CN109055372B

CN109055372B - TOX基因及其sgRNA的应用

Info

Publication number: CN109055372B
Application number: CN201810777648.8A
Authority: CN
Inventors: 王晓琛; 孙倍成; 沈彬; 田文芳; 张泽川; 于伟伟
Original assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Current assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Priority date: 2018-07-16
Filing date: 2018-07-16
Publication date: 2021-10-19
Anticipated expiration: 2038-07-16
Also published as: CN109055372A

Abstract

本发明公开了TOX基因及其sgRNA在制备抗肿瘤药物中的的应用，涉及T细胞分子生物领域；本发明通过在不同耗竭程度的CD8+T细胞中表达差异最显著的基因的发现、检测及其应用，通过高通量RNA测序，发现TOX在CD8+T细胞耗竭发生发展中具有重要调节作用，TOX表达与CD8+T细胞耗竭的发生、发展密切相关；再根据TOX的编码序列，设计合成sgRNA，通过与质粒载体接合，转化，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术CD8+T细胞中敲低TOX，能够显著减少CD8+T细胞耗竭的发生，显著恢复耗竭的CD8+T细胞的抗肿瘤能力，可应用于制备抗肿瘤药物。

Description

TOX基因及其sgRNA的应用

技术领域

本发明涉及T细胞分子生物领域，具体而言，本发明具体涉及TOX基因及其sgRNA在制备恢复T细胞耗竭药物中的应用。

背景技术

原发性肝癌，是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居于全球恶性肿瘤第五位，致死率列第三位，按病理学分型可分为肝细胞型、胆管细胞型和混合型三种，其中以肝细胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)最为常见，占原发性肝癌90％以上(Chen W,etal.Cancer statistics in China,2015.CA Cancer J Clin 2016；66:115-132.)。

导致HCC的主要病因为慢性活动性肝炎，包括乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)导致的病毒性肝炎，酒精性肝炎及非酒精性脂肪肝性肝炎。目前国内常见的肝细胞肝癌以HBV感染为主要途径。HCC以早期症状隐匿，复发率高及预后不佳为主要特点(LlovetJM,et al.Advances in targeted therapies for hepatocellular carcinoma in thegenomic era.Nat Rev Clin Oncol 2015；12:408-424；Miltiadous O,et al.Progenitorcell markers predict outcome of patients with hepatocellular carcinoma beyondMilan criteria undergoing liver transplantation.J Hepatol 2015；63:1368-1377；Zhu AX,et al.HCC and angiogenesis:possible targets and future directions.NatRev Clin Oncol 2011；8:292-301.)。目前HCC的治疗方法主要包括外科手术治疗、放疗、介入治疗及化学治疗等方式。近年兴起的免疫治疗，通过调节机体的免疫系统，提高其对肿瘤细胞的杀伤能力以及改善肿瘤的免疫抑制状态来实现对抗肿瘤的目的，因为在多种恶性肿瘤治疗中的发挥了重要作用而备受关注，被称为肿瘤治疗最有前途的发展方向，其在HCC治疗中的应用也有相关的研究和报道(Greten TF,et al.Current concepts of immunebased treatments for patients with HCC:from basic science to novel treatmentapproaches.Gut 2015；64:842-848；Prieto J,et al.Immunological landscape andimmunotherapy of hepatocellular carcinoma.Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2015；12:681-700)。

免疫系统在慢性炎症向肿瘤的转化过程中扮演了极为重要而复杂的角色,肿瘤微环境中普遍存在一种特殊的T细胞功能紊乱现象，称为T细胞耗竭(T cell exhaustion)。耗竭的T细胞主要呈现细胞活力、增殖能力及抗凋亡能力减弱，分泌效应细胞因子(IL-2，IFN-γ，TNF等)的能力及杀伤能力降低。在慢性炎症环境中，T细胞耗竭介导的低水平免疫状态，为肿瘤发生提供潜在可能，并且在肿瘤发生发展过程中，T细胞耗竭程度的加重逐渐导致抗肿瘤免疫减弱，从而使肿瘤免疫微环境变得更适宜肿瘤发展。耗竭T细胞在表面表达一系列免疫抑制性受体，如PD-1(programmed cell death-1)、CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyteantigen-4)、LAG-3(lymphocyte-activation gene-3)、TIM-3(T cell immunoglobulinand mucin-domain-containing molecule-3)、(Kim PS,et al.Features of respondingT cells in cancer and chronic infection.Curr Opin Immunol 2010；22:223-230；Hanahan D,et al.Hallmarks of cancer:the next generation.Cell 2011；144:646-674.)。

T细胞耗竭，根据其程度分为可逆性的早期耗竭(T细胞表面PD-1表达水平中等)，和不可逆的晚期耗竭(T细胞表面PD-1表达水平很高)(Wherry EJ,et al.Molecular andcellular insights into T cell exhaustion.Nat Rev Immunol 2015；15:486-499.)。针对早期耗竭的T细胞，给予阻断T细胞表面抑制分子的治疗，能够从一定程度上，恢复T细胞功能(Wherry EJ,et al.Molecular and cellular insights into T cellexhaustion.Nat Rev Immunol 2015；15:486-499；Fisicaro P,et al.Antiviralintrahepatic T-cell responses can be restored by blocking programmed death-1pathway in chronic hepatitis B.Gastroenterology 2010；138:682-693,693 e681-684；Day CL,et al.PD-1 expression on HIV-specific T cells is associated withT-cell exhaustion and disease progression.Nature 2006；443:350-354；Barber DL,et al.Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viralinfection.Nature 2006；439:682-687.)。但是这种方法,只能够部分改善早期耗竭的T细胞的功能，并且对逆转晚期耗竭T细胞的状态几乎没有作用。这可能也就是临床治疗中，很多肿瘤病人对应用PD-1，CTLA-4等抗体治疗不敏感的重要原因，因而，针对不可逆的晚期T细胞耗竭的研究，开发针对性阻碍效应T细胞向晚期耗竭发展，以及恢复这种晚期耗竭T细胞的功能的新的高效抗肿瘤药物，已经成为本领域亟待解决的技术难题。

目前对T细胞耗竭的机制研究，已发现了多个在T细胞耗竭发生中具有重要调控作用的分子，如PSGL-1，NFAT，Blimp-1，TNF，GSK3等等，提示了这些可以作为潜在的逆转T细胞耗竭的治疗靶点(Tinoco R,et al.PSGL-1 Is an Immune Checkpoint Regulator thatPromotes T Cell Exhaustion.Immunity 2016；44:1190-1203.14；Taylor A,etal.Glycogen Synthase Kinase 3Inactivation Drives T-bet-MediatedDownregulation of Co-receptor PD-1 to Enhance CD8(+)Cytolytic T CellResponses.Immunity 2016；44:274-286；BaxterAE,Kaufmann DE.Tumor-necrosis factoris a master of T cell exhaustion.Nat Immunol 2016；17:476-478；Martinez GJ,etal.The transcription factor NFAT promotes exhaustion of activated CD8(+)Tcells.Immunity 2015；42:265-278；Shin H,et al.A role for the transcriptionalrepressor Blimp-1 in CD8(+)T cell exhaustion during chronic viralinfection.Immunity 2009；31:309-320；Huang X,et al.Driving an improved CAR forcancer immunotherapy.J Clin Invest 2016；126:2795-2798；Qin H,et al.Generationof a new therapeutic peptide that depletes myeloid-derived suppressor cellsin tumor-bearing mice.Nat Med 2014；20:676-681；Rosenberg SA,et al.Adoptivecell transfer as personalized immunotherapy for human cancer.Science 2015；348:62-68；Thorne SH,et al.Synergistic antitumor effects of immune cell-viralbiotherapy.Science 2006；311:1780-1784；van der Stegen SJ,Hamieh M,SadelainM.The pharmacology of second-generation chimeric antigen receptors.Nat RevDrug Discov 2015；14:499-509.)。然而，T耗竭的具体分子机制仍远未阐明，通过干预T细胞耗竭来开发抗肿瘤治疗方法的道路依然艰难而漫长。

TOX基因(基因定位于人8号染色体q12.1上，全长4131bp，编码526个氨基酸，蛋白细胞核内表达，NCBI Gene ID:9760)被报道在T细胞淋巴瘤(Huang X,et al.Driving animproved CAR for cancer immunotherapy.J Clin Invest 2016；126:2795-2798；BenoitBM,et al.CD164 identifies CD4+ T cells highly expressing genes associatedwith malignancy in Sezary syndrome:the Sezary signature genes,FCRL3,Tox,andmiR-214.Arch Dermatol Res 2017；309:11-19；Geskin LJ,et al.Interleukin-13 isoverexpressed in cutaneous T-cell lymphoma cells and regulates theirproliferation.Blood 2015；125:2798-2805；Izykowska K,et al.Geneticrearrangements result in altered gene expression and novel fusion transcriptsin Sezary syndrome.Oncotarget 2017；8:39627-39639；Litvinov IV,Netchiporouk E,Cordeiro B,Dore MA,Moreau L,Pehr K,Gilbert M,et al.The Use of TranscriptionalProfiling to Improve Personalized Diagnosis and Management of Cutaneous T-cell Lymphoma(CTCL).Clin Cancer Res 2015；21:2820-2829；Litvinov IV,etal.Ectopic expression of embryonic stem cell and other developmental genes incutaneous T-cell lymphoma.Oncoimmunology 2014；3:e970025；McGirt LY,et al.miR-223 regulates cell growth and targets proto-oncogenes in mycosis fungoides/cutaneous T-cell lymphoma.J Invest Dermatol 2014；134:1101-1107；McGirt LY,etal.TOX expression and role in CTCL.J Eur Acad Dermatol Venereol 2016；30:1497-1502；Morimura S,et al.TOX expression in different subtypes of cutaneouslymphoma.Arch Dermatol Res 2014；306:843-849；Nguyen GH,et al.An Index Case ofConcomitant Tumoral and Ichthyosiform Mycosis Fungoides-Like Presentation ofChronic Adult T-cell Leukemia/Lymphoma Associated With Upregulation of TOX.AmJ Dermatopathol 2017；39:28-32；Nicolay JP,et al.Sezary syndrome:old enigmas,new targets.J Dtsch Dermatol Ges 2016；14:256-264；Odum N.Malignant TOXicationof T cells.Blood 2015；125:1361-1362.)，急性T淋巴细胞行白血病(Nagel S,etal.Repressed BMP signaling reactivates NKL homeobox gene MSX1 in a T-ALLsubset.Leuk Lymphoma 2015；56:480-491.)，B细胞淋巴瘤(Schrader AM,et al.TOXexpression in cutaneous B-cell lymphomas.Arch Dermatol Res 2016；308:423-427.)发挥促肿瘤作用，在蕈样真菌病(Huang Y,et al.Thymocyte selection-associated highmobility group box gene(TOX)is aberrantly over-expressed in mycosis fungoidesand correlates with poor prognosis.Oncotarget 2014；5:4418-4425；Yu X,et al.TOXacts an oncological role in mycosis fungoides.PLoS One 2015；10:e0117479；ZhangY,et al.Molecular markers of early-stage mycosis fungoides.J Invest Dermatol2012；132:1698-1706.)，牛皮癣(Mora-Velandia LM,et al.A Human Lin-CD123+CD127lowPopulation Endowed with ILC Features and Migratory Capabilities Contributesto Immunopathological Hallmarks of Psoriasis.Front Immunol 2017；8:176.)中异常高表达，在哺乳动物大脑皮质发育(Artegiani B,et al.Tox:a multifunctionaltranscription factor and novel regulator of mammalian corticogenesis.EMBO J2015；34:896-910.)，CD4+T细胞的发育(Xiong Y,et al.The enigma of CD4-lineagespecification.Eur J Immunol 2011；41:568-574.)，NK细胞的生成(Yun S,et al.TOXregulates the differentiation of human natural killer cells fromhematopoietic stem cells in vitro.Immunol Lett 2011；136:29-36.)，淋巴器官的发生(Aliahmad P,et al.Shared dependence on the DNA-binding factor TOX for thedevelopment of lymphoid tissue-inducer cell and NK cell lineages.NatImmunol2010；11:945-952.)中具有重要作用。目前，TOX基因在恢复肝癌组织中浸润性耗竭的CD8+T细胞中的应用尚未见报道。

发明内容

针对上述问题，申请人过表达谱基因芯片分析，发现TOX(Thymocyte selection-associated high mobility group box protein，TOX)基因在促进肝癌中T细胞耗竭中的关键作用，并进一步提供该基因及其sgRNA在制备恢复T细胞耗竭药物中的应用。

本发明首先提供了一种TOX基因在制备恢复T细胞耗竭药物中的应用，所述应用是指：设计编码序列外显子3(exon3)序列，检测引导Cas9酶特异性剪切TOX编码序列、抑制TOX表达的5个sgRNA序列，他们依次为：TOX-sgRNA1(其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)、TOX-sgRNA2(其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)、TOX-sgRNA3(其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)、TOX-sgRNA4(其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)以及TOX-sgRNA5(其核苷酸序列如SEQID NO.7所示)。

进一步，上述T细胞优选肝癌组织中浸润性耗竭的CD8+细胞。

其次，本发明提供了一段sgRNA序列，其核苷酸序列选自如SEQ ID NO.3～SEQ IDNO.17所示序列的任一种，本发明同时提供了上述这些sgRNA在制备恢复T细胞耗竭药物中的应用，所述T细胞优选肝癌组织中浸润性耗竭的CD8+细胞。

第三，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含核苷酸序列如SEQ IDNO.3～SEQ ID NO.17任一种所示的sgRNA以及药学上可以接受的载体、稀释剂或赋形剂，该药物组合物可以通过CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向特异性敲除肝癌组织中浸润性CD8+T细胞中TOX基因。

第四，本发明提供了一种包含核苷酸序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.17中任一种所示的sgRNA的载体或工程菌。

第五，本发明还提供了一种利用TOX基因设计sgRNA，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向特异性敲除肝癌组织中浸润性CD8+T细胞中TOX基因的方法，其步骤如下：

1)TOX-sgRNA的设计：根据NCBI Gene上TOX的基因序列(NCBI Gene ID:9760)，结合CRISPR/Cas9基因编辑原理，根据PAM序列定位，选取到位于TOX exon3上的5个位点，设计多段sgRNA序列，所设计的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.7所示。

2)TOX-sgRNA的合成：结合pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin载体质粒(含U6启动子，可在真核生物内快速表达sgRNA)和限制性内切酶BsaI(NEB，R3535S)的特性，向步骤1)所设计的sgRNA分别添加黏性末端Oligo序列，合成TOX-sgRNA其序列如SEQ ID NO.8～SEQ IDNO.17所示。

3)TOX-sgRNA的连接：将步骤2)合成的TOX-sgRNA每一对分别进行退火,接着线性化pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin载体质粒，然后用限制性内切酶BsaI(NEB，R3535S)酶切，再通过solutionI(TAKARA)连接合成的添加黏性末端的TOX-sgRNA双链。

4)质粒的转化：利用大肠杆菌，通过转化pGL3-U6-TOXsgRNA-PGK-puromycin质粒,体外转录TOX-sgRNA,通过氨苄霉素筛选阳性大肠杆菌单克隆，再进一步扩增目标产物，抽提质粒。

5)质粒的体外转录：通过MEGAshortscript^TM Kit(Thermo Fisher Scientific)对抽提的质粒进行体外转录扩增sgRNA。

6)Cas9蛋白和TOX-sgRNA电转染：利用Lonza 4D-Nucleofector电转仪电转染细胞：

电转体系：Cas9蛋白400ng+sgRNA 200ng+2*10^5个细胞+P3 Primary Cell 4D-Nucleofector^TM X Kit(Lonza)；

电转模式：human T cell。

申请人通过系统研究人肝癌组织中浸润性CD8+T细胞的转录组表达谱，发现决定CD8+T细胞耗竭的新的基因，并通过流式细胞技术，对肝癌组织浸润性CD8+T细胞根据细胞表面抑制性表面受体(PD-1，TIM3)的表达水平进行分选：非耗竭CD8+T细胞(PD1-TIM3-)3例，耗竭CD8+T细胞(PD1+TIM3+)3例，共6个样本，再通过高通量RNA测序，发现一组在不同耗竭程度的CD8+T细胞中差异性表达的基因，进一步通过实时定量PCR技术在来自40例患者的肝癌组织浸润性的非耗竭及耗竭的CD8+T细胞中验证，选择了在耗竭的CD8+T细胞中表达差异最显著的基因TOX。实施例中申请人通过在非耗竭的CD8+T细胞中过表达TOX以及在耗竭的CD8+T细胞中敲低TOX，进一步确定TOX在CD8+T细胞耗竭发生发展中具有重要调节作用，降低TOX表达能够显著减少CD8+T细胞耗竭的发生，并能显著恢复耗竭的CD8+T细胞的抗肿瘤能力。因此说明，TOX基因有望成为肝癌免疫疗法的新靶点，从而为抑制肝癌的发生与发展，改善肝癌患者的预后提供帮助。

附图说明

图1为pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin载体示意图。

图2为流式鉴定耗竭与非耗竭CD8+T细胞示意图。

图3为流式分选耗竭与非耗竭CD8+T细胞示意图。

图4为qPCR检测TOX基因在耗竭与非耗竭CD8+T细胞中mRNA的表达情况示意图。

图5为5个TOX特异性sgRNA效果剪切效果琼脂糖凝胶电泳图。图中泳道1-7依次分别为marker、control、sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5。

图6为qPCR检测CRISPR/Cas9敲除后TOX mRNA在耗竭的CD8+T细胞中的表达情况示意图。

图7为western blot检测CRISPR/Cas9敲除后TOX蛋白在耗竭的CD8+T细胞中的表达情况示意图。

图8为流式细胞术检测CRISPR/Cas9敲除后耗竭的CD8+T细胞中TOX蛋白的表达情况示意图。

图9为流式细胞术检测CRISPR/Cas9敲除后耗竭的CD8+T细胞增值活性示意图。

图10为流式细胞术检测CRISPR/Cas9敲除后耗竭的CD8+T细胞细胞因子与耗竭相关分子示意图。

图11为体外NCG小鼠皮下种瘤实验检测CRISPR/Cas9敲除TOX耗竭的CD8+T细胞抗肿瘤能力照片。

图12为两端加入酶接位点sgRNA双链示意图(自上而下分别对应sgRNA1、sgRNA2、sgRNA 3、sgRNA4、sgRNA5)。

具体实施方式

试剂来源：pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin购自addgene

PrimeScript RT Master Mix、solutionI均购自Takara公司；

氨苄霉素筛选阳性大肠杆菌购自擎科生物；

TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix购自TRANSGEN公司；

AxyPrep PlasmidMiniprep Kit购自Axygen；

MEGAshortscript^TM Kit购自ThermoFisher公司。

实施例1 筛选TOX基因

申请人在项目通过伦理委员会审核之后，系统研究人肝癌组织中浸润性CD8+T细胞的转录组表达谱，发现决定CD8+T细胞耗竭的新的基因，并通过流式细胞术，对肝癌组织浸润性CD8+T细胞根据细胞表面抑制性表面受体(PD-1，TIM3)的表达水平进行分选：非耗竭CD8+T细胞(PD1-TIM3-)3例，耗竭CD8+T细胞(PD1+TIM3+)3例，共6个样本(来源于3个病人具体信息见表1)：

表1 样本信息1

表2 样本信息2

再通过高通量RNA测序，发现一组在不同耗竭程度的CD8+T细胞中差异性表达的基因，进一步通过实时定量PCR技术在来自40例患者(具体信息见表2)的肝癌组织浸润性的非耗竭、部分耗竭及完全耗竭的CD8+T细胞中验证，选择了在不同耗竭程度的CD8+T细胞中表达差异最显著的基因TOX。

具体步骤如下：

1)不同程度耗竭CD8+T细胞的分选：通过流式细胞仪(BD Biosciences)分选40对肝癌组织中浸润性CD8+T细胞，根据表面标志物的表达情况，分为两类：非耗竭CD8+T细胞(PD1-TIM3-)，耗竭CD8+T细胞(PD1+TIM3+)(Zhen et al.,Targeting type I interferon–mediated activation restores immune function in chronic HIV infection.J ClinInvest.2017；127(1):260–268；Singer et al.,A Distinct Gene Module forDysfunction Uncoupled from Activation in Tumor-Infiltrating T Cells 2016,Cell166,1500–1511)。

实验结果如图2和图3所示：图2为流式鉴定耗竭与非耗竭CD8+T细胞示意图。图2中，Isotype为同型对照，用于流式分析中作为空白对照；PD1-TIM3-为非耗竭CD8+T细胞；PD1+TIM3+为耗竭CD8+T细胞；图中，图2A为细胞耗竭标志分子PD-1表达结果示意图；图2B为细胞活性(CD69)检测结果示意图；图2C为细胞增殖水平(Ki67)检测结果示意图；图2D为细胞因子IFN-γ检测结果示意图；图2E为细胞因子IL-2检测结果示意图；图2F为细胞因子TNF-α检测结果示意图；由图2可见，与非耗竭的CD8+T细胞相比，耗竭的CD8+T细胞活性(CD69)、增殖水平(Ki67)及细胞因子(IL-2，IFN-γ，TNF-α)水平均显著降低。

图3为流式分选耗竭与非耗竭CD8+T细胞结果示意图，其中PD1-TIM3-为非耗竭CD8+T细胞，PD1+TIM3+为耗竭CD8+T细胞。

2)Total RNA提取

通过TRIzol(Invitrogen)裂解分离的CD8+T细胞，接下来使用三氯甲烷、异丙醇和75％乙醇提取总RNA。

总RNA提取方法参见：(Brown,R.A.M.,et al.(2018)."Total RNA extractionfrom tissues for microRNA and target gene expression analysis:not all kitsare created equal."BMC Biotechnol 18(1):16.)

3)cDNA制备

通过逆转录试剂PrimeScript RT Master Mix制备cDNA.

反应条件：37℃15min，85℃5sec，4℃∞

反应体系如下：

4)qPCR检测耗竭与非耗竭CD8+T细胞TOX mRNA的表达情况

根据TOX mRNA序列情况设计特异性引物(其核苷酸序列如SEQ ID NO.18和SEQ IDNO.19所示)；

荧光定量PCR程序：95℃30s预变性，接40个循环：95℃5s，60℃32s。

反应体系如下：

实验结果如图4所示：图4为qPCR检测TOX基因在耗竭与非耗竭的CD8+T细胞中mRNA的表达情况示意图，图中，PD1-TIM3-为非耗竭CD8+T细胞，PD1^-TIM3+为耗竭的CD8+T细胞；可见，与非耗竭CD8+T细胞相比，耗竭CD8+T细胞中TOX mRNA过表达。

实施例2 sgRNA的设计、合成、连接、转化、电转染

1)TOX-sgRNA的设计

根据NCBI Gene上TOX的基因序列(其序列如SEQ ID NO.1所所示)，结合CRISPR/Cas9基因编辑原理，根据PAM序列(NGG)定位，根据其外显子3(其序列如SEQ ID NO.2所示)，选取到位于TOX exon3上的5个位点，设计sgRNA序列1～5，其核苷酸序列依次如SEQ IDNO.3-SEQ ID NO.7所示。

2)TOX-sgRNA的合成

结合pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin载体质粒(该载体结构如图1所示)(Carleton,J.B.,et al.(2017)."Multiplex Enhancer Interference RevealsCollaborative Control of Gene Regulationby Estrogen Receptor alpha-BoundEnhancers."Cell Syst 5(4):333-344e335.)和限制性内切酶BsaI(NEB，R3535S)的特性，在步骤1)设计的sgRNA1～5基础上，合成添加黏性末端的TOX-sgRNA Oligo序列(其核苷酸序列依次如SEQ ID NO.8～17所示)，其中SEQ ID NO.8与SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10与SEQID NO.11、SEQ ID NO.12与SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14与SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16与SEQ ID NO.17均为反向互补链。

3)TOX-sgRNA的连接

对pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin载体质粒用限制性内切酶BsaI(NEB，R3535S)酶切，再通过solutionI连接合成的添加黏性末端的TOX-sgRNA双链(其核苷酸序列如图12所示)。

具体步骤如下：

a)将合成的oligo每一对进行退火。

退火体系为：

4.5ul Up Oligo(100uM)

4.5ul Down Oligo(100uM)

1ul NEB buffer 2

在PCR仪(applied biosystems Thermo Fisher Scientific)中按照以下touchdown程序运行：

95℃,5min；

95–85℃ at-2℃/s；

85–25℃ at-0.1℃/s；

hold at 4℃.

b)线性化pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin质粒

3ug pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin

5ul CutSmart Buffer

1.5ul BsaI(NEB，R3535S)

补水至50ul，37℃孵育3～4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。用AxyPrep PCR Cleanup Kit纯化回收至20～40ul灭菌水中，纯化步骤严格依照试剂盒说明书进行操作。

c)连接sgRNA载体

2ul退火产物

1ul pGL3-U6-sgRNA质粒线性化产物(25ng/ul)

3ul solutionI(TAKARA)

16℃孵育大于1小时。

4)质粒的转化：pGL3-U6-TOXsgRNA-PGK-puromycin质粒,体外转录TOX-sgRNA,通过氨苄霉素筛选阳性大肠杆菌单克隆，再进一步扩增目标产物。

具体步骤如下：

a)吸取5-10ul连接产物(来自于步骤3)加入100ul感受态细胞中，充分打匀，冰上30min；

b)42℃水浴90秒，注意不要摇动试管，冰上2min；

c)加入800ul LB液(胰蛋白胨(Tryptone)10g/L,酵母提取物(Yeast extract)(Oxioid Ltd)5g/L,氯化钠(NaCl)10g/L)，37℃，200rpm摇床中振荡40-60min；

d)4500rpm离心5-10min,去上清，留沉淀，打匀，点涂于X-gal+IPTG+Amp的LB平板(Amp:100μg/ml,X-gal 40ul,IPTG 4ul)；室温放30min，吸收干净。倒置培养皿，37℃温箱12-16小时；

e)挑取单克隆菌落，混匀于20ul LB培养基，用assembly For引物(SEQ ID NO.20)和合成的Down oligo(SEQ ID NO.9,11,13,15,17)进行菌落PCR鉴定TransScript Two-Step RT-PCR SuperMix；

具体反应体系为：

f)取2ul上述阳性细菌克隆菌液加至含Amp(100μg/ml)的15mlLB培养基中37℃摇床，摇菌过夜并用AxyPrep Plasmid Miniprep Kit抽提质粒。

5)质粒体外转录：获取目的TOX-sgRNA试剂MEGAshortscript^TM Kit，具体步骤如下

a)PCR扩增DNA模板

b)加入RNA secure 60℃10min，每5min震荡1次

c)clean up回收

d)转录10ul体系

反应条件：37℃4h，cover温度55℃；

反应体体系：

e)DNA去除：TURBO1ul，37℃20min

f)琼脂糖凝胶电泳

g)RNA回收、浓度测定

Elution buffer100ul+350ulBinding buffer+250ul ETOH mix,预混入吸附柱1200rpm离心1min，400ul prep buffer 1200rpm 30s,700ul washing buffer(含乙醇)1200rpm离心。

电转体系：Cas9蛋白(VAZYME EN301-01)400ng+sgRNA 200ng+2*10^5个细胞+P3Primary Cell 4D-Nucleofector^TM X Kit(Lonza)；

电转模式：human T cell。

具体步骤如下

a)CD8+T细胞计数，每个样本2*10^5个细胞；1000rpm 5min离心后去培养基，加入PBS重悬，1000rpm 5min离心去PBS，加入电转缓冲液(P3 Primary Cell 4D-Nucleofector^TMX Kit,Lonza)重悬；

b)加入Cas9蛋白400ng+sgRNA200ng，充分混匀后加入电转杯；

c)使用Lonza 4D-Nucleofector电转仪电转染CD8+T细胞，电转模式为human Tcell；

d)向电转杯中加入100ul含10％FBS培养基，充分吹打后将细胞转移至培养皿中继续培养；即获得特异性敲除TOX的CD8+耗竭的T细胞。

实施例3 靶向特异性敲除CD8+T细胞中TOX效果鉴定

1)RT-PCR法检测CD8+T细胞中TOX mRNA表达水平

a)Total RNA提取

对实施例2中敲除TOX的耗竭性CD8+T细胞，通过TRIzol(Invitrogen)裂解，接下来使用三氯甲烷、异丙醇和75％乙醇提取总RNA。

b)cDNA制备通过逆转录试剂PrimeScript RT Master Mix(Takara)制备cDNA.反应条件：37℃15min，85℃5sec，4℃∞

反应体系如下：

c)qPCR检测耗竭与非耗竭CD8+T细胞TOX mRNA的表达情况

根据TOX mRNA序列情况设计特异性引物，序列(SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22)

反应体系如下：

结果如图5、图6所示：

图5为5个TOX特异性sgRNA效果剪切效果琼脂糖凝胶电泳图，图中泳道1-7依次分别为marker、control、sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4、sgRNA5。

图6为qPCR检测上述5个CRISPR/Cas9敲除后TOX特异性sgRNA在耗竭的CD8+T细胞中的表达情况示意图。

以上试验结果表明设计的5个TOX-sgRNA中sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4组所对应的TOXmRNA均下调，其中sgRNA3组TOX mRNA下调最明显。Western blot和流式细胞术检测TOX敲除后CD8+T细胞中TOX表达情况以及CD8+T细胞增殖活性以及细胞因子、耗竭相关分子表达情况如图7-图11所示。

图7为western blot检测的5个CRISPR/Cas9敲除后TOX蛋白在耗竭的CD8+T细胞中的表达情况示意图，其中图7A为细胞表达电泳图，图7B为细胞表达情况示意图；结果表明上述实施例设计的5个TOX-sgRNA中sgRNA2、sgRNA3、sgRNA4组所对应的TOX蛋白表达均下调，其中sgRNA3组TOX蛋白表达下调最明显。

图8为流式细胞术检测CRISPR/Cas9敲除后耗竭的CD8+T细胞中TOX蛋白的表达情况示意图，图8中，1为NC(阴性对照组)2为TOX-sgRNA，可见，通过CRISPR/Cas9敲除后TOX表达显著下调。

图9为流式细胞术检测CRISPR/Cas9敲除后耗竭的CD8+T细胞增值活性示意图，其中，图9A(活性指标CD69)和图9B(活性指标Ki67)显示，敲除TOX之后耗竭的CD8+T细胞增值活性指标CD69和Ki67显著上调，图9C和图9D为分别为图9A、图9B的柱状统计图显示敲除TOX之后耗竭的CD8+T细胞增值活性指标，CD69和Ki67显著上调差异具有统计学意义。可见，特异性敲除TOX后，耗竭的CD8+T细胞增值水平和活性显著上调。

图10为流式细胞术检测CRISPR/Cas9敲除后耗竭的CD8+T细胞细胞因子与耗竭相关分子示意图,图中，图10A(细胞因子IL2)和图10B(细胞因子IFN-γ)显示，敲除TOX之后耗竭的CD8+T细胞细胞因子IL2、IFN-γ表达显著上调，图10C(细胞耗竭标志分子TIM-3)和图10D(细胞耗竭标志分子PD-1)显示，敲除TOX之后耗竭的CD8+T细胞耗竭标志分子TIM-3和PD-1表达显著下调。可见，特异性敲除TOX后，耗竭的CD8+T细胞细胞因子IL2、IFN-γ表达显著上调，TIM-3和PD-1表达显著下调。

实施例4小鼠实验

实验步骤如下：

1.选取8-10周龄NCG小鼠，背部皮下接种肝癌细胞系SMMC-7721(购买于中国科学院细胞库),每只鼠皮下注射100万个细胞；

2. 1周后，尾静脉注射CRISPR/Cas9敲除TOX后的CD8+T细胞(实施例3获得的利用sgRNA3敲除TOX后的CD8+T细胞)，以正常T细胞作为对照组，分别于两周/四周后观察NCG小鼠背部肿瘤大小，评判CRISPR/Cas9敲除TOX后的CD8+T细胞抗肿瘤能力。

实验结果如图11所示，其中，A组(CD8++T cell-NC)为对照组，B组(CD8++T cell-TOX-sgRNA)为实验组，A组肿瘤细胞体积较B组明显增大，说明特异性敲除TOX后，CD8+T细胞抗肿瘤能力显著增强。

本技术领域技术人员可以理解的是，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南京鼓楼医院

<120> TOX基因及其sgRNA的应用

<141> 2018-07-16

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1581

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggacgtaa gattttatcc acctccagcc cagcccgccg ctgcgcccga cgctccctgt 60

ctgggacctt ctccctgcct ggacccctac tattgcaaca agtttgacgg tgagaacatg 120

tatatgagca tgacagagcc gagccaggac tatgtgccag ccagccagtc ctaccctggt 180

ccaagcctgg aaagtgaaga cttcaacatt ccaccaatta ctcctccttc cctcccagac 240

cactcgctgg tgcacctgaa tgaagttgag tctggttacc attctctgtg tcaccccatg 300

aaccataatg gcctgctacc atttcatcca caaaacatgg acctccctga aatcacagtc 360

tccaatatgc tgggccagga tggaacactg ctttctaatt ccatttctgt gatgccagat 420

atacgaaacc cagaaggaac tcagtacagt tcccatcctc agatggcagc catgagacca 480

aggggccagc ctgcagacat caggcagcag ccaggaatga tgccacatgg ccagctgact 540

accattaacc agtcacagct aagtgctcaa cttggtttga atatgggagg aagcaatgtt 600

ccccacaact caccatctcc acctggaagc aagtctgcaa ctccttcacc atccagttca 660

gtgcatgaag atgaaggcga tgatacctct aagatcaatg gtggagagaa gcggcctgcc 720

tctgatatgg ggaaaaaacc aaaaactccc aaaaagaaga agaagaagga tcccaatgag 780

ccccagaagc ctgtgtctgc ctatgcgtta ttctttcgtg atactcaggc cgccatcaag 840

ggccaaaatc caaacgctac ctttggcgaa gtctctaaaa ttgtggcttc aatgtgggac 900

ggtttaggag aagagcaaaa acaggtctat aaaaagaaaa ccgaggctgc gaagaaggag 960

tacctgaagc aactcgcagc atacagagcc agccttgtat ccaagagcta cagtgaacct 1020

gttgacgtga agacatctca acctcctcag ctgatcaatt cgaagccgtc ggtgttccat 1080

gggcccagcc aggcccactc ggccctgtac ctaagttccc actatcacca acaaccggga 1140

atgaatcctc acctaactgc catgcatcct agtctcccca ggaacatagc ccccaagccg 1200

aataaccaaa tgccagtgac tgtctctata gcaaacatgg ctgtgtcccc tcctcctccc 1260

ctccagatca gcccgcctct tcaccagcat ctcaacatgc agcagcacca gccgctcacc 1320

atgcagcagc cccttgggaa ccagctcccc atgcaggtcc agtctgcctt acactcaccc 1380

accatgcagc aaggatttac tcttcaaccc gactatcaga ctattatcaa tcctacatct 1440

acagctgcac aagttgtcac ccaggcaatg gagtatgtgc gttcggggtg cagaaatcct 1500

cccccacaac cggtggactg gaataacgac tactgcagta gtgggggcat gcagagggac 1560

aaagcactgt accttacttg a 1581

<210> 2

<211> 243

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcctaccctg gtccaagcct ggaaagtgaa gacttcaaca ttccaccaat tactcctcct 60

tccctcccag accactcgct ggtgcacctg aatgaagttg agtctggtta ccattctctg 120

tgtcacccca tgaaccataa tggcctgcta ccatttcatc cacaaaacat ggacctccct 180

gaaatcacag tctccaatat gctgggccag gatggaacac tgctttctaa ttccatttct 240

gtg 243

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaatggtag caggccatta 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtgcaccag cgagtggtct 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gactcaactt cattcaggtg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcaggccatt atggttcatg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gggagggaag gaggagtaat 20

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

accggaaatg gtagcaggcc atta 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaactaatgg cctgctacca tttc 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

accgggtgca ccagcgagtg gtct 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaacagacca ctcgctggtg cacc 24

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

accggactca acttcattca ggtg 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaaccacctg aatgaagttg agtc 24

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

accggcaggc cattatggtt catg 24

<210> 15

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aaaccatgaa ccataatggc ctgc 24

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

accggggagg gaaggaggag taat 24

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

aaacattact cctccttccc tcc 23

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gtgcagaaat cctcccccac 20

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tttgtccctc tgcatgccc 19

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cgattagtga acggatctcg acg 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

tggcagcagg ataatctgaa ggt 23

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cccaccacaa acaggtaagc a 21

Claims

1.TOX基因在制备恢复T细胞耗竭药物中的应用，所述T细胞为肝癌组织中浸润性耗竭的CD8+T细胞。

2.一种sgRNA序列在制备恢复T细胞耗竭药物中的应用；

所述sgRNA核苷酸序列选自SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15中的任一种；

所述T细胞为肝癌组织中浸润性耗竭的CD8+T细胞。