JP2021501156A - T細胞疲弊を予防および逆転するためのエピジェネティック標的および転写標的の同定 - Google Patents
T細胞疲弊を予防および逆転するためのエピジェネティック標的および転写標的の同定 Download PDFInfo
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Abstract
Description
この出願は、全体が引用により本明細書に組み込まれる、2017年10月27日に提出された米国仮出願第62/578,234号の優先権を主張する。
この発明は、国立衛生研究所(NIH)から授与された助成金番号AI105343、AI082630、AI082292、R37GM053256、および1-F30-AI-129263-01に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に所定の権利を有する。
T細胞機能不全の獲得状態であるT細胞疲弊(T cell exhaustion)は、癌および慢性ウイルス感染の特徴である(Wherry et al. (2007) Immunity 27:670-684(非特許文献1); Zajac et al. (1998) J. Exp. Med. 188:2205-2213(非特許文献2))。近年、癌におけるT細胞疲弊を逆転させる処置が著しく効果的であることが証明されている(Barber et al. (2006) Nature 439:682-687(非特許文献3); Topalian et al. (2012) New Engl. J. Med. 366:2443-2454(非特許文献4))。キメラ抗原受容体(CAR)−T細胞療法も、血液悪性腫瘍に極めて効果的であることが証明されている(Porter et al. (2011) New Engl. J. Med. 365:725-733(非特許文献5))が、固形腫瘍を治療するための操作されたT細胞における疲弊の発達は、その広範な使用に対する重要な障壁のままである(Long et al. (2015) Nat. Med. 21:581-590(非特許文献6))。T細胞疲弊を調節するメカニズムを同定することは、免疫チェックポイント遮断および癌免疫療法のための養子T細胞療法の有効性を改善し得る(Barber et al. (2006) Nature 439:682-687; Topalian et al. (2012) New Engl. J. Med. 366:2443-2454; Porter et al. (2011) New Engl. J. Med. 365:725-733(非特許文献3〜5))。
疾患を治療するのに用いるための改良された細胞治療組成物を作製する方法を供する。その方法は、
(a)対象からのリンパ球を含む試料を得る段階と、
(b)該リンパ球における疲弊した(exhausted)CD8+Tリンパ球(TEX)の誘導および/または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現を低減または排除する段階と、
(c)治療に関連する抗原を標的とするように該リンパ球を操作する段階と、
を含み、ここで、前記疾患は、癌および感染症から選択される。
からなる群から選択される。
(a)対象からの自己反応性リンパ球を含む試料を得る段階と、
(b)該自己反応性リンパ球における疲弊したCD8+Tリンパ球(TEX)の誘導および/または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現を増加させる段階と、
(c)治療に関連する抗原を標的とするようにリンパ球を操作する段階と、
を含む。
(a)対象からのリンパ球を含む試料を得る段階と、
(b)該試料における疲弊したCD8+エフェクターT細胞(TEX)に特徴的な1つまたは複数の遺伝子の発現を測定する段階と、
(c)TEXに特徴的な1つまたは複数の遺伝子の発現を、リンパ球を含む対照試料におけるTEXに特徴的な同じ1つまたは複数の遺伝子の発現と比較する段階と、
(d)段階(a)、(b)、および(c)を1または複数の後続の時点で繰り返す段階と、
(e)リンパ球を含む第2の試料または後の試料におけるTEXに特徴的な1つまたは複数の遺伝子の発現が、リンパ球を含む第1の試料または前の試料における発現と比較して増加している場合に、対象がT細胞の再活化を必要としていると決定し、または
(f)第2の試料または後の試料におけるTEXに特徴的な1つまたは複数の遺伝子の発現が、リンパ球を含む第1の試料または前の試料における発現と比較して同じか減少している場合に、対象がT細胞の再活化を必要としていないと決定する段階と、
を含む。
定義
別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関係する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の試験のための実施に用いることができるが、好ましい材料および方法が本明細書に記載される。本発明の説明および請求において、以下の用語が使用される。
本開示は、患者において疾患を治療するための方法および組成物を供する。その組成物は、エピジェネティック経路において1つまたは複数の変更を含む操作されたT細胞(たとえば、CD8+ T細胞)を含む。特定の実施形態では、操作されたT細胞の変更は、T細胞の疲弊(exhaustion)を防止、逆転または増加させる。特定の実施形態では、エピジェネティック経路は、高い優先度のエピジェネティック経路である。この方法は、本開示の操作されたT細胞を患者に投与する段階を含む。特定の実施形態では、操作されたT細胞の投与は、患者における免疫学的応答を増加させる。特定の実施形態では、患者は、別の処置、たとえば免疫チェックポイント遮断と同時に処置される。特定の実施形態では、免疫チェックポイント遮断は、少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤による処置を含む。特定の実施形態では、少なくとも1つの免疫チェックポイント阻害剤は、抗−PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM3、B7-H3、BTLA、VISTA、CD40、CEACAM1/CD66a、CD80/B7-1、CD86/B7-2、OX40/CD134、CD40 リガンド、ICOS リガンド/B7-H2、4-1BBL/CD137L、B7-DC/PD-L2/CD273、CD39/CD73、CD200/CD200R、LAG-3、TNFR2、KIRs、IDO、IL-10、IL-27、または TIGIT/CD226/CD112/CD122R/CD94抗体である。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路の標的化が、操作されたT細胞のエピゲノムを変化させる。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路のターゲティングは、Tox、SET、RuvBl1、RuvBl2、DPY30、Tox2、Stat1、Stat2、Ikzf2、Dnmt3a、Kdm4a、Bhlhe41、Nfat2、Eomes、Nr4a2、Tcf1、T-bet、Blimp-1、Id2、Zeb2、Nr4a1、Suv39h2、Csprs、Sfmbt1、Hmgn3、Chd9、Rnf2、Ikzf3、Kmt2e、Satb1、Tet1、Tet2、Tet3、Kdm5b、Sfmbt2、Actr6、および Prmt7のうちの少なくとも1つにおけるエピジェネティックな変化を含む。高優先度エピジェネティック経路をターゲットとすることは、転写因子、またはエピゲノムの形成、変更、もしくは維持に関与するタンパク質をコードする他の遺伝子をノックインまたはノックアウトすることを含む。高優先度エピジェネティック経路のターゲッティングは、T細胞疲弊に関連するOCRドメインの調節配列をノックインまたはノックアウトすることも含む。特定の実施形態では、T細胞疲弊に関連するOCRドメインは、表6に列挙されるものである。
本明細書に記載されるように、エピジェネティック経路は、細胞の「エピゲノム」またはエピゲノムの状態に寄与する任意の構成要素を含む。
本開示は、患者において疾患を治療する方法を供する。この方法は、操作されたT細胞を患者に投与することを含み、ここで、その操作されたT細胞は、1つまたは複数の高優先度エピジェネティック経路における1つまたは複数の変更を含む。特定の実施形態では、変更は、ゲノム工学アプローチを介して導入された遺伝子改変、またはエピジェネティックレギュレーターの阻害剤もしくは活性化剤を用いるエピジェネティックな改変を含む。特定の実施形態では、高優先度のエピジェネティック経路は、T細胞の疲弊を逆転させるか、防止するか、または増加させるために標的化されるか、または標的化されている。さらなる実施形態では、高優先度エピジェネティック経路は、T細胞の疲弊を逆転または防止するために標的化されるか、または標的化されている。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路は、ゲノム工学により、たとえばエピジェネティック経路における遺伝子をノックアウト/ノックインすることによって、またはエピジェネティック経路における遺伝子をコードするタンパク質の機能を変更することによって、標的化されている。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路は、エピジェネティックレギュレーターの発現を制御する位置における非コーディングゲノムの遺伝子工学によって標的とされる。たとえば、遺伝子の発現パターンを変化させるであろう欠失または改変され得る疲弊のエピジェネティックレギュレーターの遺伝子座においてオープンである疲弊特異的エンハンサーが存在する。高優先度エピジェネティック経路は、次の基準の一つを満たす遺伝子、遺伝子座、またはタンパク質である:a)エピジェネティックマークを生成または変化させる既知のまたは潜在的な役割を有する遺伝子/タンパク質、またはb)疲弊したT細胞において異なるエピジェネティックな修飾も有する転写プロファイリング研究に基づくT細胞疲弊において既知の役割を有する遺伝子。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路は、Tox、SET、RuvBl1、RuvBl2、DPY30、Tox2、Stat1、Stat2、Ikzf2、Dnmt3a、Kdm4a、Bhlhe41、Nfat2、Eomes、Nr4a2、Tcf1、T-bet、Blimp-1、Id2、Zeb2、Nr4a1、Suv39h2、Csprs、Sfmbt1、Hmgn3、Chd9、Rnf2、Ikzf3、Kmt2e、Satb1、Tet1、Tet2、Tet3、Kdm5b、Sfmbt2、Actr6、Prmt7、阻害性受容体および/またはT細胞転写因子をコードする遺伝子、ならびに他の関連T細胞遺伝子、たとえば、PD-1、CTLA-4、LAG-3、Tim3、CD200/CD200R、Ptger2、Ptger4、 T-bet、Eomes、Tox、Blimp1、BATF、AP-1ファミリーメンバー、IRF4、ならびに、Wherry et al.、Doering et al.、および/またはCrawford et al. (Wherry et al. Immunity 2007, 27:670-684 (全体が引用により本明細書に組み込まれる); Doering et al. Immunity 2012, 37:1130-1144 (全体が引用により本明細書に組み込まれる); Crawford et al. Immunity 2014,40(2):289-302 (全体が引用により本明細書に組み込まれる))に記載される他の遺伝子、のうちの少なくとも1つにおけるエピジェネティックな変化を含む。
特定の実施形態では、エピジェネティック経路に関連する標的、または本明細書で用いられるような、「エピジェネティック標的」は、細胞内において標的化される。特定の実施形態では、エピジェネティック標的は、Tet酵素(たとえば、Tet1、Tet2)、HDAC、Tox、Tox2、Csprs、Drud1、Sfmbt1、Chd9、Suv39h2、Sap30L、Hmgn3、BAZ2b、Prmt6、SET、Ruvbl1/2、DPY30、MLLタンパク質、Ezh1/2、PRC複合体、CBP、BET、および/または p300の少なくとも1つである。特定の実施形態では、エピジェネティック標的は、任意のヒストンアセチルトランスフェラーゼ、デアセチラーゼ、メチラーゼ、もしくはデメチラーゼ、または任意の他のエピジェネティック修飾酵素もしくはクロマチン修飾酵素の少なくとも1つである。特定の実施形態では、エピジェネティック標的は、エピジェネティックパターンを調節することができる酵素または細胞内タンパク質である。特定の実施形態では、エピジェネティック標的は転写因子である。特定の実施形態では、エピジェネティックな標的は、下流のエピジェネティックな経路を調節する細胞表面タンパク質である。特定の実施形態では、エピジェネティックな標的は、下流のエピジェネティックな経路を調節する細胞表面タンパク質である。特定の実施形態では、エピジェネティック標的は、SERTADI、XPA、HINT3、HIST1H1C、ZFP69、NR4A3、TNFAIP3、SAP30L、SPRY2、RYBP、TIPARP、YAf'2、GCHI、GTF2B、PCGF5、SFMBT1、METTL4、THAP6、EOMES、CPEB2、IRF9、PARP9、STAT1、TLR7、APOBEC1、ISG15、PARP12、STAT2、TFDP2、SETBP1、PARP14、IKZF2、TOX、HSPA1A、SP140、SPAG7、MYCBP、TRAPPC2、TCF4、RBL2、ALS2、IKZF3、IRF7、ELL2、MXD1、IRAK2、MXl1、UHRF2、LITAF、NR4A2、NR4A1、ID2、RORA、HIST1H2BC、TBX21、MARVELD2、HIF1A、P2RY14、P2RY13、EPAS1、IRAK3、XDH、ARAP2、EIF4E3、SWAP70、TRAPPC1、GADD45B、IRF4、HMGB2、ACADL、RBBPB、UBD、ZC3H12C、RILPL2、GNPTAB、PRDM1、CARHSP1、N4BP1、ATOH1、TAF9B、APOBEC2、LRRFIP2、NFIL3、および SAP30の少なくとも1つである。特定の実施形態では、細胞はT細胞である。特定の実施形態では、細胞は疲弊したT細胞である。
エピゲノムは、転写因子が機能するコンテキストを供する。グローバルなエピジェネティックな景観情報は、疲弊したT細胞について、以前には存在しなかったが、(PD1をエンコードする)Pdcd1遺伝子座の研究は有益であった。急性的に解決されたLCMV感染におけるPdcd1プロモーター領域の分析は、これらの領域がエフェクター・フェーズにおいて広く脱メチル化され、後に、感染が解決されてCD8+ T細胞メモリーが形成されるにつれて再メチル化されることを示しました。対照的に、慢性LCMV感染においてPdcd1遺伝子座は完全に脱メチル化され、ウイルスタイターおよび疲弊CD8+ T細胞によるPD1タンパク質発現が減少した場合でも、再メチル化は観察されなかった(Youngblood et al. Immunity. 2011, 35(3):400-12)。十分に制御されたHIV感染を調べた研究でも同様のデータが得られた(Youngblood et al. J Immunol. 2013, 191(2):540-4133)。本開示は、CD8+ T細胞疲弊における遺伝子発現のエピジェネティック調節が疲弊を防止または逆転できることを教示し、エピゲノムにおける疲弊の耐久性のある痕跡(imprint)の証拠を供する。
である。特定の実施形態において、転写標的は、以下:
である。特定の実施形態において、細胞はT細胞である。特定の実施形態において、細胞はCD8+ T細胞である。特定の実施形態において、細胞は疲弊したT細胞である。
特定の実施形態では、本発明は、癌または感染性疾患などの疾患を有する患者において免疫応答の増加に寄与する変化したエピゲノムを有するように操作された細胞(たとえば、T細胞)を供する。特定の実施形態では、本開示の操作されたT細胞は、高優先度のエピジェネティック経路における変更を含む。特定の実施形態では、T細胞は、疲弊したT細胞(TEX)である。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路は標的とされる。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路における変更は、ゲノム工学アプローチを介して導入された遺伝子改変、またはエピジェネティックレギュレーターの阻害剤もしくは活性化因子を用いるエピジェネティックな改変を含む。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路は、ゲノム工学により、たとえば、エピジェネティック経路における転写因子もしくは他の遺伝子をノックアウト/インすることによって、またはエピジェネティック経路におけるタンパク質をコードする遺伝子の機能を変更することによって、標的とされている。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路は、T細胞疲弊に関連するOCRドメインにおける調節配列をノックイン/ノックアウトすることによって標的とされる。特定の実施形態では、T細胞疲弊に関連するOCRドメインは、表6に列挙されるものである。特定の実施形態では、高優先度エピジェネティック経路の標的化は、T細胞の疲弊を防止、逆転または増加させる。さらなる実施形態では、高優先度エピジェネティック経路のターゲティングは、T細胞の疲弊を防止または逆転する。エピジェネティックな経路のターゲティングは、Tox、SET、RuvBl1、RuvBl2、DPY30、Tox2、Stat1、Stat2、Ikzf2、Dnmt3a、Kdm4a、Bhlhe41、Nfat2、Eomes、Nr4a2、Tcf1、T-bet、Blimp-1、Id2、Zeb2、Nr4a1、Suv39h2、Csprs、Sfmbt1、Hmgn3、Chd9、Rnf2、Ikzf3、Kmt2e、Satb1、Tet1、Tet2、Tet3、Kdm5b、Sfmbt2、Actr6、および Prmt7の少なくとも1つにおける1つまたは複数の変化を引き起こし得る。特定の実施形態では、エピジェネティック経路は、CRISPR/Cas9ターゲティングを介して薬物またはゲノム工学を用いてターゲティングされる。
疲弊したT細胞は、ナイーブ、エフェクター、および/またはメモリーT細胞と比較して、独特のエピゲノムを有する。この独特のエピゲノムは、本明細書では「エピゲノムのシグネチャ」と呼ぶ。エピゲノムのシグネチャは、TEXにおいてユニークに表現される遺伝子のシグネチャを含む。
を含む。TEXに特異的な転写およびエピジェネティックな変化の異種間同定を組み合わせた新規のアプローチを用いた。マウスのリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)モデルにおいて、正規T細胞集団(ナイーブ、エフェクター、メモリーT細胞)と比較してTEXにおいて特異的に上方制御される遺伝子を同定した。この遺伝子のセットの中で、オープンクロマチン領域内でユニークなTEX特異的エピジェネティック変化を有するサブセットを、ATAC-seq分析に基づいてさらに選択した(Pauken et al Science 2016, 354(6316):1160-1165)。エピジェネティックに選択された遺伝子は、シグネチャ富化のリーディングエッジで典型的に蓄積する他のデータセットで富化を駆動するため、このシグネチャは、以前の疲弊シグネチャよりも優れる。
T細胞の疲弊は、通常、エフェクター機能の進行的および階層的喪失、複数の抑制性受容体の持続的なアップレギュレーションおよび同時発現、主要な転写因子の発現およびと使用の変化、代謝攪乱、ならびに静止状態への移行の失敗など、いくつかの特徴的な機能を伴って顕在化し、抗原非依存性のメモリーT細胞恒常性応答を獲得する。T細胞の疲弊は、マウスにおける慢性ウイルス感染において最初に記述されたが、それは、HIVおよびC型肝炎ウイルス(HCV)などの感染中のヒトにおいて、ならびに癌においても観察されている。重要なことに、T細胞の疲弊は感染症および腫瘍の最適な制御を妨げるが、たとえばプログラムされた細胞死タンパク質1(PD1)および細胞傷害性Tリンパ球抗原4(CTLA4)を標的とすることにより、疲弊において過剰発現される経路を調節することにより、この機能不全の状態を逆転させ、免疫応答を再活化(reinvigorate)することできることである。しかしながら、これらの免疫応答は患者においてまれにしか耐久性がない。特定の実施形態では、患者は疾患を有し、本開示の操作されたT細胞で処置される。特定の実施形態では、疾患は癌である。特定の実施形態では、疾患は感染性疾患である。
特定の実施形態では、患者は、本開示の操作されたT細胞を投与される。ここで、そのT細胞は、T細胞の疲弊を防止、逆転または増加させるように操作されている。さらなる実施形態において、患者は、T細胞の疲弊を防止または逆行するように操作されている、本開示の操作されたT細胞を投与される。特定の実施形態では、T細胞は、本明細書に記載されるように、T細胞における高優先度エピジェネティック経路を標的とすることによって操作されている。特定の実施形態では、操作されたT細胞の投与は、患者における免疫学的応答を増加させる。特定の実施形態では、疾患を有する患者は、操作されたT細胞が投与される前に、1つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤で疾患について治療される。特定の実施形態では、操作されたT細胞を投与する前に、患者は、1つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤で処置される。特定の実施形態では、操作されたT細胞は、免疫チェックポイント阻害剤と同時にまたは同時発生的に投与される。
特定の実施形態では、非ヒト抗体はヒト化することができる。ここで、抗体の特定の配列または領域は、ヒトにおいて自然に産生される抗体との類似性を高めるように改変される。たとえば、本発明において、抗体またはその断片は、非ヒト哺乳動物scFvを含み得る。一実施形態では、抗原結合ドメイン部分はヒト化されている。
急性感染またはワクチン接種の間に、ナイーブT細胞は活性化され、1〜2週間にわたってエフェクターT細胞に分化する。この分化は、強力な増殖、転写、エピジェネティックおよび代謝的再プログラミング、ならびにエフェクター機能、変化した組織ホーミング、および劇的な数値的拡大などのエフェクターT細胞の基本的な特徴の獲得を伴う。エフェクターの拡大のピーク、炎症の解消、および抗原のクリアランスに続いて、ほとんどの活性化T細胞は死ぬが、サブセットは存続し、メモリーT細胞プールに移行する。これらのメモリーT細胞は、エフェクターT細胞の活性化プログラムの多くをダウンレギュレートするが、それらは、再刺激時にエフェクター機能を迅速に再活性化する能力を維持する。さらに、メモリーT細胞は、抗原非依存性の自己再生の重要なメモリー特性を発達させる。これは、インターロイキン-7(IL-7)とIL-15によって駆動される幹細胞のような遅い分裂の一種である。急性感染またはワクチン接種後のメモリーT細胞サブセットおよび分化には、かなりの多様性および複雑性がある(たとえば、エフェクターメモリーT細胞と中央メモリーT細胞)。しかしながら、機能的で持続的なメモリーT細胞の発達の重要な側面は、エフェクターフェーズの後、メモリー発達が、進行中の抗原刺激および高レベルの持続的な炎症がない状態で発生することである(Wherry and Kurachi. Nat Rev Immunol. 2015, 15(8):486-499)。
疲弊したT細胞は不活性ではない。それらは、進行中の病原体の複製または腫瘍の進行を制限する、最適ではないが重要な機能を保持する。疲弊したT細胞によって媒介されるこの宿主−病原体の膠着状態にもかかわらず、これらの細胞は病原体または腫瘍を根絶するのに効果的ではなく、疲弊を回避または逆転することに大きな関心が寄せられている。T細胞の疲弊が終末期または不可逆的な運命ではなく(少なくとも集団レベルで)可逆的であることの実証は、免疫療法を用いて免疫を改善する実質的な臨床機会を供する。これらのヒト治療の免疫学的効果は完全に規定されていないが、新たな結果は、ヒトにおけるT細胞疲弊の逆転が、PD1経路を遮断する剤を受容している多くの患者に見られる顕著な抗腫瘍効果の原因となるメカニズムであるという考えを支持する。
抑制性受容体は、自己反応性および免疫病理学を制御する重要な負の調節経路である。抑制性受容体は、活性化中に機能的エフェクターT細胞において一時的に発現されるが、抑制性受容体のより高く持続的な発現は、疲弊T細胞の特徴である。PD1リガンド1(PDL1)および/またはPDL2の結合に応答してPD1によって媒介される抑制性シグナル伝達経路は、例示的な例を提供する。抑制性受容体PD1がT細胞疲弊を制御する分子メカニズムについての我々の理解は不完全であり、理論に縛られることを望まないが、PD1などの抑制性受容体がT細胞機能を調節するメカニズムはいくつかある:最初に、外部ドメイン競合によるもの。これは、標的受容体またはリガンドを隔離する、および/またはマイクロクラスターおよび脂質ラフト(たとえば、CTLA4)の最適な形成を防止する阻害性受容体を指す;第2に、細胞内メディエーターの調節を介するもの。これは、TCRおよび共刺激受容体などの活性化受容体からの陽性シグナルの局所的および一過性の細胞内減衰を引き起こし得る;ならびに、第3に、抑制遺伝子の誘導を介するもの。
以下の実験例を参照することにより、本発明をさらに詳細に説明する。これらの例は、説明のみを目的として提供されており、特に指定のない限り、制限することを意図したものでない。したがって、本発明は、以下の実施例に限定されると決して解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになる任意のすべての変形を包含すると解釈されるべきである。
5〜6週齢のメスのC57BL/6およびB6-Ly5.2CR(Ly5.1を発現するB6マウス)は、Charles River(NCI strains)から購入した。C57BL/6 P14マウスをB6-Ly5.2CRマウスと交配して、記載されるようにP14 Ly5.1+マウスを生成した(Odorizzi et al. J. Exp. Med. 2015, 212:1125-1137)。LCMV株(Armstrong(Arm)およびクローン13)を増殖させ、記載されるとおりに力価を測定した(Odorizzi et al. J. Exp. Med. 2015, 212:1125-1137)。特定の実施形態では、C57BL/6 P14、Toxf/f CD4Cre+ P14、およびToxf/f Ert2Cre+ P14マウスを自家交配し、移植後の急性拒絶反応を予防するためにNCI C57BL/6マウスと戻し交配した。LCMV株(Armstrong(Arm)およびクローン13)を増殖させ、前述の通り力価を測定した。B6マウスに腹腔内(i.p.)に2x105 PFU LCMV Armを、または静脈内(i.v.)に4x106 PFU LCMVクローン13を感染させ、それぞれ急性感染または持続感染を確立した。特定の実施形態では、感染後25〜30日目の間、50:50 Kolliphor/エタノールに溶解させた2mgのタモキシフェン(Sigma)を毎日マウスにIP注射した。すべてのクローン13感染について、CD4 T細胞を、LCMVクローン13で、-1および+1 日p.i.に、200μgの抗CD4(クローンGK1.5、Bio X Cell)をi.p.注入することにより枯渇させた。抗PD-L1(クローン10F.9G2、Bio X Cell)またはアイソタイプ対照抗体(Rat IgG2b、Bio X Cell)を、記載されるように、22〜25 日p.i.の間に開始し、3日ごとに5回の注射の200μg/注射を5回の合計処置で、i.p.投与した(Barber et al. Nature 2006, 439, 682-687)。いくつかの実験では、対照としてビヒクル(PBS)を注射した。IL-7をインビボで投与した実験では、サイトカインは抗IL-7と複合体化させて安定性を高めた。これらの実験のために、IL-7/抗IL-7免疫複合体(i.c.)を記載されるように調製した(Boyman et al. J. Immunol. 2008, 180:7265-7275)。簡単に言うと、注射あたりマウス1匹あたり1.5μgの組換えヒトIL-7(NCI Preclinical RepositoryまたはBiolegend)および7.5μgの抗ヒト/抗マウスIL-7(Charlie Surh提供のクローンm25)を混合し、30分間、複合体化させ、その後、注射用PBSで希釈した。複合体は抗PD-L1と同時にi.p.投与した(5回の注射で3日ごと)。すべてのマウスはUniversity of Pennsylvaniaで特定の無菌条件下で維持し、すべてのプロトコルはInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。
P14細胞を監視する実験では、P14トランスジェニックマウスの末梢血からヒストパク1083グラジエント(histopaque 1083 gradients、Invitrogen)を用いてP14細胞を単離し、P14細胞(クローン13実験では500、Arm実験では500〜2000)を感染の少なくとも1日前に5〜6週齢のレシピエントB6マウスにi.v.で養子移入した。P14細胞を内因性DbGP33+およびDbGP276+細胞と比較した場合に同様の結果が得られ(図5)、以前の報告では、クローン13実験のために移入されたP14細胞の数(500)がウイルスロードに影響を与えなかったことを示している(Odorizzi et al. J. Exp. Med. 2015, 212:1125-1137; Blattman et al. J. Virol. 2009, 83:4386-4394)。TMEM、TEX、または抗PD-L1処理TEXを養子移入した実験では、CD8 T細胞は、抗体処理期間の1日後に脾臓から単離し、製造元の指示にしたがってCD8 T細胞EasySep陰性選択キット(Stem Cell Technologies)を用いて富化した。番号は、抗原のないレシピエントマウスへのi.v.養子移入前のDbGP33テトラマー染色に基づいてグループ間で正規化した。LCMV免疫マウス(30+日p.i.)を抗原のないレシピエントとして用いたため、内因性LCMV特異的メモリーは、記載されるように任意の移入されたウイルスを排除することができた(Angelosanto et al. J. Virol. 2012, 86:8161-8170)。抗原非依存的持続性をテストする実験では、レシピエントマウスはLCMV Armに免疫性であった(30+日pi)。再チャレンジ実験では、レシピエントマウスは、記載されるようにGP33エピトープを欠如するLCMVクローン13 V35Aによる低用量(200 PFU)感染を以前に解消していた(Shin、et al. J. Exp. Med. 2007, 204:941-949)。V35A免疫マウスは、内因性DbGP33特異的メモリーCD8 T細胞との直接の競合を防ぐためにリコール実験に用いた。
MHCクラスIペプチド四量体(DbGP276およびDbGP33)は、前述の通り作成するか、またはNIH四量体コアから取得した。抗体は、eBioscience、BD、Biolegend、Life Technologies、R&D Systems および AbD Serotecから購入し、CD8、CD4、B220、CD45.1、CD45.2、CD44、CD122、CD127、PD-1、2B4、Tim-3、Lag-3、Ki-67、granzyme B、IFNγ、TNFα、および phospho-STAT5が含まれる。単一細胞懸濁液は、製造元の指示に従ってLive/Dead Aqua(Life Technologies)で染色した後、表面抗原について染色した。Ki-67およびグランザイムBについての細胞内染色は、製造元の指示(eBioscience)にしたがってeBioscience Foxp3固定化/透過化キットを用いて行った。ブレフェルジンAおよびモネンシン(BD)の存在下で0.2μg/mlのgp33-41ペプチド(KAVYNFATM、GenScript)を用いて5時間のインビトロでの再刺激を行った後、製造元の指示(BD)にしたがって、BDサイトフィックス/サイトパームキットを用いて、IFNγおよびTNFαの細胞内染色を行った。phosho-STAT5検出では、刺激の前に脾細胞を37℃で1〜2時間、休ませた。細胞を10 ng/mlの組換えマウスIL-7またはIL-15(Peprotech)で30分間刺激した。次に、細胞を37℃で15分間、パラホルムアルデヒドで固定し、1回洗浄し、直ちにPhospho Perm Buffer III(BD)に再懸濁し、氷上で30分間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、製造元の指示に従って染色した。細胞をLSR IIフローサイトメーター(BD)で収集し、FlowJoソフトウェア(Tree Star)を用いてデータを分析した。ソーティングはFACS Aria(BD)で行い、ソートのクオリティーを決定するために、ソート後の純度を得た。
マイクロアレイによる転写プロファイリングのために、最終的な処置の1〜2日後の脾臓からのCD8 T細胞(上記のように合計5回の処置を受けた後)を、磁気ビーズ(CD8陰性選択キット、Stem Cell Technologies)を用いて富化し、DbGP276+ CD8 T細胞をFACSAria(BD)でソートした。実験ごとにグループごとにプールした10〜12匹のマウスで、各処置グループに対して4つの独立した実験を行った。RNAは、製造元の指示に従ってTRIzol(Life Technologies)で単離した。RNAをプロセッシングし、増幅し、ラベルを付け、University of Pennsylvania Microarray FacilityのAffymetrix GeneChip MoGene 2.0 STマイクロアレイにハイブリダイズさせた。マイクロアレイデータは、以前に記載されるように処理および分析した(Doering et al. Immunity 2012, 37:1130-1144)。Gene Patternのヒートマップモジュールを、異なって発現された遺伝子を同定して表示するために用いた。遺伝子セット富化分析およびリーディングエッジのメタ遺伝子分析は、記載されるように行った(Godec et al. Immunity 2016, 44:194-206)。抗PD-L1のためのメタジーンを、抗PD-L1を対照TEXと比較するマイクロアレイデータセットを用いて同定した。TEFF(LCMV Arm感染後8日目)、TMEM(LCMV Arm感染後30日目)、およびTEX(LCMVクローン13感染後30日目)細胞のメタジーンは、以前に公開された転写プロファイルを用いてナイーブT細胞と比較することによって生成した(Doering et al. Immunity 2012, 37:1130-1144)。メタ遺伝子の組成と比較の詳細は、Pauken et al. Table S4 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)に見出される。図2Cに示すエフェクター遺伝子リストを作成するために、我々は、(Doering et al. Immunity 2012, 37:1130-1144)におけるナイーブと比較した6日後Armで上方制御されたトップ300の遺伝子で開始した。次に、6つの主要な細胞周期ターム(細胞周期、有糸分裂、紡錘体、DNA複製、有糸分裂細胞周期、および細胞周期)でGOメンバーシップを有する遺伝子が削除した。このリストは、Pauken et al. Table S3 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)に示される。
CD8 T細胞は、磁気ビーズ(CD8ネガティブ選択キット、Stem Cell Technologies)を用いて富化し、P14 CD8 T細胞(8日 pi Arm(プールした実験あたり5の脾臓)、33日 pi Arm(プールした実験あたり12〜13の脾臓)、35日 piクローン13(コントロール処理プールの実験で15の脾臓、抗PD-L1処理プールの実験で7匹のマウス))またはナイーブCD8 T細胞(プールした2〜3の脾臓から)をFACSAria(BD)でソーターした。対照および抗PD-L1処理TEX細胞を、上記のように、最終処理(合計5処理、3日ごと)の1日後にソートした。条件ごとに2つの独立した実験を行った。ATAC-seqは、記載されるように行った(Buenrostro et al. Nat. Methods 2013, 10:1213-1218)。簡単に言えば、核を、10 mM Tris-HCl、10 mM NaCl、3 mM MgCl2、および0.1%IGEPAL CA-630の溶液を用いて、複製ごとに50,000〜150,000のソートされた細胞から単離した。核単離の直後に、転移反応を、Tn5トランスポザーゼおよびTDバッファー(Illumina)を用いて37℃で45分間、行った。転移されたDNA断片は、Qiagen MinElute Kitを用いて精製し、デュアルインデックスでバーコード化し(Illumina Nextera)、そしてNEBNext High Fidelity 2x PCRマスターミックス(New England Labs)を用いてPCR増幅した。シーケンシングライブラリのサイズ分布およびモル濃度は、Agilent BioanalyzerおよびKAPA定量RT-PCR(KAPA Biosystems)を用いることにより決定した。シーケンシングは、NextSeq 500(Illumina)でV2 chemistryを備えた高出力150サイクルキットを用いて行った。ペアエンドリードは、Bowtie2を用いてmm10リファレンスゲノムにマッピングした。一致してマッピングされたペアのみを、さらなる分析のために保持した。MACS v1.4を用いてピークコーリングを行い、シーケンスタグ富化の領域を同定した。BedToolsを用いて、同定されたピーク間の共通の交差点を見出し(1bp最小オーバーラップ)、マージされたピークリストを作成した。ATAC-seqタグ濃縮、マージされたピークリスト全体のDNAモチーフ分析、およびGOターム評価を、HOMER(homer.salk.edu)を用いて計算した。主成分分析、スペクトル共クラスタリング、および階層的クラスタリングを、scipy、matplotlab、およびscikit-learnを用いて行った。REVIGOは、異なる細胞型にまたがるユニークなGOタームを同定するために用いた。ピークのリストをいくつかのダウンストリーム分析用にフィルタリングして、全部で5つの細胞型にわたって富化が低いピークを削除した(第3四分位)。
TEXのユニークなエピジェネティックな景観に基づく統合された転写ネットワークを構築するために(図19D)、ウェリントンブートストラップ(Piper et al. BMC Genomics 2015, 16:1000)を最初に用いて、5つの細胞型(TN、TEFF、TMEM、TEX、抗PD-L1処理TEX)のすべての順序付けられたペアについて20セットの差分フットプリントを計算することにより精査された他の細胞型と比較したすべてのOCRにおける対照または抗PD-L1処理TEX のいずれかにおいて富化された転写因子(TF)結合モチーフを同定した。差分フットプリントにおけるモチーフ頻度を分析するために、HOMERからのannotatePeaks.plスクリプトを用いてこれらのフットプリント座標内でモチーフ検索を行い(Heinz et al. Mol. Cell 2010、38:576-589)、Piper et al. に記載されるように相対モチーフ頻度を計算した(BMC Genomics 2015, 16:1000)。マトリックスを生成し、GenePatternのClassNeighborsモジュール(Reich et al. Nat. Genet. 2006, 38:500-501)を用いてモチーフスコアをヒートマップ(図19B)として表示して、細胞型特異的TFを示した。
フローサイトメトリーおよびウイルス負荷データの統計は、GraphPad Prismソフトウェアを用いて分析した。2つの条件のみを比較した場合の2つの独立した条件間の比較では、対応のないスチューデントのt検定を用いて有意性が決定された。図面の凡例に示されるように、同じマウス由来の試料を2つの異なる時点で比較した場合、対応のあるスチューデントのt検定を用いた。2つを超えるグループを比較する場合、一元配置分散分析(One way ANOVA)テストを用いた。最初に、ダゴスティーノとピアソンの正規性検定(D’Agostino and Pearson normality test)を用いて正規性をテストした。すべてのグループが正規分布であると判断された場合は、パラメトリック一元配置分散分析を行い、ボンフェローニの多重比較テスト(Bonferroni’s multiple comparison test)を用いて、関心のあるグループのテスト後の分析を行った。すべてのグループが正規分布であると判断されなかった場合は、ノンパラメトリックANOVA(クラスカル−ウォリス検定(Kruskal-Wallis test))を行い、ダンの複数のテスト比較(Dunn’s multiple test comparisons)を用いて、対象グループのテスト後の分析を行った。ANOVAのP値は各図のY軸の横に青色で示され、示されたペア間のポスト・テストのp値は黒色で示される。0.05未満の場合、P値は有意であると見なした。有意性を示すのに用いたアスタリスクは、p <0.05 *、p <0.01 **、p <0.001 ***に対応する。
IV期の黒色腫の患者を、ペンの拡張アクセスプログラム(Expanded Access Program at Penn)(www.clinicaltrials.gov identifier NCT02083484) に基づいて、または、メモリアルスローンケタリングがんセンター(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)(‘MSKCC’)のNCT01295827に基づいて、ペンブロリズマブ(pembrolizumab)での処置(3週ごとの注入により2 mg kg−1)について登録した。患者は、ペンシルベニア大学アブラムソンがんセンター(University of Pennsylvania Abramson Cancer Center’s)(「ペン」)の黒色腫研究プログラム組織採取プロトコルUPCC 08607に基づき、および、MSKCCのプロトコル00-144に基づいて、両機関のInstitutional Review Boardsに従って、採血について同意した。末梢血は、処置前、および各ペンブロ注入前に、3週間ごとに、12週間、ヘパリンナトリウムチューブで採取した。末梢血単核細胞(PBMC)は、フィコール勾配を用いて単離し、標準的なプロトコルを用いて保存した。
腫瘍負荷:総測定可能腫瘍負荷は、治療前画像レポートで報告されたすべての測定可能な病変の長軸の合計として定義した。測定不可能な病変または活動的な脳転移のみを有する患者は、臨床応答および腫瘍負荷に関する分析から除外した。臨床応答および腫瘍負荷の評価は、盲検的に独立して行った。
ペンコホート:前処理からの凍結保存PBMC試料、サイクル1〜4(3〜12週)を解凍し、CD4 (Biolegend、OKT4)、CD8 (ebioscience、RPA-T8)、2B4 (Beckman Coulter、IM2658)、CD45RA (Biolegend、HI100)、TIM-3 (F38-2E2)、LAG-3 (Enzo、ALX-804-806B-C100)、CXCR5-BV421 (BD、RF8B2) および CD27 (BD、L128) を含む表面染色、ならびにFOXP3 (BD、259D/C7)、CTLA-4 (BD、BNI3)、Eomes (ebioscience、WD1928)、T-bet (Biolegend、4B10)、GzmB (Life Tech、GB11)、TCF-1-AlexaFluor647 (Biolegend、7F11A10) および Ki67 (BD、B56)のための細胞内染色、のための抗体のマスターミックスで染色した。透過処理は、FOXP3 Fixation / Permeabilization Concentrate and Diluent kit(eBioscience)を用いて行った。ペンブロ後の検体のPD-1は、抗ヒトIgG4 PE(Southern Biotec)を用いて検出した。前処理試料を、25μg ml-1ペンブロでインビトロで37℃で30分間、前処理し、2回洗浄して、標準的な抗体ミックスで染色した。細胞を1%パラホルムアルデヒドに再懸濁し、BD Biosciences LSR IIサイトメーターで取得し、FlowJo(Tree Star)を用いて分析した。
フローサイトメトリープロトコル(上記)のとおり、凍結保存したPBMC試料を解凍して染色した。RNAシーケンス実験では、ダンプ/デッドCD3+ CD8+ゲーティングストラテジーを用いて、全CD8 T細胞を分類した。TCRシーケンス実験では、CD8 T細胞は上記のようにゲーティングし、CD38+ HLA-DR+およびCD38+ HLA-DR+でない細胞(すなわち、CD38-HLA-DR-、CD38+ HLA-DR-、およびCD38- HLA-DR+)をソートした。セルソーティングはBD Aria Sorterで行った。
Luminexテクノロジー(EMD Millipore)を用いて、循環血漿サイトカインの濃度を分析した。
解凍した細胞を、0.25μg ml-1でホルボール12-ミリステート13-アセテート(PMA)(Sigma)で、および2.5μg ml-1でイオノマイシン(Sigma)で、2〜5時間、37°Cで刺激し、染色した。サイトカイン産生は、IFNγ(Biolegend、B27)およびTNF-α(Biolegend、Mab11)に対する抗体を用いた細胞内染色で分析した。
ランダムフォレスト回帰および分類(RF-RC)は、多変数のノンパラメトリックアンサンブルパーティショニングツリー法であり、応答変数の予測因子としての遺伝子およびタンパク質間のすべての相互作用の効果をモデル化するために用いることができる31。各モデルは、ランダムに選択されたサンプルの約3分の2を用いて構築され、モデル構築プロセスから除外されたサンプル(「out-of-bag」サンプル)の3分の1で交差検証される。多くの反復の後、すべてのモデルの結果が平均化されて、予測値、エラーレート、および変数の重要度の測定値の不偏の推定が提供される。RF-RCモデルのパフォーマンスは、回帰の平均二乗誤差により、および分類の誤分類エラーレートにより、測定される。フローサイトメトリーのサブセットは、臨床反応変数の可能な予測因子として用いた。各予測因子について、変数のエラー率への寄与を測定する重要度スコアが決定される(スコアが高いほど予測性が高くなる)。‘randomForest’ R package version 4.6-12 implementationおよび次のパラメーター:5,000 trees, node size of 1, mtry value(すなわち、各ノードでの分割に利用できる変数の数)(モデル内の変数の数値の平方根に等しい)、ならびに重要度スコアを決定するためのブライマン・カトラー(Breiman-Cutler)順列法、を用いた。精度の平均低下は、重要度スコアの指標として用いる。
必要に応じてメスならびにガイドとしてヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色したスライドを用いて、FFPEスライドで手動のマクロ切開を行った。組織の脱パラフィンおよびDNA抽出は、標準的な方法を用いて行った。DNAは、Qubit dsDNA BR Assay(Invitrogen)を用いて定量した。末梢血CD8 T細胞を精製し、BD Aria Sorterを用いてPBMCから単離した。DNA抽出、増幅、ライブラリー調製、シーケンシング、および予備的バイオインフォマティクス分析は、Adaptive Biotechnologiesによって行った。TCRB CDR3の増幅およびシーケンシングは、immunoSEQ Platform(Adaptive Biotechnologies)を用いて調査レベルの解像度で行った。
ホルマリン固定、パラフィン包埋腫瘍を外科的切除時または生検から採取した。抗PD-L1染色のため、熱誘導抗原修復(Bond ER2、20分)の後、腫瘍スライドを1:50希釈の抗PD-L1抗体(E1L3N、Cell Signaling)で染色した。特異性を確認するために、抗PD-L1抗体はホジキンリンパ腫細胞および胎盤を染色することによって検証した。抗CD8染色のために、熱誘導抗原回復(Bond ER1、20分)の後、腫瘍スライドを1:40希釈の抗CD8抗体(M7103、Dako)で染色した。腫瘍浸潤CD8陽性T細胞は、盲検の専門家黒色腫病理学者によって、非存在、最小、軽度、中程度、および活発であるとスコアリングされた。腫瘍浸潤CD8 T細胞は、ImageJ2を用いる画像認識分析によっても分析した。デジタルスライドはライカ顕微鏡により取得した。CD8染色のRGBスタック画像をグレースケールに変換し、粒子(陽性染色)を100のしきい値を用いて10〜625μm2のサイズでカウントした。腫瘍の総面積は、腫瘍マスクを用いて計算した。
ソーティング後、細胞を再懸濁し、RLTバッファー(Qiagen)で凍結した。RNAは、製造元のプロトコルに従って、Qiagen RNeasyマイクロキット(74034)を用いて単離した。RNA-seqライブラリーは、製造元のプロトコル(635007)に従って、ClonetechからSMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit for Pico Input Mammalianを用いて調製した。ライブラリーは、900万〜2060万のペアのマップされた読み取りの読み取り深度で、300サイクルの高出力フローセル(15057929)を用いてIllumina NextSeqマシン上でシーケンシングした。Fastqファイルは、STAR 2.5.2aおよびhg19を用いて調整した。アラインされたファイルは、PORT遺伝子ベースの正規化(www.github.com/itmat/Normalization)を用いて処理した。差次的遺伝子発現はLimmaを用いて行った。Limma-voomを用いて、P値<0.05を用いてグループ間で有意に異なる転写物を同定した。サイクル1にKi67ピークがある患者(3人の患者)について、MKI67と高い相関がある上位40の遺伝子で、MKI67相関遺伝子と相関する上位5遺伝子を含む相関ネットワークを作成した。最終的なネットワークには、MKI67と相関の高い(相関係数の絶対値> 0.7(abs(corr)> 0.7))値を持つノードがあった。Cytoscape 3.4.0は相関ネットワークの作成のために用い、metascape.orgはGO生物学的プロセスのための遺伝子を富化するために用いた。この出版物において議論されるデータはNCBI Gene Expression Omnibusに寄託されており、その全体が引用により本明細書に組み込まれる、GEOシリーズアクセッション番号GSE96578(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/ acc.cgi?acc=GSE96578)を介してアクセスできる。
必要に応じてメスおよびガイドとしてH&E染色されたスライドを用いて、FFPEスライドで手動のマクロ解剖を行った。組織の脱パラフィンおよびDNA抽出は、標準的な方法を用いて行った。DNAは、Qubit dsDNA BR Assay(Invitrogen)を用いて定量した。DNAライブラリーは、NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (New England BioLabs)を用いて作成し、標的はSureSelect Human All Exon V6+ COSMIC(Agilent)でキャプチャした。OptiTypeおよびネオエピトープ(neoepitope)予測を伴うHLAは、Ccons 1.1 Serverを用いて作成した。
グループ比較および相関分析のために、PRISM 6.0を用いてテストを行った。D'Agostino-Pearson omnibus正規性検定を用いて分布の正規性を評価し、F検定を用いてデータのグループ間の分散を評価した。正規分布データについて、平均差の有意性は、両側の(two-sided)対応のある、または対応のないスチューデントのt検定を用いて決定し、分散が異なるグループについては、ウェルチの修正(Welch’s correction)を伴う対応のないt検定を用いた。非正規データについて、非パラメトリックマンホイットニーU検定(Mann-Whitney U-tests)またはウィルコクソン一致対符号付き順位検定(Wilcoxon matched-pairs signed rank tests)を、非対分析と対分析とにそれぞれ用いた。記述統計には、連続変数についての平均、中央値、標準偏差、および範囲、ならびに、カテゴリー変数についての頻度および比率が含まれる。連続変数間の相関関係はピアソンのr係数によって決定し、順序スケーリングされたカテゴリー変数間の相関関係はスピアマンのr係数(Spearman’s r coefficient)によって決定した。全生存期間は、処置の開始から死亡の日または患者との最後の接触までの生存期間として規定し、カプラン・マイヤー法によって推定した。ランドマークの全生存およびPFS分析は、治療後6週間からの全生存およびPFSとして規定した。Ki67(最大6週目)、ベースラインの腫瘍負荷および臨床結果の関係を視覚的に検査するために、ベースラインの腫瘍負荷によってKi67の簡単な散布図を作成し、全生存、PFS、臨床応答などの臨床結果に色分けされた記号を採用した。一般に、平均は臨床結果の二分法(dichotomization)のために用いた。これには、PennデータセットにおけるPFSおよびランドマークPFS(図27、図33)、ならびにMSKCCデータセットについてランドマークの全生存率(図32G)が含まれる。Pennデータセットでは、ランドマークの全生存期間は、9.5か月のカットオフを用いて二分した。これは、最長の完全生存期間を表しているためである(すなわち、LOSが9.5か月未満の患者は生存しておらず、生存が検閲されない)(図32D、図33)。対数順位検定(log rank test)を用いて、患者のサブグループ間の全生存を比較した。腫瘍負荷に対するKi67の比率は全生存率と関連しており、CART分析によってさらに調査した。CARTは、この連続変数を全生存期間に従って2つの均一なサブグループに分割するための最適なカットポイントを同定した。この方法により、すべての可能なカットポイントから最適なカットポイントが選択される。生存およびCART統計分析は、IBM SPSS v23またはSTATA v14のいずれかを用いて行った。ランドマークPFSについて同様の分析を行った。
モデル選択は、一連の候補モデルの中からモデルを選択する方法である。Rパッケージ「leaps」バージョン2.9、パラメーター「nvmax = 3」、および「nbest = 10」を用いて、CD8およびKi67発現を予測するための線形回帰に基づいて10の最良のモデルを選択した。
マウス。
B6; 129S-Tet2tm1.1Iaai/J(TET2fl/fl)マウス、C57BL/6J、B6.SJL-Ptprca(CD45.1+)およびCD4Cre+マウスは、Jackson Laboratoriesから入手し、University of Pennsylvaniaで繁殖させた。TET2fl/fl CD4Cre+(TET2cKO)は、C57BL/6Jマウス10世代に、次にP14マウスに交配させまた。
TET2cKOまたは野生型P14マウスの末梢血からの同数(500)のP14 CD8+ T細胞を、コンジェニック(CD45.1+)ホストに養子移入した。翌日、宿主に4x106 PFU LCMVクローン13を静脈内で感染させた。脾臓および肝臓を感染後16または29日にマウスから採取した。単一細胞懸濁液を作製し、Percoll(TM)(GE Healthcare)勾配での密度遠心分離を用いて、肝リンパ球をさらに単離した。
細胞を単離し、洗浄し、示された抗体で染色した。抗体は、Biolegend、InvitorgenまたはeBiosciencesから購入し、CD8α-BV650 またはAlexaFluor e780; CD62L PE-TexasRed、KLRG1 PE-Cy7 または FITC、CD127 PE-Cy7、PD-1 PE-Cy7、2B4 FITC、CD45.1 AF700、CD44 BV785、Ly6C BV711、Granzyme B BV421、ヒトKi67-BV711、Eomes AF647、TCF-1 FITC、TbetBV605を含む。LCMVのH2-Db制限gp33-41に特異的なバイオチノライト化(Biotinolyted)モノマーは、NIH Tetramer Core Facility から入手し、公開されているプロトコルを用いてテトラマー化した。製造元の指示に従い、FoxP3/Transcription Factor Staining Buffer kit (eBiosciences)いずれかを用いて細胞内染色を行った。生細胞集団の識別は、製造元の指示に従って、Live/Dead Aqua染色(Invitrogen)を用いて行った。フローサイトメトリーは、BD LSRIIで実行し、FlowJoソフトウェアを用いて分析した。Prismソフトウェアを用いてデータをグラフ化した。
ナイーブマウスCD8 T細胞を単離するために、5〜6週齢のC57/Bl6雌マウスから脾臓を採取し、シリンジで70umフィルターで分離しました。細胞をPBSで3回洗浄とともにフィルターを通して洗浄し、1億個の細胞あたり1mlの磁気分離バッファー(MSB、10%FCSおよび4mM EDTAを含むPBS)に再懸濁した。MSB 1 mlあたり50 ulの正常ラット血清を添加して、非特異的な抗体相互作用をブロックした。続いて、次のビオチン化抗体を1:200希釈で加えた:抗CD4、抗NK1.1、抗CD19、抗B220、抗CD11c、抗CD11a、抗CD11b、および抗Ter119。MSB 1mlあたりストレプトアビジン磁気ビーズ125ulを添加する前に、抗体−細胞混合物を室温で15分間インキュベートした。混合物を室温でさらに15分間インキュベートし、その後、MSBで総容量を3 mlにした。次にサンプルを穏やかに混合し、磁気分離器(StemCell)に室温で10分間置いた。非結合画分を15mlのコニカルチューブにデカントした。サンプルを10mlのPBSで2回洗浄し、次のステップまで氷上に置いた。
マイクロアレイによる転写プロファイリングのために、TRIzol(Invitrogen、Carlsbad、CA)を用いて、ソートされたCD8+ T細胞からトータルRNAを単離した。RNAは、University of Pennsylvania Microarray facilityによって、処理され、増幅され、ラベルが付けられ、Affymetrix GeneChip MoGene 1.0 stマイクロアレイ((Santa Clara, CA)にハイブリダイズさせた。Affymetrix Power Toolsを用いて処理し、変位値をRobust Multichip Averagingを用いて蛍光ハイブリダイゼーション信号を標準化した。
ATAC-seqは前述のように実行した。簡単に言えば、核を、10 mM Tris-HCl、10 mM NaCl、3 mM MgCl2、および0.1%IGEPAL CA-630の溶液を用いて、複製ごとに50,000〜150,000のソートされた細胞から単離した。核単離の直後に、転位反応をTn5トランスポザーゼおよびTDバッファー(イルミナ)を用いて37°Cで45分、行った。転位したDNA断片を、Qiagen MinElute Kitを用いて精製し、デュアルインデックス(Illumina Nextera)でバーコード化し、NEBNext High Fidelity 2x PCRマスターミックス(New England Labs)を用いてPCR増幅した。シーケンシングライブラリのサイズ分布およびモル濃度は、Agilent BioanalyzerおよびKAPA定量RT-PCR(KAPA Biosystems)を用いて決定した。シーケンシングは、NextSeq 500(Illumina)でV2ケミストリーを備えた高出力150サイクルキットを用いて行った。ペアエンドリードは、Bowtie2を用いてmm10リファレンスゲノムにマッピングした。一致してマッピングされたペアのみを、さらなる分析のために保持した。MACS v1.4を用いてピークコーリングを行い、シーケンスタグ富化の領域を同定した。BedToolsを用いて、同定されたピーク間の共通する交差点(最小オーバーラップ1bp)を見つけ、マージされたピークリストを作成した。ATAC-seqタグ富化、マージされたピークリスト全体のDNAモチーフ分析、およびGOターム評価は、HOMER(homer.salk.edu)を用いて計算した。主成分分析、スペクトル共クラスタリング、および階層的クラスタリングは、scipy、matplotlab、およびscikit-learnを用いて行った。REVIGOは、さまざまな細胞型にまたがるユニークなGOタームを同定するために用いた。8つのピークのリストをいくつかのダウンストリーム分析用にフィルタリングして、全部で5つの細胞型で富化が低いピークを除去した(第3四分位)。
サンプル調製
EL4胸腺腫細胞(ATCC)を、10%胎児ウシ血清を含むDMEM培地(Invitrogen)で増殖させた。遠心分離後、細胞を収集し、温めたPBSで2回洗浄した。細胞を、10x106細胞あたり1 mlのバッファーA(10 mM TrisHCl pH7.5、1.5 mM MgCl2、10 mM KCl、25 mM NaF、1 mM Na3VO4、1 mM DTT、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む)に再懸濁した。細胞をバッファーA中で氷上で3分間インキュベートし、遠心分離し、5 mlのバッファーA中のDounceホモジナイザーに移した。細胞を5ストロークのDounceホモジナイザーで均質化した。核を遠心分離によって収集し、10x106細胞あたり1 mlのバッファーAで洗浄し、10x106細胞あたり1 mlのバッファーB(50 mM Tris-Cl、pH 7.4、1.5 mM MgCl2、20%グリセロール、420 mM NaCl、25 mM NaF、1 mM Na3VO4、1 mM DTT、400ユニット/ml DNase I、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む)に再懸濁した。溶液をローテーター内で4度で30分間インキュベートし、10分ごとにボルテックスした。次に、サンプルを4度、3300RPMで5分間遠心分離した。核抽出物を含む上清をバッファーD(50 mM Tris-Cl、pH 7.4(RT)、1.5 mM MgCl2、25 mM NaF、1 mM Na3VO4、0.6%NP40、1 mM DTT、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む)で1:3に希釈した。サンプルを再度遠心分離し、アリコート500ulを液体窒素で瞬間凍結した後、-80度で保存した。
サンプルの調製、同重体質量タグ(isobaric mass tags)での標識、ペプチド分画、および質量分析は、本質的に前述のように行った。1回の多重ランでの用量−応答阻害剤データの取得のため、6点データの取得が可能なためTMTTM(Thermo-Fisher Scientific)タグを用いた。イムノアフィニティ精製のため、最大4つのサンプルを比較し、経済性とカバレッジの理由からiTRAQTM試薬(Applied Biosystems)を用いた。
MascotTM 2.0(Matrix Science)は、ペプチド前駆体に対して10 ppmマス・トレランス質量許容度、およびフラグメントイオンに対して0.8 Da(CID)トレランスを用いてタンパク質同定のために用いた。システイン残基のカルバミドメチル化およびリジン残基のiTRAQ/TMT修飾を固定修飾として設定し、S、T、Yリン酸化、メチオニン酸化、タンパク質のN末端アセチル化、およびペプチドN末端のiTRAQ/TMT修飾を可変修飾として設定した。検索データベースは、Matrix Scienceが提供するスクリプトを用いて作成されたこのデータベースのデコイバージョンを組み合わせた、カスタマイズされたバージョンのIPIタンパク質配列データベースからなる。特に明記しない限り、我々は次のようにタンパク質同定を許容した:i)単一スペクトル対シークエンスアサインメントについて、我々は、この割り当てが最適な一致、ならびに31の最小Mascotスコア、および次の最適な割り当てに対してこの割り当ての10x差になることを要求した。これらの基準に基づいて、デコイの検索結果は1%未満の偽発見率(false discovery rate: FDR)を示した。ii)複数スペクトル対シークエンスアサインメントについて、同じパラメーターを用いて、デコイ検索結果は、0.1%未満の偽発見率を示す。タンパク質の定量のために、ユニークなペプチドに一致する最小の2つの配列アサインメントが必要であった。定量化されたタンパク質のFDRは<< 0.1%であった。同定されたタンパク質にユニークなペプチドのみを相対的タンパク質定量化に用い、補足データセットではユニークなペプチドアサインメント(UPA)と呼ばれる。さらに、定量化のために、UPAに一致するスペクトルを次の基準に従ってフィルタリングした:Mascotイオンスコア> 15、前駆体イオンのシグナル対バックグラウンド比> 4、シグナル対干渉> 0.5。レポーターイオン強度にイオン蓄積時間を掛けて、質量分析計に存在するレポーターイオンの数に比例するエリア値を算出した。化合物の競合結合実験のため、ビヒクル対照と比較したレポーターイオンエリアに基づいて倍率変化が報告され、合計ベースのブートストラップアルゴリズムを用いて計算された。倍率変化は、記載されているように同位体の純度に対して補正され、シグナル対干渉測定によって推定されるほぼ等圧のピークの共溶出によって引き起こされる干渉について調整された5。タンパク質の絶対存在量apaは、問題のタンパク質について3つの最も豊富なペプチドのMS1存在量の平均をとることによって計算された6。ベイトタンパク質Bに対する免疫沈降実験で見出されたタンパク質Pの富化Eは、E = log(apa(P)/ apa(B))として計算された。化合物プロファイリングデータは、免疫沈降データを前述の信頼できるインタラクターのセットに制限するのに用いた。ヒートマップおよびt検定は、RパッケージおよびTableauを用いて行った。Cytoscapeソフトウェアは、相互作用ネットワーク視覚化のため用いた。
調査結果をサポートするRNAシーケンシングデータはNCBI Gene Expression Omnibusに登録されており、GEOシリーズのアクセッション番号GSE96578(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE96578)を介してアクセスできる。フローサイトメトリー、TCRシーケンシング、および臨床データは、引用により全体として本明細書に組み込まれる、Huang et al. (Huang et al. Nature 2017, 4;545(7652):60-65, doi:10.1038/nature22079) およびそのExtended Data and Supplementary Informationに含まれる。
PD-1経路遮断に関連する細胞性、転写性、およびエピジェネティックな変化は、慢性リンパ性脈絡髄膜炎ウイルス(LCMV)感染のマウスモデルを用いて調べた(図1A〜図1C)(Barber et al. Nature 2006, 439, 682-687; Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165 - Supplemental Information on Science online)。抗PD-L1処置の後、1080個の遺伝子が上方制御され、1686個の遺伝子が下方制御された(p<0.05, LFC≧0.2) (図2A、図1D、および Pauken et al. Table S1 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165))。以前の研究は、PD-1経路遮断後の代謝経路における転写(Gubin et al. 2014, Nature. 515, 577-581)または細胞性(Bengsch et al. 2016, Immunity 45、358-373; Staron et al. 2014, Immunity 41、802-814)の変化を同定した。実際、いくつかの代謝遺伝子はPD-L1遮断後に変更した(Pauken et al. Table S1(Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165))。しかしながら、遺伝子セット富化分析(GSEA)は、細胞分裂経路におけるより顕著な変化を同定した(図2B、Pauken et al. Table S2 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)) (Barber et al. Nature 2006, 439, 682-687; Patsoukis et al. 2012, Sci. Signal. 5, ra46)。さらに、多くのエフェクター関連遺伝子は抗PD-L1グループに偏っていた(図2C〜2D、Pauken et al. Table S3 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165))。関心のある他の遺伝子には、Cxcl9、Il1r2およびIl7r(上)、ならびに、Klra9、Tnfrsf9、およびCd200r2(下)が含まれる(図1DおよびPauken et al. Table S1(Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165))。Leading Edge Metagene(LEM)分析(Godec 2016, Immunity. 44, 194-206)を用いて、対照TEXと比較して、抗PD-L1処理TEXにおいて2つのメタ遺伝子が同定された:1つは白血球の活性化に対応し、もう1つは細胞周期に対応する(図2E、図1E、および1F、およびPauken et al. Table S4 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165))。抗PD-L1処理TEXメタ遺伝子は、主に細胞周期経路によって駆動されるTEFFとの一部の重複を示したが、TMEMとの重複は最小限であった(図2EおよびPauken et al. Table S4(Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165))。このことは、TEX再活化時のメモリーポテンシャルの限られた獲得を示唆する。
PD-L1遮断の効果が持続しなかった1つの考えられる理由は、感染が持続したことである。感染が治癒した場合に抗PD-L1がTMEMへの分化を誘導し得るという考えをテストするために、同数の対照TEX、抗PD-L1処理TEX、またはTMEMを無抗原マウスに移入し、持続性を監視した(図8A)。以前の研究と一致して(Shin, et al. J. Exp. Med. 2007, 204: 941-949; Wherry, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2004, 101:16004-16009)、TEXは機能的なTMEMと比較して無抗原レシピエントにおいて低い生存であった(図9A〜9B)。抗PD-L1で処理されたTEXは、TMEMに比べると不十分であったが、中程度に持続する傾向があった(図9A〜9B)。次に、この傾向の潜在的なメカニズムを調査した。 PD-1経路遮断後、インターロイキン(IL)-7受容体転写物(Il7r; CD127)は有意に増加した(図1DおよびPauken et al. Table S1(Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165))。抗PD-L1後のTEXのサブセットでCD127タンパク質の適度な増加もあった(図9C〜9E)。IL-7で刺激すると、抗PD-L1で処理されたTEXは、対照で処理されたTEXと比較して、より多くのphospho-STAT5も示した(図9Fおよび図8B)。対照的に、IL-15受容体サブユニットCD122の発現およびインビトロでのIL-15に対する応答性は実質的に変化しなかった(図9Cおよび9F、および図8B)。これらのデータは、抗PD-L1処置がメモリーバイアスIL-7R経路の活性を増強し得ることを示唆する。
次に、PD-1経路の遮断がTMEMの定義的特性である再感染時の強力なリコールの可能性を復元できるか否かをテストした。等しい数のDbGP33+ CD8 TEX、抗PD-L1処理TEX、またはTMEMを無抗原マウスに移入し、休ませ、そしてGP33-41を発現するリステリア菌(Listeria monocytogenes)で再チャレンジした。TMEMは強力に拡大し、効率的にIFNγを産生した(図10A〜10D)。対照的に、対照および抗PD-L1処理TEXは両方ともリステリアGP33チャレンジに対する応答が乏しく、再活化されたTEXはこれらの重要な特性において対照TEXと同様に不完全であった(図10A〜10D)。
TEXは、TEFFおよびTMEMと比較して約6000のユニークなOCR変化を示した(図10F〜10I)。したがって、PD-L1遮断によって誘導された約650のOCR変化は、比較すると控えめであった。これらの変化が特定の転写回路に影響を与えるか否かを判断するために、得られた(たとえば、NFκB、Jun:AP1、およびCTCF)または失われたピークにおいて富化された転写因子(TF)モチーフを同定した(たとえば、NFATc1、NFAT:AP1、Nur77、EomesおよびEgr2)(図19A)。再活性化が既存のTEXエピジェネティックランドスケープ内の再配線された転写制御に起因するか否かをテストするために、ウェリントンブートストラップ分析を実行して、TF結合活性を予測した(図19BおよびPauken et al. Table S10 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)。TEXおよび抗PD-L1処理TEXは、TN、TEFFまたはTMEMよりも互いに類似していた。しかしながら、TEXまたは抗PD-L1処理TEXに偏ったTFモチーフが同定された(図19BおよびPauken et al. Table S10 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165))。次に、結合の可能性が高い証拠でTFを同定するために、TFフットプリンティングを行った(図19Cならびに図20および21)。次に、予測されたTF活性に基づいて、転写回路用のために統合ネットワークを構築した(図19DおよびPauken et al. Table S11 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165)。このネットワークは、NFκB、IRF、およびbZip因子(AP-1ファミリー)の増加した活動、ならびに、PD-L1遮断時のNFAT、Egr2、およびNur77の減少した活動を同定した。この転写ネットワークの主な機能は、追加のTFファミリーが同定された2番目のネットワークアプローチを用いて要約された(たとえば、Runx、Nr2f6、Prdm1、Rarb、Pparg.Rxra、およびホメオボックスTF;図22およびPauken et al. Table S12 (Pauken et al. Science 2016, 354(6316):1160-1165))。これらの変更が特定のTFにどのように影響するかをさらに調査するため、NFATを調査した。AP-1を使用するNFATは、多くのエフェクターフェーズ遺伝子をトランス活性化する。対照的に、AP-1に結合できない「パートナーレス」のNFATは、TEX遺伝子のサブセットを誘導する(Martinez、et al. Immunity 2015, 42:265-278)。ここでは、抗PD-L1処置時に、再活化されたTEXにおいてパートナーレスNFATのターゲットの発現が有意に減少し(図19E)、遮断後のこの転写回路の再配線を示唆する。
健康なドナー対黒色腫患者を比較した。抗PD-1抗体ペンブロリズマブ(pembro)で処置されたステージIV黒色腫の29人の患者を、本明細書に記載される臨床試験に登録した。すべての患者は以前に抗CTLA-4療法を受けていた(図23)。患者をpembroで処置し、治療前、および治療中は3週間ごとに合計12週間、血液を採取した。患者の62%は、公表されている試験と一致する、免疫RECIST(固形腫瘍における応答評価基準)基準に基づいて決定された客観的な臨床応答を有さなかった(Robert et al. N. Engl. J. Med. 2015, 372:2521-2532; Ribas et al. Lancet Oncol. 2015, 16:908-918)(図24A、図23)。
末梢血において再活化されたTEX細胞が検出された。次に、PD-1および他の抑制性受容体を共発現するCD8 T細胞がPD-1遮断の薬力学的効果を追跡する上でより高い精度を供するか否かを評価した。PD-1+ CTLA-4+ CD8 T細胞の循環集団は、主に、EomeshiT-betloおよびCD45RAloCD27hiであった(図28A)。さらに、PD-1+ CTLA-4+細胞の約50%が処理前にKi67を発現し、マウスにおけるTEX細胞に関するデータと一致し(Paley et al. Science 2012, 338:1220-1225)、これは処置後に約75%に増加した(図28B、28C)。PD-1+ CTLA-4- T細胞では、実質的により低いKi67発現があった(図28C)。第3の抑制性受容体(たとえば、2B4)の追加、または最近の記載に焦点を当ててPD-1+ CXCR5+ TCF-1+サブセット(Im et al. Nature 2016, 537:417-421; He et al. Nature 2016, 537:412-416)は、抗PD-1療法に応答する細胞についてさらに富化された(図28C、図29)。
血液からの応答性T細胞クローンが腫瘍において見つかった。ネオ抗原−および共有抗原−特異的T細胞の両方が、循環しているPD-1+ CD8 T細胞集団において同定されている(Gros et al. Nat. Med. 2016, 22:433-438)。さらに、血液中のこれらの細胞と腫瘍浸潤性T細胞との間にクローンの重複がある(Gros et al. Nat. Med. 2016, 22:433-438)。抗PD-1療法後のこれらの関係を調査するために、3人のレスポンダーと3人の非レスポンダーからの処置後のKi67発現のピークで、血液からのCD8 T細胞を分類し、T細胞受容体(TCR)レパートリーを、前処理腫瘍浸潤T細胞と比較した。上位10の腫瘍浸潤性T細胞クローンの多くは、臨床応答に関係なく、すべてのケースにおいて頻度による2つの最も豊富なクローンを含め、血液中および処置後に容易に同定可能であった(図31A、31B、図31A、表2)。
本明細書では、再活化/腫瘍比が臨床成績に影響を与えることが示される。より大きなベースライン免疫応答が臨床応答と相関する可能性があった。しかしながら、PD-1+ CD8 T細胞におけるより高い前処理Ki67レベルは、実際には予後不良の指標であった(図32A、上)。処置前のより大きな免疫応答は、それ自体が悪い予後指標である、より高い腫瘍負荷を反映し得る(図32A、下)。実際、抗PD-1療法で進行した患者は、ベースラインで全身性炎症の証拠があった(図32B、32C)。ランダムフォレスト分析では、Ki67単独は臨床結果と相関しないことを示した(データは示していない)。したがって、重要なのは再活化の絶対的な大きさではなく、腫瘍負荷に対するTEX細胞再活化の比率が臨床応答をよりよく予測し得るという仮説を立てた。これをテストするために、ベースラインの腫瘍負荷を調整した抗PD-1療法後のPD-1+ Ki67+ CD8 T細胞の倍率変化に関する臨床応答を調べた。無増悪生存期間(PFS)がより長い患者は、一般的に、腫瘍負荷が低く、PD-1+ Ki67+ CD8 T細胞対腫瘍負荷回帰線の倍率変化の上でクラスター化しており、このことは、腫瘍負荷に対するTEX細胞再活化の比率が臨床成績に関連し得ることを示唆する(図33A)。さらに、処置前後の両方の測定を必要とする倍率変化の代わりに、処置後のピークT細胞応答時点での腫瘍負荷に対するKi67+ CD8 T細胞のより高い比率は、より良い臨床成績と関連していた。レスポンダーはPD-1+ Ki67+細胞対腫瘍負担回帰線の上でクラスター化したが、非レスポンダーは大きく下回っていました(図33B)。分類および回帰ツリー(CART)分析は、治療に入る6週間の早期に、臨床結果によって患者を分離する、1.94のKi67対腫瘍負荷比を同定した。6週間での1.94より大きいKi67対腫瘍負荷比は、客観的奏効率、PFS、および全生存率により良好な結果と関連していた(図32D、図33C)。
慢性ウイルス感染症におけるCD8+ T細胞におけるTET2損失の結果を評価するために、養子移入アプローチに目を向けた。同数の野生型またはTET2cKO P14 CD8+ T細胞をコンジェニック(CD45.1+)ホストに養子移入し、その後LCMVクローン13を感染させた(図35A)。感染後16日目にマウスを分析した。感染したマウスの脾臓からのCD8+ DbGP276テトラマー+ T細胞を同定し、この集団内のドナー細胞の頻度を決定した(図35B)。この時点で宿主マウスの脾臓における野生型ドナー細胞と比較してTET2cKOドナー細胞の頻度が有意に高かった(図35C)。これらの細胞の絶対数の差は、脾臓において高くなる傾向があった。野生型対TET2欠損細胞の拡大における絶対的な変化を決定するために他の臓器を評価することが重要であろう。これらのデータは、慢性感染中にTET2を欠如するT細胞のために増殖または生存の利点が存在し得ることを示唆する。前者を支持して、野生型ドナー細胞と比較してドナーTET2cKO P14細胞の有意に高いパーセンテージがKi67+であることを見出した(図36A〜36D)。これらの集団の表現型分析は、野生型の対応物と比較して、TET2cKOドナー細胞の間のTCF-1+グランザイム-CD8+ DbGP276テトラマー+ T細胞の有意に増加した頻度を明らかにした(図37A〜37C)。転写因子TCF-1はCD8+メモリー細胞において高度に発現し、慢性感染の設定でのその発現は、疲弊したT細胞集団を維持し、PD-1遮断後の拡大に応答する細胞をマークするようである(Utzschneider et al. (2016)Immunity 45:415-27; Im et al. (2016)Nature 573:417-431)。興味深いことに、これらの細胞は高レベルのLy6Cも発現し、これはメモリー細胞で発現され、TEX細胞でダウンレギュレートされることが示されている(図38A〜38D)(Wherry et al. (2007)Immunity 27:670-684)。これらのデータは、慢性感染時のCD8+ T細胞におけるTET2の喪失が、免疫チェックポイント遮断の設定に有利であり得る、よりメモリー様のプールの分化に有利であり得ることを示唆す。
エピジェネティックな機能を持つ遺伝子がT細胞の疲弊に重要な役割を果たし得るか否かを判断するために、6、8、15、および30日間、LCMVの急性または慢性変異体に曝露されたP14 LCMV特異的CD8+ T細胞から生成された転写データを利用した。すべてのサンプルにわたって少なくとも1つの統計的に有意なペアワイズ比較(FDR <0.05)でのもののために、遺伝子を最初にフィルタリングした。これらの差次的に発現された遺伝子は、遺伝子オントロジー関連(GO Molecular Function:「クロマチン結合」、「核酸結合」、「ヌクレオチド結合」;PantherDB Protein Classes:「DNA結合タンパク質」、「クロマチン結合タンパク質」)および精選された遺伝子リスト(Zuber et al. Nature Biotechnology. 2011, 29:79-83)によって決定されたクロマチン調節または結合機能を持つもののためにフィルタリングした。最後に、遺伝子は最小発現(少なくとも1つのサンプルで>6のアレイ強度)および倍数変化(1つのサンプルは他のすべてのサンプルと比較して少なくとも2倍のアレイ強度の増加がある)でフィルター処理した。これにより、435の差次的に発現されるクロマチン調節遺伝子の最終的なリストが得られた。次に、遺伝子発現の行正規化ヒートマップを生成した(図39A)。クラスター化は、Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean on a Manhattan distance matrixを用いて実行した。クラスター4遺伝子は疲弊したT細胞において特異的に発現され、Tox、Ikzf2、Setbp1が含まれる(図39B〜39C)。この分析を通じて、Toxが最も差次的に発現されるクロマチン調節遺伝子であることが見出された。マイクロアレイの発現結果を確認するために、P14養子移入アプローチを利用して、急性および慢性感染の過程でToxタンパク質の発現を測定した。500のP14 T細胞をナイーブ宿主に移し、それをLCMV ArmまたはCl-13のいずれかに感染させた(図40A)。感染後8、15、35、および208日でのフローサイトメトリー分析は、CD8 T細胞におけるTox発現が慢性感染に限定されることを示唆する(図40B〜40C)。実際、Toxタンパク質は、急性感染症に暴露されたT細胞では決して容易に検出できなかった。
マウスはUniversity of Pennsylvania (UPenn)の特定の病原菌を含まない施設で維持した。実験および手順は、UPennのInstitutional Animal Care and Use Committee (IACUC)に従って実施した。次の遺伝子型のマウスはC57BL/6Jバックグラウンド上にあり、UPennで飼育されたか、またはJackson Laboratoryから購入した:WT P14、TOXFlox/Flox x CD4Cre P14、TOX-/- P14、およびNFAT2Flox/Flox x CD4Cre P14。CT26腫瘍での実験のため、BALB/cマウスを用い、Charles Riverから注文した。すべての実験について、マウスは年齢と性別が一致しており、生後6〜8週の間のオスとメスのマウスをランダムに実験グループに割り当てた。
T細胞受容体トランスジェニックGP特異的CD8+ T細胞(P14)は、Histopaque-1083(Sigma Aldrich)での勾配遠心を用いてドナーマウスの末梢血から単離した。LCMV感染を用いる実験のため、WT P14細胞を要求される遺伝子型(TOXFlox/Flox CD4Cre P14、TOX-/-P14、またはNFAT2Flox/Flox CD4Cre P14)の類遺伝子的に異なるP14細胞と1:1で混合し、合計500個のナイーブ細胞を感染前1〜5日に6〜8週齢のレシピエントマウスに尾静脈注射により養子移入した。レシピエントは、ホストT細胞から両方のドナー集団を区別できるようにするために、第3のコンジェニックバックグラウンドのものである。WT P14応答のみを監視する実験では、500個の細胞を移した。以前の報告では、LCMV Cl-13またはArm感染前の500 P14 T細胞の養子移入はウイルス負荷または病因に影響を与えないことが示されている(Frebel, H. et al. Programmed death 1 protects from fatal circulatory failure during systemic virus infection of mice. J Exp Med 209, 2485-2499 (2012); Odorizzi, P. M., Pauken, K. E., Paley, M. A., Sharpe, A. & Wherry, E. J. Genetic absence of PD-1 promotes accumulation of terminally differentiated exhausted CD8+ T cells. J Exp Med 212, 1125-1137 (2015); Blattman, J. N., Wherry, E. J., Ha, S. J., van der Most, R. G. & Ahmed, R. Impact of Epitope Escape on PD-1 Expression and CD8 T-Cell Exhaustion during Chronic Infection. J Virol 83, 4386-4394 (2009))。インフルエンザ、リステリア菌(Listeria monocytogenes:LM)、または水疱性口内炎ウイルス(VSV)感染での実験では、5,000 P14(インフルエンザ、LM)またはOT-I(VSV)CD8+ T細胞を感染前に養子移入した。
LCMV株Armstrong(Arm)およびclone-13(Cl-13)を増殖させ、以前に記載されるとおりにタイターを決定した(Odorizzi, P. M., Pauken, K. E., Paley, M. A., Sharpe, A. & Wherry, E. J. Genetic absence of PD-1 promotes accumulation of terminally differentiated exhausted CD8+ T cells. J Exp Med 212, 1125-1137 (2015))。C57BL/6Jマウスに、腹腔内(i.p.)に2 x 105プラーク形成単位(PFU)のLCMV Arm、または静脈内(i.v.)に4x106 PFU LMCV Cl-13を感染させた。他の実験では、マウスに2x106 PFU VSV-OVA(i.v.)または1x104コロニー形成単位(CFU)LM-GP33(i.p.)を感染させた。インフルエンザ感染については、30ulのPBS中の50 TCID50 PR8-GP33(H1N1株)を鼻腔内投与する前に、イソフルランおよびケタミンでマウスを麻酔した。B16-F10黒色腫およびCT26結腸癌細胞株はATCCから購入し、10%FBS、100U/mlペニシリン、100U/mlストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを補充したRPMI 1640培地で37℃で培養した。2x105の腫瘍細胞をマウスの右および左側腹部に皮下(s.c.)注射した。FK506(Prograf, Astellas Pharma US)は、PBS中で1.5 mg/mlに希釈することによって注射用に調製した。LCMV Cl-13感染のd3-7またはd25-29から10mg/kgの用量で希釈FK506を皮下投与した(Araki, K. et al. Pathogenic virus-specific T cells cause disease during treatment with the calcineurin inhibitor FK506: implications for transplantation. J Exp Med 207, 2355-2367 (2010))。対照処置のために、PBSをs.c.投与した。
レトロウイルス(RV)形質導入のために、EasySep磁気ネガティブセレクションキット(Stem Cell Technologies)を用いてドナーマウスの882の脾臓からCD8+ T細胞を富化し、以前に記載されるように形質導入した(Kurachi, M. et al. Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function. Nat Protoc 12, 1980-1998 (2017))。手短に言えば、細胞を106/mlで「完全RPMI(cRPMI)」に再懸濁した:10%FBS、50μM β-メルカプトエタノール、100U/mlペニシリン、100U/mlストレプトマイシン、非必須アミノ酸(Invitrogen)、ピルビン酸ナトリウム(Invitrogen)、およびHEPESバッファー(Invitrogen)を補充したRPMI 1640。3x106 T細胞を12ウェルクラスターディッシュのウェルにプレーティングし、100U/mlの組換えヒトIL-2(Peprotech)の存在下で1ug/ml抗CD3ε(145-2C11、BioLegend)および0.5ug/ml抗CD28(37.51、BioLegend)で18〜24時間活性化した。活性化後、細胞を3x106/mlでcRPMIに再懸濁し、6ウェルプレートのウェルにプレーティングし、ポリブレン(4μg/ ml)の存在下でスピン感染(2000 xgで75分間、32℃)によりMigR1ベースのRVウイルスで形質導入した。RV上清は、HEK293T細胞をRV発現プラスミドおよびpCL-EcoパッケージングプラスミドでLipofectamine3000(Invitrogen)を用いて同時トランスフェクションすることにより生成した。
感染または腫瘍チャレンジの後、サンプルを小片に切断し、70μmのセルストレーナーに対してホモジナイズすることにより、脾臓および流入領域リンパ節からCD8+ T細胞を単離した。細胞をセルストレーナーに通し、赤血球をACK溶解バッファー(Thermo Fisher Scientific)で5分間溶解した。次に、細胞懸濁液をPBSで洗浄し、70μm細胞濾過器にさらに通した。肺および腫瘍を小片に切断し、5%FBS、100U/ml DNaseI(Sigma-Aldrich)および0.2mg/mlコラゲナーゼIV(Sigma-Aldrich)を補充したRPMI 1640培地中で37℃で1時間消化した。続いてサンプルを70μmフィルターに対して機械的に破壊し、PBSで洗浄した。赤血球をACK溶解バッファーで5分間溶解し、サンプルを70μmストレーナーで再度ろ過した。サイトカインおよびエフェクター分子産生を評価するために、サンプルを平底96ウェルディッシュのウェルにcRPMI中2x106/mlでプレーティングし、37℃で5時間、タンパク質輸送阻害剤(GolgiStopおよびGolgiPlug、BD Biosciences)の存在下でGP33-41ペプチドとインキュベートした。
正常なドナー末梢血サンプル(n=10、18〜39歳の男性および女性のドナー)はCellular Technology, Incから入手した。University of Pennsylvania Abramson Cancer Centerの黒色腫研究プログラム組織収集プロトコルUPCC 08607の下で、Institutional Review Boardにしたがって、ステージIIIおよびステージIVの黒色腫患者からヒトメラノーマ腫瘍およびPBMCサンプルを収集した。腫瘍サンプルは手術室から調達され、同じ日に手作業で解離して単一細胞懸濁液に処理した。次に、腫瘍サンプルを標準的な凍結培地を用いて直ちに凍結し、液体窒素中に保存した。すべてのヒトのサンプルは、以前に記載されるように処理および染色した(Huang, A. C. et al. T-cell invigoration to tumour burden ratio associated with anti-PD-1 response. Nature 545, 60-65 (2017))。
抗体はBioLegendから入手した:CD44 (IM7)、CD62L (MEL-14)、CD127 937 (A7R34)、Tbet (4B10)、PD-1 (RMP1-30)、CD160 (7H1)、TIM3 (RMT3-23)、CD3ε (17A2)、TNFα (MP6-XT22)、CD8α (53-6.7)、CD4 (RM4-5)、CD45.1 (A29)、CD45.2 (104); Miltenyi Biotec: TOX (REA473); Southern Biotech: KLRG1 (2F1); eBioscience: Eomes (Dan11mag)、2B4 (eBio244F4)、IFNγ (XMG1.2)、Granzyme B (GB11)、B220 (RA3-6B2); or from BD Biosciences: TIGIT (1G9)、LAG33 (C9B7W)、Tcf-1 (S33-966)、2B4 (2B4)、Ki-67 (B56)。Zombie NIR色素(BioLegend)で染色することにより生細胞を識別した。サイトカイン、エフェクター分子、および転写因子の細胞内および核染色は、FoxP3/転写因子染色バッファーセット(eBioscience)を用いて、製造元のプロトコルに従って行った。フローサイトメトリーのデータはBD LSR II装置で取得し、細胞ソーティングは層流フード内に封入されたBD FACSAriaで実行した。FlowJoソフトウェア(TreeStar)を用いてデータを分析した。
マイクロアレイデータ(GSE41867)(Doering, T. A. et al. Network Analysis Reveals Centrally Connected Genes and Pathways Involved in CD8+ T Cell Exhaustion versus Memory. Immunity 37, 1130-1144 (2012))を、先に記載されるとおりに処理した(Doering, T. A. et al. Network Analysis Reveals Centrally Connected Genes and Pathways Involved in CD8+ T Cell Exhaustion versus Memory. Immunity 37, 1130-1144 2012; Pauken, K. E. et al. Epigenetic stability of exhausted T cells limits durability of reinvigoration by PD-1 blockade. Science 354, 1160-1165 (2016))。クロマチン調節機能を持つ遺伝子は、遺伝子オントロジー関連(GO分子機能:クロマチン結合、核酸結合、ヌクレオチド結合、およびPANTHERタンパク質クラス:DNA結合タンパク質、クロマチン結合タンパク質)、EpiFactorsデータベース(Medvedeva, Y. A. et al. EpiFactors: a comprehensive database of human epigenetic factors and complexes. Database 2015, bav067-10 (2015))、および先に同定されたクロマチンモジュレーター(Shi, J. et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nat Biotechnol 33, 661-667 (2015))から検索された遺伝子リストをコンパイルすることによって同定した。
T細胞におけるTOX削除の転写およびエピジェネティックな影響を評価するために、250 WTおよび250 TOX-/-ナイーブCD44LOWCD62LHI P14細胞をドナーの末梢血から選別し、混合し、WTマウスに同時導入した。その後、レシピエントにLCMV Cl-13を感染させ、感染後8日に脾細胞を採取した。処理、CD8+ T細胞富化(EasySep CD8+ T細胞陰性選択キット、Stem Cell Technologiesを使用)、および単一細胞懸濁液の染色の前に、3つの複製ごとに10個の脾臓をプールした。100,000 WTおよびTOX-/-P14細胞を、各複製について98%を超える純度までソートした。異所性および強制的発現実験において、TOX+GFPまたは対照GFPのみ(それぞれ3つの生物学的複製)で形質導入されたインビトロ分化CD8+ T細胞を、最初の活性化後6日にGFP発現で純度> 98%にソートした。NIH3T3細胞にTOX+GFPまたは対照GFPのみのRVウイルスを形質導入し、細胞選別の前に48時間培養した。RNAを抽出するために、50,000個の細胞をβ-メルカプトエタノールを補充した緩衝液RLTに再懸濁し、製造元の指示に従ってRNeasy Micro Kit(Qiagen)で処理した。
FASTQファイルは、mm10マウス参照ゲノムに対してSTAR 2.5.2aを用いてアラインした。整列されたファイルは、PORT遺伝子ベースの正規化(github.com/itmat/Normalization)を用いて処理した。Limmaを用いて示差的遺伝子発現を行った。Limma-voomは、p値<0.05を用いて、実験グループ間で有意に異なって発現された転写産物を同定するのに用いた。
未加工のATAC-seq FASTQデータを処理するために使用されるスクリプトは、次のGitHubリポジトリで入手可能である:github.com/wherrylab/jogiles_ATAC。
細胞は、PBSで希釈した1%パラホルムアルデヒド(PFA)で、回転プラットフォーム上で15分間、架橋した。サンプルをグリシンでクエンチし、細胞ペレットを、回転プラットフォーム上で4°Cで10分間、プロテアーゼ阻害剤(ThermoFisher)を補足した50mM HEPES-KOH、pH 7.5、140mM NaCl、1mM EDTA、10%グリセロール、0.5%NP-40、0.25%Triton X-100を含むバッファー中で溶解した。細胞をペレット化し、回転プラットフォーム上室温(RT)で10分間、プロテアーゼインヒビター(ThermoFisher)を補足した10 mM Tris-HCl pH 8.0、200 mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTAを含む第2の溶解バッファーに再懸濁した。核をペレット化し、10 mM Tris-HCl pH 8.0、100 mM NaCl、1 mM EDTA、0.5 mM EGTA、0.1%Na-デオキシコール酸、0.5%N-ラウロイルサルコシンおよびプロテアーゼ阻害剤を含む最終溶解バッファーに再懸濁した。クロマチンをCovarisソニケーターで剪断した。続いてライセートを抗TOX(ab155768、Abcam)または抗Kat7(ab70183、Abcam)結合Dynabeads(Invitrogen)と一緒に4℃で回転プラットフォーム上で一晩インキュベートした。ビーズを磁石により収集し、RIPA洗浄バッファー(50 mM HEPES-KOH pH 7.5、500 mM LiCl、1 mM EDTA、1%NP-40、0.7%Na-デオキシコール酸)で5回洗浄した。50mM Tris-HCl pH 8.0、10mM EDTA、および1%SDSを含むバッファーでビーズからサンプルを溶出した。65℃で12〜18時間インキュベートすることにより、サンプルおよび入力コントロールにおいて架橋を逆転させた。DNAは、サンプルをRNase A(Tris-EDTA中0.2mg/ml、37°Cで2時間)およびProteinase K(0.2mg/ml、55°Cで2時間)と順次インキュベートし、続いてフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコールと混合し、Phase Lockチューブ(Qiagen)での遠心分離による相分離によって精製した。水相を新しいチューブに移し、サンプルを冷エタノール中で-80℃で一晩インキュベートすることによりDNAを沈殿させた。ここで説明する実験では、ChIP反応ごとに25x106 EL4細胞を複製ごとに用いた。
以前に記載されているように免疫沈降(IP)を行った(Dou, Z. et al. Autophagy mediates degradation of nuclear lamina. Nature 527, 105-109 (2015))。簡単に言えば、5x106 EL4細胞を、1:100 HALTプロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル(Thermo Scientific)ならびに12.5 U/mlのベンゾナーゼ(Novagen)を補足した免疫沈降バッファー(20 mM Tris、pH 7.5、137 mM NaCl、1 mM MgCl2、1 mM CaCl2、1%NP-40、10%グリセロール)中で溶解した。溶解物を4℃で60分間回転させた。続いて、抗体結合Dynabeads(Invitrogen)を加え、サンプルを回転プラットフォーム上で4℃で一晩インキュベートした。ビーズを磁石で収集し、サンプルを免疫沈降バッファーで5回洗浄した。次に、サンプルをNuPAGEローディング色素(ThermoFisher)に再懸濁し、95℃で5分間インキュベートし、そしてウエスタンブロッティングで分析した。次の抗体を用いた:IPについてはTOX (ab155768, Abcam) およびKat7 (ab70183, Abcam) ならびに、ウエスタンブロットについてはTOX (TXRX10, eBioscience)、Kat7 (ab70183, Abcam)、H3K4me1 (ab8895, Abcam)、H3K27me3 (ab6002, Abcam)、H3K9ac (39918, Active Motif)、H3K27ac (ab4729, Abcam)、H4 (07-108, Millipore)、およびH4ac (06- 866, Millipore)。
EL4細胞核抽出物を、記載されるとおりに調製した(Dawson, M. A. et al. Inhibition of BET recruitment to chromatin as an effective treatment for MLL-fusion leukaemia. Nature 478, 529-533 (2011))。簡単に言えば、細胞を低張バッファー(10mM Tris-Cl、pH 7.4、1.5mM MgCl2、10mM KCl、25mM NaF、1mM Na3VO4、1mM DTT、およびRocheプロテアーゼ阻害剤カクテル)中で3分間インキュベートした。続いて細胞ペレットを遠心分離し、低張バッファーに再懸濁し、5ストロークのDounceホモジナイザーでホモジナイズした。核を遠心分離により収集し、抽出バッファー(50 mM Tris-Cl、pH 7.4、1.5 mM MgCl2、20%グリセロール、420 mM NaCl、25 mM NaF、1 mM Na3VO4、1 mM DTT、400 U/ml DNase I、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル)に再懸濁した。回転プラットフォーム上でサンプルを4℃で30分間インキュベートした。50mM Tris-Cl、pH 7.4、1.5mM MgCl2、25mM NaF、1mM Na3VO4、0.6%NP-40、1mM DTT、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むバッファー中で抽出物を3:1に希釈した。製造元の指示に従って、40μgの抗TOX(Abcam、ab155768)または対照IgG抗体を含む磁気co-IPキット(ThermoFisher)を用いて、核抽出物の1 mgに対して免疫精製を行った。
フローサイトメトリーデータについての統計テストは、GraphPad Prismソフトウェアを用いて行った。<0.05のp値は、これらの分析で有意であると見なした。スチューデントのt検定(両側)を用いて、2つの独立した条件間の比較を行った。比較されるサンプルが同じ動物に由来する場合、対応のあるスチューデントのt検定を用いた。
T細胞疲弊の潜在的な分子ドライバーを特定するに、最初に、急性(Armstrong; Arm)または慢性(クローン13; Cl-13)LCMV感染における、ウイルス特異的CD8+ T細胞(LCMV特異的TCRトランスジェニックP14細胞を使用)の縦方向の転写データを分析した。遺伝子発現データの多次元スケーリング(MDS)分析は、TEFFおよびTMEM対TEXの発達に関連する転写シグネチャの動的変化を強調する(図51A)。急性および慢性感染への応答は早期に著しく異なり、6日以内に遺伝子発現にかなりの相違を伴った(図51A)。T細胞疲弊は、TN、TEFFまたはTMEMのそれとは異なるユニークなクロマチンのランドスケープに関連付けられる(Pauken, K. E. et al. Epigenetic stability of exhausted T cells limits durability of reinvigoration by PD-1 blockade. Science 354, 1160-1165 (2016); Sen, D. R. et al. The epigenetic landscape of T cell exhaustion. Science 354, 1165-1169 (2016); Philip, M. et al. Chromatin states define tumour-specific T cell dysfunction and reprogramming. Nature 545, 452-456 (2017); Scott-Browne, J. P. et al. Dynamic Changes in Chromatin Accessibility Occur in CD8+ T Cells Responding to Viral Infection. Immunity 45, 1327-1340 (2016))。エピジェネティックなランドスケープは細胞のアイデンティティの主要なドライバーであるので、クロマチン調節能力を有する遺伝子が初期の発達の違いを引き起こし、TMEMおよびTEXの発達においてユニークな転写の軌道を導き得ると仮定した。実際、感染後日数(d.p.i.)6日の発現データの遺伝子オントロジー分析は、クロマチン結合および転写因子活性を有する遺伝子ファミリーの差次的発現を同定した(図51B)。さらに、これらのファミリー内の遺伝子はT細胞分化中に異なって関与しており、このことは、ユニークなセットのクロマチンモジュレーターが異なるT細胞運命の初期の特定において異なる役割を有し得ることを示唆する(図51C、図52Aおよび表4)。クラスター1(C1)の遺伝子は、慢性感染に応答するCD8+ T細胞に高度に偏っており、このクラスターには、T細胞疲弊の維持に重要な役割を果たすことが知られているいくつかの転写因子(Stat1、Stat2、Tcf4、Ikzf2)およびクロマチンモジュレーター(Tet2、Dnmt3a)(Carty, S. A. et al. The Loss of TET2 Promotes CD8+ T Cell Memory Differentiation. J Immunol 200, 82-91 (2018); Ghoneim, H. E. et al. De Novo Epigenetic Programs Inhibit PD-1 Blockade-Mediated T Cell Rejuvenation. Cell 170, 142-157.e19 (2017))、ならびに、Setbp1、Kdm4a、およびToxを含む末梢CD8+ T細胞において以前にキャラクタライズされていない機能を有するいくつかの遺伝子が含まれていた(図51Dおよび図52A〜B)。これらの中で、Toxは、急性感染症からのTEFFおよびTMEMに対するTEXの発達において、最も差異的に発現されたTFまたは潜在的なクロマチンモジュレーターであった(図51E)。
上記の転写解析を拡張するために、TOXタンパク質の発現をTEFF、TMEM、および急性または慢性LCMV感染の経過中に発達するTEXにおいて測定した。遺伝子発現データと一致して、TOXタンパク質レベルは、慢性LCMV感染から4日以内に有意に増加し、ここで、応答性のCD8+ T細胞の〜80%がd5 p.iまでに高レベルのTOXを発現した(図53A)。さらに、高いTOX発現は、d15 p.i以降からTEX集団の>95%において持続され、>200日p.i. でさえ高度に発現が維持された(図53Aおよび図54A)。対照的に、LCMV Arm感染の急激な解消に応答するTEFFにおいてTOXは誘発されたが、発現は5〜6日p.i.でピークに達し、集団の〜25%またはそれ未満に制限された。さらに、細胞あたりのTOXタンパク質の量はCl-13感染よりもかなり低く、発現は一過性であり、d8-15 p.iの間でほぼベースラインに戻った(図53A)。したがって、TOXは急性および慢性の両方のウイルス感染時に早期に誘導されたが、高いおよび持続性のTOX発現は慢性感染時にのみに観察された。特に、CD8+ T細胞におけるTOXレベルの違いは、ウイルス学的結果が分岐した時点(これは〜8日p.i.で発生する)の前に現れた(Wherry et al., Viral Persistence Alters CD8 T-Cell Immunodominance and Tissue Distribution and Results in Distinct Stages of Functional Impairment. J Virol 77:4911-4927; Odorizzi et al., Genetic absence of PD-1 promotes accumulation of terminally differentiated exhausted CD8+ T cells. J Exp Med 212:1125-1137 (2015))。このことは、ウイルス負荷だけでは差次的発現の主要な推進力ではないことを示唆する。
TEXにおけるTOXの役割をさらに調査するために、TOXFlox/Flox x CD4Cre P14マウス(cKO)を用いて、TOX欠損CD8+ T細胞を作製した。ナイーブP14 TOX cKO T細胞を、類遺伝子的に異なる対照(WT)P14細胞と1:1で混合し、第3のコンジェニックバックグラウンドを持つ宿主に養子移入した(図56A)。特に、WT P14と比較して、ナイーブTOX cKO P14細胞は、同様のベースライン活性化および抑制性受容体の発現を有した(図56B)。次に、これらのレシピエントマウスをLCMV Cl-13に感染させた。この養子移入アプローチは、ウイルス負荷および炎症環境における潜在的な差異の制御を可能にする。
TEXの発達におけるTOXの発現を支配するメカニズムを次に評価した。CD4+ CD8+(DP)胸腺細胞およびニューロンでは、TOXの発現はカルシウムおよびカルシニューリンのシグナル伝達に依存する(Aliahmad, P. et al. TOX Provides a Link Between Calcineurin Activation and CD8 Lineage Commitment. J Exp Med 199, 1089-1099 (2004); Artegiani, B. et al. Tox: a multifunctional transcription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis. EMBO J 34, 896-910 (2015))。ジアシルグリセロールアナログホルボールミリスチン酸アセテート(PMA)およびカルシウムイオノフォアイオノマイシン(Iono)またはIono単独でのDP胸腺細胞の処理は、TOX56を誘導できることが示されている。ここでは、Ionoのみは末梢ナイーブCD8+ T細胞においてTOX発現を誘導したのに対し、PMAのみまたはPMAのIonoへの添加はTOXを誘導できなかったことが発見された(図59A)。理論に拘束されるつもりはないが、これらの結果は、成熟CD8+ T細胞におけるTOX発現が主にカルシニューリン媒介シグナル伝達によって調節されることを示唆する。カルシニューリンシグナル伝達は、主にNFATタンパク質の転写および核局在化を介して転写の変化を導く(Macian, F. NFAT proteins: key regulators of T-cell development and function. Nat Rev Immunol 1278 5, 472-484 (2005))。NFAT活性化の調節不全、特にパートナーとして正規のAP-1なしで機能するNFAT(Martinez, G. J. et al. The Transcription Factor NFAT Promotes Exhaustion of Activated CD8+ T Cells. Immunity 42, 265-278 (2015))は、抑制性受容体(Pdcd1およびCtla4を含む)および転写因子(Irf4、Batf、Tcf7、およびTbx21など)を含むTEX遺伝子のサブセットの転写調節において重要な役割を果たす。TEFFからのNFAT1およびNFAT2 DNA結合データの分析は、両方のNFATがTox遺伝子座に結合することができること、およびこれらのNFAT結合部位の多くがTEXにおけるアクセシビリティにおいて変更されていることを示す(図59B)。Nfatc1(NFAT2)はTEX対TEFFおよびTMEMにおいて異なって発現されるため(図60A)、TOX発現に対するこのNFATの役割は、ここで説明する実験の焦点となった(Man, K. et al. Transcription Factor IRF4 Promotes CD8+ T Cell Exhaustion and Limits the Development of Memory-like T Cells during Chronic Infection. Immunity 47, 1129-1141.e5 (2017))。構成的に活性で核が制限されたCA-NFAT2変異体のレトロウイルス(RV)発現は、インビトロ活性化CD8+ T細胞においてTOXの発現を誘導したが、WT NFAT2はそうでなかった(図57Cおよび図58B)(Monticelli, S. & Rao, A. NFAT1 and NFAT2 are positive regulators of IL-4 gene transcription. Eur. J. Immunol. 32, 2971-2978 (2002))。さらに、NFAT2(NFAT2Flox/Flox xCD4Cre P14; NFAT2 cKO)を欠くP14 T細胞は、LCMV Cl-13感染中にインビボでTOXを発現できなかった(図57Dおよび図58C)。上記のTOX cKOデータと一致して、NFAT2欠損P14 T細胞はTEX前駆体の生成に失敗し、代わりに、KLRG1の増加ならびにPD-1およびTcf1の低下を伴い、豊富なTEFFを生成した(図57D)。しかしながら、NFAT2 cKOの1つの潜在的な警告点は、変更された初期T細胞の活性化である。このアプローチを補完するために、P14を含むマウスをLCMV Cl-13に感染させ、最初のT細胞活性化が発生した後の時点である、d3 p.i.で開始するカルシニューリン阻害剤FK506で処理した。d3-7 p.i.の間の処置は、CD44発現により測定すると、全体的なT細胞活性化への影響は最小限であったが、TOX発現は有意に減少した(図57Eおよび図58D)。さらに、FK506で処理されたマウスからのP14細胞は、高KLRG1および低Eomes発現、ならびにTcf1発現の失敗に基づき、TOX欠損T細胞を表現型模写した(図57E)。NFAT2は多くの転写効果を有し得るため、NFAT2の非存在下における強制されたTOX発現が疲弊の主要な特徴を誘発するのに十分であるか否かが次に疑われた。したがって、NFAT2 cKO P14 T細胞を、TOXを発現するレトロウイルスで形質導入し、その後、LCMV Cl−13に感染したマウスに移入した(図58E)。NFAT2欠損T細胞におけるTOXの発現はPD-1および他の抑制性受容体の発現を回復させ、EomesおよびTcf-1発現を増加させ、そしてKLRG1を有意に減少させた(図57F)。したがって、カルシニューリンおよびNFAT2はTOXを誘導するために必要とされる。さらに、NFAT2-cKO細胞における異所性TOX発現は、初期のTEX分化を回復することができ、このことは、TOXが初期T細胞活性化中に主要なNFAT2依存性TEXイベントであることを示す。
TOXの発現のみで疲弊を駆動するのに十分か否かをテストするために、インビトロのアプローチを用いて、インビトロで分化したCD8+ T細胞においてTOXの発現を強制した(図59A)。TOXのRV発現はサイトカイン産生および多機能性を低下させながらPD-1を増加させ、このことは、TOXがTEXのこれら2つの標準的な特徴を駆動できることを示す(図59B)(Wherry, E. J. & Kurachi, M. Molecular and cellular insights into T cell exhaustion. Nature Publishing Group 15, 486-499 (2015); Wherry, E. J., Blattman, J. N., Murali-Krishna, K., van der Most, R. & Ahmed, R. Viral Persistence Alters CD8 T-Cell Immunodominance and Tissue Distribution and Results in Distinct Stages of Functional Impairment. J Virol 77, 4911-4927 (2003))。インビトロでのTOXの過剰発現により誘発される遺伝子の転写解析は、インビボでのCl-13感染に応答するT細胞の転写シグネチャについて富化された(図59C)(Doering, T. A. et al. Network Analysis Reveals Centrally Connected Genes and Pathways Involved in CD8+ T Cell Exhaustion versus Memory. Immunity 37, 1130-1144 (2012))。さらに、TOX発現によりダウンレギュレートされた遺伝子は、急性的に解消された感染からのTMEMシグネチャにおいて富化された(図59C)。さらに、TOXを過剰発現するCD8 T細胞は、TEXにおいて特異的にダウンレギュレートされた転写産物の発現が低下した一方で、TEXにおいてユニークにアップレギュレートされた遺伝子のセットについて有意に富化された(図59D)(Bengsch, B. et al. Epigenomic-Guided Mass Cytometry Profiling Reveals Disease-Specific Features of Exhausted CD8 T Cells. Immunity 48, 1029-1045.e5 (2018))。実際、抑制性受容体(Pdcd1、Lag3、Ctla4)および転写因子(Nr4a2、Ikzf3、Tox2、Bhlhe41)などの多くの重要な個々の疲弊遺伝子は、インビトロでの強制的なTOX発現によって誘発されたが、記憶関連遺伝子(Ccr7、Il7r、Sell)は減少した(図59E)。
近年、TEXはユニークなエピジェネティックなランドスケープを有し、TN、TEFF、およびTMEMと比較して安定かつ明確な細胞系統を示すことが実証された(Pauken, K. E. et al. Epigenetic stability of exhausted T cells limits durability of reinvigoration by PD-1 blockade. Science 354, 1160-1165 (2016); Sen, D. R. et al. The epigenetic landscape of T cell exhaustion. Science 354, 1165-1169 (2016). Philip, M. et al. Chromatin states define tumour-specific T cell dysfunction and reprogramming. Nature 545, 452-456 (2017). Scott-Browne, J. P. et al. Dynamic Changes in Chromatin Accessibility Occur in CD8+ T Cells Responding to Viral Infection. Immunity 45, 1327-1340 (2016))。したがって、TOXがTEX運命へのこのエピジェネティックなコミットメントを制御するか否かを次に決定した。TOX-/-およびWT P14細胞を、コンジェニックレシピエントマウスに養子移入し、次にLCMV Cl-13感染させた。TOX依存性であるエピジェネティックなランドスケープの変化を規定するため、8日p.i.でWTおよびTOX-/-P14細胞をATAC-seqで分析した。TOXの欠如下において、クロマチンアクセシビリティにおいて変化した〜4,000の領域が存在した。これらの変化の70%超はエンハンサー要素と一致するイントロンまたは遺伝子間領域にあったが、20%はプロモーターまたは転写開始部位(TSS)にあった(図60A)。TOXの不在下でのこれらの変化の中には、Klrg1、Gzma、Gzmb、Gzmm、Zeb2、およびNr4a1を含む、最終TEFF分化に関連する多くの遺伝子でクロマチンアクセシビリティの増加があった(図60A)。対照的に、クロマチンアクセシビリティが低下した遺伝子座には、Tcf7(Tcf1をエンコード)の近位にある遺伝子座、ならびに、Ccr7、Slamf6、Bach2、およびIkzf2などのTMEMおよびTEX前駆体に関連する他の遺伝子が含まれた(図60A)。ピークセットエンリッチメントアプローチを用いて、慢性感染のd8におけるTOX欠損P14細胞のエピジェネティックシグネチャは、急性感染からのTEFFシグネチャについて強く富化され、TEXエピジェネティックランドスケープシグネチャが枯渇していることが見出された(図60B)。さらに、TOXの非存在下でよりアクセスしやすくなったKlrg1、Zeb2、およびClnk遺伝子座を含む、TOX依存様式で変化する多くの主要な遺伝子において特定のピークを同定することができ、Tcf7、Bach2、およびIkzf2におけるピークは強く減少または完全に失われた(図60C、60D)。
TEXが、機能的に乏しいTEFFまたはTMEMの1つの型であるか否か、それとも別個の異なる系統なのかは、長年の疑問である。この明確な細胞運命へのコミットメントの原因となる主要なイベントは、わかりにくいままである。TOXの主要な役割は、TEX特異的エピジェネティックプログラムの疲弊およびイニシエーターの標準的な特徴の主要なインデューサーとしてここに示された。これらの発見はいくつかの潜在的な意味を有する。最初に、TOX発現およびTOXによって制御される分子イベントは、TEXをより正確に検出、定量化、および評価するのに役立ち得る。なぜなら、TEXを特異的に規定および監視するのを不十分にする他のTEXマーカー(PD-1など)も他の活性化されたT細胞によっても発現されるからである。特に、ヒトCD8+ T細胞の最近のCyTOFの研究では、HIVおよび肺癌におけるTEXの大多数においてTOX発現が見出された(Bengsch, B. et al. Epigenomic-Guided Mass Cytometry Profiling Reveals Disease-Specific Features of Exhausted CD8 T Cells. Immunity 48, 1029-1045.e5 (2018))。したがって、疲弊において原因となる役割を持つ高度にTEXに偏ったTFとしてTOXを同定すると、人間の疾患のTEX設定をより良く同定および評価することを許容し得る。
CRISPRシステムとは、これらに限らないが、遺伝子の切除、遺伝子の変異(たとえば、点変異、フレームシフト変異、および目的の遺伝子の発現を変化させるその他の変異の導入)、外来遺伝子要素の組み込み(たとえば、親和性タグ、蛍光タグ、および他の外来マーカーなどの外来コーディング領域の導入)、相同性指向性修復(HDR)およびDNAメチル化による編集、を含む、さまざまなタイプのゲノム編集に役立つシステムを指す。CRISPRシステムは、一般に、ゲノム内で標的特異的様式でヌクレアーゼ活性(すなわち、DNAの切断)を駆動するために、CRISPRファミリー酵素(たとえば、Cas9)およびガイドRNA(gRNA)を用いる。CRISPRシステムにおいて有用なポリヌクレオチドは当業者に知られており、これらに限らないが、ガイドRNA(gRNA)、CRISPR RNA(crRNA)、トランス活性化CRISPR RNA(tracrRNA)、シングルガイドcrRNAおよびtracrRNA融合(sgRNA)、CRISPRファミリー酵素をコードするポリヌクレオチド、CRISPRシステム発現ベクター(たとえば、CRISPRファミリー酵素、gRNA、crRNA、tracrRNA、sgRNA、またはそれらの組み合わせをコードするベクター)、またはそれらの組み合わせ、を含む。CRISPRシステムは文献でより詳細に説明されている。たとえば、両方とも全体が引用により本明細書に組み込まれる、M. Adli (“The CRISPR tool kit for genome editing and beyond”; Nature Communications; volume 9 (2018), Article number: 1911) および Y. Lei (“Targeted DNA methylation in vivo using an engineered dCas9-MQ1 fusion protein”; Nature Communications; volume 8 (2017), Article number: 16026)を参照のこと。
本明細書における変数の任意の定義における要素のリストの列挙は、任意の単一の要素またはリストされた要素の組み合わせ(またはサブコンビネーション)としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態として、または任意の他の実施形態またはその一部と組み合わせて、その実施形態を含む。
Claims (47)
- 疾患を治療するのに用いるための改良された細胞治療組成物を作製する方法であって、該方法が、
(a)対象からのリンパ球を含む試料を得る段階と、
(b)該リンパ球における疲弊したCD8+Tリンパ球(TEX)の誘導および/または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現を低減または排除する段階と、
(c)治療に関連する抗原を標的とするように該リンパ球を操作する段階と、
を含み、前記疾患が、癌および感染症から選択される、方法。 - 前記対象からのT細胞を含む試料が、血液、腹水、胸水、リンパ液、粘液、気管支肺胞洗浄液、または組織を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記対象からのT細胞を含む試料が、CD8+T細胞、腫瘍関連リンパ球、または腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記リンパ球におけるTEXの誘導および/または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現が低減される、請求項1、2、または3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リンパ球におけるTEXの誘導および/または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現が排除される、請求項1、2、または3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リンパ球におけるTEXの誘導および/または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現が、RNA干渉、クラスター化した散在性の短い回文構造の反復(CRISPR)/CRISPR関連タンパク質(Cas)システム、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、アンチセンス、リボザイム、および不活性型(dead)Cas9を含むCRISPR阻害システムからなる群から選択される方法によって低減される、請求項4に記載の方法。
- 前記リンパ球におけるTEXの誘導および/または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現が、RNA干渉、クラスター化した散在性の短い回文構造の反復(CRISPR)/CRISPR関連タンパク質(Cas)システム、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、アンチセンス、リボザイム、不活性型Cas9を含むCRISPR阻害システムからなる群から選択される方法によって排除される、請求項5に記載の方法。
- 前記疾患がウイルス感染症である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ウイルス感染症が急性ウイルス感染症または慢性ウイルス感染症である、請求項8に記載の方法。
- 前記疾患が急性ウイルス感染症である、請求項9に記載の方法。
- 前記急性ウイルス感染症が、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、ポリオーマウイルス、アネロウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、およびインフルエンザウイルスからなる群から選択されるウイルスによる感染症を含む、請求項10に記載の方法。
- 前記ウイルスが、A型肝炎ウイルス(HAV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、D型肝炎ウイルス(HDV)、E型肝炎ウイルス(HEV)、GB肝炎ウイルスA(GBV-A)、GB肝炎ウイルスB(GBV-B)、およびGB肝炎ウイルスC(GBV-C)からなる群から選択される肝炎ウイルスである、請求項11に記載の方法。
- 前記ウイルスが、アルファヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス1型(HSV1)、単純ヘルペスウイルス2型(HSV2)、水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)、ベータヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、ヒトヘルペスウイルス6、ヒトヘルペスウイルス7、ガンマヘルペスウイルス、エプスタインバーウイルス(EBV)、およびヒトヘルペスウイルス8からなる群から選択されるヘルペスウイルスである、請求項11に記載の方法。
- 前記ウイルスが、BKウイルス(BKV)、JCウイルス(JCV)、KIポリオーマウイルス(KIPyV)、WUウイルス(WUPyV)、メルケル細胞ポリオーマウイルス(MCPyV)、ヒトポリオーマウイルス6(HPyV6)、ヒトポリオーマウイルス7(HPyV7)、毛髪異形成棘状ウイルス(trichodysplasia spinulosa virus:TSPyV)、ヒトポリオーマウイルス9(HPyV9)、およびMWウイルス(MWPyV)からなる群から選択されるポリオーマウイルスである、請求項11に記載の方法。
- 前記ウイルスが、アデノウイルス血清型A、アデノウイルス血清型B、アデノウイルス血清型C、アデノウイルス血清型D、アデノウイルス血清型E、アデノウイルス血清型F、およびアデノウイルス血清型Gからなる群から選択されるアデノウイルスである、請求項11に記載の方法。
- 前記ウイルスが、インフルエンザウイルスA、インフルエンザウイルスB、インフルエンザウイルスC、およびインフルエンザウイルスDからなる群から選択されるインフルエンザウイルスである、請求項11に記載の方法。
- 前記疾患が慢性ウイルス感染症である、請求項9に記載の方法。
- 前記慢性ウイルス感染症がHIV、HCVまたはHBVによる感染症を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記慢性ウイルス感染症がHIVによるものであり、前記対象が抗レトロウイルス療法(ART)で処置中である、請求項17に記載の方法。
- 前記慢性ウイルス感染症が、アルファレトロウイルス、ベータレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、デルタレトロウイルス、イプシロンレトロウイルス、レンチウイルス、およびスプマウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスによるものである、請求項17に記載の方法。
- 前記レトロウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)およびウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)からなる群から選択されるレンチウイルスである、請求項20に記載の方法。
- 前記感染症が細菌感染症または寄生体感染症である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患が癌である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TEXの誘導および/または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子が、転写因子またはDNAのエピジェネティックな改変に関与する遺伝子である、請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記TEXの誘導および/または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子が転写因子である、請求項23に記載の方法。
- 前記転写因子が、TOX、NFAT1、NFAT2、BATF、IRF4、T-bet、Eomes、Tcf1、Blimp-1、Bcl6、Foxo1、Stat1、Stat2、Tcf4、およびIkzf2からなる群から選択される、請求項25に記載の方法。
- 前記TEXの誘導および/または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子が、DNAのエピジェネティックな改変に関与する遺伝子である、請求項23に記載の方法。
- 治療に関連する抗原を標的とするようにリンパ球を操作する段階が、所望の抗原/MHCもしくはネオ抗原/MHCの組み合わせに結合することができる組換えT細胞受容体の導入、または所望の抗原に結合することができるキメラ抗原受容体の導入、を含む、請求項1〜28のいずれか一項に記載の方法。
- 前記治療に関連する抗原が、CD19、PSMA、CAIX、HER2、CD30zeta、葉酸受容体アルファ、ムチン1(MUC1)、C型肝炎ウイルスE2糖タンパク質、HIVエンベロープ糖タンパク質gp120、CMV pp65、GPC3、CEA、メソテリン、GD2、EGFR、PSMA、EpCAM、BCMA、IL-13R、FAPおよびCD20からなる群から選択される、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 疲弊したCD8+エフェクターT細胞(TEX)の数の増加を特徴とする疾患を治療する方法であって、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法によって作製された改良された細胞治療組成物を投与する段階を含む、方法
- 請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法によって作製された操作されたリンパ球を含む、改良された細胞治療組成物。
- 疲弊したCD8+エフェクターT細胞(TEX)の数の増加を特徴とする疾患を治療する方法であって、カルシウムシグナル伝達の阻害剤を投与することを含む、方法。
- 前記カルシウムシグナル伝達の阻害剤が、FK506/タクロリムス、ピメクロリムス、およびシクロスポリンAからなる群から選択される、請求項33に記載の方法。
- 自己免疫疾患を治療するための改良された細胞治療組成物を作製する方法であって、
(d)対象からの自己反応性リンパ球を含む試料を得る段階と、
(e)該自己反応性リンパ球における疲弊したCD8+Tリンパ球(TEX)の誘導および/または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現を増加させる段階と、
(f)治療に関連する抗原を標的とするようにリンパ球を操作する段階と、
を含む、方法。 - 前記対象からのT細胞を含む試料が、血液、腹水、胸水、リンパ液、粘液、気管支肺胞洗浄液、または組織を含む、請求項35に記載の方法。
- 前記対象からのT細胞を含む試料が、CD8+T細胞、腫瘍関連リンパ球、または腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む、請求項36に記載の方法。
- 前記自己反応性リンパ球におけるTEXの誘導および/または維持のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子の発現が増加される、請求項35〜37のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項35〜38のいずれか一項に記載の方法によって作製された操作されたリンパ球を含む、改良された細胞治療組成物。
- 疲弊したCD8+エフェクターT細胞(TEX)の数の減少を特徴とする疾患を治療する方法であって、請求項35〜38のいずれか一項に記載の方法によって作製された改良された細胞治療組成物を投与する段階を含む、方法。
- T細胞の再活化(reinvigoration)を必要とする対象を同定する方法であって、
(g)対象からのリンパ球を含む試料を得る段階と、
(h)該試料における疲弊したCD8+エフェクターT細胞(TEX)に特徴的な1つまたは複数の遺伝子の発現を測定する段階と、
(i)TEXに特徴的な1つまたは複数の遺伝子の発現を、リンパ球を含む対照試料におけるTEXに特徴的な同じ1つまたは複数の遺伝子の発現と比較する段階と、
(j)段階(a)、(b)、および(c)を1つまたは複数の後続の時点で繰り返す段階と、
(k)リンパ球を含む第2の試料または後の試料におけるTEXに特徴的な1つまたは複数の遺伝子の発現が、リンパ球を含む第1の試料または前の試料におけるその発現と比較して増加している場合に、対象がT細胞の再活化を必要としていると決定し、または
(l)第2の試料または後の試料におけるTEXに特徴的な1つまたは複数の遺伝子の発現が、リンパ球を含む第1の試料または前の試料におけるその発現と比較して同じか減少している場合に、対象がT細胞の再活化を必要としていないと決定する段階と、
を含む、方法。 - 前記TEXに特徴的な1つまたは複数の遺伝子が、TOX、NFAT1、NFAT2、BATF、IRF4、T-bet、Eomes、Tcf1、Blimp-1、Bcl6、Foxo1、Stat1、Stat2、Tcf4、およびIkzf2からなる群から選択される、請求項41に記載の方法。
- 前記対象からのT細胞を含む試料が、血液、腹水、胸水、リンパ液、粘液、気管支肺胞洗浄液、または組織を含む、請求項41に記載の方法。
- 前記対象からのT細胞を含む試料が、CD8+T細胞、腫瘍関連リンパ球、または腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む、請求項44に記載の方法。
- 前記対象がT細胞の再活化を必要としていると決定された場合に、該対象にT細胞の再活化のための組成物を投与する段階をさらに含む、請求項41〜45のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象がT細胞の再活化を必要としていないと決定された場合に、代替処置を対象に施す段階をさらに含む、請求項41〜45のいずれか一項に記載の方法。
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