JPWO2017222056A1 - ワンステップ逆転写テンプレートスイッチｐｃｒを利用したｔ細胞受容体およびｂ細胞受容体レパトア解析システム - Google Patents

ワンステップ逆転写テンプレートスイッチｐｃｒを利用したｔ細胞受容体およびｂ細胞受容体レパトア解析システム Download PDF

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Abstract

本発明は、被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を解析する方法であって、(1)該被験体から得られたRNAから、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを利用して増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と、(2)該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程と、(3)決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のTCRもしくはBCRレパトアを導出する工程とを含む、方法を提供する。

Description

本発明は、ワンステップで、逆転写テンプレートスイッチングPCRを実施するための技術およびこの技術を利用したT細胞受容体(TCR)またはB細胞受容体(BCR)レパトア解析システムに関する。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction; RT-PCR）は、RNAを鋳型として、特定の遺伝子を増幅する手法として、遺伝子工学の分野において汎用されている。RT-PCRにおいては、まず、逆転写酵素（RNA依存性DNAポリメラーゼ）を用いてRNAをcDNAに逆転写し、さらに耐熱性DNAポリメラーゼによりこのcDNAを検出可能なレベルにまで増幅させる。この反応のコンビネーションは、オーソドックスには、ツーステップ（反応ごとに別のチューブを用い、継続して反応させる）で行われるが、逆転写酵素や反応溶液組成の工夫により、この反応のコンビネーションをワンステップ（1つのチューブ中で連続して反応させる）で行う技術が開発されている。
テンプレートスイッチング（Template Switching）は、鋳型となるRNAの5’末端の配列が未知であるか、共通配列を有していない場合でも、そのRNAを鋳型とするRT-PCR増幅を可能とする技術である。テンプレートスイッチングにおいては、逆転写酵素が鋳型RNAの5’末端に達すると、逆転写酵素の有するターミナルトランスフェラーゼ活性により、新たに合成したcDNAの3’末端に特定の短い配列（例えば、Moloney Murine Leukemia Virus由来の逆転写酵素（MMLV RT）の場合は、シトシンリッチな短い配列）が自動的に付加される現象を利用する。この短い付加配列に相補的な配列を、アンカー配列の3’末端に付加したオリゴヌクレオチド（テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド）を逆転写時に系内に加えると、当該テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドが合成されたcDNAの3’末端にハイブリダイズし、逆転写酵素のための鋳型を延長する。逆転写酵素は鋳型を乗り換え、アンカー配列の5’末端までcDNA合成を続けるため、cDNAの3’端にアンカー配列に相補的な配列が付加される。逆転写のプライマーとして、鋳型RNA中の特定の配列に相補的な配列を含むオリゴDNAか、特定の既知配列が5’末端に付加されたオリゴDNAを用いることにより、新たに合成されるcDNAは5’末端にも既知配列を有するので、結果として新たに合成されるcDNA（アンチセンス鎖）は、5’末端と3’末端の両端に既知配列を備えることとなる。従って、これらの既知配列に基づき設計されたプライマーセットを用いることにより、PCR増幅が可能となる。
ポリ（A）テイルを有するmRNAに対応するcDNAの合成は、ランダムプライマーまたはポリ（A）テイルに相補的なオリゴ（dT）含有プライマーを用いた逆転写によって達成される。この反応においては、ポリ（A）テイルを有する全てのmRNAから、cDNAが合成されるので、cDNAライブラリーが構築される。一方、特定の遺伝子に特異的なプライマーを逆転写において用いることにより、特定の遺伝子のcDNAのみを特異的に合成することが可能となる。
ハイスループットへ適用可能とするように、より迅速に、より簡便に、且つ高い特異性で、逆転写テンプレートスイッチングPCRを行う技術が求められている。
ところで、PCRにおける副反応を回避する技術として、種々のホットスタート技術が開発されている。即ち、PCRを行う際に、反応液を調製してからサーマルサイクラーの温度が上昇するまでの間、PCR反応混合液は室温〜50℃という温度にさらされる。プライマーのTmは通常、50℃以上に設定されるので、この温度域ではプライマーの特異性が充分発揮されない。一方、この温度域でもポリメラーゼは弱いながら活性を示すため、ミスアニールしたプライマーを起点とした伸長が生じ、様々な副反応（プライマーダイマー、エキストラバンド等）の原因となる。この副反応を回避する技術として、熱不安定性の修飾基が結合したオリゴヌクレオチドプライマーが開発されている（特許文献1及び2、非特許文献1及び2）。このオリゴヌクレオチドプライマーにおいては、1以上のヌクレオチド間結合或いは3’末端ヒドロキシル基に修飾基が置換している。この修飾基による保護のため、PCR増幅における最初の高温でのインキュベーション期間前におけるDNAポリメラーゼ媒介性オリゴヌクレオチドプライマー伸長が抑制される。修飾基の存在のため、プライマーは、最初の変性温度（多くの場合95℃）に達するまでは不活性状態にある。最初の変性温度に到達すると、修飾基が離脱することにより、ポリメラーゼによる伸長の可能な、対応する未修飾オリゴヌクレオチドプライマーとなる。
近年、急速に進歩した次世代シーケンス解析技術により大規模な遺伝子の塩基配列決定が可能になった。ヒト試料からTCR遺伝子をPCR増幅し、次世代シーケンス解析技術を利用することで、従来は小規模かつV鎖使用頻度など限られた情報を得るTCRレパトア解析から、クローンレベルのより詳細な遺伝子情報を入手して解析する次世代TCRレパトア解析法が実現できるようになった。特許文献3は、アダプタープライマーにより非バイアス的に増幅された核酸試料を用いてT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を定量的に解析する方法を開示する。
米国特許第８１３３６６９号明細書 米国特許第８３６１７５３号明細書 国際公開第2015/075939号
Curr Protoc Nucleic Acid Chem. 2009 Sep; Chapter 4: Unit 4.35 1-17 Nucleic Acids Res. 2008 Nov; 36(20):e131
本発明は、より迅速に、より簡便に、且つ高い特異性で、逆転写テンプレートスイッチングPCRを行う技術を提供する。本発明はまた、逆転写テンプレートスイッチングPCRを応用して、T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を定量的に解析する方法を提供する。
本発明を以下に詳細に説明する。本発明者は、逆転写テンプレートスイッチングPCRにおいて、逆転写用のプライマーとして、特定の遺伝子に特異的なプライマーを使用し、且つPCR用のプライマーセットとして、テンプレートスイッチングプライマー中のアンカー配列を有するオリゴヌクレオチドと、前記逆転写用のプライマーとの組み合わせを使用し、ワンステップ（同一の反応系において一段階）で、逆転写とPCRの反応コンビネーションを実施してみた。しかしながら、この方法では、副反応が生じてしまい、特に、鋳型となるRNAのコピー数が少なく、PCRのサイクル数を多くした時に、この傾向が顕著だった。副反応が生じる原因として、PCRの特異性が逆転写用のプライマーのみに依存すること、鋳型RNAのコピー数に対して、逆転写用プライマーが大過剰に存在するため、逆転写用プライマーが非特異的に鋳型RNAにハイブリダイズし、非特異的な逆転写が生じてしまうことが考えられた。
そこで、上記反応コンビネーションにおいては、逆転写用プライマーが、逆転写のみならずPCRにおけるプライマーとしても使用されるが、これを改め、逆転写用プライマーと同一のオリゴヌクレオチドの3’末端OHを、熱不安定性の修飾基で保護して不活化したプライマー（以下、不活化したプライマーをブロックプライマーと呼ぶことがある）を、PCR用のプライマーとし、逆転写用プライマーの添加量を減らすことにより、副反応の発生を抑制することに成功した。この方法によると、逆転写において、逆転写用プライマーとブロックプライマーが鋳型RNAにハイブリダイズするが、ブロックプライマーは修飾基による保護のため、逆転写に寄与することが出来ず、逆転写用プライマーのみを起点に逆転写が生じる。ブロックプライマーは、仮に非特異的に鋳型RNAにハイブリダイズしたとしても、逆転写産物を生じない。PCR増幅における最初の高温でのインキュベーションにより、ブロックプライマーから修飾基が離脱して未修飾プライマーに変換されると、伸長反応に寄与可能となるため、PCRが進行する。驚くべきことに、未修飾の逆転写用プライマーを添加せずに、ブロックプライマーのみを添加して、ワンステップで逆転写テンプレートスイッチングPCRを行っても、高い特異性を持ったPCR増幅を達成することができた。
本発明は、上記ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを応用して、T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を定量的に解析することに応用したものである。
本発明者は、上記知見に基づき更に検討を加え、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明を含む：
［1］改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いてRNAの少なくとも一部の領域を増幅する核酸の増幅方法であって、
核酸の増幅反応は、RNAを鋳型とする逆転写工程a)と、工程a)で合成されたcDNAにテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを付加するテンプレートスイッチング工程b)と、
工程b)で合成されたテンプレートスイッチcDNAを鋳型とするPCRによるDNA増幅工程c)、からなり、前記工程a)〜c)は同一の反応系において一段階で行われ、
該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、当該改変により逆転写工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、DNA増幅工程c)ではプライマー機能の阻害が解除されることを特徴とする、核酸の増幅方法。
［2］以下の工程：
1）i)テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド、ii)該テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマー、及び改変オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット、並びにiii)鋳型RNA、を含む、該鋳型RNAをcDNAにテンプレートスイッチング逆転写するため、及び該cDNAの少なくとも一部の領域をPCR増幅するために必要な全ての試薬（但し、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを除く）を含む、組成物を提供すること；
2）1）で提供された組成物を、逆転写が進行可能な温度でインキュベートすることにより、該鋳型RNAから、アンカー配列に相補的なヌクレオチド配列が3’末端に付加されたcDNAを生成し、該cDNAを含む反応混合液を得ること；及び
3）2）で得られた反応混合液を、PCRが進行可能な複数回の熱サイクリングプロトコールに付すことにより、該cDNAを鋳型として、前記プライマーセットにより挟まれた領域が増幅された核酸を得ること
を含む、改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いてRNAの少なくとも一部の領域を増幅する核酸の増幅方法であって、
該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、当該改変により逆転写におけるプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、且つ該逆転写の結果、又はPCRの初期熱変性処理によって、プライマー機能の阻害が解除される、方法。
［3］1）で提供される組成物が、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを更に含む、［2］記載の方法。
［4］改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、［1］〜［3］のいずれかに記載の方法。
［5］該改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、［4］記載の方法。
［6］プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAにハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、［5］記載の方法。
［7］逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの濃度が40nM以下である、［1］〜［6］のいずれかに記載の方法。
［8］PCRの熱サイクリングの回数が40回以上である、［1］〜［7］のいずれか記載の方法。
［9］i)テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド；並びに
ii)該テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマー、及び改変オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセットを含む、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを実施するための、キットであって、
該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、当該改変により逆転写におけるプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、且つ該逆転写の結果、又は熱変性処理により、該逆転写の産物を鋳型とするPCRにおけるプライマー機能を獲得する、キット。
［10］i)のオリゴヌクレオチド、及びii)のプライマーセットを、両者の混合物を含む組成物として含む、［9］記載のキット。
［11］更に、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含む、［9］又は［10］記載のキット。
［12］逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含まない、［9］又は［10］記載のキット。
［A1］ 対象RNAの少なくとも一部の領域を増幅する方法であって、該方法は、
a)該対象RNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドおよび該対象RNAに対応する核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、
b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、該cDNAの少なくとも一部の領域を増幅する工程と
を含み、
該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーを含む、方法。
［A2］ 対象RNAの少なくとも一部の領域に基づいて増幅された核酸試料を生産する方法であって、該方法は、
a)該対象RNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドおよび該対象RNAに対応する核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、
b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供する工程と
を含み、
該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーを含む、方法。
［A3］ 前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、必要に応じて、前記テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含む、［A1］または［A2］に記載の方法。
［A4］ 前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まない、［A3］に記載の方法。
［A5］ 前記逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、前記混合物中に、約40nM以下の終濃度で、または前記改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下のモル比で含む、［A1］〜［A4］のいずれか一項に記載の方法。
［A6］ 前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、［A1］〜［A5］のいずれか一項に記載の方法。
［A7］ 前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、［A1］〜［A6］のいずれか一項に記載の方法。
［A8］ プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAにハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、［A7］記載の方法。
［A9］ 対象RNAの少なくとも一部の領域を増幅するためのキットであって、該キットは、
i)逆転写に必要な試薬と、
ii)テンプレートスイッチに必要な試薬と、
iii)改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬と
iv)必要に応じて、使用説明書
を含み、
i)〜iii)の試薬および該改変オリゴヌクレオチドプライマーが反応開始時においてすべて反応系において混合されていることを特徴とし、該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写が生じる条件下でプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件下でプライマー機能の阻害が解除されるように設計される、キット。
［A10］ 前記テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、必要に応じて、該テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含む、［A9］に記載のキット。
［A11］ 前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まない、［A10］に記載のキット。
［A12］ 前記逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、約40nM以下の終濃度で、または前記改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下のモル比で使用されることを特徴とする、［A9］〜［A11］のいずれか一項に記載のキット。
［A13］ 前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、［A9］〜［A12］のいずれか一項に記載のキット。
［A14］ 前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAの部分配列に相補的なヌクレオチド配列を含む、［A9］〜［A13］のいずれか一項に記載のキット。
［A15］ プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAにハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、［A14］に記載のキット。
［A16］ 改変オリゴヌクレオチドプライマーを含む、対象RNAの少なくとも一部の領域を増幅するための組成物であって、該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写が生じる条件下でプライマー機能の一部が阻害されており、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件でプライマー機能の阻害が解除されるように設計されており、プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAにハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、組成物。
［A17］ 前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、［A16］に記載の組成物。
［A18］ 前記組成物は、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチPCRにおいて使用されるものである、［A16］または［A17］に記載の組成物。
［B1］ 被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を解析する方法であって、
(1)該被験体から得られたRNAから増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と、
(2)該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程と、
(3)決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のTCRもしくはBCRレパトアを導出する工程と
を含み、
該工程(1)は、
a)該被験体から得られたRNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、
b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、該複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と
を含み、
該テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、
該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該TCRまたは該BCRのC領域特異的プライマーを含み、該C領域特異的プライマーは、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーである、方法。
［B2］ 被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を解析するための核酸試料を生産する方法であって、該方法は、(1)該被験体から得られたRNAから増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程を含み、該工程(1)は、
a)該被験体から得られたRNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、
b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、該複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と
を含み、
該テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、
該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該TCRまたは該BCRのC領域特異的プライマーを含み、該C領域特異的プライマーは、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーである、方法。
［B3］ 前記核酸試料は、非バイアス的に増幅された核酸試料である、［B1］または［B2］に記載の方法。
［B4］ 前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、必要に応じて、前記テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、［B1］〜［B3］のいずれか一項に記載の方法。
［B5］ 前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まず、前記テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドは、5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、［B1］〜［B4］のいずれか一項に記載の方法。
［B６］ 前記逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、前記混合物中に、約40nM以下の終濃度で、または前記改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下のモル比で含む、［B1］〜［B5］のいずれか一項に記載の方法。
［B7］ 前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む［B1］〜［B6］のいずれか一項に記載の方法。
［B8］ プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAにハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、［B1］〜［B7］のいずれか一項に記載の方法。
［B9］ T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域を増幅するためのキットであって、該キットは、
i)逆転写に必要な試薬と、
ii)テンプレートスイッチに必要な試薬と、
iii)改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬と
iv)必要に応じて、使用説明書
を含み、
i)〜iii)の試薬および該改変オリゴヌクレオチドプライマーが反応開始時においてすべて反応系において混合されていることを特徴とし、
ii)の試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、
該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写が生じる条件下でプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件下でプライマー機能の阻害が解除されるように設計された該TCRまたは該BCRのC領域特異的プライマーである、キット。
［B10］ 前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含む、［B9］に記載のキット。
［B11］ 前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まない、［B9］または［B10］に記載のキット。
［B12］ 前記逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、約40nM以下の終濃度で、または前記改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下のモル比で使用されることを特徴とする、［B9］〜［B11］のいずれか一項に記載のキット。
［B13］ 前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、［B9］〜［B12］のいずれか一項に記載のキット。
［B14］ プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、前記TCRまたは該BCRの鋳型RNAのC領域の部分配列にハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、［B9］〜［B13］のいずれか一項に記載のキット。
［B15］ 被験体から得られたRNAから非バイアス的に増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供するためのものである、［B9］〜［B14］のいずれか一項に記載のキット。
［B16］ 前記工程(1)は、配列解析のために適切な配列が付加された核酸試料を提供する工程をさらに含む、［B1］、ならびに［B1］に従属する場合の［B3］〜［B8］に記載の方法。
［B17］ 前記配列解析のために適切な配列は、ブリッジPCRまたはエマルジョンPCRを使用する配列解析に適切な配列である、［B16］に記載の方法。
［B18］ 前記工程(1)は、以下：
c)前記工程b)のPCR増幅産物と、第1のタグ配列が付加された第2の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第2のタグ配列が付加された第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、タグ配列が付加された複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と、
d)前記工程c)のPCR増幅産物と、第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、インデックス配列が付加された前記複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程であって、該第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーおよび該第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、配列解析の基板に固定化するための配列およびインデックス配列が付加されている、工程と
をさらに含む、［B1］、［B1］に従属する場合の［B3］〜［B8］、［B16］または［B17］に記載の方法。
［B19］ 前記工程(3)は、以下：
(3-1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する工程と、
(3-2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する工程と、
(3-3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する工程と、
(3-4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出する工程と、
(3-5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類する工程と、
(3-6)該工程(3-5)での分類に基づいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出する工程と
を含む、［B1］、［B1］に従属する場合の［B3］〜［B8］、［B16］、［B17］または［B18］に記載の方法。
［B20］ データベースを用いて被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を定量的に解析するためのシステムであって、該システムは、
(1)［B9］〜［B15］のいずれか一項に記載のキット；
(2)該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定するための装置；および
(3)決定された該核酸配列に基づいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のTCRもしくはBCRレパトアを導出するための装置
を備えるシステム。
［B21］ (1)前記キットは、以下：
c)前記工程b)のPCR増幅産物と、第1のタグ配列が付加された第2の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第2のタグ配列が付加された第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、タグ配列が付加された複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する手段と、
d)前記工程c)のPCR増幅産物と、第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、インデックス配列が付加された前記複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する手段であって、該第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーおよび該第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、配列解析の基板に固定化するための配列およびインデックス配列が付加されている、手段と
をさらに含む、［B20］に記載のシステム。
［B22］ (3)前記TCRもしくはBCRレパトアの導出のための装置は、以下：
(3-1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段；
(3-2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段；
(3-3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段；
(3-4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出する手段；
(3-5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類する手段；および
(3-6)該工程(3-5)での分類に基づいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出する手段
を備える、［B20］または［B21］に記載のシステム。
［B23］ ［B20］〜［B22］のいずれか一項に記載のシステムと、該システムに基づいて導出されたTCRもしくはBCRレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手段とを備える、被験者の疾患、障害または状態を分析するためのシステム。
［B24］ ［B23」に記載のシステムで決定された被験者の疾患、障害または状態と、前記TCRもしくはBCRレパトアとを定量的に関連付ける手段、および該定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する手段とを備える、該被験者の疾患、障害または状態を処置または予防するためのシステム。
本発明において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
本発明によれば、逆転写テンプレートスイッチングPCRを、高い特異性で、ワンステップで実施することが期待できる。特に、鋳型となるRNAのコピー数が少なく、PCRのサイクル数を多くした場合であっても、副反応の発生を抑制しつつ、特異的PCR産物を増幅することが期待できる。
種々の条件における、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRによるTCRβ鎖の増幅。矢印は、全長TCRβ鎖のバンドを示す。 種々の条件における、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRによるTCRβ鎖の増幅。矢印は、全長TCRβ鎖のバンドを示す。 シングルセルのT細胞を鋳型として用いた、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRによるTCRβ鎖の増幅。上側の矢印は、全長TCRβ鎖のバンドを示す。下側の矢印は、TCRβ鎖断片のバンドを示す。 種々の条件における、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRによるTCRβ鎖の増幅。矢印は、全長TCRβ鎖のバンドを示す。 種々の条件における、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRによるTCRβ鎖の増幅。矢印は、TCRβ鎖のターゲット配列全長のバンドを示す。 インデックスPCR反応液の電気泳動写真。左のレーンは、マーカーDNA、右のレーンは、Pmel-1由来リンパ球より抽出したRNAから増幅したDNAのバンドを示す。 Pmel-1マウス由来リンパ球細胞から得られたV遺伝子およびJ遺伝子使用頻度グラフ。 Pmel-1マウス由来リンパ球細胞から得られたV-J使用頻度グラフ。 インデックスPCR反応液の電気泳動写真。各レーンは、左から順に、1：マーカーDNA、2〜6：マウス脾臓組織（1000ng、200ng、40ng、8ng、1.6ng）、7〜8：Pmel-1由来リンパ球（8ng、1.6ng）、9：blankを示す。 C57BL/6マウス脾臓組織から得られたV遺伝子およびJ遺伝子それぞれの使用頻度グラフ。 C57BL/6マウス脾臓組織から得られたV-J使用頻度グラフ。 本発明のレパトア解析システムのブロック図。
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。本明細書において、数値の前の「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。
本発明は、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRにより、鋳型RNAの少なくとも一部の領域を増幅する方法に関する。
逆転写テンプレートスイッチングPCRは、鋳型となるRNAの5’末端の配列が未知であるか、共通配列を有していない場合にでも、そのRNAを鋳型とするRT-PCR増幅を可能とする技術である。逆転写テンプレートスイッチングPCRにおいては、逆転写酵素が鋳型RNAの5’末端に達すると、逆転写酵素の有するターミナルトランスフェラーゼ活性により、新たに合成したcDNAの3’末端に特定の短い配列が自動的に付加される現象を利用する。例えば、Moloney Murine Leukemia Virus由来の逆転写酵素（MMLV RT）は、シトシンリッチな短い配列（例、CC、CCC、CCCC）を、合成したcDNAの3’末端に付加する。この短い付加配列に相補的な配列を、特定のアンカー配列（第1のアンカー配列）の3’末端に付加したヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチド（テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド）を逆転写時に系内に加えると、cDNAの3’末端の付加配列と、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドの3’末端の当該付加配列の相補配列との間の相互作用を介して、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドが合成されたcDNAの3’末端にハイブリダイズし、逆転写酵素のための鋳型を延長する。その結果、逆転写酵素は、鋳型RNAの5’末端に達すると、鋳型をテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに乗り換え、その5’末端までcDNA合成を続けるため、cDNAの3’端に、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドのアンカー配列（第1のアンカー配列）に相補的な配列が付加される。逆転写のプライマーとして、鋳型RNA中の特定配列に相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーか、特定のアンカー配列（第2のアンカー配列）が5’末端に付加したオリゴヌクレオチドプライマー（ランダムプライマー、オリゴ（dT）プライマー等）を用いることにより、新たに合成されるcDNAは5’末端にも既知配列を備える。その結果、当該既知配列を含むオリゴヌクレオチドプライマー、及び前記第1のアンカー配列の少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドプライマーを含むプライマーセットを用いることにより、新たに合成されたcDNAを鋳型とするPCR増幅が可能となる。
いくつかの実施形態では、鋳型RNAの5'末端側の配列が既知である場合は、テンプレートスイッチを行わなくてもよい。
本発明の方法においては、「ワンステップ（一段階）」で逆転写テンプレートスイッチングPCRを実施する。「ワンステップ逆転写テンプレートスイッチPCR(RT-TS-PCR)」とは、逆転写、テンプレートスイッチおよびPCRに必要な試薬を反応開始時においてすべて混合しておき、さらなる逆転写に必要な試薬も、テンプレートスイッチに必要な試薬も、PCR増幅に必要な試薬も追加せずに、好ましくは、反応系を開放せずに（即ち、チューブの開閉や試薬の添加を行わずに）、同一の反応系において反応を進行することを特徴とする、逆転写反応からの核酸増幅方法を意味する。
即ち、本発明の方法において、核酸の増幅反応は、RNAを鋳型とする逆転写工程a)と、工程a)で合成されたcDNAにテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを付加するテンプレートスイッチング工程b)と、工程b)で合成されたテンプレートスイッチcDNAを鋳型とするPCRによるDNA増幅工程c)、からなり、前記工程a)〜c)は同一の反応系において一段階で行われる。
また、別の態様において、本発明は、対象RNAの少なくとも一部の領域を増幅する方法であって、該方法は、a)該対象RNAと、逆転写に必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供する工程であって、該混合は、必要に応じて、テンプレートスイッチに必要な試薬を混合することを含む、工程と、b)該混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、該対象RNAの少なくとも一部の領域を増幅する工程とを含み、該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーを含む、方法を提供する。
さらに、本発明は、対象RNAの少なくとも一部の領域に基づいて増幅された核酸試料を生産する方法であって、該方法は、a)該対象RNAと、逆転写に必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供する工程であって、該混合は、必要に応じて、テンプレートスイッチに必要な試薬を混合することを含む、工程と、b)該混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供する工程とを含み、該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーを含む、方法を提供する。
鋳型となるRNAの5’末端の配列が未知であるか、共通配列を有していない場合、テンプレートスイッチを実施することによって、鋳型RNAの5'末端に特定のアンカー配列を付加することができるため有利である。一方、鋳型RNAの5'末端側の配列が既知である場合は、テンプレートスイッチを行わなくてもよい。
一態様において、前記テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み得る。さらなる態様において、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含んでもよいし、含まなくてもよい。本明細書の実施例において実証されるように、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド（TS-Oligo）は、予想外にもPCR増幅におけるフォワードプライマーとしても機能することができる。したがって、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、上記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まなくてもよいし、通常使用される量よりも少量であってもよい。
驚くべきことに、逆転写用プライマーを添加せずに、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーのみを添加して、逆転写PCRを行っても、高い特異性でPCR増幅を達成することができた。理論に束縛されることを望まないが、逆転写反応時において、改変オリゴヌクレオチドプライマーのうちの一部は、その機能が阻害されておらず、機能が阻害されていない一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが逆転写プライマーとしても機能することができるか、あるいは、逆転写反応時において、改変オリゴヌクレオチドプライマーの機能が一部阻害されているため、機能が一部阻害された改変オリゴヌクレオチドプライマーが限定的に逆転写プライマーとして機能することができる。したがって、いくつかの実施形態では、逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含まなくてもよいし、含んでいたとしても、本方法において使用される逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは通常使用する量よりも少量であってもよい。いくつかの実施形態において、上記組成物中の逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、例えば、約40nM以下、好ましくは、約20nM以下、約10nM以下、約2.5nM以下、約2.0nM以下、約0.63nM以下、約0.2nM以下、約0.16nM以下、約0.02nM以下、約2.0pM以下、約0.2pM以下、又は約0.02pM以下である。別の実施形態において、上記組成物中の逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下、好ましくは、約20分の1以下、約40分の1以下、約160分の1以下、約200分の1以下、約635分の1以下、約2,000分の1以下、約2,500分の1以下、約20,000分の1以下、約200,000分の1以下、約2,000,000分の1以下、又は約20,000,000分の1以下のモル比で含む。
本発明の方法は、PCRにおける少なくとも一方のオリゴヌクレオチドプライマーとして、改変により逆転写におけるプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、PCRの核酸増幅の工程ではプライマー機能の阻害が解除される。このことによって、同一の反応系にありながら逆転写反応段階とPCRの核酸増幅段階の各段階で使われるプライマーを機能的に分けることが達成され、各反応段階におけるプライマー濃度を大きく差をつけることを特徴とする。
プライマー機能の阻害・解除する手段として、例えば、以下のアプローチが挙げられる。１）熱不安定性修飾基を含む、または逆転写反応段階では折り畳み構造を保持するように設計されたプライマーによって逆転写時のプライマー機能を阻害する。
逆転写反応後、熱処理によって熱不安定修飾基の乖離または折り畳み構造の解消により、プライマー機能の阻害が解除される。
２）人工塩基を含むプライマーによって逆転写反応段階ではプライマーとして機能を阻害する。
逆転写反応の結果、逆転写反応によって鋳型RNAから、プライマー中に含まれる人工塩基と対をなす核酸が組み込まれたcDNAを合成され、当該人工核酸に対してプライマーがアニーリング可能となり、プライマー機能の阻害が解除される。
ワンステップRT-PCRにおいては、一般的に、逆転写の開始時点において、反応系内に、鋳型RNAをcDNAに逆転写するために必要な全ての試薬と、得られたcDNAを鋳型としてPCRを行うために必要な全ての試薬が含まれる。PCRプライマーのTmは通常50℃以上に設定されるので、逆転写が進行可能な温度域（例えば、42℃）では、プライマーの特異性が十分発揮されない可能性がある。また、PCRにおいては鋳型のコピー数が指数関数的に増加するため、必要とされるPCRプライマーの濃度は、逆転写用のプライマー濃度よりも圧倒的に高い。従って、逆転写を行う際に、PCRプライマーが鋳型RNAにミスアニールし、そこを起点とした非特異的逆転写を生じ、最終的に非特異的なPCR産物を生じてしまうおそれがある。本発明においては、PCRにおけるリバースプライマーとして、改変により逆転写におけるプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、且つ該逆転写の結果、又は熱変性処理により、該逆転写の産物を鋳型とするPCRにおけるプライマー機能を獲得する改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより、非特異的逆転写を抑制することができる。
本明細書において、「オリゴヌクレオチド」、「プライマー」、又は「オリゴヌクレオチドプライマー」は、通常は一本鎖であるポリヌクレオチドを表す。天然に生ずるものであっても合成のものであってもよい。通常は約5−約50ヌクレオチド，より好ましくは約10−約30ヌクレオチド，またはより好ましくは約15−約25ヌクレオチドの配列から構成される。オリゴヌクレオチドには、DNA、RNA、DNA／RNAキメラが包含される。
本明細書において、「フォワードプライマー」との用語は、RT-PCRにおける鋳型RNAをセンス鎖としたときに、そのアンチセンス鎖にアニーリングするオリゴヌクレオチドプライマーを意味する。「リバースプライマー」は、センス鎖にアニーリングするオリゴヌクレオチドプライマーを意味する。
一態様において、本発明に用いられる改変オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列を含む。該部分配列の長さは、特に限定されないが、通常、10〜40塩基、好ましくは15〜30塩基、より好ましくは18〜25塩基である。該部分配列は、鋳型RNAに含まれる増幅を意図する領域の3’末端の部分配列であり得る。該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、その3’末端に、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列を含む。該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列の5’末端に、付加配列を含んでいてもよい。付加配列は、特に限定されないが、非特異的なハイブリダイゼーションを避ける観点から、好適には、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列を含まない。付加配列としては、例えば、特定の制限酵素認識配列を挙げることが出来る。付加配列の長さは、特に限定されないが、非特異的なハイブリダイゼーションを避けるため、短い方が好ましい。付加配列の長さは、通常1〜50塩基、好ましくは1〜30塩基、より好ましくは1〜10塩基である。一態様において、該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列からなり、付加配列を含まない。
本発明に用いられる改変オリゴヌクレオチドプライマーにおける改変の態様として、例えば、以下を挙げることができる。
（1）熱不安定性修飾基を含む、オリゴヌクレオチドプライマー
（2）同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取ることで分子内ヘアピンループ形成し、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列がマスクされた構造を呈する、オリゴヌクレオチドプライマー
（3）人工塩基を含む、オリゴヌクレオチドプライマー
以下各態様について詳述する。
（1）熱不安定性修飾基を含む、オリゴヌクレオチドプライマー
本態様においては、オリゴヌクレオチドプライマーが熱不安定性修飾基を含むことにより、修飾ヌクレオチドプライマーは、これがハイブリダイズしたポリヌクレオチドに沿って鎖を伸長することができず、すなわち，酵素の阻害により，または標的核酸へのハイブリダイゼーションの低下により、伸長可能ではない。好ましい態様において、オリゴヌクレオチドプライマーの1又はそれ以上のヌクレオチド間結合又は3’末端ヒドロキシル基に、熱不安定性修飾基が置換する。したがって，鎖伸長は，修飾または修飾されたヌクレオチドが除去されないかぎり，そして除去されるまで，実質的な程度では生じない。該修飾基は熱不安定性であるが、PCR増幅における最初の変性温度（例えば、約80−105℃、好ましくは約85−100℃、より好ましくは約90−96℃（例、95℃））に到達するまでは、殆ど解離しないため、逆転写におけるプライマー機能の一部又は全部が阻害される。最初の変性温度に到達すると、修飾オリゴヌクレオチドプライマーからの修飾基の部分的または完全な解離が熱的に誘導され、修飾オリゴヌクレオチドプライマーは対応する未修飾オリゴヌクレオチドプライマーに変換される。未修飾オリゴヌクレオチドプライマーは，活性状態のホスホジエステル結合を有し，ポリメラーゼによる伸長が可能である。
熱不安定性修飾基を含む、オリゴヌクレオチドプライマーとしては、US patent No. 8133669（開示内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれる）に開示された、3’末端のヒドロキシル基が、熱不安定性修飾基に置換された修飾オリゴヌクレオチドプライマー、US patent No. 8361753（開示内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれる）に開示された、1又はそれ以上のヌクレオチド間結合において熱不安定性修飾基を含む修飾オリゴヌクレオチドプライマー等を挙げることができる。
（1-1） 3’末端のヒドロキシル基が、熱不安定性修飾基に置換された修飾オリゴヌクレオチドプライマー（US patent No. 8133669）
一態様において、該修飾オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端に含まれる該修飾基は、
［式中、
Z10は、O、S、およびSeからなる群から選択され；
各R7、各R8、各R9、および各R10は、水素、直鎖状または分枝鎖状であり、置換されていてもよい、1〜20個の炭素原子、好ましくは1〜10個の炭素原子、好ましくは1〜6個の炭素原子を有するヒドロカルビル基からなる群から独立に選択され、
該ヒドロカルビルは、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群から選択される少なくとも1個の置換基を包含していてもよい、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり；
各X6、各X7、各X8、および各X9は、アシル、アシルオキシ、アルケニル、アルケニルアリール、アルケニレン、アルキル、低級アルキル、アルキレン、アルキニル、アルキニルアリール、アルコキシ、低級アルコキシ、アルキルアリール、アルキルカルボニルアミノ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アルキルチオ、アルキニレン、アミド、アミジノ、アミノ、アリールアルキニル、アラルキル、アロイル、アリールアルキル、アリール、アリールカルボニルアミノ、アリーレン、アリールオキシ、アリールスルホニルアミノ、カルバメート、ジチオカルバメート、シクロアルケニル、シクロアルキル、シクロアルキレン、グアニジニル、ハロ、ハロゲン、ヘテロアリール、ヘテロアリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、ヘテロ環、ヘテロ環、ヒドロカルビル、ヒドロカルビル、ヒドロカルビルカルボニル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルカルボニルオキシ、ヒドロカルビレン、オルガノスルフィニル、ヒドロキシル、オルガノスルフィニル、オルガノスルホニル、スルフィニル、スルホニル、スルホニルアミノ、およびスルフリルからなる任意の置換または非置換の基から独立に選択され；
各X10は、O、S、Se、NR11、N-OR11、およびCR11R12からなる群から独立に選択され；各R11および各R12は、アシル、アシルオキシ、アルケニル、アルケニルアリール、アルケニレン、アルキル、低級アルキル、アルキレン、アルキニル、アルキニルアリール、アルコキシ、低級アルコキシ、アルキルアリール、アルキルカルボニルアミノ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアミノ、アルキルチオ、アルキニレン、アミド、アミジノ、アミノ、アリールアルキニル、アラルキル、アロイル、アリールアルキル、アリール、アリールカルボニルアミノ、アリーレン、アリールオキシ、アリールスルホニルアミノ、カルバメート、ジチオカルバメート、シクロアルケニル、シクロアルキル、シクロアルキレン、グアニジニル、ハロ、ハロゲン、ヘテロアリール、ヘテロアリールカルボニルアミノ、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールスルホニルアミノ、ヘテロ環、ヘテロ環、ヒドロカルビル、ヒドロカルビル、ヒドロカルビルカルボニル、ヒドロカルビルオキシカルボニル、ヒドロカルビルカルボニルオキシ、ヒドロカルビレン、オルガノスルフィニル、ヒドロキシル、オルガノスルフィニル、オルガノスルホニル、スルフィニル、スルホニル、スルホニルアミノ、およびスルフリルからなる任意の置換または非置換の基から独立に選択され；
各Y1は、O、S、Se、NR6、N-OR6、およびCR6R7からなる群から独立に選択される］
からなる群から選択されるいずれかの基である。
好ましい態様において、該修飾基は、O-（p-トルエン）スルホネート；O-リン酸；O-硝酸；O-［4-メトキシ］テトラヒドロピラニル；O-［4-メトキシ］-テトラヒドロチオピラニル；O-テトラヒドロチオピラニル；O-［5-メチル］-テトラヒドロフラニル；O-［2-メチル，4-メトキシ］-テトラヒドロピラニル；O-［5-メチル］-テトラヒドロピラニル；O-テトラヒドロピラニル；O-テトラヒドロフラニル；O-フェノキシアセチル；O-メトキシアセチル；O-アセチル；O-C（O）-OCH3；O-C（O）-CH2CH2CN；およびO-C（S）-OCH3からなる群から選択される。一部の特に好ましい形態において、該修飾基は、O-メトキシテトラヒドロピラニル；O-テトラヒドロピラニル；およびO-テトラヒドロフラニルからなる群から選択される。
別の態様において、修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、式V
［式中、
Z3は3’-O-オリゴヌクレオチジル残基、またはオリゴヌクレオチドプライマーであり、
Bは、置換もしくは非置換のプリンもしくはピリミジン、その任意のアザ誘導体もしくはデアザ誘導体、または核酸ポリメラーゼにより認識可能であることが好ましい、任意のNTP類似体による任意の「ユニバーサル塩基」もしくは「縮重塩基」から選択され；
Aは、O、S、Se、CR1R2、およびNR1からなる群から選択され；
各R1および各R2は、H、F、Cl、Br、I、OR3、SR3、NR3R4、C（Y）R5、ならびに置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、およびアラルキルからなる群から独立に選択され、
任意の置換基は各々、場合によって、1つまたは複数のヘテロ原子を含有する可能性があり；
各Yは、O、S、Se、CR1R2、およびNR1からなる群から独立に選択され；
各R3および各R4は、H、または置換もしくは非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のアラルキルからなる群から独立に選択され、
任意の置換基は各々、場合によって、1つまたは複数のヘテロ原子を含有する可能性があり；
各R5は、H、F、Cl、Br、OR3、SR3、NR3R4、ならびに置換または非置換のアルキル、置換もしくは非置換のアルケニル、置換もしくは非置換のアルキニル、置換もしくは非置換のアリール、および置換もしくは非置換のアラルキルからなる群から独立に選択され、
任意の置換基は各々、場合によって、1つまたは複数のヘテロ原子を含有する可能性があり；
X4は、R1、F、Cl、Br、I、OR3、SR3、SeR3、NR3R4、NR3OR3、NR3-NR3R4、CN、N3、C（Y）R5、NO2、CN、およびSSR3からなる群から独立に選択され；
X5は、O、S、Se、NR6、N-OR6、およびCR6R7からなる群から選択され；
Y1は、O、S、Se、NR6、N-OR6、CR6R7、およびC（Y）からなる群から選択され；
各R6および各R7は、水素、また、直鎖状または分枝鎖状であり、置換されていてもよい、
1〜20個の炭素原子、好ましくは1〜10個の炭素原子、好ましくは1〜6個の炭素原子を有するヒドロカルビル基からなる群から独立に選択され、
該ヒドロカルビルは、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群から選択される少なくとも1個の置換基を包含していてもよい、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり；
X5およびY1は各々、場合によって、式IBで示されるNTP分子のX4、X5、Z3、A、W、またはB部分に対して、適切な原子または原子群を介して共有結合する可能性がある］
で表される化合物である。
式Vの特定の実施形態において、Bは、チミン、シトシン、アデニン、グアニン、ウラシル、アミノアリルウラシル、7-デアザグアニン、7-デアザ-7-メチルグアニン、7-デアザ-7-ヨードグアニン、7-デアザ-7-アミノアリルグアニン、7-デアザ-8-アザグアニン、7-デアザデニン、2，6-ジアミノプリン、5-ニトロシトシン、5-アミノアリルシトシン、5-（ビオチン-16）-シトシン、5-（フルオレセイン-11）-シトシン、4-メチルアミノ-シトシン、および2-チオ-5-メチルウラシル、または4-チオ-5-メチルウラシルである。
式Vの好ましい実施形態において、Bは、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、またはウラシルである。
好ましい態様において、修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、
からなる群から選択されるいずれかの化合物である。
上記1-1の修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、US patent No. 8361753に記載された方法により製造することができる。
（1-2） 1又はそれ以上のヌクレオチド間結合において熱不安定性修飾基を含む修飾オリゴヌクレオチドプライマー（US patent No. 8361753）
1つの態様においては、該修飾オリゴヌクレオチドプライマー中の修飾基は、式I：
［式中、
Lは、1−10個の炭素原子、好ましくは2−5個の炭素原子、より好ましくは3−4個の炭素原子、さらにより好ましくは4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基であり；
Xは、O、S、S（O）、S（O）2、C（O）、C（S）またはC（O）NHであり；および
R1は、水素または1−20個の炭素原子、好ましくは1−10個の炭素原子、より好ましくは1−6個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり；好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、これは任意に、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよい］
の化合物を含む。
1つの態様において、修飾基は、式Ia：
［式中、
Lは、1−10個の炭素原子、好ましくは2−5個の炭素原子、より好ましくは3−4個の炭素原子、さらにより好ましくは4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基であり；および
R1は水素または1−20個の炭素原子、好ましくは1−10個の炭素原子、より好ましくは1−6個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり；好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、これは任意に、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよい］
の化合物を提供する。
式Iaの修飾基の好ましい態様は以下のとおりである：
4-オキソ-1-ペンチル、
5-オキソ-1-ヘキシル、
6-オキソ-1-ヘプチル、
4-オキソ-1-ヘキシル、
5-メチル-4-オキソ-1-ヘキシル、
2-メチル-5-オキソ-ヘキシル、
1-エチル-4-オキソ-ペンチル、
1-メチル-4-オキソ-ペンチル、
1、1-ジメチル-4-オキソ-ペンチル、
4-オキソ-1-オクチル
4-オキソ-1-テトラデシル、および
4-オキソ-1-エイコサミル。
1つの態様において、修飾基は式Ib：
［式中、
kは0−2の整数であり；
Lは、1−10個の炭素原子、好ましくは2−5個の炭素原子、より好ましくは3−4個の炭素原子、さらにより好ましくは4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基であり；および
R1は、水素または1−20個の炭素原子、好ましくは1−10個の炭素原子、より好ましくは1−6個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり；好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、これは任意に、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよい］
の化合物を提供する。
好ましい態様において、式Ibの修飾基は下記に示す4-メチルチオ-1-ブチルである：
1つの態様においては、修飾基は式Ic：
［式中、
Lは、1−10個の炭素原子、好ましくは2−5個の炭素原子、より好ましくは3−4個の炭素原子、さらにより好ましくは4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基であり；および
R1は、水素または1−20個の炭素原子、好ましくは1−10個の炭素原子、より好ましくは1−6個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり；好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、これは任意に、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよい］
の化合物を提供する。
好ましい態様において、式Icの修飾基は下記に示す3-（N-tert-ブチルカルボキサミド）-1-プロピルである：
1つの態様において、修飾基は式Id：
［式中、
Lは、1−10個の炭素原子、好ましくは2−5個の炭素原子、より好ましくは3−4個の炭素原子、さらにより好ましくは4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり；および
各R1は、独立して、水素または1−20個の炭素原子、好ましくは1−10個の炭素原子、より好ましくは1−6個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり；好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、これは任意に、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよい］
の化合物を提供する。
修飾基式Idの好ましい態様として、2-（N-ホルミル-N-メチル）アミノエチルまたは2-
（N-アセチル-N-メチル）アミノエチルが挙げられる（下記に示す）：
2-（N-アセチル-N-メチル）アミノエチル
別の態様において、修飾基は式II：
［式中、
Lは、1−10個の炭素原子、好ましくは2−5個の炭素原子、より好ましくは3−4個の炭素原子、さらにより好ましくは4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖のヒドロカルビレン基であり；および
R2は、水素、シアノ、または5−10個の原子を有する任意に置換されていてもよい炭素環、複素環、アリールまたはヘテロアリールである］
の化合物を提供する。
好ましい態様において、式IIの修飾基は下記に示すN-（2-ヒドロキシエチル）-フタルイミドである：
N-（2-ヒドロキシエチル）-フタルイミド
別の態様において、修飾基は式III：
［式中、
LaおよびLbは、それぞれ独立して、単結合、または1−8個の炭素原子、好ましくは2−5個の炭素原子、より好ましくは3−4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基から選択され；
Aは、O、S、S（O）、S（O）2、Se、CR3R4、NR3、C（O）、C（S）またはCNR3であり；
Bは、C（O）R3、C（S）R3、C（O）NR3R4、OR3またはSR3であり；および
R3およびR4は、それぞれ独立して、水素または1−20個の炭素原子、好ましくは1−10個の炭素原子、好ましくは1−6個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビル基であり；好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、これは任意に、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アミノ、アミド、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリール、アリールオキシ、およびヘテロアリールからなる群より選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよい］
の化合物を提供する。
別の態様において、修飾基は、式IV：
［式中、
La、LbおよびLcは、それぞれ独立して、単結合、または1−8個の炭素原子、好ましくは2−5個の炭素原子、より好ましくは3−4個の炭素原子を有する、直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビレン基から選択され；
Dは、O、S、S（O）、S（O）2、CR5R6、またはNR5であり；
Eは、O、S、S（O）、S（O）2、CR5R6、またはNR6であり；
Fは、水素、C（O）R7、C（S）R7、C（O）NR7R8、OR7またはSR7であり；
R5およびR6は、それぞれ独立して、水素、アリール、アルキル、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、またはアミノであってもよく、またはR5およびR6は、一緒になって、5−10個の原子からなり、D、R5、R6、EおよびLbを含む単環または二環を形成してもよく、ただし、R5およびR6が一緒になって環を形成する場合、nは0−2であり；および
R7およびR8は、それぞれ独立して、アリール、アルキル、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アミド、任意に置換されていてもよいシクロアルキル、任意に置換されていてもよいヘテロシクロアルキル、任意に置換されていてもよいアリール、任意に置換されていてもよいアリールオキシ、または任意に置換されていてもよいヘテロアリールから選択される］
の化合物を提供する。
R5およびR6が一緒になって環を形成する式IVの化合物の1つの態様において、修飾基は下記に示すメトキシメチル-シクロヘキシ-1、3-イル-エチルである：
メトキシメチル-シクロヘキシ-1、3-イル-エチル
1つの態様において、修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、構造I：
［式中、
Nucはプライマー配列中のヌクレオシドであり；
UおよびZは、独立して、O、S、Se、NR9、またはCR9R10であり；
R9およびR10は、それぞれ独立して、水素、または1−10個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖の任意に置換されていてもよいヒドロカルビルであり；好ましくは、ヒドロカルビルは、アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、それぞれは独立して、ハロ、オキソ、ヒドロキシル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アミドまたは検出可能な標識から選択される少なくとも1つの置換基を含んでいてもよく；
Yは、O、SまたはSeであり；
Wは、Qが熱的に切断されることを可能とする任意の化学成分、例えばO、S、S（O）、S（O）2、Se、C（O）、C（S）、C（O）NH、C（N）H、NH、-C（＝NR11）-またはNR9であり；
R11は、水素または1−10個の炭素原子、好ましくは1−6個の炭素原子を有する任意に置換されていてもよいヒドロカルビルであり；好ましくは、R11は、H、アルキルまたは低級アルキルであり；および
Qは1またはそれ以上の熱切断性基を含む修飾基である］
の修飾骨格を有する。
1つの態様において、修飾基Qは、上記式I、Ia、Ib、Ic、Id、II、IIIまたはIVから選択される1またはそれ以上の熱切断性基を含む。
修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも1つのヌクレオチド間結合において、上述のいずれかの修飾基を含む。修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、その3’末端に、1またはそれ以上の、上述のいずれかの修飾基を含む。修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、その3’末端の最後の6個のヌクレオチド間結合のいずれか、好ましくは最後の3個のヌクレオチド間結合のいずれかに、1またはそれ以上の上述のいずれかの修飾基を含む。
別の態様において、オリゴヌクレオチドプライマーは、オリゴヌクレオチドプライマーの3’−末端で終わる2、3、4、5または6個の修飾ヌクレオチド間結合の連続する配列を含むことができる。さらに別の態様においては、オリゴヌクレオチドプライマーは、複数の非連続的3’修飾ヌクレオチド間結合を含んでいてもよい。修飾オリゴヌクレオチドプライマーの5’−末端も、修飾ヌクレオチド間結合を含むヌクレオチドの配列を有していてもよい。さらに別の態様においては、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチド間結合が修飾されていてもよい。
別の好ましい態様においては、修飾オリゴヌクレオチドプライマーはオリゴヌクレオチドプライマーの3’nヌクレオチド間結合に修飾基を含み、ここでnは3’末端のヌクレオチド間結合である。さらに別の態様においては、修飾基は、オリゴヌクレオチドの3’n−1、n−2、n−3またはn−4ヌクレオチド間結合に存在する。さらに別の態様においては、オリゴヌクレオチドは、n、n−1、n−2、n−3、n−4、n−5またはn−6位の2またはそれ以上；好ましくはn、n−1、n−2、n−3、n−4、n−5またはn−6位の2またはそれ以上；好ましくはn、n−1、n−2、n−3、n−4、n−5またはn−6位の3またはそれ以上；好ましくはn、n−1、n−2、n−3、n−4、n−5またはn−6位の4またはそれ以上；好ましくはn、n−1、n−2、n−3、n−4、n−5またはn−6位の5またはそれ以上、または好ましくはn、n−1、n−2、n−3、n−4、n−5またはn−6位の6またはそれ以上に修飾基を有する。
上記1-2の修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、US patent No. 8361753に記載された方法により製造することができる。
（2）同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取ることで分子内ヘアピンループを形成し、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列がマスクされた構造を呈する、オリゴヌクレオチドプライマー
該態様においては、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取ることで分子内ヘアピンループを形成する。当該相補領域は、１又はそれ以上のオリゴヌクレオチドで構成される第１の配列と、それに対して１又はそれ以上の相補的なオリゴヌクレオチドを含む第２の配列の組みを指す。
第１の配列と第２の配列の位置は、互いに隣接していてもよいが、第１の配列と第２の配列の間には１又はそれ以上のオリゴヌクレオチドを介して位置することでもよい。第１の配列または第２の配列が、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列を含む場合は、第１の配列と第２の配列の相補的結合によって、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列がマスクされる。従って、この場合において、第１の配列と第２の配列のオリゴヌクレオチドの数は特に限定されない。
第１の配列または第２の配列が、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列を含まない場合は、第１の配列と第２の配列のオリゴヌクレオチドの間には鋳型RNAの部分配列に相補的な配列が含まれ、分子内ヘアピンループ形成により、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列がマスクされる。
鋳型RNAの部分配列に相補的な配列がマスクされているため、逆転写時においては、鋳型RNAの対応する部分配列にハイブリダイズすることができず、プライマー機能の一部又は全部が阻害されている。しかしながら、PCR増幅における変性温度（例えば、約55−105℃、好ましくは約85−100℃、より好ましくは約90−96℃（例、95℃））においては、ヘアピンループ構造が解離し、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列が曝露されるため、引き続く対合温度において、cDNA中の対応する部分配列にハイブリダイズ可能となる（即ち、プライマー機能を獲得する）。ヘアピンループのループ部分の長さは、通常、5〜25塩基程度である。該ループ部分のヌクレオチド配列は、分子内ヘアピンループを形成することができる限り、特に限定されない。
（3）人工塩基を含む、オリゴヌクレオチドプライマー
該態様の改変オリゴヌクレオチドプライマーは、人工塩基（非天然塩基）を含むので、該改変オリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列の相補配列が、鋳型RNA（人工塩基を含まない鋳型RNA）中に実質的に存在しない。そのため、鋳型RNAへの該改変オリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーションが抑制されているので、逆転写におけるプライマー機能の一部又は全部が阻害されることになる。一態様において、該改変オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端の15塩基のうち、1塩基以上、好ましくは、3塩基以上、5塩基以上、10塩基以上、12塩基以上、好ましくは15塩基全てが、人工塩基である。好ましい態様において、該改変オリゴヌクレオチドプライマーの最も3’末端の塩基が、人工塩基である。
該態様の改変オリゴヌクレオチドプライマーは、該改変オリゴヌクレオチドプライマーの人工塩基を含む部分配列を含む、逆転写を開始するためのオリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせて使用される。人工塩基を含む部分配列の長さは、10〜40塩基、好ましくは15〜30塩基、より好ましくは18〜25塩基である。人工塩基を含む部分配列は、特に限定されないが、例えば、該改変オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端の部分配列であり得る。逆転写を開始するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列、及び前記人工塩基を含む部分配列を含み、該人工塩基を含む部分配列は、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列の5’側に付加される。鋳型RNAの部分配列の長さは、特に限定されないが、通常、10〜40塩基、好ましくは15〜30塩基、より好ましくは18〜25塩基である。該部分配列は、鋳型RNAに含まれる増幅を意図する領域の3’末端の部分配列であり得る。逆転写を開始するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、その3’末端に、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列を含む。
このような組み合わせを用いて、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを行うと、逆転写において、5’末端に、改変オリゴヌクレオチドプライマーの人工塩基を含む部分配列が付加されたcDNAが合成されるので、その結果、上記人工塩基を含む改変オリゴヌクレオチドプライマーは、該cDNAを鋳型とするPCRにおけるプライマー機能を獲得する。そして、該cDNAを鋳型とし、該改変オリゴヌクレオチドプライマーを一方のプライマーとするPCR増幅を行うことにより、目的とする領域を特異的に増幅することができる。
人工塩基としては、Z塩基／F塩基（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 105061；Nat. Struct. Biol. 1998, 5, 950；Nat. Struct. Biol. 1998, 5, 954）、Q塩基（J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 2323）、iso-G塩基／iso-C塩基（J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8322）、2-チオT（TS）塩基（Nucleic Acids Res. 2005, 33, 5640）、P塩基／Z塩基（Nucleic Acids Res. 2007, 35, 4238）、PICS塩基（J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 11585）、5SICS塩基／MMO2塩基／NaM塩基（J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 14620）、2-amino-6-dimethylaminopurine（x）／2-oxopyridine（y）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001, 98, 4922）、2-アミノ-6-(2-チエニル)プリン（s）（J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 17286；Nucleic Acids Res. 2005, 33, e129；Biotechniques 2006, 40, 711）、imidazolin-2-one（z）（J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 13298）、Ds塩基／Pa塩基（Nat. Methods 2006, 3, 729）、Pn塩基（J. Am. Chem. Soc. 2007, 129, 15549）、Px塩基（Nucleic Acids Res. 2009, 37, e14）、xA塩基、xT塩基（J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 11826）、Im-NO塩基／Na-ON塩基、Im-ON塩基／Na-NO塩基（J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 1644；Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 596）等を挙げることができるが、これらに限定されない。これらの人工塩基は、以下の塩基対を形成することにより、逆転写及び／又はPCR増幅に寄与し得る：Z-F塩基対、Q-F塩基対、isoG-isoC塩基対、A-TS塩基対、P-Z塩基対、PICS-PICS塩基対（自己相補的）、5SICS-MMO2塩基対、5SICS-NaM塩基対、x-y塩基対、s-y塩基対、s-z塩基対、Ds-Pa塩基対、Ds-Pn塩基対、Ds-Px塩基対、xA-T塩基対、A-xT塩基対、Im-NO-Na-ON塩基対、Im-ON-Na-NO塩基対。
以下に、本発明の方法を、更に詳細に記載する。
本発明の方法においては、まず、
i)テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド、
ii)該テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマー、及び上記改変オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット、並びに
iii)鋳型RNA
を含む、該鋳型RNAをcDNAにテンプレートスイッチング逆転写するため、及び該cDNAの少なくとも一部をPCR増幅するために必要な全ての試薬（但し、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを除く）を含む、組成物が提供される。
テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドは、逆転写酵素が鋳型RNAの5’末端に達した時に、逆転写酵素の有するターミナルトランスフェラーゼ活性により、新たに合成したcDNAの3’末端に付加される配列（単に、RT付加配列という場合がある）に相補的な配列、及びアンカー配列を含み、RT付加配列の相補配列の5’末端にアンカー配列（第1のアンカー配列）が付加されている。好ましくは、RT付加配列の相補配列は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドの3’末端に位置する。RT付加配列は、逆転写酵素の種類に依存する。例えば、Moloney Murine Leukemia Virus由来の逆転写酵素（MMLV RT）は、シトシンリッチな短い配列（例、CC、CCC、CCCC）を、合成したcDNAの3’末端に付加するので、その相補配列であるグアニンリッチな短い配列（例、GG、GGG、GGGG）が、RT付加配列の相補配列として、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれる。アンカー配列とは、オリゴヌクレオチドの5’末端に付加される、人工的な配列を意味する。アンカー配列は自然界に存在しない配列であることが好ましい。アンカー配列の長さは、特に限定されないが、通常、10塩基〜100塩基程度、好ましくは15塩基〜50塩基程度である。
テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドは、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA／RNAキメラであってもよい。逆転写における鋳型として効率的に機能するため、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドは、好適には、RNA又はDNA／RNAキメラであり、より好ましくはDNA／RNAキメラである。一態様において、RT付加配列の相補配列の部分がRNAであり、アンカー配列の部分がDNA又はDNA／RNAキメラである。テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドは、以下に説明する5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーとしても機能する。したがって、いくつかの実施形態では、5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーの添加を省略または少量にすることができる。逆転写テンプレートスイッチとPCR増幅を同一の反応系で実施した例はこれまでになく、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドが、PCR増幅のフォワードプライマーとして機能することは、本明細書の実施例において初めて実証された。
5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーは、上記テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列（第1のアンカー配列）の一部または全部を含む。アンカー配列の一部または全部の長さは、通常、10〜40塩基、好ましくは15〜30塩基、より好ましくは18〜25塩基である。PCRにおけるプライマーとして機能し得るよう、DNAまたはDNA／RNAキメラであり、好ましくはDNAである。5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーは、PCRにおけるフォワードプライマーであり得る。
鋳型RNAとしては、mRNA、rRNA、tRNA、non-coding RNA、化学的に合成したRNA等を用いることができるが、これらに限定されない。mRNA、rRNA及びtRNAは、如何なる細胞・組織に由来するものであってもよい。mRNA、rRNA及びtRNAは、セルソーター等を利用して得られた微量の細胞・組織（例えば、シングルセル）から採取されたものであってもよい。mRNA、rRNA及びtRNAは、トータルRNAの一部として含まれるような形態でもよい。
上記組成物には、該鋳型RNAをcDNAにテンプレートスイッチング逆転写するため、及び該cDNAの少なくとも一部をPCR増幅するために必要な全ての試薬（但し、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを除く）が含まれる。該試薬としては、上述のテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド、プライマーセット、及び鋳型RNA以外に、以下を挙げることが出来る。
・逆転写酵素（RNA依存性DNAポリメラーゼ）
・耐熱性DNAポリメラーゼ（DNA依存的DNAポリメラーゼ）
・dNTPs混合物
cDNAの3’末端にRT付加配列を形成するため、使用する逆転写酵素はターミナルトランスフェラーゼ活性を有する。ターミナルトランスフェラーゼ活性を有する逆転写酵素としては、Moloney Murine Leukemia Virus由来の逆転写酵素（MMLV RT）等が挙げられるが、これらに限定されない。ターミナルトランスフェラーゼ活性は、好ましくは、シトシンリッチな短い配列（例、CC、CCC、CCCC）を、合成したcDNAの3’末端に付加する活性である。
耐熱性DNAポリメラーゼとしては、代表的にはTaq、Tth、KOD、Pfu、Bst等を挙げることができるが、これらに限定されず、PCRに使用可能な様々な耐熱性DNAポリメラーゼが開発されており、いずれも本発明に使用可能である。PCRに使用可能な耐熱性DNAポリメラーゼは当業者に周知であり、適宜選択可能である。
一態様において、上記組成物は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを更に含む。逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列を含むことにより、鋳型RNAにハイブリダイズし、逆転写を開始する。該部分配列の長さは、特に限定されないが、通常、10〜40塩基、好ましくは15〜30塩基、より好ましくは18〜25塩基である。逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、その3’末端に、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列を含む。鋳型RNAの部分配列に相補的な配列の5’末端にアンカー配列（第2のアンカー配列）が付加されていてもよい。第2のアンカー配列は自然界に存在しない配列であることが好ましい。第2のアンカー配列の長さは、特に限定されないが、通常、10塩基〜100塩基程度、好ましくは15塩基〜50塩基程度である。第2のアンカー配列は、上記第1のアンカー配列と非同一であることが好ましい。一態様において、第2のアンカー配列には、人工塩基が含まれる。一態様において、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、第2のアンカー配列を含まない。逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、特定の遺伝子に特異的なプライマー、mRNAのポリAテイルに結合するオリゴdTプライマー、またはランダムヘキサマープライマーのようなランダムプライマーのいずれかであるが、好ましくは、特定の遺伝子に特異的なプライマーである。該プライマーは、目的とする遺伝子をコードするRNA（例、mRNA）の部分配列に相補的な配列を含む。逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写におけるプライマーとして機能し得るよう、DNAまたはDNA／RNAキメラであり、好ましくはDNAである。
一態様において、鋳型RNA上の、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする領域と、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする領域とが、少なくとも一部重複する。重複するハイブリダイゼーション領域の長さは、通常10塩基以上、好ましくは15塩基以上、より好ましくは18塩基以上であるが、特に限定されない。重複するハイブリダイゼーション領域の長さは、例えば、40塩基以下、30塩基以下、25塩基以下であり得る。
好ましい態様において、改変オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域の5’末端が、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域の5’末端よりも、鋳型RNAの5’側（上流）に位置する。即ち、改変オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端が、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端よりも、鋳型RNAの5’側（上流）で、鋳型RNAにハイブリダイズするように、両プライマーをデザインする。このように半入れ子状（semi-nested）の位置関係に上記2つのプライマーをデザインすることにより、増幅の特異性の上昇が期待できる。この場合、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域と、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域とを、一部重複させて半入れ子状（semi-nested）としてもよいし、重複させずに完全な入れ子状（full-nested）としてもよい。
逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域と、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域とを、一部重複させる場合、例えば、改変オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域の5’末端が、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域の5’末端よりも、例えば1〜12塩基、好ましくは1、2、3、4又は5塩基、鋳型RNAの5’側（上流）になるように（即ち、改変オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端が、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端よりも、例えば1〜10塩基、好ましくは1、2、3、4又は5塩基、鋳型RNAの5’側（上流）にハイブリダイズするように）両プライマーをデザインすることが好ましいが、これらに限定されない。
別の態様において、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域と、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域とが、少なくとも一部重複し、改変オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域の5’末端が、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域の5’末端と一致する。即ち、改変オリゴヌクレオチドプライマーの3’末端が、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端と同じ位置で、鋳型RNAにハイブリダイズする。
一態様において、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域と、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする鋳型RNAの領域が同一である。該態様においては、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーが、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーに対応する未修飾オリゴヌクレオチドプライマーであり得る。
別の態様において、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの部分配列を、その3’末端に含む。当該部分配列（以下、共通配列と呼ぶ場合がある。）の長さは、通常10塩基以上、好ましくは15塩基以上、より好ましくは18塩基以上であるが、特に限定されない。当該3’末端部分配列の長さは、例えば、40塩基以下、30塩基以下、25塩基以下であり得る。一態様において、当該共通配列は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端の部分配列であり得る。別の態様において、当該共通配列の3’末端は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの3’末端よりも、少なくとも1塩基（例えば1〜20塩基、1〜10塩基、1〜8塩基）、5’側に位置する。一態様において、該共通配列は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーに含まれる、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列、又はその部分配列である。一態様において、該共通配列は、第2のアンカー配列又はその部分配列である。一態様において、該共通配列は、鋳型RNAの部分配列に相補的な配列と第2のアンカー配列とに跨る、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの部分配列である。一態様において、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーが人工塩基を含むオリゴヌクレオチドプライマーであり、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーが人工塩基を含有する第2のアンカー配列を5’末端に含み、共通配列が、第2のアンカー配列又はその部分配列である。
上記組成物が、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含む場合、該オリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、逆転写を開始するのに十分な量があればよい。逆転写において、増幅を意図する領域を含むcDNAを1コピー合成することができれば、その後のPCRにより、これを検出可能なレベルにまで増幅することが可能である。従って、該組成物中に（反応系内に）少なくとも1コピー、好ましくは10コピー以上、より好ましくは100コピー以上の、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーが含まれていればよい。逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの濃度が高すぎると、非特異的なハイブリダイゼーションによる副反応を引き起こす可能性がある。上記組成物中の逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、例えば、約40nM以下、好ましくは、約20nM以下、約10nM以下、約2.5nM以下、約2.0nM以下、約0.63nM以下、約0.2nM以下、約0.16nM以下、約0.02nM以下、約2.0pM以下、約0.2pM以下、又は約0.02pM以下である。
別の態様において、上記組成物は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含まない。本態様においては、上述の改変オリゴヌクレオチドプライマーとして、熱不安定性修飾基を含み、且つ鋳型RNAの部分配列に相補的な配列を含む、オリゴヌクレオチドプライマーが用いられる。該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、好ましくは、1又はそれ以上のヌクレオチド間結合或いは3’末端において熱不安定性修飾基を含む。該改変オリゴヌクレオチドプライマーに含まれる熱不安定性修飾基は、PCR増幅における最初の変性温度（例えば、約80−105℃、好ましくは約85−100℃、より好ましくは約90−96℃（例、95℃））に到達するまでは、殆ど解離しないが、本発明者は、この熱不安定性修飾基が逆転写を進行する温度（例、45℃）において、わずかに解離し、それにより生じた対応する未修飾オリゴヌクレオチドが、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能し得ることを見出した。
上記組成物は、必要に応じてバッファー、塩（マグネシウムイオン等）、RNAase inhibitorを含んでいてもよい。
上記組成物中に含まれる、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドの濃度は、本発明の方法を実施可能な限り特に限定されないが、例えば、0.05〜5.0μM、好ましくは0.1〜1.0μM程度である。
上記組成物中に含まれる、5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマー及び上記改変オリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、従来法のPCRを行う際のプライマー濃度と同等であり、例えば0.1〜1.0μM程度である。
上記組成物中に含まれ得るその他の構成因子（鋳型RNA、逆転写酵素、耐熱性DNAポリメラーゼ、dNTPs混合物、バッファー、塩、RNAase inhibitor）の濃度は、ワンステップRT-PCRの先行技術において周知であり、更に、本発明の文脈で使用される濃度の最適化がルーチン実験から得られ得る。
次に、上記で提供された組成物を、逆転写が進行可能な温度でインキュベートする。逆転写が進行可能な温度は、逆転写酵素の種類によって適宜調整することができるが、通常、37℃〜62℃、好ましくは37℃〜55℃である。インキュベート時間は、鋳型RNAのサイズ等を考慮して適宜調整することができるが、通常、30秒〜120分、好ましくは5分〜60分である。当該インキュベーションにより、組成物中に含まれていた逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマー、或いは改変オリゴヌクレオチドプライマーから熱不安定性修飾基が解離することにより生じた未修飾オリゴヌクレオチドが、逆転写をプライムし、鋳型RNAに相補的なcDNA（アンチセンス鎖）が合成される。逆転写酵素は、鋳型RNAの5’末端に達すると、鋳型をテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに乗り換え、その5’末端までcDNA合成を続けるため、3’端に、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドのアンカー配列に相補的な配列が付加された1本鎖のcDNA（アンチセンス鎖）を生じる。
次に、得られたcDNAを含む反応混合液を、PCRが進行可能な複数回の熱サイクリングプロトコールに付す。該熱サイクリングプロトコールは、変性（熱変性とも呼ぶ。）、アニーリング、伸長の3つの温度ステップのサイクルで構成される。変性は二本鎖DNAを解離させるのに十分な温度であれば特に限定されず、好ましい熱変性温度の下限は90℃、上限は100℃である。アニーリングは解離したDNAにプライマーをアニーリングするステップで、その際の温度（アニーリング温度）は特に限定されないが、好ましいアニーリング温度の下限は45℃であり、さらに好ましくは50℃である。一方好ましい上限は75℃であり、さらに好ましくは70℃である。伸長はDNAポリメラーゼで相補鎖を合成するステップで、その際の温度（伸長温度）は特に限定されないが、好ましい伸長温度の下限は50℃であり、上限は80℃である。前記サイクルにおいて、アニーリング温度は伸長反応温度を超えない。アニーリングと伸長とを1つの温度で実施することにより、実質的に2つの温度ステップのサイクルとして熱サイクリングプロトコールを構成することも可能である。この場合、好ましいアニーリング及び伸長の温度の下限は50℃であり、更に好ましくは55℃である。一方好ましい上限は70℃であり、さらに好ましくは65℃である。各ステップにおけるインキュベーション時間としては、1秒〜5分を例示することができるが、当業者であれば、増幅産物のサイズ等を考慮し、容易に適切なインキュベーション時間を設定することができる。
反応混合液を熱サイクリングプロトコールに付す前に、逆転写酵素を失活させるための変性工程（プレインキュベーション工程）を実施してもよい。該変性温度は、逆転写酵素を失活させることが出来るかぎり特に限定されないが、好ましい熱変性温度の下限は90℃、上限は100℃である。変性時間は、逆転写酵素を失活させることが出来るかぎり特に限定されないが、通常1分以上15分以下である。
改変オリゴヌクレオチドプライマーとして、熱不安定性修飾基を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いた場合、熱サイクリングプロトコールの最初の変性工程、或いはプレインキュベーション工程において、修飾オリゴヌクレオチドプライマーから修飾基が解離し、対応する未修飾オリゴヌクレオチドプライマーに変換される。未修飾オリゴヌクレオチドプライマーは，活性状態のホスホジエステル結合を有し，ポリメラーゼによる伸長をプライムできる。
熱サイクリングの最初のアニーリング及び伸長工程においては、逆転写工程で得られた1本鎖のcDNA（アンチセンス鎖）の3’端に存在するアンカー配列に相補的な配列に、5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーがアニールし、ポリメラーゼによる伸長が生じ、5’末端にアンカー配列（第1のアンカー配列）が付加されたcDNA（センス鎖）が合成される結果、センス鎖の5’末端にアンカー配列が付加された2本鎖cDNAが生じる。
そして、上記2本鎖cDNAを含む反応混合物を、引き続き複数回の熱サイクリングプロトコールに付すことにより、5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと改変オリゴヌクレオチドプライマーにはさまれた領域（即ち、5’末端アンカー配列から改変オリゴヌクレオチドプライマーがハイブリダイズする領域まで）が増幅される。
熱サイクリングの回数は、鋳型RNAの量等を考慮して適宜設定することができるが、例えば、20回以上、好ましくは30回以上、40回以上、45回以上、50回以上、又は55回以上である。一般的なRT-PCRの場合、鋳型RNAのコピー数が少ない場合（例えば、シングルコピー）であっても、40回程度熱サイクリングをおこなえば、増幅反応は飽和に達するが、本発明の方法においては（特に、熱不安定性修飾基を含む改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いた場合）、45回以上、50回以上、又は55回以上の熱サイクリングを行っても、増幅反応が飽和に達せず、更なる増幅が可能であり得る。理論には拘束されないが、本発明の方法においては（特に、熱不安定性修飾基を含む改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いた場合）、1回の熱サイクルあたりの増幅効率が一般的なRT-PCRよりも抑制されている可能性があり得る。従って、例えば増幅を意図する鋳型RNAのコピー数が少ない場合（例、100コピー以下、10コピー以下、シングルコピー）や、シングルセルから単離したRNA（特にトータルRNA）を鋳型RNAとして、本発明の方法を実施する場合、熱サイクリングの回数を、40回以上、45回以上、50回以上、又は55回以上とすることが好ましい。
本発明の方法によれば、逆転写テンプレートスイッチングPCRを、高い特異性で、ワンステップで実施することが期待できる。逆転写テンプレートスイッチングPCRにおいては、その特異性が実質的にリバースプライマーのみで決定され得るが、本発明においては、リバースプライマーとして、上述の改変オリゴヌクレオチドプライマーを採用することにより、高い特異性で目的とする遺伝子を増幅することができる。特に、鋳型となるRNAのコピー数が少ない場合（例えば、シングルセル由来のRNAを鋳型とする場合）、PCRのサイクル数を多くした場合であっても、副反応の発生を抑制しつつ、特異的PCR産物を増幅することが期待できる。従って、例えば、抗原受容体（例、抗体（重鎖、軽鎖）、T細胞受容体（α鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖）の定常領域に特異的なリバースプライマーを、上述の改変オリゴヌクレオチドプライマーとして、抗原受容体（例、抗体（重鎖、軽鎖）、T細胞受容体（α鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖）の定常領域に特異的なリバースプライマーを用いることにより、シングルセルレベルで、抗原受容体の抗原認識部位の配列解析を実施することができる。
また、本発明は、
i)テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド；並びに
ii)該テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマー、及び改変オリゴヌクレオチドプライマーからなるプライマーセット
を含む、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを実施するための、キットであって、
該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、当該改変により逆転写におけるプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、且つ該逆転写の結果、又は熱変性処理により、該逆転写の産物を鋳型とするPCRにおけるプライマー機能を獲得する、キットをも提供する。
一態様において、本発明のキットは、更に、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
一態様において、本発明のキットは、更に、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含まない。
本発明のキットには、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを実施するために必要な他の試薬（例えば、逆転写酵素（RNA依存性DNAポリメラーゼ）、耐熱性DNAポリメラーゼ（DNA依存的DNAポリメラーゼ）、dNTPs混合物、バッファー、塩（マグネシウムイオン等）、RNAase inhibitor）が含まれていてもよい。
上記試薬は、それぞれ別個に容器に封入された上で、1つのパッケージ中に含まれていても良いし、その一部又は全部の混合物を含む組成物として提供されてもよい。
一態様において、本発明のキットは、i)のオリゴヌクレオチド、及びii)のプライマーセットを、両者の混合物を含む組成物として含む。
一態様において、該組成物は、更に、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含む。
一態様において、該組成物は、更に、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含まない。
該組成物は、逆転写酵素（RNA依存性DNAポリメラーゼ）、耐熱性DNAポリメラーゼ（DNA依存的DNAポリメラーゼ）、dNTPs混合物、バッファー、塩（マグネシウムイオン等）、及びRNAase inhibitorからなる群から選択される1、2、3、4、5又は6の試薬を含んでいてもよい。
本発明のキットを用いれば、任意の鋳型RNAを用いて、上記本発明の方法により、簡便に、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを実施することが出来る。
本発明のキットに含まれる各構成要素の用語の定義は、上記本発明の方法において記載した通りである。
また、本発明は、対象RNAの少なくとも一部の領域を増幅するためのキットであって、該キットは、i)逆転写に必要な試薬と、ii)必要に応じて、テンプレートスイッチに必要な試薬と、iii)改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とiv)必要に応じて、使用説明書を含み、i)の試薬、存在する場合ii)の試薬、iii)の試薬、および改変オリゴヌクレオチドプライマーが反応開始時においてすべて反応系において混合されていることを特徴とし、該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写が生じる条件下でプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件下でプライマー機能の阻害が解除されるように設計される、キットを提供する。
また、別の態様において、本発明は、被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を解析する方法であって、(1)該被験体から得られたRNAから増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と、(2)該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程と、(3)決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のTCRもしくはBCRレパトアを導出する工程とを含み、該工程(1)は、a)該被験体から得られたRNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、該複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程とを含み、該テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該TCRまたは該BCRのC領域特異的プライマーを含み、該C領域特異的プライマーは、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーである、方法を提供する。前記核酸試料は、非バイアス的に増幅されるのが好ましい。
本発明のレパトアを解析する方法において、配列解析のために核酸試料のために、逆転写テンプレートスイッチPCR（上記工程a)およびb)）が利用される。レパトア解析において逆転写テンプレートスイッチPCR(RT-TS-PCR)を使用することにより、時間、労力、コストを低減することが可能となり好都合である。RT-TS-PCRでは工程が少ないため短時間で処理でき、労力も低減でき、多検体処理に有利である。使用する試薬類も少ないためコストを抑えることが可能である。時間、労力、コストの低減という有利な点だけではなく、以下の点でさらに本発明の方法は有利である。１．RNAからPCR増幅までの反応が一つのチューブ内で完了するため、チューブの開閉、試薬の添加、精製等の操作によるPCR産物のコンタミネーションを防ぐことができる。２．制限酵素処理を行わないため、偶発的に発生する増幅産物本体の切断を防ぐことができる。３．シーケンシングに供する試料を得るまでの各工程での精製操作でのロスがなく高感度な解析が可能になる。
さらに、本発明は、被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を解析するための核酸試料を生産する方法であって、該方法は、(1)該被験体から得られたRNAから増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程を含み、該工程(1)は、a)該被験体から得られたRNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、該複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程とを含み、該テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該TCRまたは該BCRのC領域特異的プライマーを含み、該C領域特異的プライマーは、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーである、方法を提供する。前記核酸試料は、非バイアス的に増幅されるのが好ましい。
一態様において、前記テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み得る。さらなる態様において、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含んでもよいし、含まなくてもよい。本明細書の実施例において実証されるように、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド（TS-Oligo）は、予想外にもPCR増幅におけるフォワードプライマーとしても機能することができる。したがって、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、上記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まなくてもよいし、通常使用される量よりも少量であってもよい。
驚くべきことに、逆転写用プライマーを添加せずに、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーのみを添加して、逆転写PCRを行っても、高い特異性でPCR増幅を達成することができた。理論に束縛されることを望まないが、逆転写反応時において、改変オリゴヌクレオチドプライマーのうちの一部は、その機能が阻害されておらず、機能が阻害されていない一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが逆転写プライマーとしても機能することができるか、あるいは、逆転写反応時において、改変オリゴヌクレオチドプライマーの機能が一部阻害されているため、機能が一部阻害された改変オリゴヌクレオチドプライマーが限定的に逆転写プライマーとして機能することができる。したがって、いくつかの実施形態では、逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含まなくてもよいし、含んでいたとしても、本方法において使用される逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは通常使用する量よりも少量であってもよい。いくつかの実施形態において、上記組成物中の逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、例えば、約40nM以下、好ましくは、約20nM以下、約10nM以下、約2.5nM以下、約2.0nM以下、約0.63nM以下、約0.2nM以下、約0.16nM以下、約0.02nM以下、約2.0pM以下、約0.2pM以下、又は約0.02pM以下である。別の実施形態において、上記組成物中の逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下、好ましくは、約20分の1以下、約40分の1以下、約160分の1以下、約200分の1以下、約635分の1以下、約2,000分の1以下、約2,500分の1以下、約20,000分の1以下、約200,000分の1以下、約2,000,000分の1以下、又は約20,000,000分の1以下のモル比で含む。
本発明のレパトア解析方法において、逆転写テンプレートスイッチPCRを行った後にさらに、配列解析のために適切な配列が付加された核酸試料を提供する工程をさらに含んでもよい。当業者であれば、配列解析の種類に応じて、配列解析のための適切な配列を選択することができるが、配列解析のために適切な配列としては、例えば、ブリッジPCRまたはエマルジョンPCRを使用する配列解析に適切な配列が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明で使用される配列解析は、ブリッジPCRを使用した配列解析であるが、ブリッジPCRを使用した配列解析ために付加される適切な配列は、インデックス配列、タグ配列、配列解析の基板（例えば、フローセル）に固定化するための配列等を含む。
好ましい実施形態では、本発明のレパトア解析方法において、配列解析のための核酸試料を提供するために、上記逆転写テンプレートスイッチPCR(第1のPCR増幅反応)、タグPCR(第2のPCR増幅反応)、およびインデックスPCR(第3のPCR増幅反応)が行われ得る。
逆転写テンプレートスイッチPCR(第1のPCR増幅反応)で使用される5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーは、第1の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと称することもある。第1の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーは、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含むオリゴヌクレオチドプライマーである。第1のPCR増幅反応では、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドが、5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーとしても機能するため、上記第1の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを使用しなくてもよい。
一態様において、前記工程(1)は、c)前記工程b)のPCR増幅産物と、第1のタグ配列が付加された第2の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第2のタグ配列が付加された第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、タグ配列が付加された複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と、d)前記工程c)のPCR増幅産物と、第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、インデックス配列が付加された前記複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程であって、該第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーおよび該第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、配列解析の基板に固定化するための配列およびインデックス配列が付加されている、工程とをさらに含んでもよい。
タグ配列は、シーケンシング（例えば、Miseqによるシーケンシング）を行うために使用される配列であり、タグ配列からシーケンシングが開始される。また、タグ配列は、インデックス配列を付加するインデックスPCR(第3のPCR増幅反応)のプライミングサイトとして機能してもよい。第1のタグ配列は、第2の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーに付加された配列であり得、第2のタグ配列は、第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーに付加された配列であり得る。
本明細書において「第１のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマー」とは、本発明の逆転写テンプレートスイッチングＰＣＲによるＰＣＲ増幅反応において使用されるプライマーであって、ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に特異的な配列を含むプライマーをいう。
本明細書において「第２のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマー」とは、タグ配列が付加されたTCRまたはBCRの核酸配列を含む核酸試料を提供するためのＰＣＲ増幅反応(第2のPCR増幅反応)において使用されるプライマーであって、ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に特異的な配列を含むプライマーをいう。第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、第3のPCR増幅反応のためのプライミングサイトとなるタグ配列が付加されている。
本明細書において「第３のＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域特異的プライマー」とは、インデックス配列が付加されたTCRまたはBCRの核酸配列を含む核酸試料を提供するためのＰＣＲ増幅反応(第3のPCR増幅反応)において使用されるプライマーであって、ＴＣＲまたはＢＣＲのＣ領域に特異的な配列を含むプライマーをいう。第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、必要に応じて、配列解析の基板に固定化するための配列およびインデックス配列が付加されている。
本明細書において、「第1の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマー」とは、本発明の逆転写テンプレートスイッチングＰＣＲによるＰＣＲ増幅反応において使用されるプライマーである。テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドは、5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーとしても機能し得るため、第1の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーが使用されない、または少量で使用され得る。
本明細書において、「第2の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマー」とは、タグ配列が付加されたTCRまたはBCRの核酸配列を含む核酸試料を提供するためのＰＣＲ増幅反応(第2のPCR増幅反応)において使用されるプライマーである。
本明細書において、「第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマー」とは、インデックス配列が付加されたTCRまたはBCRの核酸配列を含む核酸試料を提供するためのＰＣＲ増幅反応(第3のPCR増幅反応)において使用されるプライマーである。第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーは、必要に応じて、配列解析の基板に固定化するための配列およびインデックス配列が付加されている。
本明細書において「第１のPCR増幅反応」とは、本発明のワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRにより被験体から得られたRNAを鋳型として行われるPCR増幅反応である。
本明細書において「第２のＰＣＲ増幅反応」とは、本発明のレパトア解析のための試料生産において、第１のＰＣＲ増幅反応の後その産物を鋳型としてなされるＰＣＲ増幅反応であって、タグ配列が付加されたTCRまたはBCRの核酸配列を含む核酸試料を提供するためのＰＣＲ増幅反応をいう。第２のＰＣＲ増幅反応では、第3のPCR増幅反応のためのプライミングサイトを提供するためのタグ配列が付加された核酸試料が提供される。このタグ配列は、配列解析における開始地点にもなる。
本明細書において「第３のＰＣＲ増幅反応」とは、本発明の解析のための試料生産において、第２のＰＣＲ増幅反応の増幅産物を鋳型としてなされるＰＣＲ増幅反応であって、その産物は、本発明の配列解析における使用に適切な配列を含む。第３のＰＣＲ増幅反応では、配列解析の基板に固定化するための配列およびインデックス配列が付加される。
一態様において、前記工程(3)は、(3-1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する工程と、(3-2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する工程と、(3-3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する工程と、(3-4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出する工程と、(3-5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類する工程と、(3-6)該工程(3-5)での分類に基づいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出する工程とを含んでもよい。
また、本発明は、T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域を増幅するためのキットであって、該キットは、i)逆転写に必要な試薬と、ii)テンプレートスイッチに必要な試薬と、iii)改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とiv)必要に応じて、使用説明書を含み、i)〜iii)の試薬および該改変オリゴヌクレオチドプライマーが反応開始時においてすべて反応系において混合されていることを特徴とし、ii)の試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写が生じる条件下でプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件下でプライマー機能の阻害が解除されるように設計された該TCRまたは該BCRのC領域特異的プライマーである、キットを提供する。本発明のキットは、被験体から得られたRNAから非バイアス的に増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供することが可能である。
本明細書において「キット」とは、通常2つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、試薬、プライマー、薬剤、標識、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、薬剤をどのように使用するか、あるいは、試薬をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、薬剤、抗体等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
本明細書において「指示書」は、本発明を使用する方法を使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の逆転写テンプレートスイッチングPCRおよび試薬の使用方法を指示する文言が記載されている。また、指示書には、使用方法（スクリーニング方法）を指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（package insert）であり、紙媒体で提供されてもよく、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
本発明のキットに含まれるポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、プライマーを含まなくてもよい。プライマーは、本発明のキットに備えられていてもよいし、別途提供されていてもよい。当業者は、対象RNAに基づいて適切にプライマーを設計し、製造することができるか、またはプライマーの提供会社に製造を依頼することができる。本発明のキットで使用されるリバースプライマーとして、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーが使用される。フォワードプライマーとして、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド、またはテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーが使用され得る。
一態様において、本発明のキットにおけるテンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み得る。さらなる態様において、本発明のキットにおけるポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含んでもよいし、含まなくてもよい。本明細書の実施例において実証されるように、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチド（TS-Oligo）は、予想外にもPCR増幅におけるフォワードプライマーとしても機能することができる。したがって、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、上記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まなくてもよいし、通常使用される量よりも少量であってもよい。
驚くべきことに、逆転写用プライマーを添加せずに、上記改変オリゴヌクレオチドプライマーのみを添加して、逆転写PCRを行っても、高い特異性でPCR増幅を達成することができた。理論に束縛されることを望まないが、逆転写反応時において、改変オリゴヌクレオチドプライマーのうちの一部は、その機能が阻害されておらず、機能が阻害されていない一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが逆転写プライマーとしても機能することができるか、あるいは、逆転写反応時において、改変オリゴヌクレオチドプライマーの機能が一部阻害されているため、機能が一部阻害された改変オリゴヌクレオチドプライマーが限定的に逆転写プライマーとして機能することができる。したがって、いくつかの実施形態では、逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含まなくてもよいし、含んでいたとしても、使用される逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは通常使用する量よりも少量であってもよい。いくつかの実施形態において、使用される逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーの終濃度は、例えば、約40nM以下、好ましくは、約20nM以下、約10nM以下、約2.5nM以下、約2.0nM以下、約0.63nM以下、約0.2nM以下、約0.16nM以下、約0.02nM以下、約2.0pM以下、約0.2pM以下、又は約0.02pM以下である。別の実施形態において、使用される逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下、好ましくは、約20分の1以下、約40分の1以下、約160分の1以下、約200分の1以下、約635分の1以下、約2,000分の1以下、約2,500分の1以下、約20,000分の1以下、約200,000分の1以下、約2,000,000分の1以下、又は約20,000,000分の1以下のモル比で使用される。
本発明のキットにおいて使用される改変オリゴヌクレオチドプライマーについては、上記に詳細に記載される。
また、本発明は、データベースを用いて被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を定量的に解析するためのシステムであって、該システムは、(1)被験体から得られたRNAから非バイアス的に増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供するためのキット；(2)該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定するための装置；および(3)決定された該核酸配列に基づいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のTCRもしくはBCRレパトアを導出するための装置を備えるシステムを提供する。
本発明のシステムで使用される前記キットは、以下：c)前記工程b)のPCR増幅産物と、第1のタグ配列が付加された第2の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第2のタグ配列が付加された第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、タグ配列が付加された複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する手段と、d)前記工程c)のPCR増幅産物と、第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、インデックス配列が付加された前記複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する手段であって、該第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーおよび該第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、配列解析の基板に固定化するための配列およびインデックス配列が付加されている、手段とをさらに含み得る。
一態様において、(3)前記TCRもしくはBCRレパトアの導出のための装置は、以下：(3-1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段；(3-2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段；(3-3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段；(3-4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出する手段；(3-5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類する手段；および(3-6)該工程(3-5)での分類に基づいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出する手段を備え得る。
さらなる態様において、本発明は、上記TCRまたはBCRの可変領域のレパトアを定量的に解析するためのシステムと、該システムに基づいて導出されたTCRもしくはBCRレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手段とを備える、被験者の疾患、障害または状態を分析するためのシステムを提供する。
さらなる態様において、本発明は、上記被験者の疾患、障害または状態を分析するためのシステムで決定された被験者の疾患、障害または状態と、前記TCRもしくはBCRレパトアとを定量的に関連付ける手段、および該定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する手段とを備える、該被験者の疾患、障害または状態を処置または予防するためのシステムを提供する。
本明細書において「データベース」とは、遺伝子に関する任意のデータベースをいい、特に本発明では、Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体レパトアを含むデータベースをいう。このようなデータベースとしては、ＩＭＧＴ（ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ， ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）データベース、日本ＤＮＡデータバンク （ＤＤＢＪ、ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ，ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ）データベース、ＧｅｎＢａｎｋ（米国生物工学情報センター、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）データベース、ＥＮＡ（ＥＭＢＬ（欧州分子生物学研究所）、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｎａ）データベース等をあげることができるがこれに限定されない。
本明細書において「可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）」とは、ＴＣＲまたはＢＣＲで遺伝子再構成により任意に作り出されたＶ（Ｄ）Ｊ領域の集合をいう。
本明細書において「インデックス配列」とは、増幅産物が同定できるように、ユニークさを付与するための配列である。したがって、目的とする配列とは異なることが好ましい。また、増幅に影響しない配列であることが好ましい。インデックス配列についての判定基準およびその代表例については以下のとおりである。すなわち、インデックス配列の判定基準について説明すると、インデックス配列は、複数のサンプルを混合して同時にシーケンスする際に、各サンプルを識別するために付加する塩基配列である。一つのサンプル由来のリードには、一つのインデックス配列が対応付けられ、獲得されたリード配列がどのサンプルに由来するかを識別することができる。Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔの４種の塩基の任意配列であり、理論的には１０塩基で約１００万、２０塩基で約１兆種類の配列を作り出すことができる。塩基配列長は、好ましくは、２塩基以上４０塩基以下であり、より好ましくは、６塩基以上１０塩基以下である。同時に、連続する配列（ＡＡ，ＣＣ，ＧＧ，ＴＴ）を含まない配列を用いることが望ましい。
本明細書において「アイソタイプ」とは、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＤ等において、同じタイプに属するが、相互に配列が異なるタイプを言う。アイソタイプは種々の遺伝子の略称や記号を用いて表示される。
本明細書において「サブタイプ」とは、ＢＣＲの場合ＩｇＡおよびＩｇＧにおいて存在するタイプ内のタイプであって、ＩｇＧについては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４、ＩｇＡについてはＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２が存在する。ＴＣＲについても、β鎖およびγ鎖において存在することが知られており、それぞれＴＲＢＣ１，ＴＲＢＣ２、あるいはＴＲＧＣ１，ＴＲＧＣ２が存在する。
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。従って本明細書において「相同体」または「相同遺伝子産物」は、本明細書にさらに記載する複合体のタンパク質構成要素と同じ生物学的機能を発揮する、別の種、好ましくは哺乳動物におけるタンパク質を意味する。
本明細書において「被験体」とは、本発明のレパトア解析のための試料の起源または本発明の診断の対象を指し、被験体としては、哺乳動物(例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等)があげられるが、霊長類が好ましく、特にヒトが好ましい。
本明細書において「試料」とは、被験体等から得られた任意の物質をいい、例えば、核酸（例えば、RNA）、細胞、組織、器官等が含まれる。当業者は本明細書の記載をもとに適宜好ましい試料を選択することができる。
本明細書において「手段」とは、ある目的を達成する任意の道具となり得るものをいう。
本明細書において「診断」とは、被験体における疾患、障害、状態などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状または未来を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、体内の状態を調べることができ、そのような情報を用いて、被験体における疾患、障害、状態、投与すべき処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。本明細書において、狭義には、「診断」は、現状を診断することをいうが、広義には「早期診断」、「予測診断」、「事前診断」等を含む。本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができ、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。本明細書において、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることを明確にするために、特に「予測診断、事前診断もしくは診断」を「支援」すると称することがある。
本発明の診断薬等の医薬等としての処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、使用すべき量を決定することができる。
本明細書において「トリミング」とは、遺伝子解析において、不適切な部分の除去を行うこという。トリミングは、リード両端から低クオリティ領域、もしくは実験手順において付与された人工的核酸配列の部分配列、もしくはその両方を削除することで行われる。トリミングは、当該分野で公知のソフトウエアおよび文献（例えば、cutadapt http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200/(EMBnet.journal,2011)；fastq-mcf Aronesty E., The Open BioinformaticsJournal(2013) 7, 1-8 (DOI:10.2174/1875036201307010001)；およびfastx-toolkit http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2009)）を参照しておこなうことができる。
本明細書において「適切な長さ」とは、本発明の遺伝子解析において、アラインメント等の分析を行う際に、分析に適合するような長さをいう。そのような長さは、例えば、Ｃ領域上の配列決定開始位置から、Ｖ領域上のＤ領域寄りの１００塩基を含む長さ以上とするようにして決定することができ、例えば、本発明では、ＴＣＲの場合、２００ヌクレオチド長以上、好ましくは２５０ヌクレオチド長以上であってよく、ＢＣＲの場合、３００ヌクレオチド長以上、好ましくは３５０ヌクレオチド長以上であってよいが、これらに限定されない。
本明細書において「入力配列セット」とは、本発明の遺伝子解析において、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアの解析の対象となる配列のセットをいう。
本明細書において「遺伝子領域」とはＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域およびＣ領域等の各領域をさす。このような遺伝子領域は、当該分野で公知であり、データベース等を参酌して適宜決定することができる。本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。本明細書において「相同性検索」とは、相同性の検索をいう。好ましくは、コンピュータを用いてインシリコで行うことができる。
本明細書において「近似する」とは、相同性検索を行った際に、相同性の程度が高いことをいう。相同性検索を行うソフトウェア（ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等）を行った際には通常相同性の高い順序で列挙されるため、順位の高いものを適宜選択することで近似することができる。
本明細書において「最も近しい」とは、相同性検索を行った際に、相同性の程度が最も高いことをいう。ソフトウェアで相同性検索を行った場合は１位で表示されるものを選択する。
本明細書において「参照アリル」とは、相同性検索を行った際に、参照データベースにおいてヒットする参照アリルをいう。
本明細書において「アラインメント」（英語では、ａｌｉｇｎｍｅｎｔまたはａｌｉｇｎ）とは、バイオインフォマティクスにおいて、ＤＮＡやＲＮＡ、タンパク質等の生体分子の一次構造の類似した領域を特定できるように並ぶように並べたもの、および並べることをいう。機能的、構造的、あるいは進化的な配列の関係性を知る手がかりを与えることができる。
本明細書において「アサイン」とは、ある配列（例えば、核酸配列、タンパク質配列等）に、特定の遺伝子名、機能、特徴領域（例えば、Ｖ領域、Ｊ領域など）等情報を割り当てることをいう。具体的には、ある配列に特定の情報を入力またはリンクさせる等により達成することができる。
本明細書において「ＣＤＲ３」とは、３つめの相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ： ＣＤＲ）をいい、ここで、ＣＤＲとは、可変領域のうち、直接抗原と接触する領域は特に変化が大きく、この超可変領域のことをいう。軽鎖と重鎖の可変領域に、それぞれ３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）と、３つのＣＤＲを取り囲む４つのＦＲ（ＦＲ１〜ＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ３領域は、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域にまたがって存在するとされているため、可変領域の鍵を握るといわれており、分析対象として用いられる。
本明細書において「参照Ｖ領域上のＣＤＲ３先頭」とは、本発明が対象とするＶ領域中のＣＤＲ３の先頭に該当する配列をいう。
本明細書において「参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾」とは、本発明が対象とするＪ領域中のＣＤＲ３の末尾に該当する配列をいう。
本明細書において「ランダムな変異が全体的に散在することを許容する条件」とは、ランダム変異が、結果として散在することになる任意の条件をいい、例えば、ＢＬＡＳＴ／ＦＡＳＴＡ最適パラメータであれば、以下の条件でよく表現される：アラインメント全長にわたり最大３３％の不一致を許容し、かつ、その中の任意の３０ｂｐについて、最大６０％の一連でない不一致を許容する。本発明で用いられるＩｇＧ等の分子のアイソタイプ等の機能的等価物は、データベース等を検索することによって、見出すことができる。本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、好ましくは電子的に、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、BLAST（Altschul et al., J.Mol.Biol.215:403-410(1990))、FASTA(Pearson & Lipman, Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 85:2444-2448(1988)）、Smith and Waterman法（Smith and Waterman,J.Mol.Biol.147:195-197(1981)）、およびNeedleman and Wunsch法（Needleman and Wunsch, J.Mol.Biol.48:443-453(1970)）などが挙げられるがそれらに限定されない。BLASTが代表的に用いられている。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
１つの実施形態では、ＢＣＲの可変領域のレパトアの定量解析を行う場合、前記Ｃ領域特異的プライマーは、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＤからなる群より選択される目的とするアイソタイプＣ領域に完全マッチの配列を含み、かつ他のＣ領域に相同性を持たない配列を有する。好ましくは、前記Ｃ領域特異的プライマーは、ＩｇＡまたはＩｇＧについては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４のいずれか、またはＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２のいずれかであるサブタイプに完全マッチする配列である。別の実施形態では、ＴＣＲの可変領域のレパトアの定量解析を行う場合、前記Ｃ領域特異的プライマーは、α鎖、β鎖、γ鎖およびδ鎖からなる群より選択される目的とする鎖のＣ領域に完全マッチし、かつ他のＣ領域に相同性を持たない配列である。
別の実施形態では、前記Ｃ領域特異的プライマーは、前記データベース中の同じアイソタイプのＣ領域アレル配列についてすべてに完全マッチする配列部分を選択することが好ましい。このような完全マッチを選択することによって、精度の高い分析を行うことができる。
（大規模解析）
別の局面において、本発明は、本発明の方法で製造された試料を用いて遺伝子解析を行う方法を提供する。
遺伝子解析としては、任意の解析手法を用いて行うことができ、たとえば、公知のＩＭＧＴ （ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）データベースから入手されるＶ、Ｄ、Ｊ、Ｃ配列をリファレンス配列として各リード配列のＶ、Ｄ、Ｊ、Ｃ配列をアサインして、ＩＭＧＴのＨｉｇｈＶ−Ｑｕｅｓｔを利用する手法、あるいは、本明細書においても解析システムの好ましい例として記載される出願人が開発した新たなソフトウェア（Ｒｅｐｅｔｏｉｒｅ Ｇｅｎｅｓｉｓ）を使用することができる。
１つの好ましい実施形態では、前記遺伝子解析は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の定量解析である。
個々の増幅分子を配列決定することで、異なる配列を識別することができ、したがって配列決定はクローン増殖における量的変化を検出するための感度を有する。概して、提供する本発明の１つの態様において、Ｔ細胞および／またはＢ細胞における組換えＤＮＡ配列のプロファイルを決定するための方法を提供する。本方法は、対象から試料を単離する工程、１ラウンドまたは複数ラウンドの核酸増幅、個々の核酸を空間的に単離する工程、および核酸を配列決定する工程を含む工程を含み得る。
１つの局面において、対象または個体における１つまたは複数のレパトアの相関関係を決定するための方法を提供する。別の局面において、疾患を有する対象に由来する任意の試料における１つまたは複数のレパトアの相関関係を予測することができるアルゴリズムを開発するための方法を提供する。別の局面において、対象に由来する任意の試料における１つまたは複数のレパトアの相関関係を予測することができるアルゴリズムを用いて、個体の１レパトアの相関関係または複数のレパトアの相関関係を発見するための方法を提供する。別の局面において、疾患活動性スコアを算出するアルゴリズムを作成するための方法を提供する。別の局面において、個体の疾患状態をモニターするための方法を提供する。
（解析システム）
本発明は、次世代シークエンシング技術を使用して、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の定量解析を行うためのバイオインフォマティクスを提供する。
１つの局面において、本発明は、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析する方法であって、以下のステップ：（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ：（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ；（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ；（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップ（好ましくは、該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、参照Ｖ領域上のＣＤＲ３先頭および参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾を目印に、ＣＤＲ３配列を抽出するステップ）；（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ（好ましくは、該ＣＤＲ３の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ）；（６）（５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップを包含する。
本発明の方法において（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップは、例えば、Ｖ領域について言えば、そのＶ領域の情報を含むデータベースを適宜選択し、これを提供することで達成されうる。
本発明の方法において、（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップは、必要な場合には適宜ソフトウェア等の機能を用いてトリミングを行い、また、必要な場合は、長さを適宜選択した上で、抽出した入力配列セットを提供することで達成する。入力配列は、例えば、公知の方法で増幅した増幅産物のセット、または本発明の逆転写テンプレートスイッチングPCRによってPCR増幅した増幅産物のセットでありうる。
本発明の方法において、（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップは、相同性検索を行うソフトウェアを適宜用いて、遺伝子領域（例えば、Ｖ領域等）ごとに、参照データベースとの相同性検索を入力配列セットに対して行い、その結果得られる近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録することによって行われる。
本発明の方法において（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップは、配列アラインメントから、既知の情報などを元に、Ｖ領域および／またはＪ領域を決定することによって達成することができる、このような抽出においては、好ましくは、該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、参照Ｖ領域上のＣＤＲ３先頭および参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾を目印に、ＣＤＲ３配列を抽出することで達成することができる。
本発明の方法において、（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップは、当該分野で公知の方法を用いてアミノ酸への翻訳を行い、そのアミノ酸配列について相同性検索等により、Ｄ領域に該当する配列を抜き出すことなどで達成することができる。好ましくは、該ＣＤＲ３の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類することができる。
本発明の方法において、（６）（５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップは、上記までのステップで算出したＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および／またはＣ領域の出現頻度を、例えば、リストで整理するなどにより算出することができる。これにより、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出することができる。
以上のステップを図12も参照しながらさらに説明する。
Ｓ１（ステップ（１））において、参照データベースが提供される。これは、外部記憶装置１４０５に保存されたものであってもよいが、通常は、通信デバイス１４１１を通じて、公共で提供されるデータベースとして取得することができる。あるいは入力装置１４０９を用いて入力し、必要に応じてＲＡＭ１４０３または外部記憶装置１４０５に記録してもよい。ここでは、Ｖ領域などの目的とする領域を含むデータベースが提供される。
Ｓ２（ステップ（２））では、入力配列セットが提供される。ここでは、入力装置１４０９を用いるか通信デバイス１４１１を介して、例えばＰＣＲ増幅反応で増幅した増幅産物のセットから得られる配列情報のセットが入力される。ここでは、ＰＣＲ増幅反応の増幅産物を受け取り、それを遺伝子配列解析する装置が接続されていてもよい。そのような接続はシステムバス１４２０を通じて行われるかまたは通信デバイス１４１１を通じて行われる。ここでは、必要に応じてトリミングおよび／または適切な長さのものの抽出を行うことができる。そのような処理は、ＣＰＵ１４０１で行われる。トリミングおよび／または抽出をするためのプログラムはそれぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。
Ｓ３（ステップ（３））では、アラインメントがなされる。ここでは、該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行うが、この相同性検索は、通信デバイス１４１１等を介して得られた参照データベースに対して相同性検索プログラム処理を行う。この処理はＣＰＵ１４０１で行われる。また、その結果得られた結果を分析して近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを行う。この処理もまたＣＰＵ１４０１で行われる。これらを実行するためのプログラムは、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。
Ｓ４（ステップ（４））では、Ｄ情報の核酸配列を検出する。この処理もまたＣＰＵ１４０１で行われる。これらを実行するためのプログラムは、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。ここでは、該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインする。アサイン処理もまたＣＰＵ１４０１でなされる。また、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出することもまたＣＰＵ１４０１でなされる。アサインおよび抽出の処理のためのプログラムもまた、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。ここでは、好ましくは、配列アラインメントから、既知の情報などを元に、Ｖ領域および／またはＪ領域を決定することによって達成することができる。結果は、ＲＡＭ１４０３または外部記憶装置１４０５に保存することができる。このような抽出においては、好ましくは、該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、参照Ｖ領域上のＣＤＲ３先頭および参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾を目印に、ＣＤＲ３配列を抽出することで達成することができる。このような処理もまたＣＰＵ１４０１において行うことができる。そのためのプログラムもまた、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。
Ｓ５（ステップ（５））では、Ｄ領域を分類する。該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類する処理がなされるが、これもまたＣＰＵ１４０１でなされる。この処理のためのプログラムもまた、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。得られたアミノ酸配列について相同性検索等により、Ｄ領域に該当する配列を抜き出してもよい。このような処理もまた、ＣＰＵ１４０１でなされる。この処理のためのプログラムもまた、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。好ましくは、該ＣＤＲ３の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類することができる。この処理もまた、ＣＰＵ１４０１でなされる。この処理のためのプログラムもまた、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。
Ｓ６（ステップ（６））では、上記分類に基づいてＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する。この算出および導出のための処理もまた、ＣＰＵ１４０１でなされる。この処理のためのプログラムもまた、それぞれ外部記憶装置または通信デバイスまたは入力装置を介して提供されうる。
１つの好ましい実施形態では、本発明において使用される遺伝子領域は、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の全部を含む。
１つの実施形態では、前記参照データベースは、各配列に一意のＩＤが割り振られたデータベースである。ＩＤが一意に割り振られることによって、ＩＤという簡単な指標を元に遺伝子の配列を分析することができる。
１つの実施形態では、前記入力配列セットは、非バイアス配列セットである。非バイアスの配列セットは、本明細書において記載されるような逆転写テンプレートスイッチングPCRによってPCR増幅することによって実施することができる。
別の実施形態では、前記配列セットはトリミングされたものである。トリミングを行うことによって、不要なあるいは不適切な核酸配列を除くことができ、分析の効率を上げることができる。
好ましい実施形態では、トリミングは、リード両端から低クオリティ領域を削除し；リード両端からテンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドの配列と１０ｂｐ以上マッチする領域を削除し；および残った長さが２００ｂｐ以上（ＴＣＲ）もしくは３００ｂｐ以上（ＢＣＲ）なら高クオリティとして解析に使用するステップによって達成される。好ましくは、前記低クオリティは、ＱＶ値の７ｂｐ移動平均が３０未満のものである。
好ましい実施形態では、前記近似する配列は、最も近しい配列である。具体的な実施形態では、前記近似する配列は、１．一致塩基数、２．カーネル長、３．スコア、４．アラインメント長の順位によって決定される。
別の実施形態では、前記相同性検索は、ランダムな変異が全体的に散在することを許容する条件で行われる。このような条件は、例えば、ＢＬＡＳＴ／ＦＡＳＴＡ最適パラメータであれば、以下の条件でよく表現される：アラインメント全長にわたり最大３３％の不一致を許容し、かつ、その中の任意の３０ｂｐについて、最大６０％の一連でない不一致を許容する１つの実施形態では、前記相同性検索は、デフォルト条件に比べて（１）ウィンドウサイズの短縮、（２）ミスマッチペナルティの低減、（３）ギャップペナルティの低減および（４）指標の優先順位のトップが一致塩基数の少なくとも１つの条件を含む。
別の実施形態では、前記相同性検索は、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡにおいて以下の条件
Ｖ ミスマッチペナルティ＝−１、最短アラインメント長＝３０、最短カーネル長＝１５
Ｄ ワード長＝７（ＢＬＡＳＴの場合）またはＫ−ｔｕｐ＝３（ＦＡＳＴＡの場合）、ミスマッチペナルティ＝−１、ギャップペナルティ＝０、最短アラインメント長＝１１、最短カーネル長＝８
Ｊ ミスマッチペナルティ＝−１、最短ヒット長＝１８、最短カーネル長＝１０
Ｃ 最短ヒット長＝３０、最短カーネル長＝１５で実施される。この条件は、例えば、より短い（〜２００ｂｐ）配列を用いて一部の領域だけでも分類する状況（「好ましい例」から外れる状況）であれば使用することができ、イルミナ製シーケンサを利用する状況でも使用することができる。この場合は、相同性検索にｂｗａもしくはｂｏｗｔｉｅを用いる可能性が考えられる。
特定の実施形態では、前記Ｄ領域の分類は、前記アミノ酸配列の出現頻度によってなされる。
さらなる実施形態では、前記ステップ（５）において、Ｄ領域の参照データベースが存在する場合は、前記ＣＤＲ３の核酸配列との相同性検索結果とアミノ酸配列翻訳結果の組合せを分類結果とする。
別の実施形態では、前記ステップ（５）において、Ｄ領域の参照データベースが存在しない場合、前記アミノ酸配列の出現頻度のみによって分類がなされる。
具体的な実施形態では、前記出現頻度は、遺伝子名単位および／またはアリル単位でなされる。
別の実施形態では、前記ステップ（４）は該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、参照Ｖ領域上のＣＤＲ３先頭および参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾を目印に、ＣＤＲ３配列を抽出するステップを包含する。
更なる実施形態では、前記ステップ（５）は、該ＣＤＲ３の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップを包含する。
１つの局面では、本発明はＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析するシステムであって、該システムは：（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段：（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段；（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段；（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出する手段；（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類する手段；（６）（５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する手段；を包含する、システムを提供する。
別の局面では、本発明は、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析する方法の処理をコンピュータに実行させるコンピュータプログラムであって、該方法は以下のステップ：（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ：（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ；（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ；（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップ；（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ；（６）（５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップ；を包含する、プログラムを提供する。
さらに別の局面では、本発明は、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを解析する方法の処理をコンピュータに実行させるコンピュータプログラムを格納する記録媒体であって、該方法は以下のステップ：（１）Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供するステップ：（２）必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供するステップ；（３）該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録するステップ；（４）該入力配列セットについてＶ領域およびＪ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、Ｄ領域の核酸配列を抽出するステップ；（５）該Ｄ領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してＤ領域を分類するステップ；（６）（５）での分類に基づいて、Ｖ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および必要に応じてＣ領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するステップ；を包含する、記録媒体を提供する。
（システム構成）
次に、図12の機能ブロック図を参照して、本発明のシステム１の構成を説明する。なお、本図においては、単一のシステムで実現した場合を示している。
本発明の遺伝子分析システム１は、コンピュータシステムに内蔵されたＣＰＵ１４０１にシステムバス１４２０を介してＲＡＭ１４０３、ＲＯＭやＨＤＤ、磁気ディスク、ＵＳＢメモリ等のフラッシュメモリなどの外部記憶装置１４０５及び入出力インターフェース（Ｉ／Ｆ）１４２５が接続されて構成される。入出力Ｉ／Ｆ１４２５には、キーボードやマウスなどの入力装置１４０９、ディスプレイなどの出力装置１４０７、及びモデムなどの通信デバイス１４１１がそれぞれ接続されている。外部記憶装置１４０５は、情報データベース格納部１４３０とプログラム格納部１４４０とを備えている。何れも、外部記憶装置１４０５内に確保された一定の記憶領域である。
このようなハードウェア構成において、入力装置１４０９を介して各種の指令（コマンド）が入力されることで、又は通信Ｉ／Ｆや通信デバイス１４１１等を介してコマンドを受信することで、この記憶装置１４０５にインストールされたソフトウェアプログラムがＣＰＵ１４０１によってＲＡＭ１４０３上に呼び出されて展開され実行されることで、ＯＳ（オペレーションシステム）と協働してこの発明の機能を奏するようになっている。
データベース格納部１４３０には、参照データベースや入力配列セットあるいは生成した分類データやＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアのデータ等、もしくは通信デバイス１４１１等を介して取得した情報が随時書き込まれ、更新される。各入力配列セット中の各々の配列、参照データベースの各遺伝子情報ＩＤ等の情報を各マスタテーブルで管理することにより、蓄積対象となるサンプルに帰属する情報を、各マスタテーブルにおいて定義されたＩＤにより管理することが可能となる。
データベース格納部１４３０には、入力配列セットエントリー情報として、試料提供者ＩＤ、試料情報、核酸分析結果、既知の個体・生理情報、及びＴＣＲもしくはＢＣＲレパトア分析結果が試料ＩＤに関連付けて格納される。ここで、ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトア分析結果は、核酸分析結果を本発明の処理によって処理して得られる情報である。
また、プログラム格納部１４４０に格納されるコンピュータプログラムは、コンピュータを、上記した処理システム、例えば、トリミング、抽出、アラインメント、アサイン、分類、翻訳等を行う処理を実施するシステムとして構成するものである。これらの各機能は、それぞれが独立したコンピュータプログラムやそのモジュール、ルーチンなどであり、上記ＣＰＵ１４０１によって実行されることでコンピュータを各システムや装置として構成させるものである。なお、以下においては、それぞれのシステムにおける各機能が協働してそれぞれのシステムを構成しているものとする。
（レパトアの解析システム・解析方法）
１つの局面において、本発明は、データベースを用いて被験体のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を定量的に解析する方法を提供する。この方法は、（１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程；（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程；および（３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する工程を包含する。この方法および本明細書で説明される１つまたは複数の更なる特徴を含む方法を、本明細書において「本発明のレパトア解析法」とも呼ぶ。そして本発明のレパトア解析法を実現するシステムを「本発明のレパトア解析システム」ともいう。
本発明の方法における（１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程は、核酸配列を決定するのに適切な試料となっている限り、どのような試料であってもよい。そのような手法として、本発明の上記の好ましい増幅方法のほか、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、エマルジョンＰＣＲ、ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ （ＡＦＬＰ）ＰＣＲ、アレル特異的ＰＣＲ、アッセンブルＰＣＲ，非対称ＰＣＲ，コロニーＰＣＲ，ヘリカーゼ依存性増幅、ホットスタートＰＣＲ、インバースＰＣＲ、ｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ、Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ ＰＣＲ、ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ＰＣＲ （ＬＡＭＰ），Ｎｕｃｌｅｉｄ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＮＡＳＢＡ）、Ｌｉｇａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｂｒａｎｃｈ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｒｏｌｌｉｎｇ Ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｃｉｒｃｌｅ ｔｏ ｃｉｒｃｌｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＳＰＩＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｔｒｇｅｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎ （ＴＡＣＬ）、５’−Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄ （５’−ＲＡＣＥ）、３’−Ｒａｐｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ ｅｎｄ （３’−ＲＡＣＥ）、Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｔ ５’−ｅｎｄｏｆ ｔｈｅ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ（ＳＭＡＲＴ）を用いることもできる。
本発明の方法における（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程は、核酸配列を決定することができる限り、どのような方法を用いてもよい。通常は、大量の配列決定を要するため、自動化された大規模配列決定方法を用いることが好ましい。そのような配列決定方法としては、Ｒｏｃｈｅ ４５４シーケンサを用いた配列決定（ＧＳ ＦＬＸ＋、ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ）、イオントレントシーケンサ（Ｉｏｎ ＰＧＭＴＭ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）の手法を用いた配列決定、イルミナ社の手法（ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒ ＩＩｘ，Ｈｉｓｅｑ，Ｍｉｓｅｑ）を用いた配列決定がある。その他のシーケンス法としては、ＨｅｌｉｓｃｏｐｅＴＭ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ、Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｔｒｕｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ （ｔＳＭＡ）（Ｈａｒｒｉｓ．Ｔ．Ｄ．ｅｔ．ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００８，３２０−１６０−１０９），ＳｏｌｉＤＴＭ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．），Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ （ＳＭＲＴＴＭ）ＰａｃＢｉｏシステム（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， ＣＡ），Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ），ＬａｓｅｒＧｅｎＴＭ（ＬａｓｅｒＧｅｎ，Ｉｎｃ．ＣＡ)（文献：Litosh VA et al., Nucleic Acids Res. 2011 Mar;39(6):e39）、Ｌｉｇｈｔｓｐｅｅｄ ＧｅｎｏｍｉｃｓＴＭ（Ｌｉｇｈｔｓｐｅｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ＣＡ）、ＧｎｕＢＩＯ（ＧｎｕＢＩＯ Ｉｎｃ．、ＭＡ）、Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ （Ｍ．Ｄａｎａｈｅｒ／Ｄｏｖｅｒ，Ａｚｃｏ Ｂｉｏｔｅｃ． Ｉｎｃ．， ＣＡ），Ｍｅｂｉｏｕｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ’ｓ ｓｉｎｇｌｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｍｅｂｉｏｕｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ），Ｍｉｌｌｉｋａｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃａｅｒｕｓ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｉｎｃ）、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｂｉｏ−Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．（文献：HutterD,et al Nucleosides Nucleotides Nucleic Acid 2010;29(11):879-95.），Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ （Ｎａｂｓｙｓ Ｉｎｃ．， ＲＩ），Ｎａｎｏｐｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ （Ｎｏｂｌｅｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．），Ｎａｎｏｐｏｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ （Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｃｉｅｎｃｅｓ，ＣＡ），Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＧＥＮＩＵＳＴＭ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（Ｇｅｎａｐｓｙｓ、Ｉｎｃ．，ＣＡ），ＣＡＥＲＵＳ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＤＩＡＧＮＯＴＩＣＳ，ＩＮＣ，ＣＡ，Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｒａｐｉｄ Ｎａｎｏｔｒａｎｓｆｅｒ （ＩＭＰＲＮＴ）（Ｈａｌｃｙｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ），Ｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ−ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｄｕａｌ−ｂｅａｍ ｌｏｗ ｅｎｅｒｇｙ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ （Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｏｐｔｉｃａ， Ｉｎｃ．，ＣＡ），ＺＳ Ｇｅｎｅｓｉｓ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＺＳ Ｇｅｎｅｔｙｉｃｓ，Ｉｎｃ）等を挙げることができる。Ｒｏｃｈｅ４５４シーケンスは、３’末端と５’末端に特異的に結合する２種類のアダプターを結合させた１本鎖ＤＮＡを作成する。その１本鎖ＤＮＡはアダプターを介してビーズに結合し、油中水滴エマルジョンの中に包み込むことにより、ビーズとＤＮＡフラグメントを持つマイクロリアクターを形成する。その後、油中水滴エマルション内でエマルションＰＣＲを行って目的遺伝子を増幅する。このビーズをピコタイタープレートへアプライし、シーケンスを行う。ＤＮＡポリメラーゼによりｄＮＴＰがＤＮＡに取りこまれるときに発するピロリン酸を基質として、ｓｕｌｆｒｙｌａｓｅによりＡＴＰを生成する（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）。このＡＴＰとＬｕｃｉｆｅｒｉｎを基質としてＬｕｃｉｆｅｒａｓｅが蛍光を発し、ＣＣＤカメラで検出することで塩基配列を決定する。イオントレント社の手法は、Ｒｏｃｈｅ社と同様の方法でエマルジョンＰＣＲを行った後、ビーズをマイクロチップに移し、マイクロチップ上でシーケンス反応を行う。検出は、ポリメラーゼによってＤＮＡが伸長する際に放出される水素イオン濃度を半導体チップ上で検出して、塩基配列に変換する。イルミナ社のシーケンスは、ブリッジＰＣＲ法とＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓという手法により、フローセル上で目的ＤＮＡを増幅させ、合成しながらシーケンシングを行う方法である。ブリッジＰＣＲ法は、両末端に異なるアダプター配列を付加した1本鎖ＤＮＡを作成する。フローセル上には予め５’末端側のアダプター配列が固定されており、伸長反応を行うことによりフローセルに固定する。同様に近接する位置に３’末端側のアダプターが固定され、合成されたＤＮＡの３’末端と結合して、いわゆるブリッジを形成した状態で２本鎖ＤＮＡを合成する。その後、ブリッジ結合→伸長→変性を繰り返すことにより、多数の１本鎖ＤＮＡ断片が局所的に増幅し、集積したクラスターが形成される。この１本鎖ＤＮＡを鋳型として、シーケンシングを行う。Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓは、シーケンスプライマーを添加後、ＤＮＡポリメレースによって３’末端ブロック蛍光ｄＮＴＰによる1塩基合成反応を行う。レーザー光により塩基に結合している蛍光物質を励起させて、蛍光顕微鏡により発光を写真として記録する。次に、蛍光物質とブロックを外して次の伸長反応を行い、蛍光を検出するというステップを進めていくことで塩基配列を決定する。好ましくは、複数の配列を単一の配列決定で行うことが有利である。より長い配列長を一度に配列決定できることも有利である。
本発明における（３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出する工程は、遺伝子の出現頻度およびその組み合わせを算出することができ、ＴＣＲレパトアおよび／またはＢＣＲレパトアを導出することができるかぎり、どのような技術であっても用いることができる。たとえば、上述の解析方法の好ましい例のほか、ＩＭＧＴが提供する分析ツールＨｉｇｈＶ−Ｑｕｅｓｔが利用できる。他の手法ではアライメント機能あるいはマッピング機能を実装したソフトウェアであるＡｂＭａｐｐｅｒ， ＡＬＬＰＡＴＨＳ， Ａｒａｃｈｎｅ， ＢＡＣＣａｒｄｌ， Ｂｆａｓｔ， ＢＬＡＴ， Ｂｏｗｔｉｅ， ＢＷＡ−ＭＥＭ， ＢＷＡ−ＳＷ， ＢＷＡ， ＣＣＲａ ＶＡＴ ＆ ＱｕＴｉｅ， ＣＬＣ ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ， ＣＮＶ−ｓｅｑ， Ｅｌｖｉｒａ， ＥＲＮＥ−ｍａｐ （ｒＮＡ）， ＧＳＭａｐｐｅｒ， Ｇｌｉｍｍｅｒ， ｇｎｕｍａｐ， Ｇｏｓｅｑ ， ＩＣＡｔｏｏｌｓ， ＬＯＣＡＳ， ＭａｐＳｐｌｉｃｅ， Ｍａｑ， ＭＥＭＥ， Ｍｏｓａｉｋ， ＮＧＳＶｉｅｗ， Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ， ＯＳＬａｙ， Ｐａｒｔｅｋ， Ｐｅｒｍ， Ｐｒｏｊｅｃｔｏｒ， Ｑｐａｌｍａ， ＲａｚｅｒＳ， ＳＨＡＲＣＧＳ， ＳＨＲｉＭＰ２， ＳＮＰ−ｏ−ｍａｔｉｃ， Ｓｐｌｉｃｅｍａｐ， ＳＳＡＨＡ２， Ｓｔａｍｐｙ， Ｔａｂｌｅｔ， ＴＭＡＰ， Ｔｏｐｈａｔ， Ｖｅｌｖｅでも行うことができる。
１つの実施形態において、前記核酸試料は、複数種類のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含み、前記（２）の配列を決定する工程では、単一の配列決定により前記核酸配列が決定される。本発明の方法は、単一の配列決定を行うことにより、複数種類の配列決定を行うことにより生じ得るバイアスを低減または消滅させることができる。したがって、特に低頻度でしか生じないＴＣＲまたはＢＣＲのリードを正確に検出するのに有用である。
別の実施形態において、前記単一の配列決定は、前記核酸試料から配列決定用の試料への増幅において、プライマーとして使用する配列は少なくとも一方がＣ領域をコードする核酸配列またはその相補鎖と同一配列を有することを特徴とする。Ｃ領域をコードする核酸配列またはその相補鎖と同一配列を有するプライマーを用いることにより、どのようなＴＣＲまたはＢＣＲにおいても同様の増幅を行うことができ、非バイアスを達成することができる。
１つの実施形態では、前記非バイアス的な増幅はＶ領域特異的な増幅ではないことを含む。Ｖ特異的なプライマーを用いたマルチプレックス等の工夫をして非バイアス的な増幅を行う場合に比べて、バイアスがさらに減少または消失させることができる。
１つの実施形態において、本発明が対象とするレパトアはＢＣＲの可変領域のレパトアであり、前記核酸配列はＢＣＲの核酸配列である。ＢＣＲは、変異が入りやすく、特にＶ領域に変異が多発するとされており、Ｖ領域特異的な増幅を用いた手法では、ＢＣＲレペトアの正確な分析は困難である。
１つの局面において、本発明は、本発明のレパトア解析方法に基づいて導出されたＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する方法を提供する。
本発明の疾患、障害または状態の分析方法において、本発明のレパトア解析方法に基づいて導出されたＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手法としては、疾患、障害、状態などの臨床情報と導出されたリードの種類、リード数、リード頻度、Ｖ領域、Ｊ領域、Ｃ領域、ＣＤＲ３配列などから成るリードデータを連結し、ＥＸＣＥＬ等のスプレッドシートを使ってデータベース化することからはじまる。まず、導出した個々のリード配列について、１．ＮＫＴやＭＡＩＴなどの既知の機能を有するＴＣＲを検索する。２．既存の公共データベース内を検索し、抗原特異性などの機能が知られるＴＣＲあるいはＢＣＲと照合する。３．構築したデータベース内あるいは既存の公共データベース内で検索し、共通する試料の由来、特性あるいは機能から疾患、障害または状態と関連付ける。次に、試料中のリード配列について、１．特定のリードの頻度が増加するか（クローナリティーの増加）を明らかにする。２．疾患の発症や障害の状態に応じて特定のＶ鎖あるいはＪ鎖使用頻度が増加あるいは減少するかどうかを調べる。３．疾患の発症や障害の状態に応じて特定のＶ鎖におけるＣＤＲ３配列長が増加あるいは減少するかどうかを調べる。４．疾患の発症や障害の状態に応じて変化するＣＤＲ３領域の組成や配列を調べる。５．疾患の発症や障害の状態に応じて出現または消失するリードを検索する。６．疾患の発症や障害の状態に応じて増加あるいは減少するリードを検索する。７．疾患の発症や障害の状態に応じて出現あるいは増加・減少するリードを他の試料中に検索し、疾患、障害または状態と関連付ける。８．サンプル数、リード種類、リード数などのデータを使って、ＥＳＴＩＭＡＴＥＳあるいはＲ（ｖｅｇａｎ）などの統計解析ソフトウェアを用いて多様性指数あるいは類似性指数を算出する。９．多様性指数あるいは類似性指数の変化と疾患の発症や障害の状態に関連付けることができる。
１つの実施形態では、本発明の分析方法において、前記被験者の疾患、障害または状態は、血液腫瘍、大腸がん、免疫状態、関節リウマチ、成人T細胞白血病、T細胞大顆粒リンパ球性白血病、特発性血小板減少性紫斑病などを挙げることができるがそれらに限定されない。
別の実施形態では、本発明は、本発明の方法で決定された被験者の疾患、障害または状態と、前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアとを定量的に関連付ける工程、および該定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する工程を含む、該被験者の疾患、障害または状態を処置または予防するための方法を提供する。
１つの実施形態において、本発明の処置または予防するための方法において対象とされる被験者の疾患、障害または状態は、血液腫瘍、大腸がん、免疫状態、関節リウマチ、成人T細胞白血病、T細胞大顆粒リンパ球性白血病、特発性血小板減少性紫斑病などを挙げることができるがそれらに限定されない。
別の局面では、本発明は、データベースを用いて被験体のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）を定量的に解析するためのシステム（解析システム）を提供する。このシステムは、（１）該被験者から非バイアス的に増幅した、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供するためのキット；（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定するための装置；および（３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアを導出するための装置を備える。このようなシステムおよび本明細書で説明される１つまたは複数の更なる特徴を含むシステムを「本発明のレパトア解析システム」という。本発明のレパトア解析システムは、「本発明のレパトア解析法」を実現する。
別の実施形態では、前記核酸試料は、複数種類のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の核酸配列を含み、前記（２）の装置は単一の配列決定により前記核酸配列を決定することができるように構成される。
別の実施形態では、前記単一の配列決定は、前記核酸試料から配列決定用の試料への増幅において、プライマーとして使用する配列は少なくとも一方がＣ領域と同一配列を有することを特徴とする。本発明のシステムは、単一の配列決定を行うことにより、複数種類の配列決定を行うことにより生じ得るバイアスを低減または消滅させることができる。したがって、本発明のシステムは、特に低頻度でしか生じないＴＣＲまたはＢＣＲのリードを正確に検出するのに有用である。
別の実施形態において、前記単一の配列決定は、前記核酸試料から配列決定用の試料への増幅において、プライマーとして使用する配列は少なくとも一方がＣ領域をコードする核酸配列またはその相補鎖と同一配列を有することを特徴とする。このようなプライマーは、この装置に備え付けられていてもよいし、キットに含まれていてもよく、別途提供されてもよい。Ｃ領域をコードする核酸配列またはその相補鎖と同一配列を有するプライマーを用いることにより、どのようなＴＣＲまたはＢＣＲにおいても同様の増幅を行うことができ、非バイアスを達成することができる。
１つの実施形態では、本発明のキットが提供する核酸試料に含まれる核酸配列は、前記非バイアス的な増幅になされるところ、その増幅は、Ｖ領域特異的な増幅ではない。Ｖ領域特異的なプライマーを用いたマルチプレックス等の工夫をして非バイアス的な増幅を行う場合に比べて、バイアスをさらに減少または消失させることができる。
１つの実施形態において、本発明のシステムの分析の対象となるレパトアはＢＣＲの可変領域のレパトアであり、前記核酸配列はＢＣＲの核酸配列である。ＢＣＲは、変異が入りやすく、特にＶ領域に変異が多発するとされており、Ｖ領域特異的な増幅を用いた手法では、ＢＣＲレペトアの正確な分析は困難である。本発明のシステムを用いることによって、ＢＣＲレペトアも正確に分析することが可能になった。
別の局面においては、本発明は、本発明の解析システムと、該システムに基づいて導出されたＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手段とを備える、被験者の疾患、障害または状態を分析するシステム（分析システム）を提供する。本発明の分析システムの該システムに基づいて導出されたＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手段は、疾患、障害、状態などの臨床情報と導出されたリードの種類、リード数、リード頻度、Ｖ領域、Ｊ領域、Ｃ領域、ＣＤＲ３配列などから成るリードデータを連結し、ＥＸＣＥＬ等のスプレッドシートを使ってデータベース化することからはじまる。まず、導出した個々のリード配列について、１．ＮＫＴやＭＡＩＴなどの既知の機能を有するＴＣＲを検索する。２．既存の公共データベース内を検索し、抗原特異性などの機能が知られるＴＣＲあるいはＢＣＲと照合する。３．構築したデータベース内あるいは既存の公共データベース内で検索し、共通する試料の由来、特性あるいは機能から疾患、障害または状態と関連付ける。次に、試料中のリード配列について、１．特定のリードの頻度が増加するか（クローナリティーの増加）を明らかにする。２．疾患の発症や障害の状態に応じて特定のＶ鎖あるいはＪ鎖使用頻度が増加あるいは減少するかどうかを調べる。３．疾患の発症や障害の状態に応じて特定のＶ鎖におけるＣＤＲ３配列長が増加あるいは減少するかどうかを調べる。４．疾患の発症や障害の状態に応じて変化するＣＤＲ３領域の組成や配列を調べる。５．疾患の発症や障害の状態に応じて出現または消失するリードを検索する。６．疾患の発症や障害の状態に応じて増加あるいは減少するリードを検索する。７．疾患の発症や障害の状態に応じて出現あるいは増加・減少するリードを他の試料中に検索し、疾患、障害または状態と関連付ける。８．サンプル数、リード種類、リード数などのデータを使って、ＥＳＴＩＭＡＴＥＳあるいはＲ（ｖｅｇａｎ）などの統計解析ソフトウェアを用いて多様性指数あるいは類似性指数を算出する。９．多様性指数あるいは類似性指数の変化と疾患の発症や障害の状態に関連付けることができる。
１つの実施形態では、本発明の分析システムが分析することがでいる前記被験者の疾患、障害または状態として、血液腫瘍、大腸がん、免疫状態、関節リウマチ、成人T細胞白血病、T細胞大顆粒リンパ球性白血病、特発性血小板減少性紫斑病などを挙げることができるがそれらに限定されない。
別の局面において、本発明は、本発明の解析システムで決定された被験者の疾患、障害または状態と、前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアとを定量的に関連付ける手段、および該定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する手段とを備える、該被験者の疾患、障害または状態を処置または予防するためのシステム（処置システムまたは予防システム）を提供する。
本発明のシステムにおける被験者の疾患、障害または状態と、前記ＴＣＲもしくはＢＣＲレパトアとを定量的に関連付ける手段は、以下のような構成により実現することができる。すなわち、本発明の解析システムによって導出されたレパトアの情報を読み取り、これを、被験者の疾患、障害または状態に関する情報を読み取り、これらを関連付けることで実現することができる。導出されたリード集計データは、既存のリファレンス配列に対する照合作業からＶ領域、Ｊ領域、Ｃ領域がアサインされ、ＣＤＲ３配列が決定されている。Ｖ領域、Ｊ領域、ＣＤＲ３配列をもとに一致するリードを集計し、ユニークリード（他に同じ配列をもたないリード）別に、試料中に検出されたリード数および全リード数に占める割合（頻度）が算出される。この情報（リード配列、リード数、リード頻度、Ｖ領域、Ｊ領域、Ｃ領域、ＣＤＲ３配列）と被験者の臨床情報（病歴、疾患名、病型、進行度、重症度、ＨＬＡ型、免疫状態など）を連結し、ＥＸＣＥＬ等のスプレッドシートあるいはデータベース化機能をもつソフトウェアを使ってデータベース化を行う。試料中のリード配列は、リード数や頻度でソートし、ランキング処理を行う。また、各Ｖ領域別あるいはＪ領域別にリード数を集計し、Ｖ領域使用頻度あるいはＪ領域使用頻度を算出する。これらの情報に基づいて、１．特定のリードの頻度が増加するか（クローナリティーの増加）を明らかにする。２．疾患の発症や障害の状態に応じて特定のＶ鎖あるいはＪ鎖使用頻度が増加あるいは減少するかどうかを調べる。３．疾患の発症や障害の状態に応じて特定のＶ鎖におけるＣＤＲ３配列長が増加あるいは減少するかどうかを調べる。４．疾患の発症や障害の状態に応じて変化するＣＤＲ３領域の組成や配列を調べる。５．疾患の発症や障害の状態に応じて出現または消失するリードを検索する。６．疾患の発症や障害の状態に応じて増加あるいは減少するリードを検索する。７．疾患の発症や障害の状態に応じて出現あるいは増加・減少するリードを他の試料中に検索し、疾患、障害または状態と関連付ける。８．サンプル数、リード種類、リード数などのデータを使って、ＥＳＴＩＭＡＴＥＳあるいはＲ（ｖｅｇａｎ）などの統計解析ソフトウェアを用いて多様性指数あるいは類似性指数を算出する。９．多様性指数あるいは類似性指数の変化と疾患の発症や障害の状態に関連付けることができる。定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する手段は、以下のような構成をとることができる。すなわち、定量性を示すデータと、処置、治療または予防に関するこれまでの情報または現在入手できる情報とを関連付け、その後の経過が改善するものの選択を実現することでこの選択手段の選択を実現することができる。
１つの実施形態において、前記被験者の疾患、障害または状態は、血液腫瘍、大腸がん、免疫状態、関節リウマチ、成人T細胞白血病、T細胞大顆粒リンパ球性白血病、特発性血小板減少性紫斑病などを挙げることができるがそれらに限定されない。
（応用）本発明を用いて、大規模シーケンスにより同定されたTCRまたはBCR遺伝子の塩基配列（リード）とその出現頻度をソフトウェア上で算出し、リストや分布あるいはグラフを描出できる。それら情報に基づいて、次のような様々な指標を使うことによりレパトアの変化を検出する。その変化に基づいて、疾患や障害との関連を明らかにすることができる。
１つの局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、V遺伝子の使用頻度を検出する方法を提供する。各リードのV遺伝子を同定し、全体のTCRあるいはBCR遺伝子に占める各V遺伝子の割合を算出することができる。疾患や病態に関連したVの使用頻度の増加や減少を明らかにすることができる。
別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、J遺伝子の使用頻度を検出する方法を提供する。各リードのJ遺伝子を同定し、全体のTCRあるいはBCR遺伝子に占める各J遺伝子の割合を算出することができる。疾患や病態に関連したJの使用頻度の増加や減少を明らかにすることができる。
別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、サブタイプの頻度解析（BCR）の使用頻度を検出する方法を提供する。Ｃ領域の配列決定に基づいて、ＩｇＡ１，ＩｇＡ２、ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４サブタイプの存在頻度を算出することができる。疾患や病態に関連した特定のサブタイプの増加や減少を明らかにすることができる。
別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、CDR3配列長のパターンを分析する方法を提供する。各リードのもつＣＤＲ３塩基配列長を算出して、その分布を明らかにすることができる。正常なＴＣＲあるいはＢＣＲからは正規分布様のピークパターンを示すが、正常な分布より逸脱したピークを検出して、疾患や病態との関連を明らかにすることができる。
別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、ＴＣＲあるいはＢＣＲのクローナリティを分析する方法を提供する。各リードのＶ配列、Ｊ配列およびＣＤＲ３配列に基づいて、同一配列を有するリードを分類し、そのコピー数を算出す。全体のリード数に占める各リードのコピー数の割合を算出し、高頻度に存在するリードの存在を明らかにすることができる。出現頻度により降順にソートして、高頻度に存在するリードの数や割合について正常試料と比較することでクローナリティの度合いを評価する。そのことから疾患や病態に関連するＴＣＲあるいはＢＣＲクローナリティの変化を調べる。特に、白血病細胞などの検出に用いることができる。
別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、重複リードを抽出する方法を提供する。特定の疾患、病型、病態、組織、遺伝子型（ＨＬＡなど）に分類される試料のリードを検索し、試料間に重複するＴＣＲまたはＢＣＲリードを抽出する。そのことから疾患や障害の状態に関連するＴＣＲあるいはＢＣＲ遺伝子を明らかにすることができる。自己免疫疾患の発症に関与する疾患特異的Ｔ細胞、疾患関連抗体を産生するＢ細胞、がん細胞を攻撃するがん特異的Ｔ細胞などの同定を行うことができる。
別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、疾患特異的TCRあるいはBCRクローンを検索する方法を提供する。特定の疾患や障害の状態に関連づけられたTCRあるいはBCRリードを、試験試料において検索し、その出現や消失、あるいは増加や減少を明らかにすることで、疾患の発症や病態の進行あるいは改善を予測することができる。
別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、多様性指数を使って対象を分析する方法を提供する。あるいは、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、多様性指数を使って対象を分析を支援する方法を提供する。ＣＤＲ３配列に基づいて同定されたリード配列をカウントし、リードの種数、個体数を算出し、ＴＣＲあるいはＢＣＲレパトアの多様性について指数化する。Ｓｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒの多様性指数（Ｈ’）、Ｓｉｍｐｓｏｎの多様性指数（λ、１−λあるいは１／λ）、Ｐｉｅｌｏｕ均等度指数（Ｊ’）あるいはＣｈａｏ１指数などを用いて、正常試料と対比することで多様度を評価する。骨髄移植後の免疫系の回復度を測る指標として利用することができる。また、造血器腫瘍に伴う免疫系細胞の異常を検出する指標として利用できる。
１つの実施形態では、多様性指数を使った対象の分析方法では、骨髄移植後の免疫系の回復度を測る指標、または、造血器腫瘍に伴う免疫系細胞の異常を検出する指標として前記多様性指数を使用する。このような多様性指標を用いた分析は、従来のシステムでは困難であった。
本明細書において、種々の多様性指標は、サンプル数、リードの種類、リード数のデータから、ＥＸＣＥＬスプレッドシート、ＥＳＴＩＭＡＴＥＳ（Colwell, R. K. et al. Journal of Plant Ecology 5:3-21.）あるいはＲパッケージ（ｖｅｇａｎ）等のソフトウェアを用いて算出することができる。Ｓｈａｎｎｏｎ−Ｗｉｅｎｅｒの多様性指数（Ｈ’）、Ｓｉｍｐｓｏｎの多様性指数（λ、１−λあるいは１／λ）、Ｐｉｅｌｏｕ均等度指数（Ｊ’）あるいはＣｈａｏ１指数は次に示す数式により求める。Ｎ： 全リード数、ｎｉ：リードｉにおけるリード数Ｓｈａｎｎｏｎ−Ｗｅａｖｅｒ ｉｎｄｅｘ Ｈ’
Ｓｉｍｐｓｏｎ’ｓ ｉｎｄｅｘ λ
Ｉｎｖｅｒｓｅ Ｓｉｍｐｓｏｎ’ｓ ｉｎｄｅｘ
Ｐｉｅｌｏｕ’ｓ Ｊ
ＳＣｈａｏ１Ｓｏｂｓ：全リード種数、Ｆ１：シングルトンリード、Ｆ２：ダブルトンリード

別の局面において、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、類似性指数を使って対象を分析する方法。あるいは、本発明は、本発明の解析方法、または解析システムを用いて、類似性指数を使って対象を分析を支援する方法を提供する。ＣＤＲ３配列に基づいて同定されたリード配列の種数、個体数を算出し、比較する試料間のＴＣＲあるいはＢＣＲレパトアの類似度を明らかにする。Ｍｏｒｉｓｉｔａ―Ｈｏｒｎ指数、木元のＣπ指数あるいはＰｉａｎｋａのα指数を用いて、試料間の類似度を明らかにします。ＨＬＡ型一致あるいは不一致間のレパトアの類似度の評価、骨髄移植後のレシピエントとドナー間のレパトアの類似度の評価などに利用することができる。
１つの実施形態では、ＨＬＡ型一致あるいは不一致間のレパトアの類似度の評価、骨髄移植後のレシピエントとドナー間のレパトアの類似度の評価として前記類似性指数を使用する。このような類似性指数を用いた分析は、従来のシステムでは困難であった。種々の類似性指数は以下の数式を用いて、ＥＳＴＩＭＡＴＥＳ（Colwell, R. K. et al. Journal of Plant Ecology 5:3-21.）あるいはＲパッケージ（ｖｅｇａｎ）を用いて算出することができる。Ｍｏｒｉｓｉｔａ―Ｈｏｒｎ指数、木元のＣπ指数あるいはＰｉａｎｋａのα指数は次に示す数式により求める。Ｍｏｒｏｓｉｔａ−Ｈｏｒｎ指数Ｘｉ：片方のサンプルに由来する全Ｘリードに出現するリードｉの回数ｙｉ：もう一方のサンプルに由来する全Ｙリードに出現するリードｉの回数Ｓ：ユニークリード数

木元のπ指数

Ｐｉａｎｋａのα指数

本発明は、次世代シークエンシング技術を使用して、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）の可変領域のレパトア（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）の定量解析を行うための試料の調整を行うことができる。これらのシークエンシング技術は、妥当なコストで、試料から100万またはそれ以上のリードを得ることができる。1/1,000,000またはそれよりも低い頻度で存在する遺伝子型でさえ、これらの技術を用いて特異的様式で、しかもバイアスのかかっていない様式で検出することができる。血液または骨髄等のDNA由来の試料から、遺伝子または転写物の特定部分の配列の異なる型をすべて増幅するための非バイアス増幅方法が達成される。
＜がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法＞
１つの局面では、本発明は、被験者にがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法に使用するための組成物を調製する方法を提供する。この方法は、（１）本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムによって、該被験者のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）レパトアを解析する工程；（２）該解析の結果に基づいて、該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲを決定する工程であって、該決定は該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子の存在頻度ランキングにおいて、上位ランクの配列が、該がん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲとして選択することによってなされる、工程；（３）決定された該がん由来のＴＣＲまたはＢＣＲに基づいて、ＨＬＡ検査ペプチドの候補のアミノ酸配列を決定する工程であって、該決定は、ＨＬＡ結合ペプチド予測アルゴリズムを用いて算出されたスコアに基づきなされる、工程；および（４）決定されたペプチドを合成する工程を包含する。ここで合成されたペプチドは、がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法に使用することができる。この方法は、本明細書において「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」と呼ばれることがある。
がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法では、具体的には臨床では以下のような手順を用いて実施することができる。例えば、手短には、（１）血液腫瘍を罹患したがん患者末梢血細胞を採取し、リンパ球細胞を分離し、その後、本発明のレパトア解析法を実施することができ、そして、これを用いてがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法を行うことができる。 別の実施形態では、Ｔ細胞系腫瘍の場合はＴＣＲ、Ｂ細胞系腫瘍の場合はＢＣＲについて本発明のレパトア解析法を実施することができる。そして、その後、ＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子の存在頻度ランキングにおいて、上位ランクの配列を該がん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲとして選択し、該ＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子のＣＤＲ３領域を含む配列から別途決定した該がん患者のヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）に結合するペプチドを、ＨＬＡ結合ペプチド予測プログラム（本明細書においてほかにも説明されているように任意の公知のプログラムを用いることができる）を用いて予測する。そして、ＨＬＡ結合ペプチドをペプチド合成装置により合成し、その後、以下を行う。オーダーメイドペプチド感作ＣＴＬ療法の場合は、患者末梢血単核球細胞を採取し、単核球細胞あるいは患者由来抗原提示細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞を混合したものに該ペプチドを添加して培養し、抗原ペプチドによる刺激を行なうことができる。
オーダーメイドペプチド感作ＣＴＬ療法の場合は、該ペプチド刺激リンパ球細胞を患者に移入し、ＣＴＬ療法を行うことができる。
あるいは、オーダーメイドペプチド感作ＤＣワクチン療法の別法として、患者末梢血単核球細胞を採取した後、単球細胞を分離し、分化誘導因子の存在下で樹状細胞（ＤＣ）に分化誘導した後に、該ペプチドを添加して培養し、該ペプチド感作樹状細胞を患者に移入し、樹状細胞療法を行っても実現することができる。
がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法は例えば、急性骨髄性白血病ならびに類縁前駆細胞腫瘍、リンパ芽球性白血病/リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病/リンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、毛様細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞性白血病/リンパ腫などの血液がん、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群などの白血病類縁疾患、関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患、種々の感染症患者等に使用することができ、末期がん患者、難治性自己免疫疾患、重篤な感染症という患者に用いることができる。特に、腫瘍細胞を標的とした抗体療法などを行なう場合、腫瘍細胞に標的抗原が発現していない、あるいは標的抗原が正常細胞にも発現することで問題となる。それと比し、腫瘍細胞に特異的な配列を選択して利用するため、より特異性の高い、副作用の少ない治療が期待される。
１つの実施形態では、本発明における（３）工程のＨＬＡ検査ペプチドの候補は、ＢＩＭＡＳ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ、ＲＡＮＫＰＥＰまたはＮｅｔＭＨＣを用いて決定される。
別の実施形態では、本発明は、本発明における（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞とを混合して培養する工程を包含する。これは、改良型ＣＴＬ法とも呼ばれる。
改良型ＣＴＬ法では、例えば、既存の抗ＣＤ３抗体やＩＬ−２による広範なＴ細胞の活性化とは異なり、抗原ペプチドを利用したＣＤ８＋Ｔ細胞への抗原特異性の付与により、より特異性が高く副作用の少ない治療が期待できる。また、該患者の腫瘍細胞から得られた情報をもとに作成した個別化ペプチドを利用するため、高い治療効果が期待できるのが特徴である。
改良型ＣＴＬ法では例えば、急性骨髄性白血病ならびに類縁前駆細胞腫瘍、リンパ芽球性白血病/リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病/リンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、毛様細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞性白血病/リンパ腫などの血液がん、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群などの白血病類縁疾患、関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患、種々の感染症患者等に使用することができ、末期がん患者、難治性自己免疫疾患、重篤な感染症という患者に用いることができる。
別の実施形態では、本発明は、本発明の（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養する工程を包含する。これは、ＤＣワクチン療法とも呼ばれる。
ＤＣワクチン療法では、例えば、該患者由来の腫瘍細胞から得られた配列情報をもとに個別化ペプチドを作出するため、正常細胞には作用せず、腫瘍細胞により特異的に作用して、高い治療効果が見込める。抗原としてペプチドを用いるため、蛋白とは異なり容易に化学合成することができる利点がある。
ＤＣワクチン療法では例えば、急性骨髄性白血病ならびに類縁前駆細胞腫瘍、リンパ芽球性白血病/リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病/リンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、毛様細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞性白血病/リンパ腫などの血液がん、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群などの白血病類縁疾患、関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患、種々の感染症患者等に使用することができ、末期がん患者、難治性自己免疫疾患、重篤な感染症という患者に用いることができる）。
別の実施形態では、本発明は、本発明の（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞とを混合して培養してＣＤ８＋Ｔ細胞−樹状細胞／抗原提示細胞−ペプチド混合物を生産する工程、および前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養して樹状細胞−ペプチド混合物を生産する工程を包含する。これは、患者自己免疫細胞療法とも呼ばれる。
患者自己免疫細胞療法では、例えば、ＣＴＬ療法同様に該患者由来のペプチドによるＣＤ８＋Ｔ細胞の刺激活性化とともに、樹状細胞のペプチド感作も行なうことになる。該患者由来のＣＤ８＋細胞と樹状細胞を共に患者に移入することにより、特異性を付与したＣＴＬによる急性効果と抗原提示細胞として利用した樹状細胞による持続的効果の相乗効果が期待できるのが特徴である。
患者自己免疫細胞療法では例えば、血液がん（白血病等）、急性骨髄性白血病ならびに類縁前駆細胞腫瘍、リンパ芽球性白血病/リンパ腫、Ｔリンパ芽球性白血病/リンパ腫、慢性リンパ性白血病/小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、毛様細胞白血病、Ｔ細胞前リンパ球性白血病、Ｔ細胞大顆粒リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞性白血病/リンパ腫などの血液がん、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群などの白血病類縁疾患、関節リウマチ、全身性エリトマトーデス、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患、種々の感染症患者等に使用することができ、末期がん患者、難治性自己免疫疾患、重篤な感染症という患者に用いることができる。
別の局面において、本発明は、被験者にがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法を付与する方法を提供する。この方法は、（１）本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムによって、該被験者のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）またはＢ細胞レセプター（ＢＣＲ）レパトアを解析する工程；（２）該解析の結果に基づいて、該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲを決定する工程であって、該決定は該被験者のがん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲ遺伝子の存在頻度ランキングにおいて、上位ランクの配列が、該がん細胞由来のＴＣＲまたはＢＣＲとして選択することによってなされる、工程；（３）決定された該がん由来のＴＣＲまたはＢＣＲに基づいて、ＨＬＡ検査ペプチドの候補のアミノ酸配列を決定する工程であって、該決定は、ＨＬＡ結合ペプチド予測アルゴリズムを用いて算出されたスコアに基づきなされる、工程；（４）決定されたペプチドを合成する工程；必要に応じて（５）合成したペプチドを用いて治療を行う工程を包含する。この方法は、治療剤を製造する方法および治療自体を行う方法の両方を包含する。医療行為を除く場合は、（５）の前までの工程で完了させることができる。
好ましい実施形態では、本発明では、前記（３）工程のＨＬＡ検査ペプチドの候補は、ＢＩＭＡＳ、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ、ＲＡＮＫＰＥＰまたはＮｅｔＭＨＣを用いて決定される。
ＢＩＭＡＳとは、www-bimas.cit.nih.gov/で提供されるＨＬＡペプチド結合の推定プログラムである。
ＳＹＦＰＥＩＴＨＩとは、www.syfpeithi.de/で提供される、ＭＨＣリガンドおよびペプチドモチーフのデータベースおよび検索エンジンである。
ＲＡＮＫＰＥＰとは、http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.htmlで提供される、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子に対するペプチド結合の予測プログラムである。
ＮｅｔＭＨＣとはwww.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/で提供される、多数のＨＬＡ対立遺伝子に対するペプチドの結合を予測するプログラムサーバーである。
好ましい実施形態では、改良型ＣＴＬ法として、本発明は、前記（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞とを混合して培養する工程、および該培養後の混合物を患者に投与する工程を包含する。
好ましい実施形態では、ＤＣワクチン療法として、本発明は、前記（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養する工程、および該培養された混合物を患者に投与する工程を包含する。
好ましい実施形態では、患者自己免疫細胞療法として、本発明は、前記（４）工程の後に、前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞または抗原提示細胞と、前記被験者由来のＣＤ８＋Ｔ細胞とを混合して培養してＣＤ８＋Ｔ細胞−樹状細胞／抗原提示細胞−ペプチド混合物を生産する工程、および前記ペプチドと、前記被験者由来の樹状細胞とを混合して培養して樹状細胞−ペプチド混合物を生産する工程を行い、該ＣＤ８＋Ｔ細胞−樹状細胞／抗原提示細胞−ペプチド混合物、および該樹状細胞−ペプチド混合物を患者に投与する工程を包含する。
＜オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離＞
別の局面において、本発明は、オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離技術を提供する。したがって、本発明は、（Ａ）被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドまたは該被験者に由来するリンパ球または本発明の「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」において決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程；（Ｂ）該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムによって解析する工程；および（Ｃ）該解析の結果に基づいて、所望の腫瘍特異的Ｔ細胞を単離する工程を包含する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原刺激による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製する方法を提供する。このようなｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原刺激による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製は、いったん遺伝子情報が得られたならば、当該分野で周知の任意の手法を用いて実施することができる。このような単離されたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子およびがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いて、種々のがんの治療および予防に用いることができる。
このような単離されたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子およびがん特異的ＴＣＲ遺伝子は、具体的には臨床では以下のような手順を用いて実施することができる。
１つの実施形態では、以下のように実施することができ、例えば、（１）がん患者から腫瘍細胞を摘出する。（２）該患者由来腫瘍細胞を破砕後、単一細胞に分離し、マイトマイシンＣなどの化学処理や放射線照射により不活化処理をする。（３）該がん患者の全血より末梢血細胞を分離する。（４）末梢血細胞の一部を未処理コントロール試料として、細胞よりＲＮＡを抽出する（５）不活化腫瘍細胞と末梢血細胞を混合し、培養することにより腫瘍特異的Ｔ細胞を活性化し、増殖させる。（６）活性化後、末梢血細胞を回収し、刺激後試料として、細胞よりＲＮＡを抽出する。（７）（４）及び（６）で抽出したＲＮＡ試料から本発明のレパトア解析法を実施する。（８）コントロール試料に比し刺激試料で大きく増加したＴＣＲ遺伝子を抽出し、それらをランキングした後に、上位のＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子を選択する。（９）これらの全長ＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子をクローニングし、遺伝子発現用レトロウイルスベクターに導入する。（１０）これらＴＣＲα及びＴＣＲβ遺伝子発現レトロウイルスベクターから遺伝子導入用ウイルスを作成する。（１１）該患者より採取したリンパ球にＴＣＲα、ＴＣＲβを単独で、続けて感染させることにより形質転換する、あるいはＴＣＲαおよびＴＣＲβ両遺伝子を含む遺伝子発現レトロウイルスベクターを作成することにより、一度に両遺伝子を形質転換する。（１２）細胞表面におけるＴＣＲα／ＴＣＲβヘテロダイマーの発現を確認する。（１３）目的のＴＣＲα／ＴＣＲβを発現する腫瘍特異的患者リンパ球を患者に細胞移入することによって、単離されたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子およびがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いた治療を実現することができる。
具体的には、本発明の実施形態において、例えば、血液腫瘍の場合は、「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」に記載の方法で決定したＴＣＲまたはＢＣＲを抗原もしくはペプチドとして使用することができる。ここでは任意のがん抗原や患者由来の不活化がん組織が想定されるが、代表的に以下の方法が利用され得る：任意の抗原タンパク質または任意の抗原ペプチド、Ｔリンパ球と抗原提示細胞を混合する方法；被験者由来リンパ球と被験者由来不活化がん細胞を混合する方法；「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」において提供されるレパトア解析より決定されたＴＣＲまたはＢＣＲ由来のペプチド、Ｔリンパ球と抗原提示細胞を混合する方法が提供される。
したがって、１つの実施形態では、本発明における（Ａ）工程は、被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程を含む。
さらなる実施形態では、本発明における（Ａ）工程は、前記被験者に由来するリンパ球と、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である。
さらなる実施形態では、本発明における（Ａ）工程は、「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」において決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である。
このような単離されたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子およびがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いた治療は例えば、副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、胆嚢癌、ホジキン病、下咽頭癌、喉頭癌、口唇口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌などの広範な癌患者等に用いることができるがこれらに限定されない。
さらなる局面では、本発明は、オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離を提供する。したがって、本発明は、（Ａ）共通のＨＬＡを有する被験体から単離されたリンパ球またはがん組織を提供する工程；（Ｂ）該リンパ球またはがん組織について、該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムによって解析する工程；および（Ｃ）腫瘍特異的Ｔ細胞に共通する配列を有するＴ細胞を単離する工程を包含する、共通配列検索による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製する方法を提供する。このような共通配列検索による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製は、いったん遺伝子情報が得られたならば、当該分野で周知の任意の手法を用いて実施することができる。このようなオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離によって得られた遺伝子は、種々のがんの治療および予防に用いることができる。この方法は、「本発明のオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離方法」とも呼ばれる。
このようなオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離によって得られた遺伝子は、具体的には臨床では以下のような手順を用いて実施することができる。１つの実施形態では、まず、（１）ＨＬＡが同一のがん患者から腫瘍細胞を摘出または末梢血を分離する。（２）腫瘍細胞浸潤Ｔ細胞を含む腫瘍組織、あるいはリンパ球細胞を用いてレパトア解析を行なう。（３）各試料においてその存在頻度に基づいてランキングし、末梢血細胞に比し腫瘍細胞で高い存在頻度を示した腫瘍特異的Ｔ細胞を選択する。（４）それら腫瘍特異的Ｔ細胞について、複数のＨＬＡ一致がん患者で共通する配列を検索する。（５）最も多くの癌患者で共通する腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子を治療用腫瘍特異的ＴＣＲとして選択する。（６）これらの全長ＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子をクローニングし、遺伝子発現用レトロウイルスベクターに導入する。（７）これらＴＣＲα及びＴＣＲβ遺伝子発現レトロウイルスベクターから遺伝子導入用ウイルスを作成する。（８）該患者より採取したリンパ球にＴＣＲα、ＴＣＲβを単独で、続けて感染させることにより形質転換する、あるいはＴＣＲαおよびＴＣＲβ両遺伝子を含む遺伝子発現レトロウイルスベクターを作成することにより、一度に両遺伝子を形質転換する。（９）細胞表面におけるＴＣＲα／ＴＣＲβヘテロダイマーの発現を確認する。（１０）目的のＴＣＲα／ＴＣＲβを発現する腫瘍特異的患者リンパ球を患者に細胞移入することによって、オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離によって得られた遺伝子を用いた治療を実現することができる。
このようなオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離によって得られた遺伝子を用いた治療は例えば、副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、胆嚢癌、ホジキン病、下咽頭癌、喉頭癌、口唇口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌などの広範な癌患者等に用いることができるがこれらに限定されない。
したがって、別の局面では、本発明は、（Ａ）被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドまたは該被験者に由来するリンパ球またはがんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法において決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程；（Ｂ）該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムによって解析する工程；および（Ｃ）該解析の結果に基づいて、所望の腫瘍特異的Ｔ細胞を単離する工程を包含する、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離方法を提供する。このようなｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原刺激による単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を調製は、いったん遺伝子情報が得られたならば、当該分野で周知の任意の手法を用いて実施することができる。このような単離されたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子およびがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いて、種々のがんの治療および予防に用いることができる。
したがって、このｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離方法の１つの実施形態では、本発明における（Ａ）工程は、被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程を含む。
さらなる実施形態では、本発明における（Ａ）工程は、前記被験者に由来するリンパ球と、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である。
さらなる実施形態では、本発明における（Ａ）工程は、「がんイディオタイプペプチド感作免疫細胞療法」において決定されたペプチドと、該被験者に由来する不活化がん細胞と、該被験者に由来するＴリンパ球とを混合し培養して腫瘍特異的Ｔ細胞を生産する工程である。
さらに別の局面では、本発明は、オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離技術を提供し、（Ａ）共通のＨＬＡを有する被験体からリンパ球またはがん組織を単離する工程；（Ｂ）該リンパ球またはがん組織について、該腫瘍特異的Ｔ細胞のＴＣＲを本発明のレパトア解析法によって解析する工程；および（Ｃ）腫瘍特異的Ｔ細胞に共通する配列を有するＴ細胞を単離する工程を包含する、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離する方法を提供する。このような単離されたオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子およびがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いて、種々のがんの治療および予防に用いることができる。
＜細胞加工療法＞
さらなる局面において、本発明は、細胞加工療法を提供する。詳細には、本発明は、A)患者から採取されたＴリンパ球を提供する工程；B)該Ｔリンパ球を抗原刺激した後に、本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムに基づいてＴＣＲを解析する工程であって、該抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチド、該被験者に由来する不活性化がん細胞、または腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、工程；Ｃ)解析された該ＴＣＲにおいて最適抗原および最適ＴＣＲを選択する工程；およびＤ）該最適ＴＣＲのＴＣＲ遺伝子の腫瘍特異的αおよびβＴＣＲ発現ウイルスベクターを生産する工程を包含する細胞加工療法に使用するための該腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を調製する方法を提供する。この腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を用いた細胞加工療法は、種々のがんの治療および予防に用いることができる。
このような腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を用いた細胞加工療法は、具体的には臨床では以下のような手順を用いて実施することができる。例えば、＜オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗原刺激によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離＞あるいは＜オーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離＞で記載された方法により腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入リンパ球を用いることができる。
したがって、本発明の細胞加工療法において、抗原として任意のがん抗原またはがんペプチドを製造もしくは合成によって生産し、採取された不活性化患者がん細胞を利用することができ、あるいは腫瘍由来イディオタイプペプチドを利用することができる。選択方法としては、がん組織で高発現する抗原を選択する、あるいは患者ＨＬＡ型に結合するペプチドを抗原として選択することができる。
好ましい実施形態では、本発明の細胞加工療法では、最適抗原として、例えば、（１）患者がん組織に高発現する抗原、（２）抗原特異的リンパ球刺激試験において最も強くＴ細胞を活性させる抗原、（３）抗原刺激前後のレパトア解析から特定のＴＣＲの頻度を最も増加させる、抗原を選択することが想定され得るがこれらに限定されない。また、（３）抗原刺激前後のレパトア解析から特定のＴＣＲの頻度を最も増加させる例において最も増加したＴＣＲを最適ＴＣＲとして選択する方法なども想定することができる。また、代表的な例としては、最適ＴＣＲ候補を患者リンパ球に人為的に遺伝子導入し、実際の患者がん組織に最も高い反応性を示したものを最適ＴＣＲとして選択することができる。
このような腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を用いた細胞加工療法は例えば、副腎皮質癌、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、乳癌、子宮頚癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング腫瘍、胆嚢癌、ホジキン病、下咽頭癌、喉頭癌、口唇口腔癌、肝臓癌、非小細胞肺癌、非ホジキンリンパ腫、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌などの広範な癌患者等に用いることができるがこれらに限定されない。
したがって、１つの実施形態では、本発明の方法の抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドによってなされる。
別の実施形態では、本発明のの抗原刺激は、前記被験者に由来する不活性化がん細胞によってなされる。
別の実施形態では、本発明の方法の抗原刺激は、前記腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる。
別の実施形態では、本発明の方法のＣ）工程は、前記被験体のがん組織に高発現する抗原を選択することを含む。
別の実施形態では、本発明の方法のＣ）工程は、抗原特異的リンパ球刺激試験において最も強くＴ細胞を活性させる抗原を選択することを含む。
別の実施形態では、本発明の方法のＣ）工程は、抗原刺激前後において本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムに基づいて行ったレパトア解析から特定のＴＣＲの頻度を最も増加させる抗原を選択することを含む。
１つの特定の実施形態では、本発明は、「本発明のオーダーメイドがん特異的Ｔ細胞受容体遺伝子の単離、共通配列検索によるがん特異的ＴＣＲ遺伝子の単離方法」で単離されたがん特異的ＴＣＲ遺伝子を用いてインビトロで刺激試験を行い有効性および／または安全性評価を行う方法を提供する。
有効性は、例えば、がん特異的ＴＣＲ遺伝子を導入したＴ細胞と被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドによってなされる抗原刺激がなされた該被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチド、被験者に由来する不活性化がん細胞によってなされ抗原刺激がなされたような該被験者に由来する不活性化がん細胞、または腫瘍由来イディオタイプペプチドによって抗原刺激がなされた腫瘍由来イディオタイプペプチドと培養した後に、Ｔ細胞の活性化に応じて細胞外に分泌されるサイトカイン（インターフェロンγ等）量を測定する、Ｔ細胞の活性化に応じて上昇する特定の遺伝子の発現量を測定する、あるいはＴ細胞の活性化に応じて発現または発現増加する細胞表面分子を測定することで、有効性を評価することができる。
＜安全性＞例えば、がん特異的ＴＣＲ遺伝子を導入した前記被験者に由来するＴ細胞と該被験者に由来する正常細胞を混合した場合に、上記Ｔ細胞の活性化に応じて分泌されるサイトカイン、遺伝子発現、あるいは細胞表面分子の発現を測定し、該ＴＣＲ遺伝子導入Ｔ細胞が正常細胞により活性化されないことを確認することにより安全性を評価することができる。
１つの実施形態では、有効性および／または安全性評価の具体的なステップは以下のように実現することができる。すなわち、例えば、（１）レトロウイルス遺伝子発現系を用いて腫瘍特異的ＴＣＲαおよびＴＣＲβ遺伝子導入Ｔリンパ球細胞を作出する。（２）有効性を評価する場合、患者由来の癌細胞を摘出・分離し、不死化処理を行なった後、腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球と混合培養する。（３）上記培養細胞を用い、細胞増殖試験（チミジン取込試験、ＭＴＴ試験あるいはＩＬ−２産生試験など）を行うことにより、腫瘍細胞に対する反応性を定量的に評価し、より強く腫瘍細胞に反応するＴＣＲ遺伝子を選択することができる。（４）安全性を評価する場合、対照となる既存の細胞株、患者癌細胞を含んでいない正常組織（腫瘍摘出の過程で採取される正常組織の一部）、あるいは固形腫瘍の場合は患者末梢血細胞を用いて不死化処理を行なった後、腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球と混合培養する。（５）上記培養細胞を用い、細胞増殖試験（チミジン取込試験、ＭＴＴ試験あるいはＩＬ−２産生試験など）を行うことにより、腫瘍細胞に対する反応性を定量的に評価し、正常細胞に対し反応性を示さないＴＣＲ遺伝子を選択することができる。
したがって、別の局面では、本発明は、A)患者からＴリンパ球を採取する工程；B)該Ｔリンパ球を抗原刺激した後に、本発明のレパトア解析法または本発明のレパトア解析システムに基づいてＴＣＲを解析する工程であって、該抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチド、該被験者に由来する不活性化がん細胞、または腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる、工程；Ｃ)解析された該ＴＣＲにおいて最適抗原および最適ＴＣＲを選択する工程；Ｄ）該最適ＴＣＲのＴＣＲ遺伝子の腫瘍特異的αおよびβＴＣＲ発現ウイルスベクターを生産する工程；E)該腫瘍特異的TCR遺伝子導入Tリンパ球を該患者に導入する工程；を包含する細胞加工療法を提供する。
得られた腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を該患者に導入する工程を実施する方法は以下：Ａ）腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を製造する工程；Ｂ）腫瘍特異的ＴＣＲαおよびＴＣＲβの発現を確認する工程；Ｃ）腫瘍特異的ＴＣＲ遺伝子導入Ｔリンパ球を静脈から点滴移入する工程を包含する。
したがって、１つの実施形態では、本発明の細胞加工療法における抗原刺激は、前記被験者に由来する抗原タンパク質または抗原ペプチドによってなされる。
別の実施形態では、本発明の細胞加工療法における抗原刺激は、前記被験者に由来する不活性化がん細胞によってなされる。
別の実施形態では、本発明の細胞加工療法における抗原刺激は、前記腫瘍由来イディオタイプペプチドによってなされる。
別の実施形態では、本発明の細胞加工療法におけるＣ）工程は、前記被験体のがん組織に高発現する抗原を選択することを含む。
別の実施形態では、本発明の細胞加工療法におけるＣ）工程は、抗原特異的リンパ球刺激試験において最も強くＴ細胞を活性させる抗原を選択することを含む。
別の実施形態では、本発明の細胞加工療法におけるＣ）工程は、抗原刺激前後において本発明のレパトア解析法に基づいて行ったレパトア解析から特定のＴＣＲの頻度を最も増加させる抗原を選択することを含む。
＜ＢＣＲレパトア解析を利用したヒト型抗体の単離＞
一つの実施形態として、本発明のレパトア解析法を用いてＢＣＲ遺伝子レパトア解析を行い、以下に記載の方法で標的抗原に特異的なヒト型抗体を迅速に取得することができる
（Ａ）標的となる抗原タンパクまたは抗原ペプチドをマウスに免疫し、該マウスより抗体産生Ｂ細胞を含む細胞集団（例えば脾臓、リンパ節、末梢血細胞）を分離し、本発明のレパトア解析法によるＢＣＲレパトア解析により免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を解析する方法
（Ａ１）免疫するマウスが抗体多様性を維持したまま完全ヒト抗体を産生することができるＫＭマウスであるＡの方法
（Ａ２）免疫するマウスがNOD/scidマウスにIL-2レセプターγ鎖ノックアウトマウスを交配して作製された重度な複合型免疫不全を呈するNOG(NOD/Shi-scid, IL-2Rγnull)マウスにヒト幹細胞を移植して作製されたヒト化マウスであるＡの方法
（Ｂ）対照マウスと免疫マウス、あるいは抗原免疫前と後のマウス由来の試料から得られた免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子配列とその頻度を比較する
（Ｃ）免疫マウスで強く発現する、あるいは免疫後に増加する免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を同定する
（Ｄ）Ｃの工程から選択した免疫グロブリン重鎖と軽鎖遺伝子を選択し、１種の抗体発現用ベクターにあわせて挿入する、あるいは別個に２種の抗体発現用ベクターにそれぞれ挿入する方法
（Ｅ）Ｄの工程で作製した免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子発現ベクターをＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary）などの真核細胞に導入し、細胞培養を行う
（Ｆ）遺伝子組換え細胞により産生、分泌された抗体分子を分離・精製し、標的抗体タンパクあるいはペプチドに対する特異性を検証する
上記Ａ−Ｆの工程により、動物由来の抗体遺伝子を取得した後にヒト抗体とのキメラ型抗体あるいはヒト化抗体に改変することなく、直接的かつ迅速に抗原特異的ヒト型抗体を取得する方法であり、ヒト型抗体から成る抗体医薬品の開発と製造に用いることができる。
この実施形態で用いられるKMマウスについては、Ishida I, Tomizuka K, Yoshida H, Tahara T, Takahashi N, Ohguma A, Tanaka S, Umehashi M, Maeda H, Nozaki C, Halk E, Lonberg N. Production of human monoclonal and polyclonal antibodies in TransChromo animals. Cloning Stem Cells. 2002;4(1):91-102. Review.を参照することができ、NOGマウスについては、Ito M, Hiramatsu H, Kobayashi K, Suzue K, Kawahata M, Hioki K, Ueyama Y, Koyanagi Y, Sugamura K, Tsuji K, Heike T, Nakahata T. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 2002 Nov 1;100(9):3175-82.を参照することができ、CHO細胞/抗体産生については、Jayapal KP, Wlaschin KF, Hu W-S, Yap MGS. Recombinant protein therapeutics from CHO cells-20 years and counting. Chem Eng Prog. 2007;103:40?47.；Chusainow J, Yang YS, Yeo JH, Toh PC, Asvadi P, Wong NS, Yap MG. A study of monoclonal antibody-producing CHO cell lines: what makes a stable high producer? Biotechnol Bioeng. 2009 Mar 1;102(4):1182-96を参照することができる。
＜ＢＣＲレパトア解析を利用したヒト型抗体の単離＞
一つの実施形態として、当該ＢＣＲ遺伝子レパトア解析法を利用して、以下に記載の方法で標的抗原に特異的なヒト型抗体を迅速に取得することができる
（Ａ）標的となる抗原タンパクまたは抗原ペプチドをマウスに免疫し、該マウスより抗体産生Ｂ細胞を含む細胞集団（例えば脾臓、リンパ節、末梢血細胞）を分離し、ＢＣＲレパトア解析法により免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を解析する方法
（Ａ１）免疫するマウスが抗体多様性を維持したまま完全ヒト抗体を産生することができるＫＭマウスであるＡの方法
（Ａ２）免疫するマウスがNOD/scidマウスにIL-2レセプターγ鎖ノックアウトマウスを交配して作製された重度な複合型免疫不全を呈するNOG(NOD/Shi-scid, IL-2Rγnull)マウスにヒト幹細胞を移植して作製されたヒト化マウスであるＡの方法
（Ｂ）対照マウスと免疫マウス、あるいは抗原免疫前と後のマウス由来の試料から得られた免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子配列とその頻度を比較する
（Ｃ）免疫マウスで強く発現する、あるいは免疫後に増加する免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子を同定する
（Ｄ）Ｃの工程から選択した免疫グロブリン重鎖と軽鎖遺伝子を選択し、１種の抗体発現用ベクターにあわせて挿入する、あるいは別個に２種の抗体発現用ベクターにそれぞれ挿入する方法
（Ｅ）Ｄの工程で作製した免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子発現ベクターをＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary）などの真核細胞に導入し、細胞培養を行う
（Ｆ）遺伝子組換え細胞により産生、分泌された抗体分子を分離・精製し、標的抗体タンパクあるいはペプチドに対する特異性を検証する
上記Ａ−Ｆの工程により、動物由来の抗体遺伝子を取得した後にヒト抗体とのキメラ型抗体あるいはヒト化抗体に改変することなく、直接的かつ迅速に抗原特異的ヒト型抗体を取得する方法であり、ヒト型抗体から成る抗体医薬品の開発と製造に用いることができる。
これらの方法の実施形態としては以下を挙げることができる。その一例として、
１．ＫＭマウスに実験的自己免疫性脳脊髄炎の抗原ペプチドであるMyelin Oligodendrocyte Glycoprotein(MOG35-55, MOG)を免疫する。等量の2mg/mL MOGペプチドと完全フロイントアジュバントを混合し、エマルジョンを作成し、200μgのMOGを皮下に免疫し、同時に400ngの百日咳毒素を腹腔に免疫する。対PBSと完全フロイントアジュバントによる免疫を行い、対照マウスとする。
２．初回免疫後2日目に400ngの百日咳毒素を免疫し、免疫後10日目に発症を確認した後、脳脊髄炎発症マウスより脾臓を摘出する。
３．発症マウスと対照マウスの脾臓を用いて、次世代BCRレパトア解析を実施する。IgG免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖について、個々のBCR配列の出現頻度の集計とランキングを行う。
４．対照ウスに比し、発症マウスにおいて出現頻度が大きく増加したBCR配列を抽出し、ランキングする。これら抗体投与によって誘導されたBCR配列のランキング上位のものの組み合わせについて、MOG特異的抗体遺伝子として同定する。
５．発症マウスから増幅したBCR遺伝子増幅産物からPCR-cloning法により全長ヒト免疫フロブリン配列をクローニングする。抗体発現用ベクターにIgG免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖のそれぞれをクローニングする。１種の抗体発現用ベクターにあわせて挿入する、あるいは別個に２種の抗体発現用ベクターにそれぞれ挿入する方法がある。
６．これら構築した発現ベクターでリポフェクタミン３０００（Life Science）を用いてＣＨＯ（Chinese Hamster Ovary）細胞を形質転換し、IgG免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖を導入する。
７．CHO細胞培養液を回収し、ProteinAアフィニティーカラムによる精製、ゲル濾過による濃縮により、分泌された抗体蛋白を回収する。
８．回収した抗体を用いたELISAアッセイにより、MOG35-55またはMOG蛋白に対する結合活性を測定し、抗体の特異性を検証する。
９．十分な特異性が得られたら、抗体発現安定発現細胞株を取得し、大量培養系によりヒト型抗MOG抗体を製造する。
本明細書中で挙げられた科学文献、特許公報、特許出願公報などの参考文献を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
以下の試薬を用いた。

使用したオリゴヌクレオチドの配列は以下の通りである。
Block primer: GAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAATCTC（配列番号1）
RT primer： AAGCACACGAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAA（配列番号2）
Template switch Oligo （3’の3塩基はRNA）：AAGCAGTGGTATACCCGCAGAGTACATrGrGrG（配列番号3）
Block primer及びRT primerは、マウスTCRβ鎖の定常領域に特異的なリバースプライマーである。全配列がTCRβmRNAにハイブリダイズするように設計されている。RT primerは3’側に4塩基分、nestedに設計されている。またRT primerは、5’側を8塩基伸ばし、affinityを高くしている。これらのプライマーを用いて逆転写テンプレートスイッチングPCRを行うことにより、TCRβ鎖をコードするmRNAの定常領域から5’末端までを増幅することができる。増幅される領域には、抗原認識部位を含む再構成されたVDJや非翻訳領域などが含まれる。従って、T細胞集団から採取したtotal RNAを鋳型として、これらのプライマーを用いて逆転写テンプレートスイッチングPCRを行うことにより、TCRβ鎖の抗原認識部位や非翻訳領域などのcDNAライブラリーを構築することができる。また、セルソーター等によりソートしたシングルセルのT細胞をそのまま鋳型として用いれば（細胞内のRNAが鋳型となる）、個々の細胞のTCRβ鎖の抗原認識部位を特異的に増幅し、その配列を決定することができる。
本試験においては、ワンステップで逆転写テンプレートスイッチングPCRを行った。典型的には以下の表の組成の反応混合液を用いた。

典型的には以下の熱サイクリング条件を用いた。
尚、反応混合液の組成及び熱サイクリング条件の一部は、試験内容に応じて、適宜変更した。
［試験例1］
以下のTotal RNA濃度、ブロックプライマー濃度、及びRTプライマー濃度の条件で、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを行った。

結果を図1に示す。ブロックプライマーを用いないときは、多数の非特異的なバンドが検出されたが（レーン1）、ブロックプライマーの添加により、非特異的なバンドが消失した（レーン2〜11）。0.04μM〜0.00016μMのRTプライマー濃度で、TCRβ鎖の特異的増幅が観察された。比較的高いRTプライマー濃度（0.4μMなど）において、マイナーな非特異的バンドを認めたが、RTプライマー濃度を低下させることにより、これを抑制することができた。
［試験例2］
以下の細胞数、ブロックプライマー濃度、及びRTプライマー濃度の条件で、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを行った。PCRのサイクル数は48とした。

結果を図2に示す。いずれの条件においても、TCRβ鎖の特異的増幅が観察された。RTプライマーを添加しなくても、TCRβ鎖の特異的増幅が観察された（レーン3）。また、細胞数を10個とし、上記ブロックプライマーをCleanAmpTM Turbo Primers（TriLink社）に変更して前述の条件と同様にワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを行った結果、同様にTCRβ鎖の特異的増幅が観察された。
［試験例3］
シングルセルのマウスT細胞に、直接ワンステップで反応溶液を加え、ダイレクトワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを行った。PCRのサイクル数は56とした。
結果を図3に示す。TCRβ鎖の全長のみが増幅された細胞と、TCRβ鎖の全長及び断片が増幅された細胞が認められた。また、56回もの多サイクル数に関わらず、非特異的増幅は認められなかった。
［試験例4］
PCR増幅のサイクル数を種々変動させた（サイクル数：38、40、42及び44）。Block primer濃度は0.4μM、RT primer濃度は0.002nMとした。
結果を図4に示す（レーン1：38、レーン2：40、レーン3：42、レーン4：44）。44サイクルで、TCRβ鎖の特異的バンドが観察された。
［試験例5］
以下のTotal RNA濃度、ブロックプライマー濃度、及びRTプライマー濃度の条件で、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチングPCRを行った。PCRのサイクル数は42回とした。

結果を図5に示す。ブロックプライマーを用いないときは、スメア状の多数の非特異的なバンドが検出されたが（レーン1）、ブロックプライマーの添加により、非特異的なバンドが消失した（レーン2〜10）。比較的高いRTプライマー濃度（0.2μM）において、マイナーな非特異的バンドが残存したが、RTプライマー濃度を低下させることにより、これを抑制することができた。RTプライマーを添加しなくても、TCRβ鎖の特異的増幅が観察された（レーン10）。
[試験例6]
ワンステップ逆転写テンプレートスイッチPCRレパトア解析法にて特定のTCRα鎖およびTCRβ鎖を過剰発現する遺伝子改変マウス（Pmel-1マウス）由来リンパ球細胞のレパトア解析を行った。
試薬のリスト
-PrimeScript II HighFidelity Onestep RT-PCR kit(R026A, タカラバイオ)
-40U/uL RNasin Plus RNase Inhibitor (N2611, Promega)
-40 U/uL Cloned RNase Inhibitor (Ambion, AM2682)
-20 U/uL SUPERaseIn RNase Inhibitor (Ambion, AM2694)
-200U/uL SuperScript IV Reverse Transcriptase(18090010, Invitrogen)
-2×KAPA HiFi Hot Start Ready Mix(KK2602, 日本ジェネティクス)
-AmpureXP Agencourt(A63880, BECKMAN COULTER)
-Qubit dsDNA HS assay kit (Q32854, Thermo Fisher Scientific)
使用したオリゴヌクレオチド配列
-RT primer(30塩基): ACACGAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAA（配列番号4）
-Block primer（30塩基）: GAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAATCTC（配列番号5）
-TS-Oligo（30塩基）：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACAT[G][G](G)※（配列番号6）
※[ ]の右端から2、3番目の２塩基はRNA、（）の右端の1塩基はLNA
-Forward Tag primer v1 (63塩基)：
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG（下線部がタグ配列部位）（配列番号7）
-Reverse Tag primer v1 (63塩基)：
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAATCTC（下線部がタグ配列部位）（配列番号8）
-Index primer: Nextera XT Index Kit v2 Set A（Illumina）のN7シリーズ12種（配列番号9〜20）、S5シリーズ8種（配列番号21〜28）から選択した。
N7シリーズのプライマー中のインデックス配列は以下のとおりである。
TCGCCTTA(N701)、CTAGTACG(N702)、TTCTGCCT(N703)、GCTCAGGA(N704)、AGGAGTCC(N705)、CATGCCTA(N706)、GTAGAGAG(N707)、CAGCCTCG(N710)、TGCCTCTT(N711)、TCCTCTAC(N712)、TCATGAGC(N714)、CCTGAGAT(N715)
S5シリーズのプライマー中のインデックス配列は以下のとおりである。
CTCTCTAT(S502)、TATCCTCT(S503)、GTAAGGAG(S505)、ACTGCATA(S506)、AAGGAGTA(S507)、CTAAGCCT(S508)、CGTCTAAT(S510)、TCTCTCCG(S511)。
本試験では、N715-S505とN715-S506のインデックスの組み合わせを使用した。
(1)RNA調製
本試験において、特定のTCRα鎖およびTCRβ鎖を過剰発現する遺伝子改変マウス（Pmel-1マウス）由来のリンパ球細胞よりTotal RNAを抽出した。
(2)ワンステップ逆転写テンプレートスイッチPCR
抽出したTotal RNAを用い、以下の反応組成液にて、連続的に加熱反応-PCRサイクルを実施した。まず45℃30分の逆転写反応、続いて95℃5分のブロックプライマー活性化反応、次に98℃10秒、60℃6秒の2ステップPCR反応(44サイクル)、最後に60℃5分の最終伸長反応を行うことにより、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチPCR反応を完了した。
(3)タグPCR
以下の反応組成液にて、Miseqシークエンシングランのタグ配列を付加するため、フォワードプライマー、並びにリバースプライマーの5'末端にそれぞれ34塩基、33塩基のタグ配列を付加したDNAプライマーペア（Forward Tag primer v1とReverse Tag primer v1のペア）を用い、95℃3分、98℃20秒、65℃30秒、72℃2分の3ステップPCR反応(20サイクル、最終サイクル後に72℃2分の最終伸長反応あり)を行うことにより、タグ付加TCR cDNAアンプリコンを調製した。タグ配列は、Miseqによるシーケンシングを行うために必要な配列であり、タグ配列からシーケンシングが開始される。また、タグ配列は、インデックス配列を付加するインデックスPCRのプライミングサイトとしても機能する。
(4)インデックスPCR
以下の反応組成液にて、Miseqシークエンシングラン後のサンプル振り分け用Index配列、並びに最も5'末端側に解析基板であるフローセルに固定化するための配列(ブリッジPCRのための配列)を付加するためのPCR反応を行った。反応は95℃3分の後、95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒の3ステップPCR反応(13サイクル、最終サイクル後に72℃5分の最終伸長反応あり)を行うことにより、シークエンシングラン用のDNAサンプルを調製した。
(5)インデックスPCR反応液の電気泳動確認
インデックスPCR反応液3μlを1.5％アガロースゲル中にて30分間電気泳動し、これまでの実験工程でTCRDNAアンプリコンが増幅されていることを確認した（図6）。
(6)DNA断片の精製、濃度測定と濃度測定
反応液10μlを分取し、AmpureXP Agencourtビーズ液8μlを添加、メーカーのプロトコールに従いDNAのビーズへの結合反応、ビーズ洗浄操作を行った後、25μlの純水中に精製DNAを回収した。Qubit dsDNA HSアッセイキットにて精製したDNAの濃度を測定した。
(7)Miseqランの実施
精製DNAサンプルは4nMに希釈後、イルミナ社Miseqシークエンサーの標準プロトコールに従いシークエンシングランを行った。
(8)レパトアデータ解析
Fastq形式のシークエンシングデータをレパトアジェネシスソフトウエアにて解析した。サンプル中のV遺伝子およびJ遺伝子使用頻度グラフ（図7）、およびV-J使用頻度グラフ（図8）が得られた。また、CDR3配列(配列番号29〜33)を含めたユニークリードランキングの集計を表10に示す。
[試験例7]
C57BL/6マウス脾臓組織検体を用いてワンステップRT-TS-PCRレパトア解析を行った。
ワンステップ逆転写テンプレートスイッチPCRレパトア解析法にて脾臓のレパトア解析を行った。実験に供した検体は、C57BL/6マウス脾臓組織検体と、抗CD３抗体と抗CD28抗体刺激後48時間に回収したPmel-1マウス由来のリンパ球細胞の2種類を用いた。
試薬のリスト
-PrimeScript II HighFidelity Onestep RT-PCR kit(R026A, タカラバイオ)
-40U/uL RNasin Plus RNase Inhibitor (N2611, Promega)
-40 U/uL Cloned RNase Inhibitor (Ambion, AM2682)
-20 U/uL SUPERaseIn RNase Inhibitor (Ambion, AM2694)
-200U/uL SuperScript IV Reverse Transcriptase(18090010, Invitrogen)
-2×KAPA HiFi Hot Start Ready Mix(KK2602, 日本ジェネティクス)
-AmpureXP Agencourt(A63880, BECKMAN COULTER)
-Qubit dsDNA HS assay kit (Q32854, Thermo Fisher Scientific)
使用したオリゴヌクレオチド配列
-RT primer(30塩基):ACACGAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAA（配列番号4）
-Block primer（30塩基）:GAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAATCTC（配列番号5）
-TS-Oligo（30塩基）：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACAT[G][G](G)※（配列番号6）
※[ ]の右端から2、3番目の２塩基はRNA、（）の右端の1塩基はLNA
-Forward Tag primer v1 (63塩基)：
GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATGGG（下線部がタグ配列部位）（配列番号7）
-Reverse Tag primer v1 (63塩基)：
TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGAGGGTAGCCTTTTGTTTGTTTGCAATCTC（下線部がタグ配列部位）（配列番号8）
-Index primer: Nextera XT Index Kit v2 Set A（Illumina）のN7シリーズ12種（配列番号9〜20）、S5シリーズ8種（配列番号21〜28）から選択した。
N7シリーズのプライマー中のインデックス配列は以下のとおりである。
TCGCCTTA(N701)、CTAGTACG(N702)、TTCTGCCT(N703)、GCTCAGGA(N704)、AGGAGTCC(N705)、CATGCCTA(N706)、GTAGAGAG(N707)、CAGCCTCG(N710)、TGCCTCTT(N711)、TCCTCTAC(N712)、TCATGAGC(N714)、CCTGAGAT(N715)
S5シリーズのプライマー中のインデックス配列は以下のとおりである。
CTCTCTAT(S502)、TATCCTCT(S503)、GTAAGGAG(S505)、ACTGCATA(S506)、AAGGAGTA(S507)、CTAAGCCT(S508)、CGTCTAAT(S510)、TCTCTCCG(S511)。
本試験では、N715-S502、S503、S505、S506、S507、S508、S510またはS511のインデックスの組み合わせを使用した。
実験手順
(1)RNA調製
本試験においてTCRβレパトアを行うために、脾臓組織およびリンパ球細胞よりRNAを抽出した。
(2)ワンステップ逆転写テンプレートスイッチPCR
抽出したRNAを用い、以下の反応組成液にて、連続的に加熱反応-PCRサイクルを実施した。まず45℃30分の逆転写反応、続いて95℃5分のブロックプライマー活性化反応、次に98℃10秒、60℃6秒の2ステップPCR反応(44サイクル)、最後に60℃5分の最終伸長反応を行うことにより、ワンステップ逆転写テンプレートスイッチPCR反応を完了した。
(3)タグPCR
以下の反応組成液にて、Miseqシークエンシングランのタグ配列を付加するため、フォワードプライマー、並びにリバースプライマーの5‘末端にそれぞれ34塩基、33塩基のタグ配列を付加したDNAプライマーペア（Forward Tag primer v1とReverse Tag primer v1のペア）を用い、95℃3分、98℃20秒、65℃30秒、72℃2分の3ステップPCR反応(20サイクル、最終サイクル後に72℃2分の最終伸長反応あり)を行うことにより、タグ付加TCR cDNAアンプリコンを調製した。タグ配列は、Miseqによるシーケンシングを行うために必要な配列であり、タグ配列からシーケンシングが開始される。また、タグ配列は、インデックス配列を付加するインデックスPCRのプライミングサイトとしても機能する。
(4)インデックスPCR
以下の反応組成液にて、Miseqシークエンシングラン後のサンプル振り分け用Index配列、並びに最も5'末端側に解析基板であるフローセルに固定化するための配列(ブリッジPCRのための配列)を付加するためのPCR反応を行った。反応は95℃3分の後、95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒の3ステップPCR反応(13サイクル、最終サイクル後に72℃5分の最終伸長反応あり)を行うことにより、シークエンシングラン用のDNAサンプルを調製した。
(5)インデックスPCR反応液の電気泳動確認
インデックスPCR反応液3μlを1.5％アガロースゲル中にて30分間電気泳動し、これまでの実験工程でTCRDNAアンプリコンが増幅されていることを確認した（図9）。図9におけるレーンは、左から順に、1：マーカーDNA、2〜6：マウス脾臓組織（1000ng、200ng、40ng、8ng、1.6ng）、7〜8：Pmel-1由来リンパ球（8ng、1.6ng）、9：blankを示す。
(6)DNA断片の精製、濃度測定と濃度測定
反応液10μlを分取し、AmpureXP Agencourtビーズ液8μlを添加、メーカーのプロトコールに従いDNAのビーズへの結合反応、ビーズ洗浄操作を行った後、25μlの純水中に精製DNAを回収した。Qubit dsDNA HSアッセイキットにて精製したDNAの濃度を測定した。
(7)Miseqランの実施
精製DNAサンプルは4nMに希釈後、イルミナ社Miseqシークエンサーの標準プロトコールに従いシークエンシングランを行った。
(8)レパトアデータ解析
脾臓組織検体において得られたFastq形式のシークエンシングデータをレパトアジェネシスソフトウエアにて解析した。サンプル中のV遺伝子およびJ遺伝子使用頻度グラフ（図10）、およびV-J使用頻度グラフ（図11）が得られた。また、CDR3配列(配列番号34〜38)を含めたユニークリードランキングの集計を表14に示す。
本発明を好ましい態様を強調して説明してきたが、好ましい態様が変更され得ることは当業者にとって自明であろう。本発明は、本発明が本明細書に詳細に記載された以外の方法で実施され得ることを意図する。したがって、本発明は添付の「請求の範囲」の精神および範囲に包含されるすべての変更を含むものである。
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。本発明は、2016年6月23日に出願された日本国出願特願2016-125007号に対して優先権を主張するものであり、その内容はその全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれる。
本発明によれば、逆転写テンプレートスイッチングPCRを、高い特異性で、ワンステップで実施することが期待できる。特に、鋳型となるRNAのコピー数が少なく、PCRのサイクル数を多くした場合であっても、副反応の発生を抑制しつつ、特異的PCR産物を増幅することが期待できる。このような逆転写テンプレートスイッチングPCRの技術を利用することにより特異的に増幅された核酸試料が提供され、定量的な分析が特に必要とされる臨床応用場面において特に有用である。

Claims (24)

  1. 被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を解析する方法であって、
    (1)該被験体から得られたRNAから増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と、
    (2)該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程と、
    (3)決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のTCRもしくはBCRレパトアを導出する工程と
    を含み、
    該工程(1)は、
    a)該被験体から得られたRNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、
    b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、該複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と
    を含み、
    該テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、
    該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該TCRまたは該BCRのC領域特異的プライマーを含み、該C領域特異的プライマーは、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーである、方法。
  2. 被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を解析するための核酸試料を生産する方法であって、該方法は、(1)該被験体から得られたRNAから増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程を含み、該工程(1)は、
    a)該被験体から得られたRNAと、逆転写に必要な試薬と、テンプレートスイッチに必要な試薬と、ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬とを混合し、混合物を逆転写が生じる条件に供して、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含むcDNAを提供する工程と、
    b)該工程a)から得られたcDNAを、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、該複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と
    を含み、
    該テンプレートスイッチに必要な試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、
    該ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、該TCRまたは該BCRのC領域特異的プライマーを含み、該C領域特異的プライマーは、該工程a)においてプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、該工程b)ではプライマー機能の阻害が解除されるように設計された改変オリゴヌクレオチドプライマーである、方法。
  3. 前記核酸試料は、非バイアス的に増幅された核酸試料である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、必要に応じて、前記テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まず、前記テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドは、5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、請求項４に記載の方法。
  6. 前記逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、前記混合物中に、約40nM以下の終濃度で、または前記改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下のモル比で含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、鋳型RNAにハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. T細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域を増幅するためのキットであって、該キットは、
    i)逆転写に必要な試薬と、
    ii)テンプレートスイッチに必要な試薬と、
    iii)改変オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬と
    iv)必要に応じて、使用説明書
    を含み、
    i)〜iii)の試薬および該改変オリゴヌクレオチドプライマーが反応開始時においてすべて反応系において混合されていることを特徴とし、
    ii)の試薬は、テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドを含み、
    該改変オリゴヌクレオチドプライマーは、逆転写が生じる条件下でプライマー機能の一部又は全部が阻害されており、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件下でプライマー機能の阻害が解除されるように設計された該TCRまたは該BCRのC領域特異的プライマーである、キット。
  10. 前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記テンプレートスイッチングオリゴヌクレオチドに含まれるアンカー配列の少なくとも一部を含む5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項９に記載のキット。
  11. 前記ポリメラーゼ連鎖反応に必要な試薬は、前記5’アンカーオリゴヌクレオチドプライマーを含まない、請求項１０に記載のキット。
  12. 前記逆転写に必要な試薬は、逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーを含み、該逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーは、約40nM以下の終濃度で、または前記改変オリゴヌクレオチドプライマーに対して約10分の1以下のモル比で使用されることを特徴とする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のキット。
  13. 前記改変オリゴヌクレオチドプライマーが、同一の改変オリゴヌクレオチドプライマーの配列上に1又はそれ以上の相補領域を有し、PCRの初期熱変性処理前までは当該相補領域によって折り返し構造を取る、或いは熱不安定性修飾基を含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のキット。
  14. プライマー機能が阻害されなかった一部の改変オリゴヌクレオチドプライマーが、前記TCRまたは該BCRの鋳型RNAのC領域の部分配列にハイブリダイズすることで逆転写を開始するオリゴヌクレオチドプライマーとして機能する、請求項１３に記載のキット。
  15. 被験体から得られたRNAから非バイアス的に増幅した、複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供するためのものである、請求項９〜１４のいずれか一項に記載ｓのキット。
  16. 前記工程(1)は、配列解析のために適切な配列が付加された核酸試料を提供する工程をさらに含む、請求項１、ならびに請求項１に従属する場合の請求項３〜８に記載の方法。
  17. 前記配列解析のために適切な配列は、ブリッジPCRまたはエマルジョンPCRを使用する配列解析に適切な配列である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記工程(1)は、以下：
    c)前記工程b)のPCR増幅産物と、第1のタグ配列が付加された第2の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第2のタグ配列が付加された第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、タグ配列が付加された複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程と、
    d)前記工程c)のPCR増幅産物と、第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、インデックス配列が付加された前記複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程であって、該第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーおよび該第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、配列解析の基板に固定化するための配列およびインデックス配列が付加されている、工程と
    をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記工程(3)は、以下：
    (3-1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する工程と、
    (3-2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する工程と、
    (3-3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する工程と、
    (3-4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出する工程と、
    (3-5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類する工程と、
    (3-6)該工程(3-5)での分類に基づいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出する工程と
    を含む、請求項１８に記載の方法。
  20. データベースを用いて被験体のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の可変領域のレパトア(repertoire)を定量的に解析するためのシステムであって、該システムは、
    (1)請求項１５に記載のキット；
    (2)該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定するための装置；および
    (3)決定された該核酸配列に基づいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該被験体のTCRもしくはBCRレパトアを導出するための装置
    を備えるシステム。
  21. (1)前記キットは、以下：
    c)前記工程b)のPCR増幅産物と、第1のタグ配列が付加された第2の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第2のタグ配列が付加された第2のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、タグ配列が付加された複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する手段と、
    d)前記工程c)のPCR増幅産物と、第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーと、第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーとを含む混合物を、ポリメラーゼ連鎖反応が生じる条件に供して、インデックス配列が付加された前記複数種類のT細胞レセプター(TCR)またはB細胞レセプター(BCR)の核酸配列を含む核酸試料を提供する手段であって、該第3の5'アンカーオリゴヌクレオチドプライマーおよび該第3のTCRまたはBCRのC領域特異的プライマーは、配列解析の基板に固定化するための配列およびインデックス配列が付加されている、手段と
    をさらに含む、請求項２０に記載のシステム。
  22. (3)前記TCRもしくはBCRレパトアの導出のための装置は、以下：
    (3-1)V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の少なくとも１つを含む遺伝子領域ごとの参照データベースを提供する手段；
    (3-2)必要に応じてトリミングを行い、必要に応じて適切な長さのものを抽出した入力配列セットを提供する手段；
    (3-3)該入力配列セットについて、該遺伝子領域ごとに、該参照データベースと相同性検索を行い、近似する参照アリルおよび／または該参照アリルの配列とのアラインメントを記録する手段；
    (3-4)該入力配列セットについてV領域およびJ領域をアサインし、アサイン結果に基づいて、D領域の核酸配列を抽出する手段；
    (3-5)該D領域の核酸配列をアミノ酸配列に翻訳し、該アミノ酸配列を利用してD領域を分類する手段；および
    (3-6)該工程(3-5)での分類に基づいて、V領域、D領域、J領域および必要に応じてC領域の各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、TCRもしくはBCRレパトアを導出する手段
    を備える、請求項２０または２１に記載のシステム。
  23. 請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のシステムと、該システムに基づいて導出されたTCRもしくはBCRレパトアに基づいて前記被験者の疾患、障害または状態を分析する手段とを備える、被験者の疾患、障害または状態を分析するためのシステム。
  24. 請求項２３に記載のシステムで決定された被験者の疾患、障害または状態と、前記TCRもしくはBCRレパトアとを定量的に関連付ける手段、および該定量的な関連から、適切な処置または予防のための手段を選択する手段とを備える、該被験者の疾患、障害または状態を処置または予防するためのシステム。

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