苷酸引物。
该组合物可包含选自由以下项组成的组的1、2、3、4、5或6种试剂：逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)、耐热DNA聚合酶(DNA依赖性DNA聚合酶)、dNTPs混合物、缓冲液、盐(镁离子等)和RNA酶抑制剂。
如果使用本发明的试剂盒，通过使用任何模板RNA，可以用本发明的方法容易地进行一步逆转录模板转换PCR。
以上在本发明的方法中描述了包含在本发明的试剂盒中的每种成分的术语的定义。
本发明还提供了用于扩增靶RNA区域的至少一部分的试剂盒，该试剂盒；其特征在于包含：i)逆转录所需的试剂；ii)根据需要，模板转换所需的试剂；iii)使用经修饰的寡核苷酸引物进行聚合酶链反应所需的试剂；和iv)根据需要，用户手册，在反应开始时，将i)中的试剂、ii)中的试剂(如果存在)和iii)中的试剂和经修饰的寡核苷酸引物全部在反应体系中混合，其中，经修饰的寡核苷酸引物设计为在发生逆转录的条件下引物功能部分地封闭或完全地封闭，并设计为在发生聚合酶链反应的条件下清除引物功能的封闭。
如本文所用，“试剂盒”是指通常区分成两个以上的部分来提供待提供的部分(例如，试剂、引物、药剂(agent)、标签、手册等)的单元。当出于稳定性并不打算以混合状态提供而是提供优选在即将使用前混合后使用的组合物时，这种试剂盒的形式是优选的。这种试剂盒有利于具备描述如何使用所提供的部分(例如，药剂)或如何处理试剂的说明书或手册。当试剂盒在本文中用作反应试剂盒时，试剂盒通常包括描述如何使用药剂、抗体等的说明书。
如这里所使用的，“说明书”是向用户解释使用本发明的方法的文档。该说明书具有描述本发明的逆转录模板转换PCR和使用试剂的方法的说明。该说明书还可以具有描述指示使用方法(筛选方法)的说明。该说明书是根据实施本发明的国家的监管机构定义的格式制备的，其明确的描述表明监管机构的批准。该说明书是所谓的附属文书(package insert)，其可以以纸质媒体的形式提供，或也可以以诸如电子媒体(例如，因特网上提供的网站或电子邮件)的形式提供。
包含在本发明的试剂盒中的聚合酶链式反应所需的试剂可以不包含引物。引物可以包括在本发明的试剂盒中或单独提供。本领域技术人员可以基于靶RNA设计和制造合适的引物，或者将制造外包给引物制造商。上述经修饰的寡核苷酸引物用作本发明的试剂盒中使用的反向引物。如果模板RNA的5'末端侧的序列是未知的，则使用模板转换寡核苷酸或包含模板转换寡核苷酸中包含的至少一部分锚定序列的5'锚定寡核苷酸引物作为在本发明的试剂盒中使用的正向引物。如果模板RNA的5'末端侧的序列是已知的，则可以使用模板转换寡核苷酸或5'锚定寡核苷酸引物，也可以使用基于5'末端侧的已知序列设计的引物作为在本发明的试剂盒中使用的正向引物。
在一个实施方案中，本发明的试剂盒中模板转换所需的试剂可包含模板转换寡核苷酸。在另一个实施方案中，本发明的试剂盒中聚合酶链式反应所需的试剂可以包含也可以不包含5'锚定寡核苷酸引物，所述5'锚定寡核苷酸引物包含模板转换寡核苷酸中包含的至少一部分锚定序列。如本文实施例中所证明的，模板转换寡核苷酸(TS-Oligo)也可以出乎意料地在PCR扩增中起到正向引物的作用。因此，聚合酶链式反应所需的试剂可以不含上述5'锚定寡核苷酸引物或包含少于常用量的量。
令人惊讶的是，即使仅添加经修饰的寡核苷酸引物而不添加逆转录引物以进行逆转录PCR，也能够实现具有高特异性的PCR扩增。尽管不希望受任何理论的束缚，但是经修饰的寡核苷酸引物的一部分在逆转录反应时其功能未被封闭，以至于功能未被封闭的一部分的经修饰的寡核苷酸引物可以作为逆转录引物，或者在逆转录反应时，经修饰的寡核苷酸引物的功能被部分地封闭，以至于功能被部分地封闭的经修饰的寡核苷酸引物可以有限地起到逆转录引物的作用。因此，在一些实施方案中，逆转录所需的试剂可以不包含使逆转录开始的寡核苷酸引物。即使含有，本发明中使用的使逆转录开始的寡核苷酸引物的量也可以比通常使用的量少。在一些实施方案中，所使用的使逆转录开始的寡核苷酸引物的终浓度为例如，约40nM以下、优选为约20nM以下、约10nM以下、约2.5nM以下、约2.0nM以下、约0.63nM以下、约0.2nM以下、约0.16nM以下、约0.02nM以下、约2.0pM以下、约0.2pM以下、或约0.02pM以下。在另一个实施方案中，所使用的使逆转录开始的寡核苷酸引物相对于经修饰的寡核苷酸引物的摩尔比为约10分之1以下、优选为约20分之1以下、约40分之1以下、约为160分之1以下、约200分之1以下、约635分之1以下、约2,000分之1以下、约2,500分之1以下、约20,000分之1以下、约200,000分之1以下、约2,000,000分之1以下、或约20,000,000分之1以下。
以上详细描述了本发明的试剂盒中使用的经修饰的寡核苷酸引物。
本发明还提供了用于扩增靶RNA的至少一部分区域的组合物，其包含经修饰的寡核苷酸引物，其中，经修饰的寡核苷酸引物设计为在发生逆转录的条件下引物功能部分地封闭或完全地封闭，并设计为在发生聚合酶链反应的条件下清除引物功能的封闭，其中，引物功能未被封闭的一部分的经修饰的寡核苷酸引物起到通过与模板RNA杂交而使逆转录开始的寡核苷酸引物的作用。本发明的组合物可用于一步逆转录PCR或一步逆转录模板转换PCR。如上所述，用于本发明组合物的经修饰的寡核苷酸引物也可以起到使逆转录开始的寡核苷酸引物的作用。因此，使用本发明的组合物的一步逆转录PCR或一步逆转录模板转换PCR中，不需要使用使逆转录开始的寡核苷酸引物或使用比常用的量更少的量的使逆转录开始的寡核苷酸引物。以上详细描述了用于本发明组合物的经修饰的寡核苷酸引物。
所有出版物中的描述，包括参考文献(诸如本文引用的科学文献、专利和专利申请)，通过引用并入本文，其程度与具体描述每篇文献的全部内容相同。
上面已经用优选实施方案描述了本发明以便于理解。以下基于实施例描述本发明。上述说明和以下实施例不是为了限制本发明，而是为了举例说明。因此，本发明的范围不受本文具体描述的实施方案和实施例的限制，并且仅受权利要求的范围限制。
尽管在下文中通过以下实施例进一步详细解释本发明，但本发明不受以下实施例等的任何限制。
[实施例]
使用下列试剂。
[表1]
使用的寡核苷酸序列如下：
封闭引物：GAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAATCTC(SEQ ID NO:1)
RT引物：AAGCACACGAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAA(SEQ ID NO:2)
模板转换Oligo(3'的3个碱基是RNA)：AAGCAGTGGTATACCCGCAGAGTACATrGrGrG(SEQ IDNO:3)。
封闭引物和RT引物是对小鼠TCRβ链恒定区特异的反向引物。设计为全序列与TCRβmRNA杂交。RT引物设计为在3'侧嵌套4个碱基。RT引物的5'侧具有延伸的8个碱基以增强亲和力。可以通过使用这些引物并进行逆转录模板转换PCR，编码TCRβ链的mRNA的恒定区至5'末端可以通过使用这些引物扩增并进行逆转录模板转换PCR。扩增区域包括非翻译区或包含抗原识别位点的重构VDJ等。因此，可以通过使用从T细胞群收集的总RNA作为模板并用这些引物进行逆转录模板转换PCR来构建TCRβ链的抗原识别位点和非翻译区等的cDNA文库。如果通过细胞分选仪等分选的T细胞的单个细胞直接用作模板(细胞中的RNA将是模板)，则可以特异性扩增单个细胞的TCRβ链的抗原识别位点，并且测序。
在该试验中，逆转录模板转换PCR以一步进行。通常，使用具有下表中成分的反应混合物。
[表2]
*包含在PrimerScript II高保真Pnesep RT PCT试剂盒中
#1：说明书中的最终量为×1。
通常，使用以下热循环条件。
[表3]
**升降温速度：6℃/s
根据试验，适当时，部分改变反应溶液的组成和热循环条件。
[试验例1]
在以下总RNA浓度、封闭引物浓度和RT引物浓度条件下进行一步逆转录模板转换PCR。
[表4]
总RNA浓度(pg/μl) 封闭引物(μM) RT引物(μM)
1 34 0 0.4
2 34 0.4 0.04
3 34 0.4 0.01
4 34 0.4 0.0025
5 34 0.4 0.00063
6 34 0.4 0.00016
7 3.4 0.4 0.04
8 3.4 0.4 0.01
9 3.4 0.4 0.0025
10 3.4 0.4 0.00063
11 3.4 0.4 0.00016
结果如图1所示。当不使用封闭引物时，检测到大量非特异性条带(泳道1)，但通过添加封闭引物，非特异性条带消失(泳道2至11)。在RT引物浓度为0.04μM至0.00016μM时，观察到TCRβ链的特异性扩增。虽然在相对高的RT引物浓度(0.4μM等)下观察到少量的非特异性条带，但是能够通过降低RT引物浓度来抑制这种条带。
[试验例2]
在以下细胞数目、封闭引物浓度和RT引物浓度条件下进行一步逆转录模板转换PCR。PCR循环数为48。
[表5]
细胞数目 封闭引物(μM) RT引物(μM)
1 30 0.4 0.02
2 30 0.4 0.002
3 30 0.4 0
结果显示在图2中。在任何条件下观察到TCRβ链的特异性扩增。在不添加RT引物的情况下观察到TCRβ链的特异性扩增(泳道3)。作为在与上述相同条件下通过将细胞数目改变为10并且将封闭引物改变为CleanAmpTM Turbo引物(TriLink)的一步逆转录模板转换PCR的结果，同样地观察到TCRβ链的特异性扩增。
[试验例3]
直接以一步将反应溶液加入到小鼠T细胞的单个细胞后，进行直接一步逆转录模板转换PCR。PCR循环数为56。
结果显示在图3中。观察到仅扩增了TCRβ链全长的细胞，和观察到扩增了TCRβ链全长和TCRβ链片段的细胞。尽管56次的高循环次数，但未观察到非特异性扩增。
[试验例4]
将PCR扩增循环的数量改变为各种数量(循环数：38、40、42和44)。封闭引物浓度为0.4μm，且RT引物浓度为0.002nM。
结果显示在图4中(泳道1：38、泳道2：40、泳道3：42和泳道4：44)。在44个循环中观察到特异性TCRβ链条带。
[试验例5]
在以下总RNA浓度、封闭引物浓度和RT引物浓度条件下进行一步逆转录模板转换PCR。PCR循环数为42。
[表6]
总RNA浓度(pg/μl) 封闭引物(μM) RT引物
1 3.4 0 0.4μM
2 3.4 0.2 0.2μM
3 3.4 0.4 0.02μM
4 3.4 0.4 2nM
5 3.4 0.4 0.2nM
6 3.4 0.4 0.02nM
7 3.4 0.4 2pM
8 3.4 0.4 0.2pM
9 3.4 0.4 0.02pM
10 3.4 0.4 0
结果显示在图5中。当不使用封闭引物时，检测到大量弥散的非特异性条带(泳道1)，但通过添加封闭引物(泳道2至10)，非特异性条带消失。虽然在相对较高的RT引物浓度(0.2μM)时，少量的非特异性条带仍然存在，但是这可以通过降低RT引物浓度来抑制。在不添加RT引物的情况下也观察到TCRβ链的特异性扩增(泳道10)。
[试验例6]
在该试验例中，从单个调节性T细胞特异性扩增TCRα链的抗原识别位点。
使用以下试剂。
[表7]
使用的寡核苷酸序列如下：
封闭引物：GAGGATCTTTTAACTGGTACACAGCAGGTTCTG(SEQ ID NO:4)
RT引物：CGG TGA ACA GGC AGA GGG TG(SEQ ID NO:5)
模板转换Oligo(从3'末端首先是LNA，第二和第三是RNA)：AAGCAGTGGTATACCCGCAGAGTACATrGrG(L)G(SEQ ID NO:3)。
封闭引物和RT引物是对小鼠TCRα链恒定区特异的反向引物。编码TCRα链的mRNA的恒定区至5'末端可以通过使用这些引物扩增并进行逆转录模板转换PCR。扩增区域包括非翻译区或包含抗原识别位点等的重构VDJ。因此，可以通过使用从T细胞群收集的总RNA作为模板并用这些引物进行逆转录模板转换PCR来构建TCRβ链的抗原识别位点和非翻译区等的cDNA文库。如果通过细胞分选仪等分选T细胞的单个细胞直接用作模板(细胞中的RNA将是模板)，则可以特异性扩增单个细胞的TCRα链的抗原识别位点，并测序。
在该试验中，模板转换RT-PCR以一步进行。通常，使用具有下表中组成的反应混合物。
[表8]
通常，使用以下热循环条件。
[表9]
**升降温速度：6℃/s
作为用AMpure珠纯化扩增子后电泳确认的结果，观察到为单一条带的TCRα链的特异性扩增(图6)。由于对于每个细胞，TCRα链具有不同的序列，因此观察单个条带表明本发明的方法是能够从单个细胞(该试验例中的单个调节性T细胞)扩增的方法。
虽然已经在强调优选实施例的同时解释了本发明，但是可以修改优选实施例对于本领域技术人员来说是显而易见的。本发明旨在通过不同于本文详细描述的方法可用。因此，本发明包括所有包含在所附“权利要求”的精神和范围内的修改。
在本文讨论的所有出版物(包括专利和专利申请)中描述的内容通过引用并入本文，其程度与本文中明确描述其全部内容相同。本发明要求2016年6月23日提交的日本专利申请No.2016-125007的优先权，其全部内容并入本文，其程度与本文中明确描述其全部内容相同。
[工业实用性]
期望本发明以一步以高特异性进行逆转录模板转换PCR。特别地，即使模板RNA的拷贝数低且PCR循环数高，也可以预期扩增特异性PCR产物，同时抑制副反应。
序列表
<110> 国立研究开发法人理化学研究所
<120> 一步逆转录模板转换PCR
<130> EC004PCT
<150> JP 2016-125007
<151> 2016-06-23
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例1-5中的封闭引物
<400> 1
gagggtagcc ttttgtttgt ttgcaatctc 30
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例1-5中的RT引物
<400> 2
aagcacacga gggtagcctt ttgtttgttt gcaa 34
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模板转换Oligo
<400> 3
aagcagtggt atacccgcag agtacatggg 30
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例6中的封闭引物
<400> 4
gaggatcttt taactggtac acagcaggtt ctg 33
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 实施例6中的RT引物
<400> 5
cggtgaacag gcagagggtg 20

Claims (18)

1.一种扩增靶RNA的至少一部分区域的方法，所述方法包括以下步骤：
a)混合所述靶RNA、逆转录所需的试剂、模板转换所需的试剂和聚合酶链反应所需的试剂，并使混合物经历发生逆转录的条件以提供cDNA，所述cDNA包含模板转换寡核苷酸以及与所述靶RNA对应的核酸序列；和
b)使步骤a)中获得的所述cDNA经历发生聚合酶链反应的条件，以扩增所述cDNA的至少一部分区域；
其中，所述聚合酶链式反应所需的试剂包含经修饰的寡核苷酸引物，所述经修饰的寡核苷酸引物设计成在步骤a)中引物功能部分地封闭或完全地封闭，并设计成在步骤b)中清除引物功能的封闭。
2.一种产生基于靶RNA的至少一部分区域扩增的核酸样品的方法，所述方法包括以下步骤：
a)混合所述靶RNA、逆转录所需的试剂、模板转换所需的试剂和聚合酶链反应所需的试剂，并使混合物经历发生逆转录的条件以提供cDNA，所述cDNA包含模板转换寡核苷酸以及与所述靶RNA对应的核酸序列；和
b)使步骤a)中获得的所述cDNA经历发生聚合酶链反应的条件；
其中，所述聚合酶链式反应所需的试剂包含经修饰的寡核苷酸引物，所述经修饰的寡核苷酸引物设计成在步骤a)中引物功能部分地封闭或完全地封闭，并设计成在步骤b)中清除引物功能的封闭。
3.权利要求1或2所述的方法，其中，所述聚合酶链反应所需的试剂根据需要包含5'锚定寡核苷酸引物，所述5'锚定寡核苷酸引物含所述模板转换寡核苷酸中所包含的锚定序列的至少一部分。
4.权利要求3所述的方法，其中，所述聚合酶链反应所需的试剂不包含所述5'锚定寡核苷酸引物。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述逆转录所需的试剂包含使逆转录开始的寡核苷酸引物，并且所述使逆转录开始的寡核苷酸引物以约40nM以下的终浓度，或相对于所述经修饰的寡核苷酸引物约10分之1以下的摩尔比包含在所述混合物中。
6.权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述经修饰的寡核苷酸引物在同一经修饰的寡核苷酸引物的序列上具有一个或更多个互补区域，并且在PCR的初期热变性之前通过所述互补区域具有转角结构，或包含不耐热的修饰基团。
7.权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述经修饰的寡核苷酸引物包含与模板RNA的一部分序列互补的核苷酸序列。
8.权利要求7所述的方法，其中，引物功能尚未被封闭的一部分的所述经修饰的寡核苷酸引物起到通过与所述模板RNA杂交而使逆转录开始的寡核苷酸引物的作用。
9.用于扩增靶RNA的至少一部分区域的试剂盒，所述试剂盒包括：
i)逆转录所需的试剂；
ii)模板转换所需的试剂；
iii)使用经修饰的寡核苷酸引物进行聚合酶链反应所需的试剂；和
iv)根据需要，用户手册；
其特征在于，在反应开始时，将所述i)至iii)的试剂和所述经修饰的寡核苷酸引物全部混合在反应体系中，所述经修饰的寡核苷酸引物设计成在发生逆转录的条件下引物功能部分地封闭或完全地封闭，并设计成在发生聚合酶链反应的条件下清除引物功能的封闭。
10.权利要求9所述的试剂盒，其中，所述模板转换所需的试剂包含模板转换寡核苷酸，并且所述聚合酶链反应所需的试剂根据需要包含5'锚定寡核苷酸引物，所述5'锚定寡核苷酸引物含所述模板转换寡核苷酸中所包含的锚定序列的至少一部分。
11.权利要求10所述的试剂盒，其中，所述聚合酶链式反应所需的试剂不包含5'锚定寡核苷酸引物。
12.权利要求9-11中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述逆转录所需的试剂包含使逆转录开始的寡核苷酸引物，并且所述使逆转录开始的寡核苷酸引物以约40nM以下的终浓度，或相对于所述经修饰的寡核苷酸引物约10分之1以下的摩尔比来使用。
13.权利要求9-12中任一项所述的试剂盒，其中，所述经修饰的寡核苷酸引物在同一经修饰的寡核苷酸引物的序列上具有一个或更多个互补区域，并且在PCR的初期热变性之前通过所述互补区域具有转角结构，或包含不耐热的修饰基团。
14.权利要求9-13中任一项所述的试剂盒，其中，所述经修饰的寡核苷酸引物包含与模板RNA的一部分序列互补的核苷酸序列。
15.权利要求14所述的试剂盒，其中，引物功能尚未被封闭的一部分的所述经修饰的寡核苷酸起到通过与所述模板RNA杂交而使逆转录开始的寡核苷酸引物的作用。
16.一种用于扩增靶RNA的至少一部分区域的组合物，所述组合物包含经修饰的寡核苷酸引物，其中，所述经修饰的寡核苷酸引物设计成在发生逆转录的条件下引物功能部分地封闭或完全地封闭，并设计成在发生聚合酶链反应的条件下清除引物功能的封闭，引物功能尚未被封闭的一部分的所述经修饰的寡核苷酸引物通过与模板RNA杂交而起到使逆转录开始的寡核苷酸引物的作用。
17.权利要求16所述的组合物，其中，所述经修饰的寡核苷酸引物在同一经修饰的寡核苷酸引物的序列上具有一个或更多个互补区域，并且在PCR的初期热变性之前通过所述互补区域具有转角结构，或包含不耐热的修饰基团。
18.权利要求16或17所述的组合物，其中，所述组合物用于一步逆转录模板转换PCR。
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