JP2021501318A - 疲弊したt細胞に関連する疾患を治療するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、全体が引用によりそれぞれ本明細書に組み込まれる、2017年10月27日に提出された米国仮出願第62/578,193号、2017年10月27日に提出された米国仮出願第62/578,212号、2018年4月20日に提出された米国仮出願第62/660,754号、および2018年4月23日に提出された米国仮出願第62/661,467号の優先権を主張する。
この発明は、国立衛生研究所(NIH)から授与された助成金番号AI105343およびAI082630に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に所定の権利を有する。
T細胞機能不全の獲得状態であるT細胞疲弊(T cell exhaustion)は、癌および慢性ウイルス感染の特徴である(Wherry et al. (2007) Immunity 27:670-684(非特許文献1); Zajac et al. (1998) J. Exp. Med. 188:2205-2213(非特許文献2))。近年、癌におけるT細胞疲弊を逆転させるための処置が著しく効果的であることが証明されている(Barber et al. (2006) Nature 439:682-687(非特許文献3); Topalian et al. (2012) New Engl. J. Med. 366:2443-2454(非特許文献4))。キメラ抗原受容体(CAR)−T細胞療法も、血液悪性腫瘍に対して極めて効果的であることが証明されている(Porter et al. (2011) New Engl. J. Med. 365:725-733(非特許文献5))が、固形腫瘍を治療するための操作されたT細胞における疲弊の開発は、その広範な使用に対する重要な障壁のままである(Long et al. (2015) Nat. Med. 21:581-590(非特許文献6))。T細胞疲弊を調節するメカニズムを同定することは、免疫チェックポイント遮断および癌免疫治療のための養子T細胞療法の有効性を改善することができるであろう(Barber et al. (2006) Nature 439:682-687(非特許文献3); Topalian et al. (2012) New Engl. J. Med. 366:2443-2454(非特許文献4); Porter et al. (2011) New Engl. J. Med. 365:725-733(非特許文献5))。
疾患を有する対象において疾患状態に特徴的な疲弊した(exhausted)T細胞(TEX)集団を同定する方法を供する。その方法は、
(a)対象からのT細胞を含む試料を得る段階と、
(b)前記疾患を有する対象からのT細胞において、1つまたは複数のT細胞系統特異的マーカーまたはT細胞系統特異的マーカーの組み合わせ、および1つまたは複数のT細胞疲弊特異的(TEX)マーカーまたはTEX特異的マーカーの組み合わせ、を含むマーカーのパネルの発現を測定する段階と、
(c)該マーカーのパネルの発現を、T細胞を含む対照試料におけるマーカーの同じパネルの発現と比較する段階と、
(d)前記疾患に特徴的な1つまたは複数のTEX集団を同定する段階であって、該疾患に特徴的なTEX集団が、T細胞を含む対照試料中のマーカーのパネルにおける同じ1つまたは複数のマーカーを発現するTEX細胞の数と比較して、前記疾患を有する対象からのT細胞におけるマーカーのパネルにおける1つまたは複数のマーカーの発現が上方制御または下方制御されている、より多数のTEX細胞を含む、段階と、
を含む。
(a)PD-1+/CD39+、CD38+/CD39+、GzmK+、TIGIT+、TCF1+、2B4+、CD160+、CD7、Helios、CD103、Ptger2+、CTLA-4+、Tim-3+、LAG-3+;
(b)PD-1+、CD160+、TIGIT+、2B4+、CXCR5+、GzmK+、CD27+、TCF1+;
(c)CD38+/CD39+、CD16+、CXCR5+、Helios+、PD-1+/CD39+、CTLA-4-、2B4-、TIGIT-、CD160-、CD7+、Ptger2+;
(d)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、CD16+、Perforin+、CD57+、CD38+/CD39-、T-bet+、GzmK-;
(e)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、GzmK+;
(f)PD-1+、PD-1+/CD39+、CD39+、Ki67+、CD38+/CD39+、CTLA-4+、CD103+、CD200R+、Tim-3+、Lag-3+、CD28+;
(g)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、CD38+、GzmK+、Ki67+、HLA-DR+、CXCR5+、PD-1+/CD39+;
(h)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、GzmK-;
(i)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Helios+、CD16+、Perforin+、CD57+、PD-1++、Ki67;
(j)TIGIT+、Eomes+、GzmB-、CD160+、2B4+、T-bet+、Toxint; および
(k)TIGIT+、Eomes+、GzmB+、CD160+、2B4+、T-bet+、Tox+、CD16+、CD57+、Perforin+
からなる群から選択されるマーカーのセットを含み、ここで、該マーカーまたはマーカーの組み合わせの発現は、増加した発現を示す(+)、(++)、または(+++)、中間の発現を示す(int)、および、減少した発現を示す(-)を用いる手動のゲーティングによって評価される。
(a)対象からのT細胞を含む試料を得る段階と、
(b)前記疾患を有する対象からのT細胞において、1つまたは複数のT細胞系統特異的マーカーまたはT細胞系統特異的マーカーの組み合わせ、および1つまたは複数のTEX特異的マーカーまたはTEX特異的マーカーの組み合わせ、を含むマーカーのパネルの発現を測定する段階と、
(c)該マーカーのパネルの発現を、T細胞を含む対照試料におけるマーカーの同じパネルの発現と比較する段階と、
(d)疾患に特徴的な1つまたは複数のT細胞集団を同定する段階であって、該疾患に特徴的なT細胞集団が、T細胞を含む対照試料において同じ1つまたは複数のマーカーを発現するT細胞の数と比較して、疾患を有する対象からのT細胞におけるパネルにおける1つまたは複数のマーカーの発現が上方制御または下方制御されている、より多数のT細胞を含む、段階と、
を含む。
(a)PD-1+/CD39+、CD38+/CD39+、GzmK+、TIGIT+、TCF1+、2B4+、CD160+、CD7、Helios、CD103、Ptger2+、CTLA-4+、Tim-3+、LAG-3+;
(b)PD-1+、CD160+、TIGIT+、2B4+、CXCR5+、GzmK+、CD27+、TCF1+;
(c)CD38+/CD39+、CD16+、CXCR5+、Helios+、PD-1+/CD39+、CTLA-4-、2B4-、TIGIT-、CD160-、CD7+、Ptger2+;
(d)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、CD16+、Perforin+、CD57+、CD38+/CD39-、T-bet+、GzmK-;
(e)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、GzmK+;
(f)PD-1+、PD-1+/CD39+、CD39+、Ki67+、CD38+/CD39+、CTLA-4+、CD103+、CD200R+、Tim-3+、Lag-3+、CD28+;
(g)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、CD38+、GzmK+、Ki67+、HLA-DR+、CXCR5+、PD-1+/CD39+;
(h)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、GzmK-;
(i)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Helios+、CD16+、Perforin+、CD57+、PD-1++、Ki67;
(j)TIGIT+、Eomes+、GzmB-、CD160+、2B4+、T-bet+、Toxint; および
(k)TIGIT+、Eomes+、GzmB+、CD160+、2B4+、T-bet+、Tox+、CD16+、CD57+、Perforin+
からなる群から選択されるマーカーのセットを含み、ここで、該マーカーまたはマーカーの組み合わせの発現は、増加した発現を示す(+)、(++)、または(+++)、中間の発現を示す(int)、および、減少した発現を示す(-)を用いる手動のゲーティングによって評価される。
(a)対象からのT細胞を含む試料を得る段階と、
(b)前記疾患を有する対象からのT細胞において、1つまたは複数のT細胞系統特異的マーカーまたはT細胞系統特異的マーカーの組み合わせ、および、1つまたは複数のT細胞疲弊特異的(TEX)マーカーまたはTEX特異的マーカーの組み合わせ、を含むマーカーのパネルの発現を測定する段階と、
(c)該マーカーのパネルの発現を、T細胞を含む対照試料におけるマーカーの同じパネルの発現と比較する段階と、
(d)前記疾患に特徴的な1つまたは複数のTEX集団を同定する段階であって、該疾患に特徴的なTEX集団が、T細胞を含む対照試料中のマーカーのパネルにおける同じ1つまたは複数のマーカーを発現するTEX細胞の数と比較して、前記疾患を有する対象からのT細胞におけるマーカーのパネルにおける1つまたは複数のマーカーの発現が上方制御または下方制御されている、より多数のTEX細胞を含む、段階と、
(e)段階(a)、(b)、(c)、および(d)を1つまたは複数の後続の時点で繰り返す段階と、
(f)前記対象からのT細胞を含む第2の試料または後の試料が、該対象からのT細胞を含む第1の試料または前の試料より、前記疾患に特徴的なTEX集団においてより多数の細胞を含む場合に、疾患が進行していることを決定する段階と、
(g)前記対象からのT細胞を含む第2の試料または後の試料が、該対象からのT細胞を含む第1の試料または前の試料より、前記疾患に特徴的なTEX集団においてより少数の細胞を含む場合に、疾患が進行していないことを決定する段階と、
を含む。
(a)PD-1+/CD39+、CD38+/CD39+、GzmK+、TIGIT+、TCF1+、2B4+、CD160+、CD7+、Helios+、CD103+、Ptger2+、CTLA-4+、Tim-3+、およびLAG-3+;
(b)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、CD16+、Perforin+、CD57+、CD38+/CD39-、T-bet+、およびGzmK-;
(c)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Helios+、CD16+、Perforin+、CD57+、PD-1++、Ki67;
(d)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、CD38+、GzmK+、Ki67+、HLA-DR+、CXCR5+、および PD-1+/CD39+
からなる群から選択されるTEX細胞の1つまたは複数の疾患関連集団(DAT)の特徴を示す、T細胞系統特異的マーカーまたはT細胞系統特異的マーカーの組み合わせ、および、TEX特異的マーカーまたはTEX特異的マーカーの組み合わせ、を含み、かつ、
前記マーカーのパネルが、少なくとも1セットの、
(e)TIGIT+、Eomes+、GzmB+、CD160+、2B4+、T-bet+、Tox+、CD16+、CD57+、Perforin+;
(f)PD-1+、CD160+、TIGIT+、2B4+、CXCR5+、GzmK+、CD27+、TCF1+; および
(g)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、GzmK+.
からなる群から選択されるTEX細胞の1つまたは複数の健康関連集団(HAT)の特徴を示す、T細胞系統特異的マーカーまたはT細胞系統特異的マーカーの組み合わせ、および、TEX特異的マーカーまたはTEX特異的マーカーの組み合わせ、をさらに含む。
(a)対象からのT細胞を含む試料を得る段階と、
(b)該T細胞を刺激または活性化する段階と、
(c)T細胞による、IFNγ、TNFα、IL-2、IL-10、IL-21、CCL3、CCL4、XCL1、およびアンフィレギュリンからなる群から選択される1つまたは複数のサイトカインおよび1つまたは複数のケモカインの生産を測定する段階と、
(d)次式:
FES=[(2×(%IFN+TNF-)-(%IFN-TNF+)-(%IL-2+))×(%CCL3/4+)]
(式中、「%IFN+TNF-」は、TNFαではなくIFNγを産生するT細胞の割合(%)を示し、「%IFN-TNF+」は、IFNγではなくTNFαを産生するT細胞の割合(%)を示し、「%IL-2+」は、IL-2を産生するT細胞の割合(%)を示し、「%CCL3/4+」は、CCL3および/またはCCL4を産生する細胞の割合(%)を示す)
のとおり機能疲弊スコア(FES)を計算する段階と、
(e)対象のT細胞の疲弊状態を決定する段階であって、FES> 0は対象のT細胞が疲弊していることを示し、FESが高いほど対象のT細胞の疲弊の程度が増加していることを示す、段階と、
を含む。
(a)前記対象からのT細胞を含む試料を得る段階と、
(b)上記の方法により該対象のT細胞の疲弊状態を決定する段階と、
(c)段階(a)および(b)を1つまたは複数の後続の時点で繰り返す段階と、
(d)前記対象からのT細胞を含む第2の試料または後の試料が、該対象からのT細胞を含む第1の試料または前の試料と比較して増加したFESを含む場合に、疾患が進行していることを決定する段階、または
(e)前記対象からのT細胞を含む第2の試料または後の試料が、該対象からのT細胞を含む第1の試料または前の試料と比較して減少したFESを含む場合に、疾患が進行していないと決定する段階と、
を含む。
定義
別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の試験のための実施に用いることができるが、好ましい材料および方法が本明細書に記載される。本発明の説明および請求において、以下の用語が使用される。
本開示は、疾患を有する患者において疲弊したT細胞を検出および追跡するための方法を供する。本開示はまた、疾患を有する患者を治療するための方法も供する。本開示はまた、疾患を有する患者のための治療における変更を決定するための方法も供する。特定の実施形態では、疾患は腫瘍である。特定の実施形態では、疾患は癌である。特定の実施形態では、疾患は感染性疾患である。
(d)対象からのT細胞を含む試料を得る段階と、
(e)前記疾患を有する対象からのT細胞において、1つまたは複数のT細胞系統特異的マーカーまたはT細胞系統特異的マーカーの組み合わせ、および1つまたは複数のT細胞疲弊特異的(TEX)マーカーまたはTEX特異的マーカーの組み合わせ、を含むマーカーのパネルの発現を測定する段階と、
(f)該マーカーのパネルの発現を、T細胞を含む対照試料におけるマーカーの同じパネルの発現と比較する段階と、
(g)前記疾患に特徴的な1つまたは複数のTEX集団を同定する段階であって、該疾患に特徴的なTEX集団が、T細胞を含む対照試料中のマーカーのパネルにおける同じ1つまたは複数のマーカーを発現するTEX細胞の数と比較して、前記疾患を有する対象からのT細胞におけるマーカーのパネルにおける1つまたは複数のマーカーの発現が上方制御または下方制御されている、より多数のTEX細胞を含む、段階と、
を含む。
(l)PD-1+/CD39+、CD38+/CD39+、GzmK+、TIGIT+、TCF1+、2B4+、CD160+、CD7、Helios、CD103、Ptger2+、CTLA-4+、Tim-3+、LAG-3+;
(m)PD-1+、CD160+、TIGIT+、2B4+、CXCR5+、GzmK+、CD27+、TCF1+;
(n)CD38+/CD39+、CD16+、CXCR5+、Helios+、PD-1+/CD39+、CTLA-4-、2B4-、 TIGIT-、CD160-、CD7+、Ptger2+;
(o)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、CD16+、Perforin+、CD57+、CD38+/CD39-、T-bet+、GzmK-;
(p)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、GzmK+;
(q)PD-1+、PD-1+/CD39+、CD39+、Ki67+、CD38+/CD39+、CTLA-4+、CD103+、CD200R+、Tim-3+、Lag-3+、CD28+;
(r)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、CD38+、GzmK+、Ki67+、HLA-DR+、CXCR5+、PD-1+/CD39+;
(s)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、GzmK-;
(t)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Helios+、CD16+、Perforin+、CD57+、PD-1++、Ki67;
(u)TIGIT+、Eomes+、GzmB-、CD160+、2B4+、T-bet+、Toxint; および
(v)TIGIT+、Eomes+、GzmB+、CD160+、2B4+、T-bet+、Tox+、CD16+、CD57+、Perforin+;
からなる群から選択されるマーカーのセットを含み、ここで、該マーカーまたはマーカーの組み合わせの発現は、増加した発現を示す(+)、(++)、または(+++)、中間の発現を示す(int)、および、減少した発現を示す(-)を用いる手動のゲーティングによって評価される。
(d)対象からのT細胞を含む試料を得る段階と、
(e)前記疾患を有する対象からのT細胞において、1つまたは複数のT細胞系統特異的マーカーまたはT細胞系統特異的マーカーの組み合わせ、および1つまたは複数のTEX特異的マーカーまたはTEX特異的マーカーの組み合わせ、を含むマーカーのパネルの発現を測定する段階と、
(f)該マーカーのパネルの発現を、T細胞を含む対照試料におけるマーカーの同じパネルの発現と比較する段階と、
(g)疾患に特徴的な1つまたは複数のT細胞集団を同定する段階であって、該疾患に特徴的なT細胞集団が、T細胞を含む対照試料において同じ1つまたは複数のマーカーを発現するT細胞の数と比較して、疾患を有する対象からのT細胞におけるパネルにおける1つまたは複数のマーカーの発現が上方制御または下方制御されている、より多数のT細胞を含む、段階と、
を含む。
(l)PD-1+/CD39+、CD38+/CD39+、GzmK+、TIGIT+、TCF1+、2B4+、CD160+、CD7、Helios、CD103、Ptger2+、CTLA-4+、Tim-3+、LAG-3+;
(m)PD-1+、CD160+、TIGIT+、2B4+、CXCR5+、GzmK+、CD27+、TCF1+;
(n)CD38+/CD39+、CD16+、CXCR5+、Helios+、PD-1+/CD39+、CTLA-4-、2B4-、TIGIT-、CD160-、CD7+、Ptger2+;
(o) PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、CD16+、Perforin+、CD57+、CD38+/CD39-、T-bet+、GzmK-;
(p)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、GzmK+;
(q)PD-1+、PD-1+/CD39+、CD39+、Ki67+、CD38+/CD39+、CTLA-4+、CD103+、CD200R+、Tim-3+、Lag-3+、CD28+;
(r)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、CD38+、GzmK+、Ki67+、HLA-DR+、CXCR5+、PD-1+/CD39+;
(s)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、GzmK-;
(t)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Helios+、CD16+、Perforin+、CD57+、PD-1++、Ki67;
(u)TIGIT+、Eomes+、GzmB-、CD160+、2B4+、T-bet+、Toxint; および
(v)TIGIT+、Eomes+、GzmB+、CD160+、2B4+、T-bet+、Tox+、CD16+、CD57+、Perforin+;
からなる群から選択されるマーカーのセットを含み、ここで、該マーカーまたはマーカーの組み合わせの発現は、増加した発現を示す(+)、(++)、または(+++)、中間の発現を示す(int)、および、減少した発現を示す(-)を用いる手動のゲーティングによって評価される。
(g)対象からのT細胞を含む試料を得る段階と、
(h)前記疾患を有する対象からのT細胞において、1つまたは複数のT細胞系統特異的マーカーまたはT細胞系統特異的マーカーの組み合わせ、および、1つまたは複数のT細胞疲弊特異的(TEX)マーカーまたはTEX特異的マーカーの組み合わせ、を含むマーカーのパネルの発現を測定する段階と、
(i)該マーカーのパネルの発現を、T細胞を含む対照試料におけるマーカーの同じパネルの発現と比較する段階と、
(j)前記疾患に特徴的な1つまたは複数のTEX集団を同定する段階であって、該疾患に特徴的なTEX集団が、T細胞を含む対照試料中のマーカーのパネルにおける同じ1つまたは複数のマーカーを発現するTEX細胞の数と比較して、前記疾患を有する対象からのT細胞におけるマーカーのパネルにおける1つまたは複数のマーカーの発現が上方制御または下方制御されている、より多数のTEX細胞を含む、段階と、
(k)段階(a)、(b)、(c)、および(d)を1つまたは複数の後続の時点で繰り返す段階と、
(l)前記対象からのT細胞を含む第2の試料または後の試料が、該対象からのT細胞を含む第1の試料または前の試料より、前記疾患に特徴的なTEX集団においてより多数の細胞を含む場合に、疾患が進行していることを決定する段階と、
(m)前記対象からのT細胞を含む第2の試料または後の試料が、該対象からのT細胞を含む第1の試料または前の試料より、前記疾患に特徴的なTEX集団においてより少数の細胞を含む場合に、疾患が進行していないことを決定する段階と、
を含む。
(g)PD-1+/CD39+、CD38+/CD39+、GzmK+、TIGIT+、TCF1+、2B4+、CD160+、CD7+、Helios+、CD103+、Ptger2+、CTLA-4+、Tim-3+、およびLAG-3+;
(h)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、CD16+、Perforin+、CD57+、CD38+/CD39-、T-bet+、およびGzmK-;
(i)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Helios+、CD16+、Perforin+、CD57+、PD-1++、Ki67;
(j)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、CD38+、GzmK+、Ki67+、HLA-DR+、CXCR5+、および PD-1+/CD39+;
からなる群から選択されるTEX細胞の1つまたは複数の疾患関連集団(DAT)の特徴を示す、T細胞系統特異的マーカーまたはT細胞系統特異的マーカーの組み合わせ、および、TEX特異的マーカーまたはTEX特異的マーカーの組み合わせ、を含み、かつ、
前記マーカーのパネルが、少なくとも1セットの、
(k)TIGIT+、Eomes+、GzmB+、CD160+、2B4+、T-bet+、Tox+、CD16+、CD57+、Perforin+;
(l)PD-1+、CD160+、TIGIT+、2B4+、CXCR5+、GzmK+、CD27+、TCF1+;および
(m)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、GzmK+.
からなる群から選択されるTEX細胞の1つまたは複数の健康関連集団(HAT)の特徴を示す、T細胞系統特異的マーカーまたはT細胞系統特異的マーカーの組み合わせ、および、TEX特異的マーカーまたはTEX特異的マーカーの組み合わせ、をさらに含む。
(e)対象からのT細胞を含む試料を得る段階と、
(f)該T細胞を刺激または活性化する段階と、
(g)T細胞による、IFNγ、TNFα、IL-2、IL-10、IL-21、CCL3、CCL4、XCL1、およびアンフィレギュリンからなる群から選択される1つまたは複数のサイトカインおよび1つまたは複数のケモカインの生産を測定する段階と、
(h)次式:
FES=[(2×(%IFN+TNF-)-(%IFN-TNF+)-(%IL-2+))×(%CCL3/4+)]
(式中、「%IFN+TNF-」は、TNFαではなくIFNγを産生するT細胞の割合(%)を示し、「%IFN-TNF+」は、IFNγではなくTNFαを産生するT細胞の割合(%)を示し、「%IL-2+」は、IL-2を産生するT細胞の割合(%)を示し、「%CCL3/4+」は、CCL3および/またはCCL4を産生する細胞の割合(%)を示す)
のとおり機能疲弊スコア(FES)を計算する段階と、
(e)対象のT細胞の疲弊状態を決定する段階であって、FES> 0は対象のT細胞が疲弊していることを示し、FESが高いほど対象のT細胞の疲弊の程度が増加していることを示す、段階と、
を含む。
(f)前記対象からのT細胞を含む試料を得る段階と、
(g)上記の方法により該対象のT細胞の疲弊状態を決定する段階と、
(h)段階(a)および(b)を1つまたは複数の後続の時点で繰り返す段階と、
(i)前記対象からのT細胞を含む第2の試料または後の試料が、該対象からのT細胞を含む第1の試料または前の試料と比較して増加したFESを含む場合に、疾患が進行していることを決定する段階、または
(j)前記対象からのT細胞を含む第2の試料または後の試料が、該対象からのT細胞を含む第1の試料または前の試料と比較して減少したFESを含む場合に、疾患が進行していないと決定する段階と、
を含む。
特定の実施形態において、疾患は、癌、ウイルス感染症、細菌感染症、および寄生体感染症からなる群から選択される。さらなる実施形態において、ウイルス感染症は、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、アネロウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、およびインフルエンザウイルスからなる群から選択される。特定の実施形態において、疾患は、結核菌(MTB)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、大腸菌(Escherichia coli)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、およびコレラ菌(Vibrio cholera)からなる群から選択される細菌感染症である。特定の実施形態において、癌は、免疫チェックポイント阻害剤での処置に対して応答性である。さらなる実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤での処置に対して応答性である癌は、切除不能な黒色腫、転移性黒色腫、ステージIII黒色腫、転移性非小細胞肺癌(NSCLC)、NSCLC、頭頸部の再発性扁平上皮がん(SCCHN)、転移性腎細胞がん(RCC)、尿路上皮がん、肝細胞がん(HCC)、膀胱がん、結腸直腸がん、卵巣がん、および内皮がんからなる群から選択される。
特定の実施形態では、T細胞は、ホルボール12−ミリステート13−アセテート(PMA)およびイオノマイシンで刺激および/または活性化され得る。さらなる実施形態では、T細胞は、モネンシンおよびブレフェルジンA(BFA)の存在下で、PMAおよびイオノマイシンで刺激および/または活性化される。T細胞を刺激および/または活性化する方法は当技術分野で知られている。細胞分泌経路を介したタンパク質輸送を阻害するブレフェルジンA(「BFA」)および/またはモネンシンの存在下で活性化ステップを実行することにより、サイトカインタンパク質が細胞に蓄積し、検出することができる。
本開示は、T細胞の集団におけるエンハンサーの状態を同定するための方法を供する。本開示はまた、患者からのT細胞の集団におけるエンハンサー状態を同定する段階、および本開示の操作されたT細胞を患者に投与する段階を含む、疾患を有する患者を治療する方法を供する。細胞のエンハンサーの状態とは、細胞のエピゲノム内のエンハンサーがオープンクロマチン領域(OCR)にあり、それゆえ潜在的に活性であることを同定することを指す。特定の実施形態では、細胞のエンハンサー状態は、疲弊した、ナイーブ、エフェクターまたはメモリーT細胞を規定する、オープンおよびクローズのクロマチン領域の特定のパターンを指す。
本明細書に記載される場合、エピジェネティック経路は、細胞の「エピゲノム」またはエピゲノム状態に寄与する成分の任意の組み合わせを含む。
本開示は、患者において疾患を治療する方法を提供する。その方法は、操作されたT細胞を患者に投与する段階を含み、ここで、その操作されたT細胞は、1つまたは複数の高優先エピジェネティック経路において1つまたは複数の変更を含む。特定の実施形態では、その変更は、ゲノム工学アプローチを介して導入された遺伝子改変、またはエピジェネティックレギュレーターの阻害剤もしくは活性化剤を用いるエピジェネティックな改変を含む。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路は、T細胞の疲弊を逆転または防止するために標的とされるか、または標的とされている。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路は、ゲノム工学により、たとえば、エピジェネティック経路の遺伝子をノックアウト/インすることによって、またはエピジェネティック経路の遺伝子をコードするタンパク質の機能を変更することによって、標的にされている。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路は、エピジェネティック経路を改変する薬物を患者に投与することによって標的化される。特定の実施形態では、高優先度のエピジェネティック経路は、エピジェネティックレギュレーターの発現を制御する位置において非コーディングゲノムの遺伝子工学によって標的とされる。たとえば、遺伝子の発現パターンを変化させるであろう欠失または改変され得る疲弊のエピジェネティックレギュレーターの遺伝子座においてオープンである疲弊特異的エンハンサーがある。特定の実施形態では、遺伝子は、疲弊の主要なエピジェネティックレギュレーターであるToxであり、遺伝子座はTox遺伝子座である。
特定の実施形態では、エピジェネティック経路に関連する標的、または本明細書で使用する場合の「エピジェネティック標的」は、以下にさらに記載されるように、剤により、またはCRISPR/Cas9ターゲティングを介したゲノム工学により、細胞内で標的化される。特定の実施形態では、エピジェネティック標的は、Tet酵素(たとえば、Tet1、Tet2)、HDAC、Tox、Tox2、Csprs、Drud1、Sfmbt1、Chd9、Suv39h2、Sap30L、Hmgn3、BAZ2b、Prmt6、SET、Ruvbl1/2、DPY30、MLLタンパク質、Ezh1/2、PRC複合体、CBP、BET、および/またはp300である。特定の実施形態では、エピジェネティック標的は、任意のヒストンアセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ、メチラーゼ、またはデメチラーゼ、または任意の他のエピジェネティック修飾酵素またはクロマチン修飾酵素であり得る。特定の実施形態では、エピジェネティック標的は、エピジェネティックパターンを調節することができる酵素または細胞内タンパク質である。特定の実施形態では、エピジェネティックな標的は、下流のエピジェネティックな経路を調節する細胞表面タンパク質である。特定の実施形態では、エピジェネティックな標的は、
のうちの少なくとも1つである。特定の実施形態において、細胞はT細胞である。特定の実施形態において、細胞は疲弊T細胞である。
エピゲノムは、転写因子が機能するコンテキストを供する。グローバルなエピジェネティックな景観情報は、疲弊したT細胞について、以前には存在しなかったが、(PD1をエンコードする)Pdcd1遺伝子座の研究は有益であった。急性的に解決されたLCMV感染におけるPdcd1プロモーター領域の分析は、これらの領域がエフェクター・フェーズにおいて広く脱メチル化され、後に、感染が解決されてCD8+ T細胞メモリーが形成されるにつれて再メチル化されることを示しました。対照的に、慢性LCMV感染においてPdcd1遺伝子座は完全に脱メチル化され、ウイルスタイターおよび疲弊CD8+ T細胞によるPD1タンパク質発現が減少した場合でも、再メチル化は観察されなかった(Youngblood et al. Immunity. 2011, 35(3):400-12)。十分に制御されたHIV感染を調べた研究でも同様のデータが得られた(Youngblood et al. J Immunol. 2013, 191(2):540-4133)。本開示は、CD8+ T細胞疲弊における遺伝子発現のエピジェネティック調節が疲弊を防止または逆転できることを教示し、エピゲノムにおける疲弊の耐久性のある痕跡(imprint)の証拠を供する。
である。
特定の実施形態では、本発明は、癌または感染性疾患などの疾患を有する患者において免疫応答の増加に寄与する変化したエピゲノムを有するように操作された細胞(たとえば、T細胞)を供する。特定の実施形態では、本開示の操作されたT細胞は、高優先度エピジェネティック経路の変化を含む。特定の実施形態では、T細胞は、疲弊したT細胞(TEX)である。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路が標的化される。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路を標的とすることにより、T細胞の疲弊を防止または逆転させる。エピジェネティック経路の標的化(ターゲティング)により、Tox、SETタンパク質、RuvBl1タンパク質、RuvBl2タンパク質、DPY30タンパク質、Tox2、Suv39h2、Csprs、Sfmbt1、Hmgn3、Chd9、Rnf2、Ikzf3、Kmt2e、Satb1、Tet1、Tet2、Tet3、Kdm5b、Sfmbt2、Actr6、およびPrmt7のうちの少なくとも1つの発現における1つまたは複数の変化を生じさせることができる。特定の実施形態では、エピジェネティック経路は、薬物またはCRISPR/Cas9ターゲティングを介するゲノム工学を用いてターゲティングされる。
疲弊したT細胞は、ナイーブ、エフェクター、および/またはメモリーT細胞と比較して、独特のエピゲノムを有する。この独特のエピゲノムは、本明細書では「エピゲノムのシグネチャ」と呼ぶ。エピゲノムのシグネチャは、TEXにおいてユニークに表現される遺伝子のシグネチャを含む。
のうちの少なくとも1つを含む。
のうちの少なくとも1つを含む。TEXに特異的な転写およびエピジェネティックな変化の異種間同定を組み合わせた新規のアプローチを用いた。マウスのリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)モデルにおいて、正規T細胞集団(ナイーブ、エフェクター、メモリーT細胞)と比較してTEXにおいて特異的に上方制御される遺伝子を同定した。この遺伝子のセットの中で、オープンクロマチン領域内でユニークなTEX特異的エピジェネティック変化を有するサブセットを、ATAC-seq分析に基づいてさらに選択した(Pauken et al 2016 Science)。エピジェネティックに選択された遺伝子は、シグネチャ富化のリーディングエッジで典型的に蓄積する他のデータセットで富化を駆動するため、このシグネチャは、以前の疲弊シグネチャよりも優れる。
本明細書で使用される場合、「エピゲノムアッセイ」は、細胞、たとえば、T細胞、たとえば、疲弊したT細胞のエピゲノムのエピゲノムシグネチャを同定することができるものである。本明細書で使用される「エピゲノム的(エピゲノミック)に選択された」とは、比較トランスクリプトミクスの組み合わせを用いて疲弊T細胞の高度に特異的な転写シグネチャを導き出し、その遺伝子セットをエピジェネティックデータを介してフィルタリングして、疲弊T細胞によって特異的に発現された、疲弊特異的なエピジェネティックな変化を有する遺伝子を選択する場合である。エピゲノム的に選択された遺伝子セットは、高パラメーターマスサイトメトリーパネルを含むエピゲノムアッセイを生成するために用いられる。特定の実施形態では、エピゲノムアッセイは、サイトメトリーアッセイ、たとえば、マスサイトメトリーアッセイである。特定の実施形態では、サイトメトリーアッセイは、高パラメーター(たとえば、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、または 130パラメーター)サイトメトリーアッセイである。特定の実施形態では、高パラメーターサイトメトリーアッセイは、45パラメーターサイトメトリーアッセイである。特定の実施形態では、高パラメーターサイトメトリーアッセイは、30パラメーターサイトメトリーアッセイである。
プロテオミクスはタンパク質の大規模研究である。プロテオームは、生物またはシステムによって生産または改変されるタンパク質のセット全体である。プロテオミクスは一般にタンパク質の大規模な実験分析を指すが、タンパク質の精製および質量分析のためにしばしば特に用いられる。「プロテオミクス同定」という用語は、タンパク質の同定を指す。タンパク質は、たとえば、マスサイトメトリーなどのさまざまな技術を用いて同定される。
クロマチンアクセス可能な領域は、分子および調節要素、たとえば、転写因子、酵素、たとえば、クロマチン修飾酵素などにアクセスできる細胞内のクロマチンの領域である。クロマチンアクセス可能な領域内には、クロマチンアクセス可能なゲノム遺伝子調節領域、たとえば、エンハンサーおよび/またはサプレッサーがある。
T細胞のエンハンサー状態を決定するために、オープンクロマチン領域を調べた。細胞のエンハンサー状態とは、細胞のエピゲノム内のエンハンサーがオープンクロマチン領域(OCR)にあり、それゆえ他のタンパク質にアクセスできることを指す。
本明細書では、エピジェネティック/エピゲノム的状態、エンハンサー状態、および治療的調節を調査するために、エンハンサー開放性PCRアッセイを用いる。アッセイは次のステップで構成される:末梢血単離;CD8+ T細胞富化;細胞溶解;クロマチン放出;転位反応およびライブラリー生成;プライマーのテストおよび選択のための関連OCRライブラリの編集;サンプルOCRのqPCR読み出し;および複数の並列qPCRまたはアレイベースのプラットフォームによるハイスループットテスト:疾患の存在/不在、疾患の重症度、および/または治療への応答に関連するCD8+ T細胞の変化に関連するオープンまたはクローズのOCR状態。
T細胞の疲弊は、通常、エフェクター機能の進行的および階層的喪失、複数の抑制性受容体の持続的なアップレギュレーションおよび同時発現、主要な転写因子の発現およびと使用の変化、代謝攪乱、ならびに静止状態への移行の失敗など、いくつかの特徴的な機能を伴って顕在化し、抗原非依存性のメモリーT細胞恒常性応答を獲得する。T細胞の疲弊は、マウスにおける慢性ウイルス感染において最初に記述されたが、それは、HIVおよびC型肝炎ウイルス(HCV)などの感染中のヒトにおいて、ならびに癌においても観察されている。重要なことに、T細胞の疲弊は感染症および腫瘍の最適な制御を妨げるが、たとえばプログラムされた細胞死タンパク質1(PD1)および細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA4)を標的とすることにより、疲弊において過剰発現される経路を調節することにより、この機能不全の状態を逆転させ、免疫応答を再活化(reinvigorate)することできることである。しかしながら、これらの免疫応答は患者においてまれにしか耐久性がない。特定の実施形態では、患者は疾患を有し、本開示の操作されたT細胞で処置される。特定の実施形態では、T細胞は、たとえば、CRISPR/Cas9ターゲティングを介して、上記のように操作される。特定の実施形態では、T細胞は、T細胞におけるエピジェネティックな変化をもたらす薬物への曝露によって操作される。特定の実施形態では、T細胞は、キメラ抗原受容体(CAR)を発現するように操作される。特定の実施形態では、疾患は癌である。特定の実施形態では、疾患は感染性疾患である。
特定の実施形態では、患者は、本開示の操作されたT細胞を投与される。ここで、そのT細胞は、T細胞の疲弊を防止、逆転または増加させるように操作されている。さらなる実施形態において、患者は、T細胞の疲弊を防止または逆行するように操作されている、本開示の操作されたT細胞を投与される。特定の実施形態では、T細胞は、本明細書に記載されるように、T細胞における高優先度エピジェネティック経路を標的とすることによって操作されている。特定の実施形態では、操作されたT細胞の投与は、患者における免疫学的応答を増加させる。特定の実施形態では、疾患を有する患者は、操作されたT細胞が投与される前に、1つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤で疾患について治療される。特定の実施形態では、操作されたT細胞を投与する前に、患者は、1つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤で処置される。特定の実施形態では、操作されたT細胞は、免疫チェックポイント阻害剤と同時にまたは同時発生的に投与される。免疫チェックポイント阻害剤は、これらに限らないが、PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM3、B7-H3、BTLA、VISTA、CD40、CEACAM1/CD66a、CD80/B7-1、CD86/B7-2、OX40/CD134、CD40 Ligand、ICOS Ligand/B7-H2、4-1BBL/CD137L、または B7-DC/PD-L2/CD273のアンタゴニストまたはそれらに対する抗体であり得る。特定の実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗免疫チェックポイント阻害剤抗体で標的化される。特定の実施形態では、抗免疫チェックポイント阻害剤抗体は、抗- PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM3、B7-H3、BTLA、VISTA、CD40、CEACAM1/CD66a、CD80/B7-1、CD86/B7-2、OX40/CD134、CD40 Ligand、ICOS Ligand/B7-H2、4-1BBL/CD137L、B7-DC/PD-L2/CD273、CD39/CD73、CD200/CD200R、LAG-3、TNFR2、KIRs、IDO、IL-10、IL-27、または TIGIT/CD226/CD112/CD122R/CD94抗体である。特定の実施形態では、患者は、本開示の抗免疫チェックポイント阻害剤および操作されたT細胞で同時にまたは同時発生的に処置される。
特定の実施形態では、非ヒト抗体はヒト化することができる。ここで、抗体の特定の配列または領域は、ヒトにおいて自然に産生される抗体との類似性を高めるように改変される。たとえば、本発明において、抗体またはその断片は、非ヒト哺乳動物scFvを含み得る。一実施形態では、抗原結合ドメイン部分はヒト化されている。
急性感染またはワクチン接種の間に、ナイーブT細胞は活性化され、1〜2週間にわたってエフェクターT細胞に分化する。この分化は、強力な増殖、転写、エピジェネティックおよび代謝的再プログラミング、ならびにエフェクター機能、変化した組織ホーミング、および劇的な数値的拡大などのエフェクターT細胞の基本的な特徴の獲得を伴う。エフェクターの拡大のピーク、炎症の解消、および抗原のクリアランスに続いて、ほとんどの活性化T細胞は死ぬが、サブセットは存続し、メモリーT細胞プールに移行する。これらのメモリーT細胞は、エフェクターT細胞の活性化プログラムの多くをダウンレギュレートするが、それらは、再刺激時にエフェクター機能を迅速に再活性化する能力を維持する。さらに、メモリーT細胞は、抗原非依存性の自己再生の重要なメモリー特性を発達させる。これは、インターロイキン-7(IL-7)とIL-15によって駆動される幹細胞のような遅い分裂の一種である。急性感染またはワクチン接種後のメモリーT細胞サブセットおよび分化には、かなりの多様性および複雑性がある(たとえば、エフェクターメモリーT細胞と中央メモリーT細胞)。しかしながら、機能的で持続的なメモリーT細胞の発達の重要な側面は、エフェクターフェーズの後、メモリー発達が、進行中の抗原刺激および高レベルの持続的な炎症がない状態で発生することである(Wherry and Kurachi. Nat Rev Immunol. 2015, 15(8):486-499)。
疲弊したT細胞は不活性ではない。それらは、進行中の病原体の複製または腫瘍の進行を制限する、最適ではないが重要な機能を保持する。疲弊したT細胞によって媒介されるこの宿主−病原体の膠着状態にもかかわらず、これらの細胞は病原体または腫瘍を根絶するのに効果的ではなく、疲弊を回避または逆転することに大きな関心が寄せられている。T細胞の疲弊が終末期または不可逆的な運命ではなく(少なくとも集団レベルで)可逆的であることの実証は、免疫療法を用いて免疫を改善する実質的な臨床機会を供する。これらのヒト治療の免疫学的効果は完全に規定されていないが、新たな結果は、ヒトにおけるT細胞疲弊の逆転が、PD1経路を遮断する剤を受容している多くの患者に見られる顕著な抗腫瘍効果の原因となるメカニズムであるという考えを支持する。
抑制性受容体は、自己反応性および免疫病理学を制御する重要な負の調節経路である。抑制性受容体は、活性化中に機能的エフェクターT細胞において一時的に発現されるが、抑制性受容体のより高く持続的な発現は、疲弊T細胞の特徴である。PD1リガンド1(PDL1)および/またはPDL2の結合に応答してPD1によって媒介される抑制性シグナル伝達経路は、例示的な例を提供する。抑制性受容体PD1がT細胞疲弊を制御する分子メカニズムについての我々の理解は不完全であり、理論に縛られることを望まないが、PD1などの抑制性受容体がT細胞機能を調節するメカニズムはいくつかある:最初に、外部ドメイン競合によるもの。これは、標的受容体またはリガンドを隔離する、および/またはマイクロクラスターおよび脂質ラフト(たとえば、CTLA4)の最適な形成を防止する阻害性受容体を指す;第2に、細胞内メディエーターの調節を介するもの。これは、TCRおよび共刺激受容体などの活性化受容体からの陽性シグナルの局所的および一過性の細胞内減衰を引き起こし得る;ならびに、第3に、抑制遺伝子の誘導を介するもの。
以下の実験例を参照することにより、本発明をさらに詳細に説明する。これらの例は、説明のみを目的として提供されており、特に指定のない限り、制限することを意図したものでない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されると決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになる任意のすべての変形を包含すると解釈されるべきである。
5〜6週齢のメスのC57BL/6およびB6-Ly5.2CR(Ly5.1を発現するB6マウス)は、Charles River(NCI strains)から購入した。C57BL/6 P14マウスをB6-Ly5.2CRマウスと交配して、記載されるようにP14 Ly5.1+マウスを生成した(Odorizzi et al. J. Exp. Med. 2015, 212:1125-1137)。LCMV株(Armstrong(Arm)およびクローン13)を増殖させ、記載されるとおりに力価を測定した(Odorizzi et al. J. Exp. Med. 2015, 212:1125-1137)。B6マウスに腹腔内(i.p.)に2x105 PFU LCMV Armを、または静脈内(i.v.)に4x106 PFU LCMVクローン13を感染させ、それぞれ急性感染または持続感染を確立した。すべてのクローン13感染について、CD4 T細胞を、LCMVクローン13で、-1および+1 日p.i.に、200μgの抗CD4(クローンGK1.5、Bio X Cell)をi.p.注入することにより枯渇させた。抗PD-L1(クローン10F.9G2、Bio X Cell)またはアイソタイプ対照抗体(Rat IgG2b、Bio X Cell)を、記載されるように、22〜25 日p.i.の間に開始し、3日ごとに5回の注射の200μg/注射を5回の合計処置で、i.p.投与した(Barber et al. Nature 2006, 439, 682-687)。いくつかの実験では、対照としてビヒクル(PBS)を注射した。IL-7をインビボで投与した実験では、サイトカインは抗IL-7と複合体化させて安定性を高めた。これらの実験のために、IL-7/抗IL-7免疫複合体(i.c.)を記載されるように調製した(Boyman et al. J. Immunol. 2008, 180:7265-7275)。簡単に言うと、注射あたりマウス1匹あたり1.5μgの組換えヒトIL-7(NCI Preclinical RepositoryまたはBiolegend)および7.5μgの抗ヒト/抗マウスIL-7(Charlie Surh提供のクローンm25)を混合し、30分間、複合体化させ、その後、注射用PBSで希釈した。複合体は抗PD-L1と同時にi.p.投与した(5回の注射で3日ごと)。すべてのマウスはUniversity of Pennsylvaniaで特定の無菌条件下で維持し、すべてのプロトコルはInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。
P14細胞を監視する実験では、P14トランスジェニックマウスの末梢血からヒストパクグラジエント(histopaque gradients)を用いてP14細胞を単離し、P14細胞(クローン13実験では500、Arm実験では500〜2000)を感染の少なくとも1日前に5〜6週齢のレシピエントB6マウスにi.v.で養子移入した。P14細胞を内因性DbGP33+およびDbGP276+細胞と比較した場合に同様の結果が得られ(図5)、以前の報告では、クローン13実験のために移入されたP14細胞の数(500)がウイルスロードに影響を与えなかったことを示している(Odorizzi et al. J. Exp. Med. 2015, 212:1125-1137; Blattman et al. J. Virol. 2009, 83:4386-4394)。TMEM、TEX、または抗PD-L1処理TEXを養子移入した実験では、CD8 T細胞は、抗体処理期間の1日後に脾臓から単離し、製造元の指示にしたがってCD8 T細胞EasySep陰性選択キット(Stem Cell Technologies)を用いて富化した。番号は、抗原のないレシピエントマウスへのi.v.養子移入前のDbGP33テトラマー染色に基づいてグループ間で正規化した。LCMV免疫マウス(30+日p.i.)を抗原のないレシピエントとして用いたため、内因性LCMV特異的メモリーは、記載されるように任意の移入されたウイルスを排除することができた(Angelosanto et al. J. Virol. 2012, 86:8161-8170)。抗原非依存的持続性をテストする実験では、レシピエントマウスはLCMV Armに免疫性であった(30+日pi)。再チャレンジ実験では、レシピエントマウスは、記載されるようにGP33エピトープを欠如するLCMVクローン13 V35Aによる低用量(200 PFU)感染を以前に解消していた(Shin、et al. J. Exp. Med. 2007, 204:941-949)。V35A免疫マウスは、内因性DbGP33特異的メモリーCD8 T細胞との直接の競合を防ぐためにリコール実験に用いた。
MHCクラスIペプチド四量体(DbGP276およびDbGP33)は、記載されるように(Qiu et al. Nat. Biotechnol. 2011, 29:886-891)作成するか、またはNIH四量体コアから取得した。抗体は、eBioscience、BD、Biolegend、Life Technologies、R&D Systems および AbD Serotecから購入し、CD8、CD4、B220、CD45.1、CD45.2、CD44、CD122、CD127、PD-1、2B4、Tim-3、Lag-3、Ki-67、granzyme B、IFNγ、TNFα、および phospho-STAT5に対する抗体が含まれる。単一細胞懸濁液は、製造元の指示に従ってLive/Dead Aqua(Life Technologies)で染色した後、表面抗原について染色した。Ki-67およびグランザイムBについての細胞内染色は、製造元の指示(eBioscience)にしたがってeBioscience Foxp3固定化/透過化キットを用いて行った。ブレフェルジンAおよびモネンシン(BD)の存在下で0.2μg/mlのgp33-41ペプチド(KAVYNFATM、GenScript)を用いて5時間のインビトロでの再刺激を行った後、製造元の指示(BD)にしたがって、BDサイトフィックス/サイトパームキットを用いて、IFNγおよびTNFαの細胞内染色を行った。phosho-STAT5検出では、刺激の前に脾細胞を37℃で1〜2時間、休ませた。細胞を10 ng/mlの組換えマウスIL-7またはIL-15(Peprotech)で30分間刺激した。次に、細胞を37℃で15分間、パラホルムアルデヒドで固定し、1回洗浄し、直ちにPhospho Perm Buffer III(BD)に再懸濁し、氷上で30分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、製造元の指示に従って染色した。細胞をLSR IIフローサイトメーター(BD)で収集し、FlowJoソフトウェア(Tree Star)を用いてデータを分析した。ソーティングはFACS Aria(BD)で行い、ソートのクオリティーを決定するために、ソート後の純度を得た。
マイクロアレイによる転写プロファイリングのために、最終的な処置の1〜2日後の脾臓からのCD8 T細胞(上記のように合計5回の処置を受けた後)を、磁気ビーズ(CD8陰性選択キット、Stem Cell Technologies)を用いて富化し、DbGP276+ CD8 T細胞をFACSAria(BD)でソートした。実験ごとにグループごとにプールした10〜12匹のマウスで、各処置グループに対して4つの独立した実験を行った。RNAは、製造元の指示に従ってTRIzol(Life Technologies)で単離した。RNAをプロセッシングし、増幅し、ラベルを付け、University of Pennsylvania Microarray FacilityのAffymetrix GeneChip MoGene 2.0 STマイクロアレイにハイブリダイズさせた。マイクロアレイデータは、以前に記載されるように処理および分析した(Doering et al. Immunity 2012, 37:1130-1144)。Gene Patternのヒートマップモジュールを、異なって発現された遺伝子を同定して表示するために用いた。遺伝子セット富化分析およびリーディングエッジのメタ遺伝子分析は、記載されるように行った(Godec et al. Immunity 2016, 44:194-206)。抗PD-L1のためのメタジーンを、抗PD-L1を対照TEXと比較するマイクロアレイデータセットを用いて同定した。TEFF(LCMV Arm感染後8日目)、TMEM(LCMV Arm感染後30日目)、およびTEX(LCMVクローン13感染後30日目)細胞のメタジーンは、以前に公開された転写プロファイルを用いてナイーブT細胞と比較することによって生成した(Doering et al. Immunity 2012, 37:1130-1144)。メタ遺伝子の組成と比較の詳細は、Pauken et al. Table S4 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)に見出される。図2Cに示すエフェクター遺伝子リストを作成するために、我々は、(Doering et al. Immunity 2012, 37:1130-1144)におけるナイーブと比較した6日後Armで上方制御されたトップ300の遺伝子で開始した。次に、6つの主要な細胞周期ターム(細胞周期、有糸分裂、紡錘体、DNA複製、有糸分裂細胞周期、および細胞周期)でGOメンバーシップを有する遺伝子が削除した。このリストは、Pauken et al. Table S3 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)に示される。
CD8 T細胞は、磁気ビーズ(CD8ネガティブ選択キット、Stem Cell Technologies)を用いて富化し、P14 CD8 T細胞(8 日pi Arm(プールした実験あたり5の脾臓)、33日 pi Arm(プールした実験あたり12〜13の脾臓)、35日 piクローン13(コントロール処理プールの実験で15の脾臓、抗PD-L1処理プールの実験で7匹のマウス))またはナイーブCD8 T細胞(プールした2〜3の脾臓から)をFACSAria(BD)でソーターした。対照および抗PD-L1処理TEX細胞を、上記のように、最終処理(合計5処理、3日ごと)の1日後にソートした。条件ごとに2つの独立した実験を行った。ATAC-seqは、Buenrostro et al. Nat. Methods 2013, 10:1213-1218に記載されるように行った。簡単に言えば、核を、10 mM Tris-HCl、10 mM NaCl、3 mM MgCl2、および0.1%IGEPAL CA-630の溶液を用いて、複製ごとに50,000〜150,000のソートされた細胞から単離した。核単離の直後に、転移反応を、Tn5トランスポザーゼおよびTDバッファー(Illumina)を用いて37℃で45分間、行った。転移されたDNA断片は、Qiagen MinElute Kitを用いて精製し、デュアルインデックスでバーコード化し(Illumina Nextera)、そしてNEBNext High Fidelity 2x PCRマスターミックス(New England Labs)を用いてPCR増幅した。シーケンシングライブラリのサイズ分布およびモル濃度は、Agilent BioanalyzerおよびKAPA定量RT-PCR(KAPA Biosystems)を用いることにより決定した。シーケンシングは、NextSeq 500(Illumina)でV2 chemistryを備えた高出力150サイクルキットを用いて行った。ペアエンドリードは、Bowtie2を用いてmm10リファレンスゲノムにマッピングした。一致してマッピングされたペアのみを、さらなる分析のために保持した。MACS v1.4を用いてピークコーリングを行い、シーケンスタグ富化の領域を同定した。BedToolsを用いて、同定されたピーク間の共通の交差点を見出し(1bp最小オーバーラップ)、マージされたピークリストを作成した。ATAC-seqタグ濃縮、マージされたピークリスト全体のDNAモチーフ分析、およびGOターム評価を、HOMER(homer.salk.edu)を用いて計算した。主成分分析、スペクトル共クラスタリング、および階層的クラスタリングを、scipy、matplotlab、およびscikit-learnを用いて行った。REVIGOは、異なる細胞型にまたがるユニークなGOタームを同定するために用いた。ピークのリストをいくつかのダウンストリーム分析用にフィルタリングして、全部で5つの細胞型にわたって富化が低いピークを削除した(第3四分位)。
TEXのユニークなエピジェネティックな景観に基づく統合された転写ネットワークを構築するために(図19D)、ウェリントンブートストラップ(Piper et al. BMC Genomics 2015, 16:1000)を最初に用いて、5つの細胞型(TN、TEFF、TMEM、TEX、抗PD-L1処理TEX)のすべての順序付けられたペアについて20セットの差分フットプリントを計算することにより精査された他の細胞型と比較したすべてのOCRにおける対照または抗PD-L1処理TEX のいずれかにおいて富化された転写因子(TF)結合モチーフを同定した。差分フットプリントにおけるモチーフ頻度を分析するために、HOMERからのannotatePeaks.plスクリプトを用いてこれらのフットプリント座標内でモチーフ検索を行い(Heinz et al. Mol. Cell 2010、38:576-589)、相対モチーフ頻度を(Piper et al. BMC Genomics 2015, 16:1000)に記載されるように計算した。マトリックスを生成し、GenePatternのClassNeighborsモジュール(Reich et al. Nat. Genet. 2006, 38:500-501)を用いてモチーフスコアをヒートマップ(図19B)として表示して、細胞型特異的TFを示した。
フローサイトメトリーおよびウイルス負荷データの統計は、GraphPad Prismソフトウェアを用いて分析した。2つの条件のみを比較した場合の2つの独立した条件間の比較では、対応のないスチューデントのt検定を用いて有意性が決定された。図面の簡単な説明に示されるように、同じマウス由来の試料を2つの異なる時点で比較した場合、対応のあるスチューデントのt検定を用いた。2つを超えるグループを比較する場合、一元配置分散分析(One way ANOVA)テストを用いた。最初に、ダゴスティーノとピアソンの正規性検定(D’Agostino and Pearson normality test)を用いて正規性をテストした。すべてのグループが正規分布であると判断された場合は、パラメトリック一元配置分散分析を行い、ボンフェローニの多重比較テスト(Bonferroni’s multiple comparison test)を用いて、関心のあるグループのテスト後の分析を行った。すべてのグループが正規分布であると判断されなかった場合は、ノンパラメトリックANOVA(クラスカル−ウォリス検定(Kruskal-Wallis test))を行い、ダンの複数のテスト比較(Dunn’s multiple test comparisons)を用いて、対象グループのテスト後の分析を行った。ANOVAのP値は各図のY軸の横に青色で示され、示されたペア間のポスト・テストのp値は黒色で示される。0.05未満の場合、P値は有意であると見なした。有意性を示すのに用いたアスタリスクは、p <0.05 *、p <0.01 **、p <0.001 ***に対応する。
IV期の黒色腫の患者を、ペンの拡張アクセスプログラム(Expanded Access Program at Penn)(www.clinicaltrials.gov identifier NCT02083484) に基づいて、または、メモリアルスローンケタリングがんセンター(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)(‘MSKCC’)のNCT01295827に基づいて、ペンブロリズマブ(pembrolizumab)での処置(3週ごとの注入により2 mg kg−1)について登録した。患者は、ペンシルベニア大学アブラムソンがんセンター(University of Pennsylvania Abramson Cancer Center’s)(「ペン」)の黒色腫研究プログラム組織採取プロトコルUPCC 08607に基づき、および、MSKCCのプロトコル00-144に基づいて、両機関のInstitutional Review Boardsに従って、採血について同意した。末梢血は、処置前、および各ペンブロ注入前に、3週間ごとに、12週間、ヘパリンナトリウムチューブで採取した。末梢血単核細胞(PBMC)は、フィコール勾配を用いて単離し、標準的なプロトコルを用いて保存した。
腫瘍負荷:総測定可能腫瘍負荷は、治療前画像レポートで報告されたすべての測定可能な病変の長軸の合計として定義した。測定不可能な病変または活動的な脳転移のみを有する患者は、臨床応答および腫瘍負荷に関する分析から除外した。臨床応答および腫瘍負荷の評価は、盲検的に独立して行った。
ペンコホート:前処理からの凍結保存PBMC試料、サイクル1〜4(3〜12週)を解凍し、CD4 (Biolegend、OKT4)、CD8 (ebioscience、RPA-T8)、2B4 (Beckman Coulter、IM2658)、CD45RA (Biolegend、HI100)、TIM-3 (F38-2E2)、LAG-3 (Enzo、ALX-804-806B-C100)、CXCR5-BV421 (BD、RF8B2) および CD27 (BD、L128) を含む表面染色、ならびにFOXP3 (BD、259D/C7)、CTLA-4 (BD、BNI3)、Eomes (ebioscience、WD1928)、T-bet (Biolegend、4B10)、GzmB (Life Tech、GB11)、TCF-1-AlexaFluor647 (Biolegend、7F11A10) および Ki67 (BD、B56)のための細胞内染色、のための抗体のマスターミックスで染色した。透過処理は、FOXP3 Fixation / Permeabilization Concentrate and Diluent kit(eBioscience)を用いて行った。ペンブロ後の検体のPD-1は、抗ヒトIgG4 PE(Southern Biotec)を用いて検出した。前処理試料を、25μg ml-1ペンブロでインビトロで37℃で30分間、前処理し、2回洗浄して、標準的な抗体ミックスで染色した。細胞を1%パラホルムアルデヒドに再懸濁し、BD Biosciences LSR IIサイトメーターで取得し、FlowJo(Tree Star)を用いて分析した。
フローサイトメトリープロトコル(上記)のとおり、凍結保存したPBMC試料を解凍して染色した。RNAシーケンス実験では、ダンプ/デッドCD3+ CD8+ゲーティングストラテジーを用いて、全CD8 T細胞を分類した。TCRシーケンス実験では、CD8 T細胞は上記のようにゲーティングし、CD38+ HLA-DR+およびCD38+ HLA-DR+でない細胞(すなわち、CD38-HLA-DR-、CD38+ HLA-DR-、およびCD38- HLA-DR+)をソートした。セルソーティングはBD Aria Sorterで行った。
Luminexテクノロジー(EMD Millipore)を用いて、循環血漿サイトカインの濃度を分析した。
解凍した細胞を、0.25μg ml-1でホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)(Sigma)で、および2.5μg ml-1でイオノマイシン(Sigma)で、2〜5時間、37°Cで刺激し、染色した。サイトカイン産生は、IFNγ(Biolegend、B27)およびTNF-α(Biolegend、Mab11)に対する抗体を用いた細胞内染色で分析した。
ランダムフォレスト回帰および分類(RF-RC)は、多変数のノンパラメトリックアンサンブルパーティショニングツリー法であり、応答変数の予測因子としての遺伝子およびタンパク質間のすべての相互作用の効果をモデル化するために用いることができる(Breiman Mach. Learn. 2001, 45 :5-32)。各モデルは、ランダムに選択されたサンプルの約3分の2を用いて構築され、モデル構築プロセスから除外されたサンプル(「out-of-bag」サンプル)の3分の1で交差検証される。多くの反復の後、すべてのモデルの結果が平均化されて、予測値、エラーレート、および変数の重要度の測定値の不偏の推定が提供される。RF-RCモデルのパフォーマンスは、回帰の平均二乗誤差により、および分類の誤分類エラーレートにより、測定される。フローサイトメトリーのサブセットは、臨床反応変数の可能な予測因子として用いた。各予測因子について、変数のエラー率への寄与を測定する重要度スコアが決定される(スコアが高いほど予測性が高くなる)。‘randomForest’ R package version 4.6-12 implementationおよび次のパラメーター:5,000 trees, node size of 1, mtry value(すなわち、各ノードでの分割に利用できる変数の数)(モデル内の変数の数値の平方根に等しい)、ならびに重要度スコアを決定するためのブライマン・カトラー(Breiman-Cutler)順列法、を用いた。精度の平均低下は、重要度スコアの指標として用いる。
マスサイトメトリー試薬は、Fluidigmから入手したか、または、MAXPARキット(Fluidigm)を用いて標識されていないmAbをアイソトープがロードされたポリマーにカスタム結合させることによって生成した。使用したマスサイトメトリー抗体を表5に示す。マスサイトメトリー染色は記載されているとおりに行った(Bengsch et al. J Immunol Methods. 2017, pii:S0022-1759(17)30132-1)。簡単に言えば、単一細胞懸濁液をペレット化し、PBS中で20μMランタン-139(Trace Sciences)をロードしたマレイミド−モノ−アミン−DOTA(大環状分子)と共にインキュベートし、ライブ/デッド区別(LD)のために室温(RT)で10分間インキュベートした。細胞を染色バッファーで洗浄し、表面抗体カクテル中に再懸濁し、室温で30分間インキュベートし、染色バッファーで2回洗浄し、固定化し、FOXP3染色バッファーセット(eBioscience)を用いて透過処理し、そしてRTで60分間細胞内染色した。細胞をさらに2回洗浄した後、125 nMイリジウムを含む1.6%PFA(Electron Microscopy Sciences)溶液で4℃で一晩固定した。CyTOF2(Fluidigm)でデータを取得する前に、細胞をPBSで2回、dH2Oで1回洗浄した。データ分析は、以前に概説したように(Breiman. Mach. Learn. 2001, 45:5-32)、FlowJo v10(TreeStar)およびSPADE(Cytobank)を用いて行った。倍率変化頻度の分析は、計算log10 [合計のパーセンテージ(3週目)/(合計のパーセンテージ(前処理)]を実行するSPADEの「percenttotalratiolog」パラメーターを用いて行った。TEX、TMEM、およびTEFF細胞の要約統計を、各ノードが寄与する比率を考慮することにより、各クラスターの中央値倍率変化または質量強度(mass intensity)として計算した。Rパッケージ「pheatmap」をヒートマップの作成に用いた。
(Doering et al. Immunity 2012, 37:1130-1144)に記載されるアクセッション番号GSE41867でGene Expression Omnibus(GEO)データベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)から入手可能な転写プロファイリングを、Pauken らおよび/または Sen ら(Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165; Sen et al. Science. 2016, 354(6316):1165-1169) (GSE97646, GSE86881)に記載されるATAC-Seqデータと一緒に用いた。転写プロファイリングデータはGEOからダウンロードし、R 3.3.1およびGEOqueryパッケージを用いて注釈を付けた。ATAC-Seqオープンクロマチン領域(OCR)分析は、Pauken らおよび/または Sen ら (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165; Sen et al. Science. 2016, 354(6316):1165-1169)(GSE97646, GSE86881)に記載されるように行った。疲弊特異的トランスシプトミック(transciptomic)およびエピゲノムの発現パターンの同定は、limmaパッケージで計算されたモデレートベイズ統計を用いて行った。具体的には、モデレートT統計が対照T細胞集団と比較して(> = 2.9)である場合、疲弊したCD8 T細胞において上方制御または下方制御された遺伝子を選択した。
必要に応じてメスならびにガイドとしてヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色したスライドを用いて、FFPEスライドで手動のマクロ切開を行った。組織の脱パラフィンおよびDNA抽出は、標準的な方法を用いて行った。DNAは、Qubit dsDNA BR Assay(Invitrogen)を用いて定量した。末梢血CD8 T細胞を精製し、BD Aria Sorterを用いてPBMCから単離した。DNA抽出、増幅、ライブラリー調製、シーケンシング、および予備的バイオインフォマティクス分析は、Adaptive Biotechnologiesによって行った。TCRB CDR3の増幅およびシーケンシングは、immunoSEQ Platform(Adaptive Biotechnologies)を用いて調査レベルの解像度で行った。
ホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍を外科的切除時または生検から採取した。抗PD-L1染色のため、熱誘導抗原修復(Bond ER2、20分)の後、腫瘍スライドを1:50希釈の抗PD-L1抗体(E1L3N、Cell Signaling)で染色した。特異性を確認するために、抗PD-L1抗体はホジキンリンパ腫細胞および胎盤を染色することによって検証した。抗CD8染色のために、熱誘導抗原回復(Bond ER1、20分)の後、腫瘍スライドを1:40希釈の抗CD8抗体(M7103、Dako)で染色した。腫瘍浸潤CD8陽性T細胞は、盲検の専門家黒色腫病理学者によって、非存在、最小、軽度、中程度、および活発であるとスコアリングされた。腫瘍浸潤CD8 T細胞は、ImageJ2を用いる画像認識分析によっても分析した。デジタルスライドはライカ顕微鏡により取得した。CD8染色のRGBスタック画像をグレースケールに変換し、粒子(陽性染色)を100のしきい値を用いて10〜625μm2のサイズでカウントした。腫瘍の総面積は、腫瘍マスクを用いて計算した。
ソーティング後、細胞を再懸濁し、RLTバッファー(Qiagen)で凍結した。RNAは、製造元のプロトコルに従って、Qiagen RNeasyマイクロキット(Cat. No. 74034)を用いて単離した。RNA-seqライブラリーは、製造元のプロトコル(Cat. No. 635007)に従って、ClonetechからSMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit for Pico Input Mammalianを用いて調製した。ライブラリーは、900万〜2060万のペアのマップされた読み取りの読み取り深度で、300サイクルの高出力フローセル(Cat. No. 15057929)を用いてIllumina NextSeqマシン上でシーケンシングした。Fastqファイルは、STAR 2.5.2aおよびhg19を用いて調整した。アラインされたファイルは、PORT遺伝子ベースの正規化(www.github.com/itmat/Normalization)を用いて処理した。差次的遺伝子発現はLimmaを用いて行った。Limma-voomを用いて、P値<0.05を用いてグループ間で有意に異なる転写物を同定した。サイクル1にKi67ピークがある患者(3人の患者)について、MKI67と高い相関がある上位40の遺伝子で、MKI67相関遺伝子と相関する上位5遺伝子を含む相関ネットワークを作成した。最終的なネットワークには、MKI67と相関の高い(相関係数の絶対値> 0.7(abs(corr)> 0.7))値を持つノードがあった。Cytoscape 3.4.0は相関ネットワークの作成のために用い、metascape.orgはGO生物学的プロセスのための遺伝子を富化するために用いた。この出版物において議論されるデータはNCBI Gene Expression Omnibusに寄託されており、その全体が引用により本明細書に組み込まれる、GEOシリーズアクセッション番号GSE96578(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/ acc.cgi?acc=GSE96578)を介してアクセスできる。
必要に応じてメスおよびガイドとしてH&E染色されたスライドを用いて、FFPEスライドで手動のマクロ解剖を行った。組織の脱パラフィンおよびDNA抽出は、標準的な方法を用いて行った。DNAは、Qubit dsDNA BR Assay(Invitrogen)を用いて定量した。DNAライブラリーは、NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (New England BioLabs)を用いて作成し、標的はSureSelect Human All Exon V6+ COSMIC(Agilent)でキャプチャした。OptiTypeおよびネオエピトープ(neoepitope)予測を伴うHLAは、Ccons 1.1 Serverを用いて作成した。
グループ比較および相関分析のために、PRISM 6.0を用いてテストを行った。D'Agostino-Pearson omnibus正規性検定を用いて分布の正規性を評価し、F検定を用いてデータのグループ間の分散を評価した。正規分布データについて、平均差の有意性は、両側の(two-sided)対応のある、または対応のないスチューデントのt検定を用いて決定し、分散が異なるグループについては、ウェルチの修正(Welch’s correction)を伴う対応のないt検定を用いた。非正規データについて、非パラメトリックマンホイットニーU検定(Mann-Whitney U-tests)またはウィルコクソン一致対符号付き順位検定(Wilcoxon matched-pairs signed rank tests)を、非対分析と対分析とにそれぞれ用いた。記述統計には、連続変数についての平均、中央値、標準偏差、および範囲、ならびに、カテゴリー変数についての頻度および比率が含まれる。連続変数間の相関関係はピアソンのr係数によって決定し、順序スケーリングされたカテゴリー変数間の相関関係はスピアマンのr係数(Spearman’s r coefficient)によって決定した。全生存期間は、処置の開始から死亡の日または患者との最後の接触までの生存期間として規定し、カプラン・マイヤー法によって推定した。ランドマークの全生存およびPFS分析は、治療後6週間からの全生存およびPFSとして規定した。Ki67(最大6週目)、ベースラインの腫瘍負荷および臨床結果の関係を視覚的に検査するために、ベースラインの腫瘍負荷によってKi67の簡単な散布図を作成し、全生存、PFS、臨床応答などの臨床結果に色分けされた記号を採用した。一般に、平均は臨床結果の二分法(dichotomization)のために用いた。これには、PennデータセットにおけるPFSおよびランドマークPFS(図27、図35)、ならびにMSKCCデータセットについてランドマークの全生存率(図34G)が含まれる。Pennデータセットでは、ランドマークの全生存期間は、9.5か月のカットオフを用いて二分した。これは、最長の完全生存期間を表しているためである(すなわち、LOSが9.5か月未満の患者は生存しておらず、生存が検閲されない)(図34D、図35)。対数順位検定(log rank test)を用いて、患者のサブグループ間の全生存を比較した。腫瘍負荷に対するKi67の比率は全生存率と関連しており、CART分析によってさらに調査した。CARTは、この連続変数を全生存期間に従って2つの均一なサブグループに分割するための最適なカットポイントを同定した。この方法により、すべての可能なカットポイントから最適なカットポイントが選択される。生存およびCART統計分析は、IBM SPSS v23またはSTATA v14のいずれかを用いて行った。ランドマークPFSについて同様の分析を行った。
モデル選択は、一連の候補モデルの中からモデルを選択する方法である。Rパッケージ「leaps」バージョン2.9、パラメーター「nvmax = 3」、および「nbest = 10」を用いて、CD8およびKi67発現を予測するための線形回帰に基づいて10の最良のモデルを選択した。
CyTOFデータのビーズベースの正規化は、www.github.com/nolanlab/bead-normalization/releasesから入手できるNolan labノーマライザーを用いて行った。FCSファイルは、市販のソフトウェアFlowJo v10(TreeStar)、FCSExpress 6(DeNovo Software)、およびViSNE(Cytobank)によってさらに分析した。RベースのtSNE分析は、Rtsneパッケージを用いて行った。(Chen et al. PLoS Comput Biol. 2016, 12(9):e1005112; Levine et al. Cell. 2015,162(1):184-97)に記載されるcytofkitパッケージを介して実装されたRPhenographパッケージを用いてフェノグラフ分析を行った。視覚化のために、クラスタリング後にグラフから10000個のノードがサンプリングした(すなわち、クラスタリングは完全なデータセットに対して実行したが、読みやすさのためにサブサンプルのみが表示される)。結果のサブグラフは、ForceAtlas2の強制指向レイアウトアルゴリズム(Jacomy et al. PLoS One. 2014, 9(6):e98679)を用いてレイアウトした。VisneまたはPhenographを用いる疲弊データスペースの分析は、図24および図28に規定されるように疲弊特異的分子に対応するマスチャネルで実行した。イリジウムインターカレーター陽性、シングレットLD陰性CD45+ CD3+ CD8 T細胞の疲弊データスペースのフェノグラフ分析は、30個の高次元クラスターを同定し、そのうち5個(c14、c20、c22、c24、c30)が品質管理ゲーティング後にCD8 T細胞の0.01%未満の細胞頻度を示し、下流の分析から除外した。
直接表現型分析またはモネンシンおよびブレフェルジンAの存在下で37℃で5時間での完全培地中のPMA/イオノマイシンによる刺激のためにサンプルを分割し、マスサイトメトリー分析のために染色した。表現型と刺激のパネルとの間で共有される疲弊特異的マーカーを用いて、共有tSNEベースの疲弊マップを作成した。フェノグラフクラスターを反映するゲートを、この共有された疲弊マップで同定し、刺激されたサンプルからの対応するゲートでのサイトカイン発現を、フェノグラフクラスターにマッピングした(図26も参照)。検証のために、フェノグラフの「分類」モードにより行われるとおり、第2のマッピング方法を用いた(Levine et al. Cell. 2015, 162(1):184-97)。トレーニングデータは、刺激のある各サンプルから50kの細胞をサンプリングすることによって作成した。この分析のために、非刺激データおよび刺激後データの両方に共通する疲弊マーカーである、CTLA4、CD7、CD127、Helios、PD-1、CCR7、Eomes、CD38、TOX、TIGIT、CXCR5、2B4、LAG3、CD36を用いた。刺激されたサンプルごとに、トレーニングデータおよび刺激されたサンプルからの細胞を用いて、Jaccardメトリックを用いる最近傍グラフを作成した。グラフ全体のランダムウォーク確率を用いて、刺激された各細胞にクラスターを割り当てた。より詳細な記載については、(Levine et al. Cell. 2015, 162(1):184-97)を参照のこと。
ヒートマップは、Pheatmap Rパッケージ(v. 1.0.8)を用いて生成した。色表現はZスコアに基づき、ヒートマップの横の図のカラーパレットで示される。
統計分析は、JMP 12.2.0(SAS)、GraphPad Prism 7.02およびR 3.3.1 limmaパッケージを用いて行った。図29〜31において、患者試料におけるフェノグラフクラスター頻度の単純な回帰分析を行い、それぞれのピアソン相関をR ggplot2パッケージを用いてプロットした。
調査結果をサポートするRNAシーケンシングデータはNCBI Gene Expression Omnibusに登録されており、GEOシリーズのアクセッション番号GSE96578(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE96578)を介してアクセスできる。フローサイトメトリー、TCRシーケンシング、および臨床データは、引用により全体として本明細書に組み込まれる、Huang et al. (Huang et al. Nature 2017, 4;545(7652):60-65, doi:10.1038/nature22079) およびそのExtended Data and Supplementary Informationに含まれる。
患者集団および検体採取
血液は、すべての研究参加者の書面によるインフォームドコンセントおよびペンシルバニア大学機関審査委員会(University of Pennsylvania Institutional Review Board)の承認を得て取得された。HIV試料は、Penn Center for AIDS Research (CFAR) (IRB# 815056)を通じて取得され、肺癌について血液および組織試料が取得され(IRB#813004)、健常対照者について血液が取得された(IRB#820151)。PBMCおよびTILは、記述されているように抽出した(Huang et al. (2017)Nature 545:60-65; Quatromoni et al. (2015)J Leukoc Biol 97:201-209)。
アクセッション番号GSE41867でGene Expression Omnibus(GEO)データベース(www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)から入手できるLCMV特異的T細胞の転写プロファイリングは、Doering et al. (Doering et al. (2012) Immunity 37:1130-1144)に記載される。ATAC-Seqデータは、Pauken et al. Science (2016) 354(6316):1160-1165 およびSen et al. (2016) Science 354(6316):1165-1169 (GSE97646、GSE86881)に記載される。転写プロファイリングデータはGEOからダウンロードし、R 3.3.1およびGEOqueryパッケージを用いて注釈が付けられた。ATAC-Seqオープンクロマチン領域(OCR)分析は、Pauken et al. Science (2016) 354(6316):1160-1165 およびSen et al. (2016) Science 354(6316):1165-1169 (GSE97646、GSE86881)のように行った。疲弊特異的トランスクリプトームおよびエピゲノムの発現パターンの同定は、limmaパッケージで計算されたモデレートされたベイズ統計を使用して実行した。具体的には、モデレーテッドT統計がTN、TEFF、およびTMEMと比較して(> = 2.9)である場合、ウイルス特異的TEXにおいて上方制御または下方制御された遺伝子が選択された。
Broad Instituteソフトウェア(www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)を用いる遺伝子セット富化分析(GSEA)を、GEOからのマイクロアレイデータに対して行った。疲弊特異的遺伝子シグネチャを、GSEAによってテストした。GSEAによって取得された正規化富化スコア(NES)およびリーディングエッジ(LE)遺伝子は、図1、2、および3におけるさまざまなデータセット全体の比較のために用いた。図8では、GSVA Rパッケージを用いる遺伝子セット変動分析(GSVA)(Hanzelmann et al, (2013)BMC Bioinformatics 14:7)を、(Tirosh et al. (2016) Science 352:189-196)からの単一細胞トランスクリプトームデータを調査するため、および腫瘍微小環境におけるさまざまな疲弊遺伝子セットを評価するために行った。要約すると、CD8 T細胞の単一細胞データはNIH GEO(GSE72056; www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE72056で入手可能)から取得し、単一細胞データのGSVAは、完全なエピゲノム的およびトランスクリプトーム的に規定された疲弊遺伝子リスト、または後にCyTOFによって分析される遺伝子のサブセットを用いて行った。UPおよびDOWN制御された遺伝子リストを用いるGSVA分析の結果を用いて、GSVA枯渇スコア(GSVA_score_UP - GSVA_score DN)を計算した。
PBMCまたはソートされたT細胞集団を、L-グルタミン、10%FCSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを添加した補足培養培地(RPMI 1640(Gibco))で72時間20 U/ml IL-2(Stemcell)の存在下で抗CD3/CD28ビーズ(Miltenyi Biotec)で刺激した。抗-CD27-BV785 (クローン O323)、抗-CD45RA-BV605 (クローン HI100)、抗-PD-1-BV421 (クローン E12.2.H7)、抗-CD8 APC-Fire (クローン RPA-T8) (Biolegend)、抗-CCR7-FITC (クローン 150503) (BD Biosciences)を用いて,TN (CCR7+CD45RA+CD27+)、TCM (CD27+CD45RA-CCR7+)、TEM (CD27-CCR7-CD45RA-)、TEMRA (CD27-CCR7-CD45RA+) および PD-1+ 集団を染色した後、および生/死試薬 Ghost Violet (Tonbo)で染色した後、FACS Aria II (BD Biosciences)でソーティングを行った。
マスサイトメトリー試薬は、Fluidigmから入手したか、または、MAXPARキット(Fluidigm)を用いてアイソトープがロードされたポリマーへのカスタム結合によって生成した。用いたマスサイトメトリー抗体を表5に示す。以下に基づいて、マスサイトメトリーのために疲弊特異的マーカーを選択した:1)TEXの転写シグネチャの存在(ユニーク上方または下方制御);2)遺伝子座におけるユニークなTEX特異的エピジェネティック変化の存在(獲得または喪失);および3)CyTOFのため適した抗体の利用可能性、結合前またはインハウス結合および検証後。(Bengsch et al. (2017) J Immunol Methods 453:3-10)に記載されるように染色を行った。簡単に言えば、単一細胞懸濁液をペレット化し、PBS 中の20μMランタン-139(Trace Sciences)をロードしたマレイミド−モノ−アミン−DOTA(Macrocyclics)で、室温で10分間、生/死の識別(LD)のためにインキュベートした。細胞を染色バッファーで洗浄し、表面抗体カクテルに再懸濁し、RTで30分間インキュベートし、染色バッファーで2回洗浄し、FoxP3染色バッファーセット(eBioscience)を用いて固定化および透過処理し、RTで60分間細胞内染色した。細胞をさらに2回洗浄した後、125nMイリジウムを含む1.6%PFA(Electron Microscopy Sciences)溶液で一晩4Cで固定化した。CyTOF2(Fluidigm)でのデータ収集の前、およびCyTOF Helios(Fluidigm)での反復コホート実験において、細胞をPBSで2回、dH2Oで1回洗浄した。57人の患者からのサンプルのマスサイトメトリーデータは、異なるバッチで取得した。特に、図40〜43で分析されたサンプルは、類似するCyTOF機器パフォーマンスで、同じコア抗体を用いて3つのバッチで取得した。バッチコントロールのために、ビーズベースの正規化を用い、それぞれのバッチで単一のコントロールドナーからのPBMCを分析し、高次元分析で同様の結果を示した(データは示さない)。その後、後の時点で染色され、異なるマスサイトメーターで取得された同じ起源の出血日からの患者サンプルを再分析することにより、繰り返しのコホート分析を行い、元の分析と同様の結論が得られた(図39、図45)。
CyTOFデータのビーズベースの正規化は、github.com/nolanlab/bead-normalization/releasesから入手できるNolan labノーマライザーを用いて行った。FCSファイルは、市販のソフトウェアFlowJo v10(TreeStar)、FCSExpress 6(DeNovo Software)、およびViSNE(Cytobank)によってさらに分析した。RベースのtSNE分析は、Rtsneパッケージを使用して実行した。フェノグラフは、(Chen et al. (2016) PLoS Comput Biol 12, e1005112; Levine et al. (2015) Cell 162:184-197)に記載される、cytofkitパッケージを介して実装されたRPhenographパッケージを用いて行った。ViSNEまたはフェノグラフを用いた疲弊データスペースの分析は、図37および38で規定されるように疲弊特異的分子に対応するマスチャネルで行った。イリジウムインターカレーター陽性、シングレットLD陰性CD45+CD3+CD8 T 細胞での疲弊データスペースのフェノグラフ分析は、30個の高次元クラスターを同定し、そのうち5個(c14、c20、c22、c24、c30)は、品質管理ゲーティング後に細胞頻度<0.01%のCD8 T細胞を示し、下流の分析から除外した。フェノグラフおよびVisne分析の後、データはfcsファイルに統合し、FlowJoまたはFCSExpressによってさらに処理した。
直接表現型分析、またはモネンシンおよびブレフェルジンAの存在下で37℃で5時間の完全培地中のPMA/イオノマイシンによる刺激のためにサンプルを分割し、マスサイトメトリー分析のために染色した。表現型検査(phenotyping)と刺激パネルとの間で共有される疲弊特異的マーカー(「スキャフォールド」)を用いて、フェノグラフの「分類」モードにより刺激後のサンプルを刺激前のクラスターにマッピングした(Levine et al. (2015)Cell 162:184- 197)。刺激を伴う各サンプルから等しい量の細胞(50000)をサンプリングすることにより、トレーニングデータを作成した。非刺激データと刺激後データの両方に共通する疲弊マーカーであるCTLA4、CD7、CD127、Helios、PD-1、CCR7、Eomes、CD39、TOX、TIGIT、CXCR5、2B4、LAG3をこれらの分析のために用いた。刺激されたサンプルごとに、トレーニングデータおよび刺激されたサンプルからの細胞を用いて、Jaccardメトリックを用いる最近傍グラフを作成した。グラフ全体のランダムウォーク確率を用いて、刺激された各細胞にクラスターを割り当てた。より詳細な記載についてLevine et al. (2015) Cell 162:184-197をご参照ください。次に、機能疲弊スコア(FES)を、IL-2およびCCL3の生産、ならびにIFN-γおよびTNFの同時生産(2 *(%IFN+ TNF-)-(%IFN-TNF+)-(%IL-2+))x(%CCL3/4+)を用いて計算した。
ヒートマップは、Pheatmap Rパッケージ(v. 1.0.8)を用いて生成した。色表現はZスコアに基づき、ヒートマップの横の図のカラーパレットで示される。
統計分析は、JMP 12.2.0(SAS)、GraphPad Prism 7.02およびR 3.3.1 limmaパッケージを用いて行った。図41〜43におけるグループ比較は、ウェルチの修正(Welch’s correction)を伴う対応のないt検定を用いて行った。図41および42では、ウイルス負荷およびCD4/CD8比に対して、ウイルス血症のHIV患者サンプルにおけるフェノグラフクラスター頻度の単純な回帰分析を行った。それぞれのピアソン相関は、R ggplot2パッケージを用いてプロットした。図41Gおよび43Cに示されるクラスタードットサイズは、個々のクラスターの存在量に比例的にスケーリングした(CD8の%)。図42および43では、サンプルあたりのフェノグラフクラスターのパーセンテージの合計を、図41および42に示される最も高いFESでのトップ2クラスターおよびトップ9クラスター、図42に示されるHIV(DAT/HAT)における疾患−または健常関連TEXクラスターについて計算した。さらに、HATの頻度の合計で割ったDATの頻度の合計を用いてTEX比率を計算し、疾患全体にわたるさまざまな品質のTEXの組成の歪みを評価した。
PD-1経路遮断に関連する細胞性、転写性、およびエピジェネティックな変化は、慢性リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)感染のマウスモデルを用いて調べた(図1A〜図1C)(Barber et al. Nature. 2006, 439(7077):682-7; Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165 - Supplemental Information on Science online)。抗PD-L1処置の後、1080個の遺伝子が上方制御され、1686個の遺伝子が下方制御された(p<0.05, LFC≧0.2) (図2A、図1D、および Pauken et al. Table S1 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165))。以前の研究は、PD-1経路遮断後の代謝経路における転写(Gubin et al. Nature. 2014, 515:577-581)または細胞性(Bengsch et al. 2016, Immunity 45、358-373; Staron et al. 2014, Immunity 41、802-814)の変化を同定した。実際、いくつかの代謝遺伝子はPD-L1遮断後に変更した(Pauken et al. Table S1(Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165))。しかしながら、遺伝子セット富化分析(GSEA)は、細胞分裂経路におけるより顕著な変化を同定した(図2B、Pauken et al. Table S2 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)) (Barber et al. Nature 2006, 439, 682-687; Patsoukis et al. Sci. Signal. 2012, 5, ra46)。さらに、多くのエフェクター関連遺伝子は抗PD-L1グループに偏っていた(図2C〜2D、Pauken et al. Table S3 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165))。関心のある他の遺伝子には、Cxcl9、Il1r2およびIl7r(上)、ならびに、Klra9、Tnfrsf9、およびCd200r2(下)が含まれる(図1DおよびPauken et al. Table S1(Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165))。Leading Edge Metagene(LEM)分析(Godec. Immunity. 2016, 44:194-206)を用いて、対照TEXと比較して、抗PD-L1処理TEXにおいて2つのメタ遺伝子が同定された:1つは白血球の活性化に対応し、もう1つは細胞周期に対応する(図2E、図1E、および1F、およびPauken et al. Table S4 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165))。抗PD-L1処理TEXメタ遺伝子は、主に細胞周期経路によって駆動されるTEFFとの一部の重複を示したが、TMEMとの重複は最小限であった(図2EおよびPauken et al. Table S4(Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165))。このことは、TEX再活化時のメモリーポテンシャルの限られた獲得を示唆する。
PD-L1遮断の効果が持続しなかった1つの考えられる理由は、感染が持続したことである。感染が治癒した場合に抗PD-L1がTMEMへの分化を誘導し得るという考えをテストするために、同数の対照TEX、抗PD-L1処理TEX、またはTMEMを無抗原マウスに移入し、持続性を監視した(図8A)。以前の研究と一致して(Shin, et al. J. Exp. Med. 2007, 204: 941-949; Wherry, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101:16004-16009)、TEXは機能的なTMEMと比較して無抗原レシピエントにおいて低い生存であった(図9A〜9B)。抗PD-L1で処理されたTEXは、TMEMに比べると不十分であったが、中程度に持続する傾向があった(図9A〜9B)。次に、この傾向の潜在的なメカニズムを調査した。 PD-1経路遮断後、インターロイキン(IL)-7受容体転写物(Il7r; CD127)は有意に増加した(図1DおよびPauken et al. Table S1(Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165))。抗PD-L1後のTEXのサブセットでCD127タンパク質の適度な増加もあった(図9C〜9E)。IL-7で刺激すると、抗PD-L1で処理されたTEXは、対照で処理されたTEXと比較して、より多くのphospho-STAT5も示した(図9Fおよび図8B)。対照的に、IL-15受容体サブユニットCD122の発現およびインビトロでのIL-15に対する応答性は実質的に変化しなかった(図9Cおよび9F、および図8B)。これらのデータは、抗PD-L1処置がメモリーバイアスIL-7R経路の活性を増強し得ることを示唆する。
次に、PD-1経路の遮断がTMEMの定義的特性である再感染時の強力なリコールの可能性を復元できるか否かをテストした。等しい数のDbGP33+ CD8 TEX、抗PD-L1処理TEX、またはTMEMを無抗原マウスに移入し、休ませ、そしてGP33-41を発現するリステリア菌(Listeria monocytogenes)で再チャレンジした。TMEMは強力に拡大し、効率的にIFNγを産生した(図10A〜10D)。対照的に、対照および抗PD-L1処理TEXは両方ともリステリアGP33チャレンジに対する応答が乏しく、再活化されたTEXはこれらの重要な特性において対照TEXと同様に不完全であった(図10A〜10D)。
TEXは、TEFFおよびTMEMと比較して約6000のユニークなOCR変化を示した(図10F〜10I)。したがって、PD-L1遮断によって誘導された約650のOCR変化は、比較すると控えめであった。これらの変化が特定の転写回路に影響を与えるか否かを判断するために、得られた(たとえば、NFκB、Jun:AP1、およびCTCF)または失われたピークにおいて富化された転写因子(TF)モチーフを同定した(たとえば、NFATc1、NFAT:AP1、Nur77、EomesおよびEgr2)(図19A)。再活性化が既存のTEXエピジェネティックランドスケープ内の再配線された転写制御に起因するか否かをテストするために、ウェリントンブートストラップ分析を実行して、TF結合活性を予測した(図19BおよびPauken et al. Table S10 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)。TEXおよび抗PD-L1処理TEXは、TN、TEFFまたはTMEMよりも互いに類似していた。しかしながら、TEXまたは抗PD-L1処理TEXに偏ったTFモチーフが同定された(図19BおよびPauken et al. Table S10 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165))。次に、結合の可能性が高い証拠でTFを同定するために、TFフットプリンティングを行った(図19Cならびに図20および21)。次に、予測されたTF活性に基づいて、転写回路用のために統合ネットワークを構築した(図19DおよびPauken et al. Table S11 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)。このネットワークは、NFκB、IRF、およびbZip因子(AP-1ファミリー)の増加した活動、ならびに、PD-L1遮断時のNFAT、Egr2、およびNur77の減少した活動を同定した。この転写ネットワークの主な機能は、追加のTFファミリーが同定された2番目のネットワークアプローチを用いて要約された(たとえば、Runx、Nr2f6、Prdm1、Rarb、Pparg.Rxra、およびホメオボックスTF;図22およびPauken et al. Table S12 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165))。これらの変更が特定のTFにどのように影響するかをさらに調査するため、NFATを調査した。AP-1を使用するNFATは、多くのエフェクターフェーズ遺伝子をトランス活性化する。対照的に、AP-1に結合できない「パートナーレス」のNFATは、TEX遺伝子のサブセットを誘導する(Martinez、et al. Immunity 2015, 42:265-278)。ここでは、抗PD-L1処置時に、再活化されたTEXにおいてパートナーレスNFATのターゲットの発現が有意に減少し(図19E)、遮断後のこの転写回路の再配線を示唆する。
健康なドナー対黒色腫患者を比較した。抗PD-1抗体ペンブロリズマブ(pembro)で処置されたステージIV黒色腫の29人の患者を、本明細書に記載される臨床試験に登録した。すべての患者は以前に抗CTLA-4療法を受けていた(図23)。患者をpembroで処置し、治療前、および治療中は3週間ごとに合計12週間、血液を採取した。患者の62%は、公表されている試験と一致する、免疫RECIST(固形腫瘍における応答評価基準)基準に基づいて決定された客観的な臨床応答を有さなかった(Robert et al. N. Engl. J. Med. 2015, 372:2521-2532; Ribas et al. Lancet Oncol. 2015, 16:908-918)(図24a、図23)。
末梢血において再活化されたTEX細胞が検出された。次に、PD-1および他の抑制性受容体を共発現するCD8 T細胞がPD-1遮断の薬力学的効果を追跡する上でより高い精度を供するか否かを評価した。PD-1+ CTLA-4+ CD8 T細胞の循環集団は、主に、EomeshiT-betloおよびCD45RAloCD27hiであった(図28A)。さらに、PD-1+ CTLA-4+細胞の約50%が処理前にKi67を発現し、マウスにおけるTEX細胞に関するデータと一致し(Paley et al. Science 2012, 338:1220-1225)、これは処置後に約75%に増加した(図28B、28C)。PD-1+ CTLA-4- T細胞では、実質的により低いKi67発現があった(図28C)。第3の抑制性受容体(たとえば、2B4)の追加、または最近の記載に焦点を当ててPD-1+ CXCR5+ TCF-1+サブセット(Im et al. Nature 2016, 537:417-421; He et al. Nature 2016, 537:412-416)は、抗PD-1療法に応答する細胞についてさらに富化された(図28C、図29)。さらに、IFNγ産生PD-1+ CTLA-4+およびPD-1+ CXCR5+サブセットは、TEX細胞の活化と一致して、抗PD-1処置後に増加した(図29G)。
CyTOFのために、高次元の可視化および教師なしクラスタリングを用いた。PD-1はTEX細胞だけでなく、エフェクター、エフェクターメモリー、およびセントラルメモリーCD8 T細胞でも発現されることが知られている(Bengsch et al. PLoS Pathog. 2010, 6:e1000947; Duraiswamy et al. J. Immunol. 2011, 186:4200-4212)。実際に、メモリー(CCR7hi)およびエフェクター(CD27lo)集団は、PD-1を発現するCD8 T細胞の中にあった(図30A)。しかしながら、疲弊のマーカーを発現する第3の集団(たとえば、Eomes、CD39(Gupta et al. PLoS Pathog. 2015, 11:e1005177);図28D、図30E、30F)は、抗PD-1療法後に頻度およびKi67発現が増加されることも同定された(図30B〜30D)。この循環TEX細胞の集団は、抗PD-1療法の前後で、グランザイムBおよびパーフォリンの発現は低かったが、グランザイムAおよびKは高かった(図28E〜28G)。全CD8 T細胞からのRNA-seqは、処置後に強く変化したいくつかの転写産物を同定した(図31A、31B)。
血液からの応答性T細胞クローンが腫瘍において見つかった。ネオ抗原−および共有抗原−特異的T細胞の両方が、循環しているPD-1+ CD8 T細胞集団において同定されている(Gros et al. Nat. Med. 2016, 22:433-438)。さらに、血液中のこれらの細胞と腫瘍浸潤性T細胞との間にクローンの重複がある(Gros et al. Nat. Med. 2016, 22:433-438)。抗PD-1療法後のこれらの関係を調査するために、3人のレスポンダーと3人の非レスポンダーからの処置後のKi67発現のピークで、血液からのCD8 T細胞を分類し、T細胞受容体(TCR)レパートリーを、前処理腫瘍浸潤T細胞と比較した。上位10の腫瘍浸潤性T細胞クローンの多くは、臨床応答に関係なく、すべてのケースにおいて頻度による2つの最も豊富なクローンを含め、血液中および処置後に容易に同定可能であった(図32A、32B、図33A、表2)。
本明細書では、再活化/腫瘍比が臨床成績に影響を与えることが示される。より大きなベースライン免疫応答が臨床応答と相関する可能性があった。しかしながら、PD-1+ CD8 T細胞におけるより高い前処理Ki67レベルは、実際には予後不良の指標であった(図34A、上)。処置前のより大きな免疫応答は、それ自体が悪い予後指標である、より高い腫瘍負荷を反映し得る(図34A、下)。実際、抗PD-1療法で進行した患者は、ベースラインで全身性炎症の証拠があった(図34B、34C)。ランダムフォレスト分析では、Ki67単独は臨床結果と相関しないことを示した(データは示していない)。したがって、重要なのは再活化の絶対的な大きさではなく、腫瘍負荷に対するTEX細胞再活化の比率が臨床応答をよりよく予測し得るという仮説を立てた。これをテストするために、ベースラインの腫瘍負荷を調整した抗PD-1療法後のPD-1+ Ki67+ CD8 T細胞の倍率変化に関する臨床応答を調べた。無増悪生存期間(PFS)がより長い患者は、一般的に、腫瘍負荷が低く、PD-1+ Ki67+ CD8 T細胞対腫瘍負荷回帰線の倍率変化の上でクラスター化しており、このことは、腫瘍負荷に対するTEX細胞再活化の比率が臨床成績に関連し得ることを示唆する(図35A)。さらに、処置前後の両方の測定を必要とする倍率変化の代わりに、処置後のピークT細胞応答時点での腫瘍負荷に対するKi67+ CD8 T細胞のより高い比率は、より良い臨床成績と関連していた。レスポンダーはPD-1+ Ki67+細胞対腫瘍負担回帰線の上でクラスター化したが、非レスポンダーは大きく下回っていました(図35B)。分類および回帰ツリー(CART)分析は、治療に入る6週間の早期に、臨床結果によって患者を分離する、1.94のKi67対腫瘍負荷比を同定した。6週間での1.94より大きいKi67対腫瘍負荷比は、客観的奏効率、PFS、および全生存率により良好な結果と関連していた(図34D、図35C)。さらに、CyTOFにより、臨床的利益(完全応答、部分応答、および安定した疾患)を持つ3人の患者はTEX細胞の拡大を示したが、進行した患者はTEFF細胞の拡大を示し(図30G、30H)、このことは、TEX細胞の再活化が重要であるというアイデアを支持する。
疲弊したCD8 T細胞(TEX)は、それらをナイーブ(TN)、エフェクター(TEFF)およびメモリー(TMEM)T細胞から区別する主要な転写の変化を引き起こす(図37A)(Wherry and Kurachi. Nat Rev Immunol. 2015, 15(8):486-499)。癌モデルにおける同様の発症を伴い(Philip et al. (2017)Nature 545:452-456; Schietinger et al. (2016)Immunity 45:389-401)、慢性感染の約2週間後の慢性LCMV感染中に(Angelosanto et al. (2012)J Virol 86:8161-8170; Doering et al. (2012)Immunity 37:1130-1144)、疲弊の機能的および転写的特徴が発生する。本研究では、慢性LCMV感染時にTEXにおいて特に調節される遺伝子のコアシグネチャは、他の設定でTEXを同定および監視するために用いることができることが同定された。我々およびや他の人々(Doering et al. (2012) Immunity 37:1130-1144; Singer et al. (2016) Cell 166:1500-1511, e1509; Wherry et al. (2007) Immunity 27:670-684)は疲弊の転写シグネチャを以前に報告しているが、ここでの我々の目標とアプローチは明確であった。我々は、高度にTEXバイアスされた遺伝子のフォーカスされたセットを同定し、このシグネチャを他の疲弊の設定からの幅広いシグネチャに対して検証し、そして次に、個々の遺伝子のエピジェネティック情報を用いてシグネチャをさらに精密にし、これらのシグネチャをバルクRNAおよびエピジェネティックデータからヒトTEXの生物学を調べるための単一細胞法に変換するマスサイトメトリープラットフォームの開発を可能にすることを目的とした。
エピゲノムのリモデリングは、細胞の運命の決定の根底にあり、しばしば系統特異的な様式で遺伝子発現の安定性を制御する(Nashun et al. (2015)EMBO J 34:1296-1308)。したがって、エピジェネティックなパターンは、遺伝子発現よりも細胞同一性のより忠実な指標であり得る。たとえば、Th1およびTh2細胞では、T-betまたはGATA3は遺伝的に除去され得るが、これらのCD4 T細胞は、Th1およびTh2同一性の主要なエピジェネティックな特徴を保持する(Vahedi et al. (2012)Cell 151:981-993)。今日まで、トランスクリプトームのおよびエピジェネティックな変化を同時統合するTEXのシグネチャは開発されていない。理論に拘束されるつもりはないが、1つの仮説は、TEX特異的なエピジェネティックな変化((すなわち、オープンクロマチン領域(OCR:エンハンサーなど)におけるもの)も示すTEXにおいてユニークにアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる遺伝子が、疲弊のより強力かつ安定なシグネチャを供し得るということである。この仮説をテストするために、エンハンサーを、GSE86797およびGSE87646データセット(Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165; Sen et al. Science 2016, 354(6316):1165-1169)におけるハイスループットシーケンシング(ATAC-Seq)でのAssay for Transposase-Accessible Chromatinによるエピゲノムプロファイリングを用いて、TN、TEFF、TMEMと比較して慢性LCMV感染からTEXにおいて同定した。
TEXは慢性HIV感染のハロマークであり、CD4/CD8比が低下してウイルス負荷が上昇した場合に進行したHIV疾患において重度の疲弊が報告されている(Buggert et al. (2014) J Immunol 192:2099-2108; Hoffmann et al. (2016) PLoS Pathog 12, e1005661; Serrano-Villar et al. (2014) PLoS Pathog 10, e1004078)。理論に縛られることを望まないが、仮説は、上記で規定された集団ベースのエピゲノムの疲弊シグネチャを単一細胞プロファイリングアプローチに変換すると、HIV疾患におけるTEXの多様性に対する洞察を提供できるというものである。これにより、マスサイトメトリーパネルは、系統および他の分化状態を規定するための他のT細胞マーカーと一緒に16+エピゲノム的に選択された疲弊関連遺伝子を統合するように構築された。CyTOFによるさらなる分析のために選択された遺伝子は、サイトメトリー分析のための高品質の抗体の入手可能性に部分的に基づいて選択された。とりわけ、ADAM19、BHLHE41、DUSP4、GLP1R、GPR65、GPR155、IFI27、IFI44、PRDM1、PTPN13、RGS16、SLC22A15を含む、その他の潜在的に興味深いエピゲノム的に選択された遺伝子もさらなる分析のために利用できる。このCyTOFパネルのために選択されたタンパク質をコードする疲弊遺伝子は、さまざまな疾患での疲弊シグネチャの富化に対する高いリーディングエッジ寄与を有しており、このことは、この遺伝子のサブセットでさえ、疲弊の主要な特徴を象徴していることを示す(図39A、39B)。これらの選択された遺伝子/タンパク質が単一細胞データセットにおいて差別的な可能性を有するか否かを調査するため、およびCyTOFパネルのために選択された16 TEX標的をより大きなエピゲノム的に選択されたリストと比較するため、ヒト黒色腫腫瘍浸潤リンパ球(TIL)からの近年公開されたCD8 T細胞単一細胞トランスクリプトームデータセットのGene Set Variation Analysis(GSVA)を用いた(Tirosh et al. (2016)Science 352:189-196)。これらの分析は、a)すべてのエピゲノム的に選択された遺伝子とCyTOF選択された遺伝子セットとの両方が、さまざまな患者からのサンプルに対応するscRNA-seqデータにおけるかなりの変動を識別すること、b)CyTOF分析のために選択された遺伝子はより大きなエピゲノム的に選択された遺伝子リストに類似する識別能力を有することを示した(図44)。
このCyTOFパネルによって規定された複雑なTEX表現型を視覚化するため、最初に、tSNEベースの次元削減アプローチを、CyTOFによって分析された疲弊マーカーからの情報を統合するために用いた。非ナイーブCD8 T細胞の高次元疲弊データを「疲弊マップ」に表示した(図40A)。マップの隣接領域に局在する、密接に関連する高次元表現型を持つ細胞(図40B)。たとえば、PD-1の発現は、Eomes、複数の他のIR、およびCD127発現の不足と大きく重なった(図40B)。Eomesおよび他のIRを欠如するPD-1+細胞のより小さな領域も明らかで、おそらく活性化依存のPD-1発現を反映する。他の領域では、他のTEX遺伝子(CD38、CD39、Helios、TOXなど)の発現が異なるパターンで共発現していた(図40B)。この疲弊マップは、患者と疾患全体の疲弊状態の違いを調べるために用いた(図40C)。真正のウイルス特異的CD8 T細胞集団がこのランドスケープでマップされた場所を最初に調べた。CMVおよびインフルエンザウイルス(FLU)エピトープをターゲットとするウイルス特異的CD8 T細胞は、HIV特異的CD8 T細胞と比較して疲弊マップの異なる領域に配置され、このことは、ウイルス特異的CD8 T細胞の既知の分化パターンを区別するこのアプローチの能力を確認する(図40D)(Appay et al. (2008)Cytometry A 73:975-983)。さらに、HIV特異的CD8 T細胞は、FLU特異的およびいくつかのCMV特異的集団ではそうではないが、疲弊マップのPD-1+部分と重複した(図40B、40D)。したがって、ウイルス特異的CD8 T細胞の検査により、HIV、CMV、およびFLU特異的集団を区別する能力における疲弊マップが検証された。
上記のtSNEアプローチは、高次元空間におけるいくつかの関係の有用な視覚化を提供するが、データのかなりのダウンサンプリングを必要とし、場合によっては、高次元情報の損失により、データ構造のトポロジーの解釈を困難にし得る。これらのTEXデータおよび疾患の関連性に関する追加の洞察は、フェノグラフを用いる非冗長の高次元分析アプローチによって達成された(図41A)(Levine et al. (2015)Cell 162:184-197)。このアプローチは、クラスター同定の高い安定性を可能にし、ダウンサンプリングまたは次元的な削減を採用しない(Melchiotti et al. (2017)Cytometry A 91:73-84)。これらの分析においては、疲弊マーカーの発現パターンの高次元の表現型の類似性に基づいてグラフを作成した。次に、表現型的に規定された細胞の近隣を、密接に相互接続された細胞のクラスターに分割した。この分析は、疲弊マーカーの発現に基づいて25個のクラスターを同定した(30個のクラスターを計算したが、クラスターc14、c20、c22、c24、c30にはイベントがほとんど含まれていなかったため、以降の分析から除外した。STAR法を参照のこと)。この分析が、古典的に規定されたTN、TCM、TEM、およびTEMRAを表すクラスターを同定するか否かをテストした(図39C)。実際に、いくつかのフェノグラフクラスターは、表現型的に規定されたTNおよびTCM(c13、c15、またはc21などのクラスター)またはTEM(たとえば、クラスターc10、c11)もしくはTEMRA様細胞(たとえば、クラスターc10、c9、c23)の特徴を持つ集団と明確に関連していた(図41B、41C)。対照的に、PD-1+ CD8 T細胞へのクラスターの寄与は多様性を示し、集団の15%超に寄与する単一のクラスターはなかった(図41B)。この分析における約9〜12のクラスターには、3つまたはそれを超える(最大9)のIRの共発現に基づく推定されるTEXが含まれ(c1、c2、c3、c4、c9、c16、c18、c19、c27、c28、c29)、他方、9つのクラスターはTNおよび/またはTCM表現型に関連しており、<3 IRの細胞が含まれた。TEMおよびTEMRA表現型細胞は3〜8個の異なるクラスターに含まれた。特に、これらのクラスターの3つには、IRが3未満の細胞が含まれていたが、古典的に規定されたTEMおよびTEMRAを含む他のクラスターにもIRを発現するクラスターが含まれた(図41C)。この観察は、TEX表現型細胞がほとんどCD27+ CD45RA-(Bengsch et al. (2010)PLoS Pathog 6, e1000947; Huang et al. (2017)Nature 545:60-65)であり、CD27-CD45RA+表現型を獲得する追加のTEXを伴うTEM(CCR7-CD45RA-)の古典的な定義によって規定されるCD8 T細胞サブセットに分類されるという事実を反映している可能性が高い。したがって、これらの異なるCD8 T細胞集団を解析するには、この高次元のアプローチが必要である。
これらの分析がTEFFからTEXを区別できるか否かをテストするために、TEFFをインビトロで全PBMCまたはソートされたTN、TCM、TEM、もしくはTEMRAで開始して生産し、結果として得られるTEFFの機能的および表現型プロファイルを検査した。TEFFは、TEXをTEFFから区別する、高い多機能性、IFN-γおよびTNF共産生、ならびに低いFESスコアを有した。FESが高次元表現型にいかに関連するかをテストするため、tSNEを用いてTEXのフェノグラフに由来するクラスターをプロットし(図48)、FESを疲弊空間のこの簡略化されたクラスターマップに投影した(図42B)。正の疲弊スコアのクラスターは、このマップですぐ近くにある(図42B)。TEXクラスターにおける転写因子発現パターンの分析は、高いFESを伴うクラスターにおける高いEomesおよびTOXを示した(図42C)。対照的に、高いT-betおよびHeliosは、多くの細胞毒性分子を発現するTEXクラスターc9に存在した。最後に、TCF1はクラスターc1およびc16を含むTEXのサブセットによって発現されたが、この転写因子は非TEXにおいて最も高く(図42C)、TNおよびTMEMにおけるTCF1の主要な役割と一致していた。これらの結果は、高次元のTEXクラスターが異なる表現型、転写および機能特性を示すことを示した。
仮説は、重度のHIVに関連するTEXクラスター(「Disease Associated TEX」、(DAT))の、軽度の疾患に関連するもの(「Health Associated TEX」、(HAT))と比較した分布は、TEX生物学に基づく疾患状態の指標となり得るというものである(図42D)。この仮説をテストするために、FLU、CMV、またはHIV特異的T細胞を、FESが最も高い上位2または上位9のTEXクラスターの頻度の合計について、および、重度対軽度のHIV疾患に関連するクラスターの比率(TEX比率)について分析した。HIV特異的T細胞は、TEXクラスターの頻度が高く、FLUおよびCMV特異的T細胞と比較して、疾患関連対健常関連TEX クラスター(Disease Associated to Health Associated TEX clusters)の比率も高かった(図42E)。TEX比はまた、ART療法中の変化を明らかにし、健常関連TEX クラスター(Health Associated TEX clusters)が増加した(図42E)。HIV特異的CD8+ T細胞で観察されたこれらの発見は、健康な個体と比較したウイルス血症のHIV患者におけるTop2およびTop9のTEXクラスターの富化およびより高いTEX比を示し、治療によるいくらかの減少を示す、総CD8 T細胞のプロファイリングに拡張することができた(図42F)。重度または軽度のHIVとクラスターを関連付ける相関関係はウイルス血症の未治療患者から得られたが(図41)、TEXクラスターとCD4/CD8比との相関関係はART治療を受けた患者でも安定したままであった(図49)。したがって、TEX生物学の詳細な分析は、HIV疾患の変化に対する洞察を提供することができ、疾患のさまざまな段階に関与する疲弊の特定の機能を理解し、TEX生物学における変化が新しい治療アプローチにいかに関連付けられるかを同定するためのフレームワークを提供し得る。
1つの未解決の問題は、疲弊の主要な特徴がさまざまな疾患および/または組織部位において共有されるか否かである。この問題を調査するために、上記で概説したアプローチを用いて、末梢血、肺腫瘍、巨視的に影響を受けていない肺組織のサンプルを用いて、新たに診断された肺癌の患者からのCD8 T細胞を検査した。TNおよびTCM様の特徴を持つクラスター(c13、c15、c21)は、健康な対象と比較して肺癌患者PBMCにおいて減少した(図43A)。TEXクラスターc2およびc29、ならびにTILにおけるTEM/TEMRAクラスターc10における富化を含む、クラスター分布の大きな変化が血液、肺組織、およびTIL間で観察された(図43A)。組織レジデンシーにしばしば関与するCD103分子を発現するクラスターは、関与していない肺組織およびTILサンプル(c11、c18、c28など)において富化され、腫瘍微小環境においてさえTEX集団と非TEX集団の両方への肺組織のインプリントを示唆する(図43A)。TRM様集団は、FLU特異的細胞も含んだ(図47)。したがって、肺癌患者の気道におけるTEXの一般的な特徴を持つ細胞は、血液で観察されるものと重複するが、この解剖学的位置は、組織特異的プログラミングに関連し得るTEXおよび非TEX集団の変化にも関連付けられる。
これらのTILクラスターがいかに機能に関連するかを調べるため、短期のインビトロ刺激後にIFN-γ産生を検査した(図43B)。次に、サンプルを高および低IFN-γプロデューサーにグループ化した。上記で開発したFESクラスタリングアプローチ(図41)を用いて、健康な対象からのPBMCを、肺癌患者からのPBMC、肺組織からのCD8 T細胞、およびTILと比較するクラスター富化の変化をプロットした(図43C)。TILは、高および低IFN-γ機能性とも比較した(図43C)。肺がん患者からの血液は、TNおよびTCMクラスター(c13、c15)の顕著な損失およびTEXクラスターc4およびc9の富化があった。肺組織は、CD103を発現するc11、c18、c28などのクラスターについて富化された(図43C)。より機能的なTIL集団では、非TEXクラスターc11およびc18、ならびにクラスターc28が富化されたのに対し、低機能性TILでは、TEXクラスターc4、c27、およびc29が過剰に示された(図43C)。TEXの不均一性およびHIV感染における役割の評価を調整した後、これらの結果を用いて腫瘍の状況における疲弊および疾患の検査に情報を提供できるか否かを調査した。PBMCと比較して、肺およびTILからのCD8 T細胞は、上記で同定された上位2または上位9のTEXクラスターの合計において富化された(図43D)。さらに、TEX FESクラスター比は、隣接する肺と比較してTILサンプルにおいて強く増加した(図43D)。特定のクラスターを検査すると、c3、c4、およびc6はTILにおいて富化され、IFN-γ産生が低く、c8およびc29でも同様の傾向であった(図43E)。これらのクラスターはPD-1およびEomesを共発現し、多くは複数のIRの高い共発現も有した(図41C、43F)。対照的に、c28は、IFN-γ産生が高い腫瘍で過剰発現されていた(図43C、43E)。このクラスターは、CD103ならびにいくつかのPD-1および他の疲弊関連分子(CD39、CTLA4、TOXなど)を発現したが、Eomesのような重度の疲弊の他の特徴の発言および他のIR(たとえば、2B4、CD160、TIGIT)の最も高い発現を欠如し、HIVデータにおいて高いFESも有さなかった。高機能および低機能TILには「健康関連」TEXクラスター(上記で定義)が含まれたが、低機能TILは「疾患関連」TEXクラスターにおいて実質的に富化された(図43G)。これらの結果は、機能不全の腫瘍微小環境は、機能的なTRM様集団および軽度の疲弊特性からのより重度の機能不全TEXへの移行によって規定されることを示す。さらに、これらの分析は、疾患特異的富化(肺組織および肺TILにおけるCD103+クラスターの傑出など)への追加的洞察とともに、HIVおよび癌全体での保存されたTEX生物学を明らかにした。これらの結果は、組織、疾患の種類、および疾患の重症度にまたがるTEXの分化ランドスケープをつなぐために、エピゲノム的に誘導されたCyTOFアプローチを用いる能力を実証する。さらに、このアプローチは、共通のTEX生物学および疾患特異的特徴を明らかにする。
エンハンサーqPCR法の概要
1.標的細胞富化
A.テストする疾患のための関連する細胞は、適切な表面抗原(癌患者のためのPD1および/またはCD39など)を用いる磁気ビーズ分離によって、全血またはPBMCから富化した。
A.サンプル洗浄
(i)標的細胞を1.5mlエッペンドルフDNA Lo-Bindチューブに移し、650xgで4℃で7分間遠心した。(ii)培地を吸引し、500ulの冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)と交換した。次に、細胞を再び650xgで7分間、4℃で遠心した。(iii)次に、PBSを吸引し、別の500ulの冷PBSと交換した。細胞を再び650xgで7分間4℃で遠心した。
(i)PBSを吸引し、適切な量の細胞溶解培地(10 mM Tris-HCl pH8.0、10 mM NaCl、3 mM MgCl2、0.1%Tween20)と交換した。細胞溶解培地の量は、反応中の標的細胞の数に合わせて調整した(50,000細胞未満の場合は50ul、50,000細胞の場合は50ul、さらに1,000の標的細胞あたり1ulの溶解培地を追加)。(ii)P200ピペットで細胞を溶解培地で10回混合し、氷上で5分間インキュベートした。(iii)次に、細胞を650xgで10分間4℃で遠心した。
A.転位反応
(i)溶解溶液および細胞デブリを吸引し、適切な量の転位反応溶液と交換した。転位反応溶液の量は、反応中の標的細胞の数に合わせて調整した(25,000細胞未満の場合は25ul、25,000細胞の場合は25ul、さらに1,000の標的細胞あたり1ulの反応溶液を追加)。50ulの反応の場合、転位反応溶液には、25ulの2x ATAC TDバッファー(20mM Tris pH 7.5、10mM MgCl2、20%DMF)、22.5ulのNuclease-free UltraPure Water、2.5ulのTn5アダプターをロードしたトランスポザーゼ混合物(Illumina、FC-121-1031)が含まれる。(ii)細胞を転位溶液中でP200ピペットで10回混合し、37℃で45分間インキュベートした。
(i)転位された遺伝子材料の精製は、製造元の説明(Qiagen、28204)に従ってMinElute Reaction Cleanup Kitを用いて行った。(ii)サンプルは、11ulの溶出バッファー(EB; 10mM Tris、pH 8.0)でカラムから溶出させた。
A.ライブラリー増幅
(i)10ulの転位したDNAサンプルをAmplification Solution(10ulヌクレアーゼフリー水、25ulのNEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix(New England Biolabs、M0541)、2.5ulのN501プライマー、2.5ulのN701プライマー(Illumina、FC-121-1012)中で増幅した。サンプルを完全に混合し、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)8−ストリップ100ul反応チューブに移した。ライブラリー増幅は、次のプロトコルを用いて加熱蓋付きのサーモサイクラーで行った:1. 72℃- 5分、2.98℃- 30秒、3.98℃- 10秒、4.63℃- 30秒、5.72℃- 60秒。ステップ3〜5をさらに11回繰り返した。
(i)転位された遺伝子材料の精製は、製造元の説明(Qiagen、28004)に従ってMinElute PCR Purification Kitを用いて行った。(ii)サンプルは、20ulの溶出バッファー(EB; 10mM Tris、pH 8.0)でカラムから溶出した。
A.疾患特異的OCR
(i)疾患特異的OCRは、1)DESeq2、2)スペクトルまたはバイクラスタリング、3)ランダムフォレスト、を用いて患者のサンプルを通常のドナーと比較するさまざまな方法で同定する。ヒト疲弊、エフェクター、およびメモリーOCRのリストは、種間マッピングおよびマウスにおける規定されたCD8 T細胞サブセットを用いて生成されている(ドキュメント)。これらは、多くの疾患に関連している可能性がある。疾患のバイオマーカーとして用いることができる正常なドナーと比較した、黒色腫患者における血液非ナイーブCD8 T細胞およびTregにおいて異なるOCRが定義されている(ドキュメント)。
(i)陽性対照OCRは、正常なドナーおよび疾患患者におけるすべてのCD8 T細胞サブセットにおいてオープンであるゲノム領域として同定される。具体的には、候補の陽性OCRは、正常なドナーおよび疾患患者の間で有意ではないものとして選択される。このリストは、平均の上位四分位数、すべてのサンプルにわたるカウントの分散の最小四分位数、および160の最小ピーク長でフィルター処理され、次に分散でソートされる(低から高)。
(i)陰性対照OCRは、無関係な細胞型においてオープンであるが、ベッドツール・インターセクトによって決定されるCD8 T細胞サブセットにおいてはオープンでない領域として同定される。候補の陰性対照OCRのこのリストは、関連する各患者ATAC-seqサンプル(bedtoolsカバレッジ)の読み取りの数を計算するのに用いられ、次に患者サンプル全体のカウントの平均でソートされる(低から高)。
A.NCBI Primer-BLASTを用いて、次のパラメーターで2つのプライマー対を生成した:アンプリコンサイズ80〜120塩基対;最適プライマー融解温度60℃;最新のヒトまたはマウス参照ゲノムアセンブリでの特異性テスト。各OCR領域について、ピーク中心に最も近い上位2つのプライマーセットを選択した。各陽性対照OCR遺伝子座および疾患関連OCRについて、領域の中心50%をシーケンス入力に用いられる;陰性対照領域では、全体のピーク長が用いられる。
効率=-1+10(-1/slope)
qPCR分析は、R2値が0.95を超え、効率が90〜110%のプライマーに対してのみ有効と見なされよう。
A.転位および増幅されたcDNAサンプルをPCRグレードの水で33.3ng/mlの濃度に希釈した。「標準」曲線は、すべての増幅されたDNAをプールし、5ステップの5倍連続希釈を作ることによって生成した。100pg(3ul)の転位および増幅したDNAサンプル(または「標準」またはPCRグレードのウォーターブランク)を5ulのiTaq Universal SYBR Green Supermix(BioRad)およびそれぞれ1ulのフォワードおよびリバースプライマー(最終プライマー濃度500nMの場合)に加えた。サンプルを384ウェルプレートに3回重複で播種し、次に、サーマルサイクラーで次の条件で定量的に増幅した:1. 95℃- 30秒、2. 95℃- 1秒、3. 60℃- 20秒。ステップ2〜3をさらに39回繰り返した。4. 65〜95℃の勾配、2秒/ステップで0.5℃刻み(融解曲線分析用)
A.アレイの構築
(i)カスタマイズされた8 x 15,000マイクロアレイをAgilent Technologiesによってプリントした。アレイは、1,500の疲弊または疾患特異的OCRプローブ、500の陽性対照プローブ、500の陰性対照プローブ、ならびにハイブリダイゼーションおよびプリンティング品質管理用の500のプローブが含んだ。各プローブは、各アレイで5回、示した。カスタマイズされた各スライドに8つの同一のマイクロアレイをプリントし、8つのサンプルを同時に処理できるようにした。
(i)プローブは、各OCRピークセンターの上流の80塩基対および下流の80塩基対を単離することによって設計した。各160 merを30 bp間隔でユニークな60 merに分割し、NCBI BLASTを介して配列特異性をチェックした。マウスまたはヒトのRefSeqデータベースとの一致が1を超えるすべての60 merは破棄した。残りの60-merのうち、最も低いE-Valueを持つ2つをプローブ合成のために選択した。
C.マイクロアレイ分析のためのサンプル調製
(i)患者またはマウスからのOCRライブラリーは、上記のプロトコルに従って調製した。マイクロアレイ解析のために、Low Input Quick Amp Labeling Kit(Cy5, Agilent Technologies 5190-2307)を用いてラベルされたcRNAを生成した。サンプルをカスタムチップにロードし、One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysisテクニカルマニュアル(Agilent Technologies)に記載されるプロトコルに従ってスキャンした。
A.エンハンサーアクセシビリティの定量化は、2つのアプローチを用いて計算される:1)内部正規化:疾患関連OCRの相対的アクセシビリティが、患者サンプル内の陽性および陰性OCRと比較される。 2)外部正規化:疾患関連OCRのアクセシビリティが、合成標準と比較される。この分析は、各疾患関連OCRのアクセシビリティの絶対値を提供し、患者間の比較を可能にする。
ナイーブおよびエフェクターCD8 T細胞の生産。ナイーブマウスCD8 T細胞を単離するために、C57/Bl6マウスから脾臓を採取し、シリンジで70umフィルター上で分離した。細胞をフィルターを通してPBSで3回洗浄した。分離した細胞を、摂氏4度で7分間、1650 RPMでスピンダウンした。PBSを吸引し、1mlのAck Lysis Buffer(Invitrogen)で置き換えた。細胞をAck中で室温で5分間インキュベートした。溶解バッファーを、10%ウシ胎児血清(FCS)を含む10mlのPBSでクエンチした。次に、細胞混合物を別の70umフィルターに通して、細胞デブリおよび脂肪組織を除去した。細胞を1500 RPMで5分間、室温で遠沈させ、1億個の細胞あたり1mlの磁気分離バッファー(MSB、10%FCSおよび4mM EDTAを含むPBS)に再懸濁した。MSB 1 mlあたり50 ulの正常ラット血清を添加して、非特異的な抗体相互作用をブロックした。続いて、以下のビオチン化抗体を1:200希釈で加えた:抗CD4、抗NK1.1、抗CD19、抗B220、抗CD11c、抗CD11a、抗Ter119、抗CD44。MSB 1mlあたり125ulのストレプトアビジン磁気ビーズ(Miltenyi)を添加する前に、抗体−細胞混合物を室温で15分間インキュベートした。混合物を室温でさらに15分間インキュベートした後、MSBで総容量を3 mlにした。次にサンプルを穏やかに混合し、磁気分離器(StemCell)に室温で10分間置いた。非結合画分を15mlのコニカルチューブにデカントした。サンプルを10mlのPBSで2回洗浄し、次のステップまで氷上に置いた。
効率 = -1+10(-1/slope)
qPCR分析は、R2値が0.95を超え、効率が90〜110%のプライマーに対してのみ有効と見なした。
Delta Ct = Ctexperimental primer - (CtCD3g Pr 1 + CtCD3g Pr 2 + CtCD3e UTR 1 + CtCD3e UTR 2)/4
倍率変化アクセシビリティは、2-delta Ct を計算することにより、後に定量化した。
アッセイの概要と概略を図50に示す。最初に標的細胞が富化され、次に溶解されてクロマチンを収集し、次にこれは、オープンクロマチン領域(OCR)にのみ転位して統合することができる、Tn5アダプターをロードしたトランスポザーゼで処理される。このDNAライブラリーは、アダプタータグ付きの転置されたDNAのみが増幅される1回目の増幅にかけられる。続いて、疾患特異的OCRならびに陽性および陰性対照OCRに対するプライマーを伴い、これらの転位および増幅されたDNAライブラリーに対してqPCRが実行される。正常なドナーおよび患者の両方が対照オープンクロマチン領域において同様のアクセシビリティを有するはずであるが、疾患特異的OCRは患者でのみ定量化可能なアクセシビリティを有し、正常なドナーではそうではないはずである。最終的に、このアッセイは、ハイスループットアレイを介した多遺伝子座試験用にスケールアップすることができる。
図51は、アッセイのパフォーマンスを示し、PCR読み出しが直線的にスケーリングすることを示す。DNA「標準」は、すべてのサンプルからの増幅されたDNAをプールし、連続的に希釈することによって作成した。デルタctは、生のct値から最も高い標準の平均ct(またはサイクルしきい値)を差し引くことによって計算した;倍率変化のアクセシビリティは、その後、2-delta ctを計算することにより定量化した。これらの値をDNA濃度に対してプロットし、線形回帰を行って、代表的なプライマー対のR2値を計算した(図51、最上列)。代表的なプライマー対のPCR効率は、生のct値をDNA濃度に対してプロットして計算された線の傾きを用いて、次の式で計算した(図51、下の行):
効率= -1+10(-1/slope)
これらの代表的なプライマーセット(Tcf7、CD8、およびPD1)では、qPCR効率は比較的高くて100%に近く、このことは、ATAC転位および増幅から生成されたDNAに対するqPCRのアッセイ性能および信頼性を示す。
ナイーブCD8およびCD4 T細胞をマウスから単離し、マウスリンパ腫細胞株であるEL4細胞と比較した。アッセイの感度を評価するために、複数の細胞濃度を重複してテストした。様々な細胞型にわたる既知のアクセシビリティの代表的な遺伝子座(図52A)を相対的な開放性についてアッセイした。定量的な正規化は細胞型特異的参照遺伝子座を必要とするので、生のct値を用いてこれらの細胞型間の相対的な開放性を評価した。ここで、低いct値は増幅、したがって相対的な遺伝子座のアクセシビリティを示し、高いct値は増幅の欠如、したがって、相対的な遺伝子座の非アクセシビリティを示す。EL4細胞ではなくナイーブT細胞においてオープンである既知のクロマチン遺伝子座であるTcf7は、CD4およびCD8 T細胞においてより低いct値を示し、これは、相対的な開放性を示し、そして、EL4細胞におけるより高いct値はこの細胞型における非アクセシビリティを示す(図52B、上)。CD8遺伝子座のエンハンサーは、CD8 T細胞でct値が低く、CD4 T細胞およびEL4でct値が高いことを示し、このことは、適切な細胞型特異的クロマチン接近性を示す(図52B、中央)。最後に、CD4 T細胞(Treg)のサブセットであるEL4細胞においてオープンであることが知られているが、ナイーブCD8 T細胞にはない疲弊した、疲弊特異的PD1エンハンサー(Sen et al. Science. 2016、354(6316) :1165-1169)は、CD4 T細胞において増幅を示したがナイーブCD8 T細胞においてはそうでなかった(図52B、下)。多くのプライマーセットでは、細胞濃度の違いが信号強度の違いを示した:10Kおよび50K細胞のct値が低いほど、アッセイ信号が強いことを示す。
ナイーブCD8 T細胞を単離し、複数の陽性および陰性対照遺伝子座でのクロマチンアクセシビリティについてアッセイした。複数の細胞濃度および増幅サイクルをテストして、アッセイ感度を最適化した(図53)。さまざまなCD3遺伝子座におけるオープンクロマチン領域を、T細胞特異的表面およびアイデンティティマーカーとしてのCD3の役割により、陽性対照として選択した。2つの代表的な陰性対照遺伝子座は、NIH3T3線維芽細胞とCD8 T細胞サブセットとの間のATACseq分析を比較し、T細胞ではなくNIH3T3のみで富化されたピークを選択することにより、同定した。さまざまな細胞濃度および増幅サイクル数にわたって、ナイーブCD8 T細胞は、陽性対照遺伝子座(CD3gamma PrおよびCD3epsilon UTR)で同様の生ct値(約25)を生成し、これらのオープンクロマチン領域における均一な相対的クロマチンアクセシビリティを示す。陰性対照遺伝子座(Tinagl1およびCol1a2)では、生のCt値は、細胞濃度および増幅サイクル数に依存する、より大きな変動を示した。しかしながら、これらの生ct値は高く(ほとんどのサンプルで> 30)、これらの遺伝子座における増幅およびアクセシビリティの欠如を示す。陽性および陰性の両方の対照遺伝子座において、観察された変動の量が最も少ない条件は、12サイクルの増幅および50K細胞におけるものであった。
実施例23:陽性および陰性対照遺伝子座は、ナイーブおよびエフェクターCD8 T細胞間の適切な相対的クロマチンアクセシビリティを示す。
エフェクターCD8 T細胞をインビトロで生成し(Pipkin et al. Immunity. 2010、32(1):79-90)、同腹仔マウスから単離したナイーブCD8 T細胞と比較した。アッセイ感度を評価するために、複数の細胞濃度をテストした。T細胞特異的表面およびアイデンティティマーカーとしてのCD3の役割およびこれらの領域での既知のアクセシビリティのため、さまざまなCD3遺伝子座におけるオープンクロマチン領域を陽性対照として選択した(図54A)。代表的な陰性対照遺伝子座は、NIH3T3線維芽細胞とCD8 T細胞サブセットとの間のATACseq分析を比較し、T細胞ではなくNIH3T3のみで富化されたピークを選択することによって同定した。陽性対照遺伝子座、Cd3g PrおよびCD3e UTRにおけるナイーブおよびエフェクターCD8 T細胞の両方について、低いct値(約25)が生成され、これは、すべての条件でのアクセシビリティを示す(図54B、上および中央)。陰性対照遺伝子座Col1a2におけるすべての細胞濃度でナイーブおよびエフェクターCD8 T細胞の両方について、高いct値(> 30)が生成され、これは、この遺伝子座が均一に閉じていることを示す(図54B、下)。
エフェクターCD8 T細胞をインビトロで生成し(Pipkin et al. Immunity. 2010、32(1):79-90)、同腹仔マウスから単離されたナイーブCD8 T細胞と比較した。アッセイ感度を評価するために、複数の細胞濃度をテストした。IfngおよびIl2raを、エフェクター特異的遺伝子における既知の示差的なアクセシビリティを有する遺伝子座として選択し(図55A)、ナイーブおよびエフェクターCD8 T細胞間のアクセシビリティについて比較した。ナイーブCD8 T細胞は、高い生ct値(Ifng遺伝子座で25〜30、Il2ra遺伝子座で約30)を示し、これは、これらの遺伝子座における低い増幅およびこれによる低いアクセシビリティを示す(図55B、左パネル)。エフェクターCD8 T細胞は、さまざまな細胞濃度における生のct値における幅広い変動を示し、これは、様々な量の入力材料での示差的なアッセイ感度を示す。2K細胞の濃度では、生ct値はナイーブおよびエフェクターCD8 T細胞の間で類似していた。しかしながら、それぞれの個々のサンプルの陽性対照遺伝子座(Cd3g PrおよびCd3e UTR)全体のct値を意味するように生のct値を正規化し、これらの値から2^-delta ctを計算することによって定量化されたアクセシビリティの倍率変化は、IfngおよびIl2ra遺伝子座の両方においてナイーブ細胞と比較してエフェクター細胞において有意に増加した。さらに、正規化後、アクセシビリティ倍率変化の値は、異なる細胞濃度間で類似していた(図42B、右パネル)。
本明細書における変数の任意の定義における要素のリストの列挙は、任意の単一の要素またはリストされた要素の組み合わせ(またはサブコンビネーション)としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態またはその一部と組み合わせて、その実施形態を含む。
Claims (64)
- 疾患を有する対象において疾患状態に特徴的な疲弊したT細胞(TEX)集団を同定する方法であって、該方法が、
(a)対象からのT細胞を含む試料を得る段階と、
(b)前記疾患を有する対象からのT細胞において、1つまたは複数のT細胞系統特異的マーカーまたはT細胞系統特異的マーカーの組み合わせ、および1つまたは複数のT細胞疲弊特異的(TEX)マーカーまたはTEX特異的マーカーの組み合わせ、を含むマーカーのパネルの発現を測定する段階と、
(c)該マーカーのパネルの発現を、T細胞を含む対照試料におけるマーカーの同じパネルの発現と比較する段階と、
(d)前記疾患に特徴的な1つまたは複数のTEX集団を同定する段階であって、該疾患に特徴的なTEX集団が、T細胞を含む対照試料中のマーカーのパネルにおける同じ1つまたは複数のマーカーを発現するTEX細胞の数と比較して、前記疾患を有する対象からのT細胞におけるマーカーのパネルにおける1つまたは複数のマーカーの発現が上方制御または下方制御されている、より多数のTEX細胞を含む、段階と、
を含む、方法。 - 前記対象からのT細胞を含む試料が、血液、腹水、胸水、リンパ液、粘液、気管支肺胞洗浄液、または組織を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象からのT細胞を含む試料が、CD8+T細胞、腫瘍関連リンパ球(TAL)、または腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記T細胞系統特異的マーカーまたはTEX特異的マーカーの1つまたは複数の組み合わせが、2、3、4、または5のT細胞系統特異的マーカーまたはTEX特異的マーカーを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のT細胞系統特異的マーカーまたはT細胞系統特異的マーカーの組み合わせ、および1つまたは複数のTEX特異的マーカーまたはマーカーの組み合わせが、CD45RA+、PD-1-/CD127-、Tim-3MMI、LAG-3MMI、TCF1MMI、CCR7+、CD45RA+/CD27+、CD73+、CD27+、CD28+、CD26+、CD7MMI、CD127+、PD-1-/CD127+、Helios+、CD16+、Perforin+、CD57+、Granzyme B+ (GzmB+)、T-bet+、Granzyme K+ (GzmK+)、PD-1+/CXCR5+、CXCR5+、CD160+、TIGIT+、Eomesodermin+ (Eomes+)、2B4+、KLRG1+、Granzyme M+ (GzmM+)、PD-1+/2B4+/CD160+、PD-1+/2B4+、PD-1+/Eomes+、CD45RO+、PD-1+、PD-1+/CD127-、PD-1+/CD127+、CD200RMMI、CD103+、CTLA-4+、PD-1+/CTLA-4+、CD38+/CD39+、Ki67+、PD-1+/CD39+、HLA-DRMMI、CD38+、TOXMMI、CD39+、CD36+、およびPtger2MMIからなる群から選択され、かつ、前記マーカーまたはマーカーの組み合わせの発現が、発現の増加を示す(+)および発現の減少を示す(−)を用いる手動のゲーティングにより、または中央金属強度(median metal intensity)(MMI)により評価される、請求項1、2、3、または4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のT細胞系統特異的マーカーまたはT細胞系統特異的マーカーの組み合わせが、CD27+、CD45RA+、CCR7+、およびCD103+からなる群から選択され、かつ、前記1つまたは複数のTEX特異的マーカーまたはTEX特異的マーカーの組み合わせが、CTLA-4+、CD7+、CD73-、CD127-、CD39+、GzmK+、XCL1+、Helios+、PD-1+、CCR7-、IL-21+、TCF1-、CXCL10+、Eomes+、Amphiregulin+ (Areg+)、CD38+、TOX+、TIGIT+、CXCR5+、2B4+、IL-10+、LAG-3+、およびPtger2+からなる群から選択され、かつ、前記マーカーまたはマーカーの組み合わせの発現が、発現の増加を示す(+)および発現の減少を示す(-)を用いる手動のゲーティングにより評価される、請求項1、2、3、または4のいずれか一項に記載の方法。
- 1つまたは複数のT細胞系統特異的マーカーまたはT細胞系統特異的マーカーの組み合わせおよび1つまたは複数のTEX特異的マーカーまたはTEX特異的マーカーの組み合わせを含む前記マーカーのパネルが、
(a)PD-1+/CD39+、CD38+/CD39+、GzmK+、TIGIT+、TCF1+、2B4+、CD160+、CD7、Helios、CD103、Ptger2+、CTLA-4+、Tim-3+、LAG-3+;
(b)PD-1+、CD160+、TIGIT+、2B4+、CXCR5+、GzmK+、CD27+、TCF1+;
(c)CD38+/CD39+、CD16+、CXCR5+、Helios+、PD-1+/CD39+、CTLA-4-、2B4-、TIGIT-、CD160-、CD7+、Ptger2+;
(d)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、CD16+、Perforin+、CD57+、CD38+/CD39-、T-bet+、GzmK-;
(e)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、GzmK+;
(f)PD-1+、PD-1+/CD39+、CD39+、Ki67+、CD38+/CD39+、CTLA-4+、CD103+、CD200R+、Tim-3+、Lag-3+、CD28+;
(g)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、CD38+、GzmK+、Ki67+、HLA-DR+、CXCR5+、PD-1+/CD39+;
(h)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、GzmK-;
(i)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Helios+、CD16+、Perforin+、CD57+、PD-1++、Ki67;
(j)TIGIT+、Eomes+、GzmB-、CD160+、2B4+、T-bet+、Toxint; および
(k)TIGIT+、Eomes+、GzmB+、CD160+、2B4+、T-bet+、Tox+、CD16+、CD57+、Perforin+
からなる群から選択されるマーカーのセットを含み、かつ、
該マーカーまたはマーカーの組み合わせの発現が、増加した発現を示す(+)、(++)、または(+++)、中間の発現を示す(int)、および、減少した発現を示す(-)を用いる手動のゲーティングによって評価される、請求項5に記載の方法。 - 疾患を有する対象において疾患状態に特徴的なT細胞集団を同定する方法であって、該方法が、
(a)対象からのT細胞を含む試料を得る段階と、
(b)前記疾患を有する対象からのT細胞において、1つまたは複数のT細胞系統特異的マーカーまたはT細胞系統特異的マーカーの組み合わせ、および1つまたは複数のTEX特異的マーカーまたはTEX特異的マーカーの組み合わせ、を含むマーカーのパネルの発現を測定する段階と、
(c)該マーカーのパネルの発現を、T細胞を含む対照試料におけるマーカーの同じパネルの発現と比較する段階と、
(d)疾患に特徴的な1つまたは複数のT細胞集団を同定する段階であって、該疾患に特徴的なT細胞集団が、T細胞を含む対照試料において同じ1つまたは複数のマーカーを発現するT細胞の数と比較して、疾患を有する対象からのT細胞におけるパネルにおける1つまたは複数のマーカーの発現が上方制御または下方制御されている、より多数のT細胞を含む、段階と、
を含む、方法。 - 前記対象からのT細胞を含む試料が、血液、腹水、胸水、リンパ液、粘液、気管支肺胞洗浄液、または組織を含む、請求項8に記載の方法。
- 前記対象からのT細胞を含む試料が、CD8+T細胞、腫瘍関連リンパ球(TAL)、または腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む、請求項9に記載の方法。
- 前記T細胞系統特異的マーカーまたはTEX特異的マーカーの1つまたは複数の組み合わせが、2、3、4、または5のT細胞系統特異的マーカーまたはTEX特異的マーカーを含む、請求項8〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記パネルが、2B4、CCR7、CD103、CD127、CD16、CD160、CD200R、CD26、CD27、CD28、CD36、CD38、CD45RA、CD57、CD7、CD73、CTLA-4、CXCR5、Eomes、GzmB、GzmK、GzmM、Helios、HLA-DR、Ki67、KLRG1、LAG-3、PD-1、Perforin、PTGER2、T-bet、TCF-1、TIGIT、TIM-3、TOX、2B4/CD160/TIGIT、CD160/TIGIT、CD38/39、CD45RA/CD27、PD-1/CD127、PD-1/CD39、およびPD-1/Eomesからなる群から選択される少なくとも3つのマーカーまたはマーカーの組み合わせを含む、請求項11に記載の方法。
- 前記パネルが、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10のマーカーまたはマーカーの組み合わせを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記パネルが、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、または少なくとも20のマーカーまたはマーカーの組み合わせを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記マーカーのパネルが、
(a)PD-1+/CD39+、CD38+/CD39+、GzmK+、TIGIT+、TCF1+、2B4+、CD160+、CD7、Helios、CD103、Ptger2+、CTLA-4+、Tim-3+、LAG-3+;
(b)PD-1+、CD160+、TIGIT+、2B4+、CXCR5+、GzmK+、CD27+、TCF1+;
(c)CD38+/CD39+、CD16+、CXCR5+、Helios+、PD-1+/CD39+、CTLA-4-、2B4-、TIGIT-、CD160-、CD7+、Ptger2+;
(d)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、CD16+、Perforin+、CD57+、CD38+/CD39-、T-bet+、GzmK-;
(e)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、GzmK+;
(f)PD-1+、PD-1+/CD39+、CD39+、Ki67+、CD38+/CD39+、CTLA-4+、CD103+、CD200R+、Tim-3+、Lag-3+、CD28+;
(g)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、CD38+、GzmK+、Ki67+、HLA-DR+、CXCR5+、PD-1+/CD39+;
(h)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、GzmK-;
(i)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Helios+、CD16+、Perforin+、CD57+、PD-1++、Ki67;
(j)TIGIT+、Eomes+、GzmB-、CD160+、2B4+、T-bet+、Toxint; および
(k)TIGIT+、Eomes+、GzmB+、CD160+、2B4+、T-bet+、Tox+、CD16+、CD57+、Perforin+
からなる群から選択されるマーカーのセットを含み、かつ、
該マーカーまたはマーカーの組み合わせの発現が、増加した発現を示す(+)、(++)、または(+++)、中間の発現を示す(int)、および、減少した発現を示す(-)を用いる手動のゲーティングによって評価される、請求項13または14に記載の方法。 - 疾患を有する対象において疾患の進行を監視する方法であって、該方法が、
(a)対象からのT細胞を含む試料を得る段階と、
(b)前記疾患を有する対象からのT細胞において、1つまたは複数のT細胞系統特異的マーカーまたはT細胞系統特異的マーカーの組み合わせ、および、1つまたは複数のT細胞疲弊特異的(TEX)マーカーまたはTEX特異的マーカーの組み合わせ、を含むマーカーのパネルの発現を測定する段階と、
(c)該マーカーのパネルの発現を、T細胞を含む対照試料におけるマーカーの同じパネルの発現と比較する段階と、
(d)前記疾患に特徴的な1つまたは複数のTEX集団を同定する段階であって、該疾患に特徴的なTEX集団が、T細胞を含む対照試料中のマーカーのパネルにおける同じ1つまたは複数のマーカーを発現するTEX細胞の数と比較して、前記疾患を有する対象からのT細胞におけるマーカーのパネルにおける1つまたは複数のマーカーの発現が上方制御または下方制御されている、より多数のTEX細胞を含む、段階と、
(e)段階(a)、(b)、(c)、および(d)を1つまたは複数の後続の時点で繰り返す段階と、
(f)前記対象からのT細胞を含む第2の試料または後の試料が、該対象からのT細胞を含む第1の試料または前の試料よりも、前記疾患に特徴的なTEX集団において、より多数の細胞を含む場合に、疾患が進行していると決定する段階と、
(g)前記対象からのT細胞を含む第2の試料または後の試料が、該対象からのT細胞を含む第1の試料または前の試料よりも、前記疾患に特徴的なTEX集団において、より少数の細胞を含む場合に、疾患が進行していないと決定する段階と、
を含む、方法。 - 前記対象からのT細胞を含む試料が、血液、腹水、胸水、リンパ液、粘液、気管支肺胞洗浄液、または組織を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記対象からのT細胞を含む試料が、CD8+T細胞、腫瘍関連リンパ球、または腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記疾患が、急性ウイルス感染症または慢性ウイルス感染症である、請求項16、17、または18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患が、急性ウイルス感染症である、請求項19に記載の方法。
- 前記急性ウイルス感染症が、インフルエンザウイルスによる感染症を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記疾患が、慢性ウイルス感染症である、請求項19に記載の方法。
- 前記慢性ウイルス感染症が、サイトメガロウイルス(CMV)またはヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染による感染症を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記慢性ウイルス感染症が、HIVによるものであり、前記対象が抗レトロウイルス療法(ART)で処置中である、請求項23に記載の方法。
- 前記マーカーのパネルが、少なくとも1セットの、
(a)PD-1+/CD39+、CD38+/CD39+、GzmK+、TIGIT+、TCF1+、2B4+、CD160+、CD7+、Helios+、CD103+、Ptger2+、CTLA-4+、Tim-3+、およびLAG-3+;
(b)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、CD16+、Perforin+、CD57+、CD38+/CD39-、T-bet+、およびGzmK-;
(c)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Helios+、CD16+、Perforin+、CD57+、PD-1++、Ki67;
(d)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、CD38+、GzmK+、Ki67+、HLA-DR+、CXCR5+、およびPD-1+/CD39+
からなる群から選択される、TEX細胞の1つまたは複数の疾患関連集団(DAT)に特徴的な、T細胞系統特異的マーカーまたはT細胞系統特異的マーカーの組み合わせ、および、TEX特異的マーカーまたはTEX特異的マーカーの組み合わせ、を含み、かつ、
前記マーカーのパネルが、少なくとも1セットの、
(e)TIGIT+、Eomes+、GzmB+、CD160+、2B4+、T-bet+、Tox+、CD16+、CD57+、Perforin+;
(f)PD-1+、CD160+、TIGIT+、2B4+、CXCR5+、GzmK+、CD27+、TCF1+; および
(g)PD-1+/Eomes+、2B4+/CD160+/TIGIT+、GzmB+、Tox+、GzmK+
からなる群から選択される、TEX細胞の1つまたは複数の健康関連集団(HAT)に特徴的な、T細胞系統特異的マーカーまたはT細胞系統特異的マーカーの組み合わせ、および、TEX特異的マーカーまたはTEX特異的マーカーの組み合わせ、をさらに含む、請求項20または24に記載の方法。 - HATに対するDATの比率を計算する段階をさらに含む、請求項25に記載の方法。
- HATに対するDATの比率が、対象からのT細胞を含む第2の試料または後の試料において増加する場合に、疾患が進行しており、HATに対するDATの比率が、対象からのT細胞を含む第2の試料または後の試料において減少する場合に、疾患が進行していない、請求項26に記載の方法。
- 対象のT細胞の疲弊状態を決定する方法であって、該方法が、
(a)対象からのT細胞を含む試料を得る段階と、
(b)該T細胞を刺激または活性化する段階と、
(c)T細胞による、IFNγ、TNFα、IL-2、IL-10、IL-21、CCL3、CCL4、XCL1、およびアンフィレギュリンからなる群から選択される1つまたは複数のサイトカインおよび1つまたは複数のケモカインの生産を測定する段階と、
(d)次式:
FES=[(2×(%IFN+TNF-)-(%IFN-TNF+)-(%IL-2+))×(%CCL3/4+)]
(式中、「%IFN+TNF-」は、TNFαではなくIFNγを産生するT細胞の割合(%)を示し、「%IFN-TNF+」は、IFNγではなくTNFαを産生するT細胞の割合(%)を示し、「%IL-2+」は、IL-2を産生するT細胞の割合(%)を示し、「%CCL3/4+」は、CCL3および/またはCCL4を産生する細胞の割合(%)を示す)
のとおり機能疲弊スコア(FES)を計算する段階と、
(e)対象のT細胞の疲弊状態を決定する段階であって、FES> 0は対象のT細胞が疲弊していることを示し、FESが高いほど対象のT細胞の疲弊の程度が増加していることを示す、段階と、
を含む、方法。 - 前記対象からのT細胞を含む試料が、血液、腹水、胸水、リンパ液、粘液、気管支肺胞洗浄液、または組織を含む、請求項28に記載の方法。
- 前記対象からのT細胞を含む試料が、CD8+T細胞、腫瘍関連リンパ球、または腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む、請求項29に記載の方法。
- 疾患を有する対象において疾患の進行を監視する方法であって、該方法が、
(a)前記対象からのT細胞を含む試料を得る段階と、
(b)請求項28に記載の方法により該対象のT細胞の疲弊状態を決定する段階と、
(c)段階(a)および(b)を1つまたは複数の後続の時点で繰り返す段階と、
(d)前記対象からのT細胞を含む第2の試料または後の試料が、該対象からのT細胞を含む第1の試料または前の試料と比較して増加したFESを含む場合に、疾患が進行していると決定する段階、または
(e)前記対象からのT細胞を含む第2の試料または後の試料が、該対象からのT細胞を含む第1の試料または前の試料と比較して減少したFESを含む場合に、疾患が進行していないと決定する段階と、
を含む、方法。 - 前記疾患が、癌、ウイルス感染症、細菌感染症、および寄生体感染症からなる群から選択される、請求項31に記載の方法。
- 前記疾患がウイルス感染症である、請求項32に記載の方法。
- 前記ウイルス感染症が、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、アネロウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、およびインフルエンザウイルスからなる群から選択されるウイルスによるものである、請求項33に記載の方法。
- 前記ウイルスが、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、D型肝炎ウイルス(HDV)、E型肝炎ウイルス(HEV)、GB肝炎ウイルスA(GBV-A)、GB肝炎ウイルスB(GBV-B)、およびGB肝炎ウイルスC(GBV-C)からなる群から選択される肝炎ウイルスである、請求項34に記載の方法。
- 前記ウイルスが、アルファヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス1型(HSV1)、単純ヘルペスウイルス2型(HSV2)、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、ベータヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、ヒトヘルペスウイルス6、ヒトヘルペスウイルス7、ガンマヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス(EBV)、およびヒトヘルペスウイルス8からなる群から選択されるヘルペスウイルスである、請求項34に記載の方法。
- 前記ウイルスが、BKウイルス(BKV)、JCウイルス(JCV)、KIポリオーマウイルス(KIPyV)、WUウイルス(WUPyV)、メルケル細胞ポリオーマウイルス(MCPyV)、ヒトポリオーマウイルス6(HPyV6)、ヒトポリオーマウイルス7(HPyV7)、毛髪異形成棘状ウイルス(trichodysplasia spinulosa virus:TSPyV)、ヒトポリオーマウイルス9(HPyV9)、およびMWウイルス(MWPyV)からなる群から選択されるポリオーマウイルスである、請求項34に記載の方法。
- 前記ウイルスが、アデノウイルス血清型A、アデノウイルス血清型B、アデノウイルス血清型C、アデノウイルス血清型D、アデノウイルス血清型E、アデノウイルス血清型F、およびアデノウイルス血清型Gからなる群から選択されるアデノウイルスである、請求項34に記載の方法。
- 前記ウイルスが、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルス、およびスプマウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスである、請求項34に記載の方法。
- 前記レトロウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)およびウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)からなる群から選択されるレンチウイルスである、請求項39に記載の方法。
- 前記ウイルスが、インフルエンザウイルスA、インフルエンザウイルスB、インフルエンザウイルスC、およびインフルエンザウイルスDからなる群から選択されるインフルエンザウイルスである、請求項34に記載の方法。
- 前記疾患が、結核菌(Mycobacterium tuberculosis;MTB)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)、カンピロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)、大腸菌(Escherichia coli)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、サルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)、サルモネラ・ボンゴリ(Salmonella bongori)、およびコレラ菌(Vibrio cholerae)からなる群から選択される細菌感染症である、請求項32に記載の方法。
- 前記疾患が、原生動物および蠕虫からなる群から選択される寄生体感染症である、請求項32に記載の方法。
- 前記原生動物が、アカントアメーバ種(Acanthamoeba spp.)、バラムチア・マンドリラリス(Balamuthia mandrillaris)、ブラストシスチス種(Blastocystis spp.)、クリプトスポリジウム種(Cryptosporidium spp.)、二核アメーバ(Dientamoeba fragilis)、エントアメーバ・ヒストリチカ(Entamoeba histolytica)、ジアルジア・ランブリア(Giardia lamblia)、リーシュマニア種(Leishmania spp.)、ネグレリア・フォーレリ(Naegleria fowleri)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)、卵形マラリア原虫(Plasmodium ovale)、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)、二日熱マラリア原虫(Plasmodium knowlesi)、トキソプラズマ・ゴンディ(Toxoplasma gondii)、トリコモナス・ヴァギナリス(Trichomonas vaginalis)、トリパノソーマ・ブルセイ(Trypanosoma bruceii)、およびトリパノソーマ・クルジ(Trypanosoma cruzi)からなる群から選択される、請求項43に記載の方法。
- 前記蠕虫が、条虫、吸虫、および回虫からなる群から選択される、請求項43に記載の方法。
- 前記疾患が癌である、請求項32に記載の方法。
- 前記癌が免疫チェックポイント阻害剤での治療に対して応答性である、請求項46に記載の方法。
- 前記免疫チェックポイント阻害剤での治療に対して応答性の癌が、切除不能な黒色腫、転移性黒色腫、ステージIII黒色腫、転移性非小細胞肺癌(NSCLC)、NSCLC、頭頸部の再発性扁平上皮がん(SCCHN)、転移性腎細胞がん(RCC)、尿路上皮がん、肝細胞がん(HCC)、膀胱がん、結腸直腸がん、卵巣がん、および内皮がんからなる群から選択される、請求項47に記載の方法。
- 前記癌が、マイクロサテライト不安定性(MSI)を示す、請求項46に記載の方法。
- 前記疾患を治療する段階をさらに含む、請求項32に記載の方法。
- 疲弊したT細胞のエピジェネティックなフットプリント特性を同定するための方法であって、該方法が、
(a)疲弊したT細胞(TEX)を含む試料および活化された(invigorated)(すなわち、正常な、疲弊していない)T細胞を含む対照試料を得る段階と、
(b)両方の試料においてオープンクロマチン領域(OCR)を同定する段階と、
(c)TEXにおいて同定されたOCRを、活化されたT細胞において同定されたOCRと比較する段階と、
を含み、前記TEXのエピジェネティックなフットプリント特性が、TEXに存在し対照T細胞には存在しない1つまたは複数のOCRを含む、方法。 - 前記OCRが、(a)ATAC-seqライブラリーを作製し、(b)qPCRを実行し、そして、(c)配列決定すること、によって同定される、請求項51に記載の方法。
- 患者において疲弊したT細胞を検出するための方法であって、該方法が、OCRフットプリントを検出する段階を含み、該OCRフットプリントが、疲弊したT細胞と相関する、方法。
- 前記患者からのT細胞における前記OCRフットプリントが、該患者からの前記T細胞の集団からのクロマチンライブラリーに対して定量的PCR(qPCR)を行うことを含む方法によって決定される、請求項53に記載の方法。
- 前記qPCRの増幅産物に対してハイスループットアレイベースの試験を行う段階をさらに含む、請求項54に記載の方法。
- 多遺伝子座qPCR試験を行う段階をさらに含む、請求項54に記載の方法。
- 患者において疾患を治療するための方法であって、
(i)先の請求項のいずれか一項に記載の方法により患者において疲弊したT細胞を検出する段階と、
(ii)該疲弊したT細胞を再活化する(reinvigorating)段階と、
を含む方法。 - 前記T細胞が、患者またはT細胞に薬物を投与することにより、または、T細胞のゲノム操作により、再活化される、請求項57に記載の方法。
- 前記薬物が5-アザシチジン(Aza)、ゼブラリン、DNMT1阻害剤、たとえば、RG108、BETファミリータンパク質阻害剤、たとえば、I-BET726(BET726の阻害剤)、ヒストンアセチラーゼ(HAT)阻害剤、たとえば、クルクミン、ガルシノール、もしくはアナカルジアック酸、PCAFおよびp300を阻害するイソチオゾロン、Lys-CoA、C464、ヒストンメチル化阻害剤、たとえば、3-デアゼパノクリンA(DZNep)、HDAC阻害剤、たとえば、アミノスベロイルヒドロキサム酸、スベラニロヒドロキサム酸(SAHA、商品名Vorinostat)、またはACY-1215(HDAC6の阻害剤)である、請求項58に記載の方法。
- 前記ゲノム操作が、エピジェネティック経路における遺伝子をノックアウトすること、エピジェネティック経路における遺伝子をノックインすること、エピジェネティック経路におけるタンパク質コード遺伝子の機能を改変すること、エピジェネティックレギュレーターの発現を制御する位置における非コーディングゲノムを標的とすること、を含む、請求項58に記載の方法。
- 前記ゲノム編集が、CRISPR/Cas9ターゲティングを介して行われる、請求項58または60に記載の方法。
- 患者において疾患を治療するための方法であって、該方法が、請求項53〜61のいずれか一項に記載の方法により患者における疲弊したT細胞を同定する段階を含み、ここで、高優先度のエピジェネティック経路が同定され、T細胞が操作され、ここで、該高優先度のエピジェネティック経路が標的とされ、そして、該操作されたT細胞が患者に投与される、方法。
- 患者において疲弊したT細胞を検出するための方法であって、該方法が、OCRパネルを含むオープンクロマチン領域(OCR)アッセイを用いて、対照T細胞と比較して疲弊したT細胞に特有のOCRフットプリントを同定する段階を含む、方法。
- 前記疲弊したT細胞に特有のOCRフットプリントが、患者からの疲弊したT細胞からのクロマチンライブラリーに対してqPCRを行うこと、および、対照細胞からのクロマチンライブラリーに対してqPCRを行うことを含む方法により決定される、請求項63に記載の方法。
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