CN109777872A - 肺癌中的t细胞亚群及其特征基因 - Google Patents
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Abstract
本发明利用单细胞转录组分析技术，通过分析肺癌组织中浸润的T细胞的单细胞基因表达谱，分离和表征了能反映肺癌患者机体肿瘤免疫状态的T细胞亚群，即，表达基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN的耗竭性CD8+T细胞或调节性T细胞。并进一步研究确定了，所述细胞亚群表达的新的特征性基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN与肺癌预后之间的关系，可用于肺癌预后的诊断和监测，以及作为新的肺癌免疫治疗的靶点。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是总体上涉及细胞或细胞亚群，特别是源自肺癌组织的T细胞亚群的鉴定、表征以及富集。本发明也涉及分离肺癌中T细胞亚群的一系列标记、分离方法和所得到的制剂，以及使用分离肺癌中的T细胞亚群用于药物研究与开发和用于诊断、治疗和其他临床与非临床应用。
背景技术
一般认为，T淋巴细胞参与的适应性免疫应答是人体对抗肿瘤细胞主要途径之一。
当前免疫治疗已经成为肿瘤临床治疗中不可或缺的环节。免疫治疗的药物和方案涉及到机体免疫系统识别和攻击癌细胞的各个阶段。已有的肿瘤免疫的药物包括以下多个类型：靶向癌细胞的抗体、过继细胞治疗、溶瘤病毒、树突状细胞相关治疗、DNA和蛋白水平的肿瘤疫苗、免疫激活细胞因子以及其他免疫调节化合物。这些药物涉及机体免疫系统识别和杀伤肿瘤的各个阶段。其中针对T细胞检验点抑制蛋白的抗体类药物和肿瘤抗原特异性的T细胞过继疗法近年来取得突破，广受瞩目。
针对T细胞检验点抑制剂是一种抗体类免疫治疗，通过恢复细胞毒T细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)的活性来监控和杀死肿瘤细胞。肿瘤微环境中的效应T细胞受到抑制而无法杀死肿瘤细胞，这是由于肿瘤中存在多种免疫逃逸机制。人们针对已知的免疫逃逸机制设计出加强或阻碍相关通路的抗体，从而增强免疫系统的作用。例如靶向CTLA-4的药物Ipilimumab，通过阻断CTLA-4来解除调节性T细胞(T regular，Treg)对CTL的抑制作用。PD-1是T细胞表面表达的PD-L1/L2的受体，后者在肿瘤细胞表面表达，两者结合后会激活T细胞的凋亡通路。抗体类药物Nivolumab通过阻断T细胞表面的PD-1来抑制其与PD-L1/L2的结合，从而抑制T细胞失活或凋亡，使CTL始终具有免疫活性。反过来，靶向PD-L1的MDX-1151也可以有效的提高肺癌、黑色素瘤和肾癌的生存率。但是，与靶向治疗等类似，T细胞检验点抑制剂的靶点仍有进一步拓展的空间；同时，如何寻找到更多的有效应答的患者，也需要从生物学上系统的了解T细胞在癌组织中的反应过程。
另一方面，肿瘤的早期诊断、早期治疗和预后的判断，对提高肿瘤的治疗效果、患者的生存率有重要意义。利用分子生物学技术确定可靠的肿瘤标志物，对预测肿瘤临床结局，靶向治疗和评价疗效均有重要意义。目前发现的肿瘤预后标志物主要包括抑癌基因、癌基因、细胞周期调控因子、凋亡调控因子、侵袭和转移相关标志物、端粒酶等。能够用于监测和评估肿瘤免疫状态的分子标志物还很少。
理解免疫系统与癌组织的相互作用成为开发和改善免疫疗法的关键，也能对机体的肿瘤免疫状态提供评估和监测的手段。但是浸润到癌组织中T细胞(tumor infiltratinglymphocyte,TIL)的类别、分化以及受抑制的途径迄今还没有被完整理解。目前已知TIL中存在耗竭T细胞、失能的T细胞或老化的T细胞群体。
考虑到人体免疫细胞、特别是T细胞类型的复杂性，需要从更高精度认识与肿瘤相关的免疫细胞的分类、分化过程和功能基因，进一步为肿瘤免疫治疗药物开发提供更多潜在的免疫靶点，以及可用于肿瘤预后的分子标志物。
近年来，迅速发展的单细胞测序技术为群体细胞以及单细胞的基因表达差异研究提供了有力的支撑。目前已发展出STRT-Seq(single-cell tagged reverse transcription sequencing)、Smart-Seq和Smart-Seq2、Cell-Seq(cell expression by linearamplification and sequencing)和PMA-Seq(Phi29-mRNA amplification andsequencing)等单细胞转录组深度测序方法，以及多种与之匹配的生物信息学分析方法。
发明内容
本发明发明人利用单细胞转录组分析技术，通过分析肺癌组织中浸润的T细胞的单细胞基因表达谱，分离和表征了能反映肺癌患者机体肿瘤免疫状态的T细胞亚群，并进一步研究确定了该细胞亚群所表达的特征基因，以及这些特征基因与肿瘤预后之间的关系，在此基础上完成了本发明。
本发明对肺癌患者外周血中T细胞、肿瘤周围正常组织中T细胞和肿瘤内浸润的T细胞，依据T细胞的表面分子CD4、CD8、CD25的表达筛选出辅助性T细胞(CD4+CD25-)、细胞毒T细胞(CD8+)和调节性T细胞(CD4+CD25+)，获取每类细胞的单细胞基因表达谱，并通过单细胞基因表达量的SC3非监督聚类获得了6个不同的CD8+T细胞亚群，9个不同的CD4+T细胞亚群，依据各亚群中细胞特征性基因的表达判定出肿瘤中的耗竭T细胞和非耗竭性T细胞，对比这两类细胞的基因表达谱，以表达量绝对值差异(Fold Change)大于等于4倍，BH矫正的P<0.01为标准，将其中耗竭性T细胞相对于非耗竭T细胞差异高表达的基因定义为T细胞耗竭相关基因，获得了55个T细胞耗竭相关基因(见表1)。同样，判定出肿瘤中的有活性的调节性T细胞与其他调节性T细胞，对比这两类细胞的基因表达谱，以表达量绝对值差异(FoldChange)大于等于4倍，BH矫正的P<0.01为标准，将其中有活性的调节性T细胞相对于其他调节性T细胞差异高表达的基因定义为调节性T细胞抑制功能相关基因，获得了21个调节性T细胞抑制功能相关基因(见表2)。
对上述55个T细胞耗竭相关基因和21个调节性T细胞抑制功能相关基因，利用TCGA的LUAD数据集，依据数据集中每个病人的相应基因表达量，进行标准化转化后，计算出单个病人的55个T细胞耗竭相关基因集合的平均表达水平，以及21个调节性T细胞抑制功能相关基因集合的平均表达水平。以所有病人的55个基因平均表达水平值的中位值作为阈值，将病人分为T细胞耗竭相关基因高表达组和低表达组，比较两组病人生存时间的差异，发现高表达组的生存时间短于低表达组，差异具有显著性，表明所述的55个基因集合具有肺癌预后判断的效能。同样，以所有病人的21个基因平均表达水平值的中位值作为阈值，将病人分为调节性T细胞抑制功能相关基因高表达组和低表达组，比较两组病人生存时间的差异，发现高表达组的生存时间短于低表达组，差异具有显著性，表明所述的21个基因集合也具有肺癌预后判断的效能。
采用同样的研发方法研究发现，所述55个T细胞耗竭相关基因和21个调节性T细胞抑制功能相关基因中包含3个相同的基因：TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN，所述TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN的组合也具有肺癌预后的判断效能。而以单独的基因为区分指标时，单独的IL1R2基因具有很好的肺癌预后判断效能。
因此，本发明在广义上是针对可以用来鉴定或表征并且任选地用来分离、划分、分开或富集与肺癌的肿瘤免疫有关的T细胞亚群的一系列标记、方法、化合物、组合物和制造品。所述的T细胞包括CD8+T细胞和CD4+T细胞，尤其是耗竭性CD8+T细胞和有活性的调节性CD4+T细胞。
更具体地，本申请的发明人已经发现一系列可以独立或共同地用来精确鉴定、分选、富集和/或表征来自肺癌的T细胞亚群的标记。使用选择的生物化学技术，通过本发明的标记与肺癌的肿瘤组织中的T细胞关联，能够富集、分离或纯化出反映肺癌的肿瘤免疫状态的T细胞亚群。
本发明公开的这些标记，能够识别或鉴定来自肺癌的T细胞亚群，构成这类肿瘤免疫细胞的通用性表征，能用于治疗靶标的阐明和药物化合物的筛选。而且，可以进一步在临床和非临床中使用，用于肺癌患者的诊断、预后、分类、监测和管理，以及提供相关的试剂盒或其他制造品。
本发明的第一方面提供用于识别或检测肺癌组织中浸润的T细胞的生物标志物组及其制药用途。
一种用于识别、检测或监测肺癌组织中浸润的CD4+T细胞的生物标志物组，其包含基因IL1R2，或者所述基因编码的蛋白或蛋白片段。
优选，所述生物标志物组为基因IL1R2或其编码的蛋白或蛋白片段。
所述识别、检测或监测是为了识别、检测或监测肺癌组织中浸润的活性的调节性CD4+T细胞。所述识别、检测或监测可用于肺癌患者的分子分型、辅助诊断或预后判断等。
本申请的发明人发现，肺癌组织中高表达IL1R2的调节性CD4+T细胞是有活性的调节性CD4+T细胞，调节性CD4+T细胞高表达IL1R2后成为有活性的调节性CD4+T细胞，对浸润到肺癌组织中的CD8+T细胞等免疫细胞的免疫功能产生抑制作用，使患者的预后不佳，例如生存期显著缩短。
一种用于识别、检测或监测肺癌组织中浸润的T细胞的生物标志物组，其包含基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN，或者所述三个基因所编码的蛋白或蛋白片段。
优选，所述T细胞是CD8+T细胞。
优选，所述T细胞是CD4+T细胞。
优选，所述T细胞是CD8+T细胞时，所述生物标志物组进一步包含基因CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP中的至少一种，或者所述至少一种基因所编码的蛋白或蛋白片段。
更优选，所述T细胞是CD8+T细胞时，所述生物标志物组进一步包含基因CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP，或者所述各基因所编码的蛋白或蛋白片段。
优选，所述T细胞是CD4+T细胞时，所述生物标志物组进一步包含基因IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4中的至少一种，或者所述至少一种基因所编码的蛋白或蛋白片段。
更优选，所述T细胞是CD4+T细胞时，所述生物标志物组进一步包含基因IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4，或者所述各基因所编码的蛋白或蛋白片段。
所述识别、检测或监测是为了识别、检测或监测肺癌组织中浸润的有活性的调节性CD4+T细胞或者耗竭性CD8+T细胞。所述识别、检测或监测可用于肺癌患者的分子分型、辅助诊断或预后判断等。
本申请的发明人发现，肺癌组织中高表达TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN的调节性CD4+T细胞是有活性的调节性CD4+T细胞，高表达TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN的CD8+T细胞是耗竭性CD8+T细胞。肺癌患者的肺癌组织中高表达TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN时，意味着其肿瘤组织中的调节性CD4+T细胞成为有活性的调节性CD4+T细胞，或者CD8+T细胞成为耗竭性CD8+T细胞，患者机体的肿瘤免疫功能低下，患者预后不佳，例如生存期显著缩短。
而耗竭性CD8+T细胞也会同时高表达CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP中的至少一种；有活性的调节性CD4+T细胞也会同时高表达IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4中的至少一种。
在本发明的一个实施方式中，所述肺癌是非小细胞肺癌，包括腺癌和鳞癌。
基因IL1R2或其编码的蛋白或蛋白片段在制备肺癌患者预后判断的试剂中的应用。
一组生物标志物组在制备肺癌患者预后判断的试剂中的应用，所述生物标志物组包含基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN，或者所述三个基因所编码的蛋白或蛋白片段。
优选，所述生物标志物组进一步包含基因CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP，或者所述各基因所编码的蛋白或蛋白片段。
或者，优选，所述生物标志物组进一步包含基因IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4，或者所述各基因所编码的蛋白或蛋白片段。
在本发明的一个实施方式中，所述肺癌是非小细胞肺癌，包括腺癌和鳞癌。
本发明的第二个方面提供能够检测本发明第一个方面所述生物标志物组的检测试剂、检测试剂盒、及其制药用途以及相应的评价方法。
一种检测试剂，所述试剂包含能与基因IL1R2或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂。
一种检测试剂，所述试剂包含能与基因TNFRSF9或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂，能与基因TNFRSF18或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂，以及，能与基因LAYN或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂。
在本发明的一个实施方式中，所述检测试剂进一步包含一个或多个结合剂，所述每个结合剂能与各个目标基因或其编码的蛋白或蛋白片段分别相应结合，所述目标基因为T细胞耗竭相关基因或调节性T细胞抑制功能相关基因。
优选，所述T细胞耗竭相关基因选自CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP中的至少一种。
更优选，所述T细胞耗竭相关基因为CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP。
优选，所述调节性T细胞抑制功能相关基因选自IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4中的至少一种。
更优选，所述调节性T细胞抑制功能相关基因为IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4。
一种检测试剂，包含多个结合剂，所述多个结合剂的每一个能与以下各个目标基因或其编码的蛋白或蛋白片段分别相应结合，所述目标基因为TNFRSF9、TNFRSF18、LAYN、CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP。
一种检测试剂，包含多个结合剂，所述多个结合剂的每一个能与以下各个目标基因或其编码的蛋白或蛋白片段分别相应结合，所述目标基因为TNFRSF9、TNFRSF18、LAYN、IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4。
一种检测试剂盒，其包含前述任一种所述的检测试剂。
根据本发明，所述检测试剂盒进一步包含用于检测的其他辅助性试剂，包括但不限于，PCR用辅助性试剂(例如，聚合酶、dNTP、扩增缓冲液等)，ELISA用辅助性试剂(例如底物溶液、第二抗体、缓冲液等)或West-blot用辅助性试剂(例如第二抗体、缓冲液)等。
根据本发明，所述试剂盒进一步包括盛装一种或多种所述检测试剂或辅助性试剂的一个容器或多个容器。
根据本发明，所述试剂盒还包含使用所述试剂盒的指导材料，例如说明书。
本发明所述的检测试剂和检测试剂盒用于识别、检测或监测肺癌组织中浸润的T细胞，以用于肺癌的分子分型、辅助诊断或预后判断等。
本发明所述的检测试剂或检测试剂盒在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂用于识别、检测或监测肺癌组织中浸润的T细胞。
本发明所述的检测试剂或检测试剂盒在制备诊断剂中的用途，所述诊断剂用于肺癌的分子分型、辅助诊断或预后判断。
根据本发明，所述结合剂包括核酸、配体、酶、底物和/或抗体等。
根据本发明，所述核酸可以是能与所述目标基因结合的探针。
根据本发明，所述核酸可以是能特异性扩增目标基因的引物。
根据本发明，所述结合剂可以是能结合所述目标基因编码的蛋白或蛋白片段的单克隆抗体。
根据本发明，所述结合剂可进一步结合指示分子，所述指示分子例如：荧光物质、放射性物质和/或酶等。
优选，所述结合剂是特异性扩增目的基因的引物。
优选，所述结合剂是各个目的基因编码的蛋白或蛋白片段的单克隆抗体。
可以采用本领域已知的探针和引物序列的设计方法，根据所述目标基因的序列，设计并合成所述的核酸探针和引物序列，例如采用本领域已知的设计软件包括但不限于Oligo、PrimerPremier、DNA man等。
可以采用本领域中已知的各种方法进行抗体的设计和制备，包括但不限于，抗原免疫法、杂交瘤技术、噬菌体展示库技术等。
根据本发明，所述肺癌组织中浸润的T细胞是有活性的调节性CD4+T细胞。
根据本发明，所述肺癌组织中浸润的T细胞是耗竭性CD8+T细胞。
在本发明的一个实施方式中，所述结合剂是扩增所述55个T细胞耗竭相关基因的引物。在本发明的一个实施方式中，所述检测试剂包括扩增所述55个T细胞耗竭相关基因的引物。在本发明的一个实施方式中，所述检测试剂盒包括扩增所述55个T细胞耗竭相关基因的引物。
能够检测基因IL1R2或其编码的蛋白或蛋白片段的检测试剂在制备肺癌患者预后判断的试剂中的用途。
优选，所述检测试剂包含能特异性扩增基因IL1R2的引物。
优选，所述检测试剂包含能检测基因IL1R2的探针。
能够检测一组生物标志物组的检测试剂在制备肺癌患者预后判断的试剂中的用途，所述生物标志物组包含基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN，或者所述三个基因所编码的蛋白或蛋白片段。
优选，所述生物标志物组进一步包含基因CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP，或者所述各基因所编码的蛋白或蛋白片段。
或者，优选，所述生物标志物组进一步包含基因IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4，或者所述各基因所编码的蛋白或蛋白片段。
优选，所述检测试剂包含能特异性扩增所述生物标志物组中的各基因的引物组。
优选，所述检测试剂包含能与所述生物标志物组中的各基因发生杂交反应的探针的集合。
一种肺癌患者预后判断的评价方法，该方法包括以下步骤：
1)获取受试者的肺癌组织；
2)检测所述肺癌组织中目标基因的表达水平。
根据本发明，所述目标基因是IL1R2。
根据本发明，所述目标基因是TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN。
根据本发明，所述目标基因是TNFRSF9、TNFRSF18、LAYN、CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP。
根据本发明，所述目标基因是TNFRSF9、TNFRSF18、LAYN、IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4。
根据本发明，所述检测可以采用本发明第二方面所述的检测试剂、检测试剂盒。例如，可以利用能扩增55个T细胞耗竭相关基因的引物，经过定量PCR检测55个基因的mRNA表达水平。或者利用基因IL1R2编码的蛋白的单克隆抗体，经过免疫组化的方法检测组织中IL1R2的蛋白质水平。
优选，所述方法还包括根据目标基因的表达水平，判断其表达量是否增高或降低的步骤。
进一步优选，所述判断根据对应基因表达水平的阈值进行，高于阈值的判断为表达量高，低于阈值的判断为表达量低，表达量高的受试者预后不佳。
优选，所述阈值是相应基因在给定人群中的平均表达水平。
优选，所述表达水平是目标基因的mRNA表达水平。
优选，所述表达水平是目标基因的蛋白质水平。
在本发明的一个实施方式中，检测目标基因的mRNA表达水平，所述给定人群的目标基因的mRNA平均表达水平，是根据TCGA的LUAD数据集中所有肺癌患者的所述基因的mRNA表达水平计算出的平均值。对于目标基因IL1R2，该阈值为1.88(log2(TPM+1)＝1.88)；对于目标基因为TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN的集合，所述集合的阈值为2.27(log2(TPM+1)＝2.27)；对于目标基因为55个T细胞耗竭相关基因的集合，所述集合的阈值为3.21(log2(TPM+1)＝3.21)；对于目标基因为21个调节性T细胞抑制功能相关基因的集合，所述集合的阈值为3.94(log2(TPM+1)＝3.94)。
在本发明的一个实施方式中，该评价方法在患者接受治疗之前进行。例如检测患者肺癌组织中目标基因的mRNA水平，如果患者体内目标基因的mRNA表达量高，则其肺癌组织中浸润的T细胞的免疫功能低，预后不佳；如果患者体内目标基因的mRNA表达量低，则其肺癌组织中浸润的T细胞的免疫功能较好，预后较好。
在本发明的另一个实施方式中，该评价方法在受试者接受治疗之后进行，例如化疗后、放疗后、免疫治疗后、手术治疗后等。例如治疗后，检测患者肺癌组织中目标基因的mRNA水平，如果患者体内目标基因的mRNA表达量高，则其肺癌组织中浸润的T细胞的免疫功能低，预后不佳；如果患者体内目标基因的mRNA表达量低或蛋白质没有表达，则其肺癌组织中浸润的T细胞的免疫功能较好，预后较好。
本发明的第三个方面提供第一个方面所述的生物标志物组作为肺癌免疫治疗靶点中的应用。
一种抑制剂在制备肺癌治疗药物中的应用，所述抑制剂抑制目标基因的表达或抑制目标基因编码的蛋白，所述目标基因选自由以下基因组成的组：IL1R2、TNFRSF9、TNFRSF18、LAYN、CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7、ALOX5AP、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4。
优选，所述目标基因是IL1R2，优选，所述药物能够抑制活性调节性CD4+T细胞或者阻碍调节性CD4+T细胞转变为活性调节性CD4+T细胞。
优选，所述目标基因是TNFRSF9，优选，所述药物能够抑制活性调节性CD4+T细胞或者阻碍调节性CD4+T细胞转变为活性调节性CD4+T细胞，或者阻碍CD8+T细胞转变为耗竭性CD8+T细胞，或者恢复耗竭性CD8+T细胞的活性。
优选，所述目标基因是TNFRSF18，优选，所述药物能够抑制活性调节性CD4+T细胞或者阻碍调节性CD4+T细胞转变为活性调节性CD4+T细胞，或者阻碍CD8+T细胞转变为耗竭性CD8+T细胞，或者恢复耗竭性CD8+T细胞的活性。
优选，所述目标基因是LAYN，优选，所述药物能够抑制活性调节性CD4+T细胞或者阻碍调节性CD4+T细胞转变为活性调节性CD4+T细胞，或者阻碍CD8+T细胞转变为耗竭性CD8+T细胞，或者恢复耗竭性CD8+T细胞的活性。
所述抑制目标基因表达的抑制剂可以是抑制目标基因mRNA水平的抑制剂，包括但不限于：其反义核酸序列、siRNA、miRNA、shRNA、dsRNA，或者抑制目标基因mRNA水平的蛋白质、多肽、酶、小分子化合物(例如天然化合物、合成化合物等)。
所述抑制目标基因编码的蛋白的抑制剂可以是抑制目标基因编码的蛋白质的活性或蛋白质水平的化学物质，包括但不限于所述蛋白质的抗体、抑制所述蛋白质活性或蛋白质水平的蛋白质、多肽、酶、小分子化合物(例如天然化合物、合成化合物等)。
由于上述目标基因的高表达会导致相应的CD8+T细胞处于耗竭状态，或导致调节性CD4+T细胞转化为有活性的调节性T细胞，抑制这些基因的表达或者抑制其编码蛋白的活性，将有利于恢复耗竭状态的CD8+T细胞的活性，或抑制CD8+T细胞的失活或凋亡，或解除调节性T细胞对细胞毒T细胞的抑制作用，或者阻碍调节性CD4+T细胞转变为活性调节性CD4+T细胞，从而恢复机体对肿瘤的免疫功能，实现免疫治疗肺癌的效果。
例如，由于TNFRSF9、TNFRSF18或LAYN的高表达会导致相应的CD8+T细胞处于耗竭状态，导致CD4+T细胞转化为有活性的调节性T细胞，抑制这些基因的表达或者抑制其编码蛋白的活性，将有利于恢复耗竭状态的CD8+T细胞的活性，或抑制CD8+T细胞的失活或凋亡，或解除调节性T细胞对细胞毒T细胞的抑制作用，或者阻碍调节性CD4+T细胞转变为活性调节性CD4+T细胞，从而实现肺癌的免疫治疗效果。
再如，由于IL1R2的高表达会导致相应的CD4+T细胞转化为有活性的调节性T细胞，抑制该基因的表达或者抑制其编码蛋白的活性，将有利于解除调节性T细胞对细胞毒T细胞的抑制作用，或者阻碍调节性CD4+T细胞转变为活性调节性CD4+T细胞，实现肺癌的免疫治疗效果。
本发明的第四个方面提供第一个方面的生物标志物组在药物筛选中的应用。
筛选药物的方法，该方法包括以下步骤：
1)将受试化学物质与表达所述基因的CD8+T细胞或者CD4+T细胞接触；
2)检测所述细胞的所述基因表达量的变化；
所述基因选自由以下基因组成的组：IL1R2、TNFRSF9、TNFRSF18、LAYN、CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7、ALOX5AP、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4。
优选，所述基因是IL1R2。
优选，所述基因是TNFRSF9。
优选，所述基因是TNFRSF18。
优选，所述基因是LAYN。
优选，所述基因是TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN。
优选，所述表达量是mRNA水平的表达量。
根据本发明，所述药物筛选的方法是在体外进行的。药物筛选方法能用于新药研发工业。
优选，所述药物筛选方法用于筛选治疗肿瘤的药物。
优选，所述药物筛选方法用于筛选治疗肺癌的药物。
优选，所述药物筛选方法用于筛选能够恢复耗竭性CD8+T细胞的活性的药物。
优选，所述药物筛选方法用于筛选能够抑制有活性的调节性CD4+T细胞的药物。
上述基因是耗竭性CD8+T细胞或有活性的调节性CD4+T细胞差异性高表达的基因，可以作为药物筛选的效应指标。受试化学物质作用于表达相应基因的耗竭性CD8+T细胞或有活性的调节性CD4+T细胞后，通过检测这些基因表达量的变化，可以判断所述耗竭性CD8+T细胞是否被恢复了活性，或者所述有活性的调节性CD4+T细胞是否被抑制了。如果在受试化学物质作用后，表达所述基因的CD8+T细胞中相应基因的表达量降低了，则意味着该细胞从耗竭状态恢复，所述受试化学物质是潜在的药物。类似的，如果在受试化学物质作用后，表达所述基因的CD4+T细胞中相应基因的表达量降低了，则意味着该细胞从活性调节性CD4+T细胞转为非活性的，所述受试化学物质是潜在的药物。
本发明的第五个方面提供由本发明第一个方面提供的生物标志物组确定出的细胞亚群，以及其富集方法和应用。
一种肺癌组织中浸润的CD8+T细胞亚群，其高表达基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN。
所述CD8+T细胞亚群可进一步高表达基因CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP中的至少一种。
所述CD8+T细胞亚群是耗竭性T细胞。本发明的发明人通过对比研究首次发现，肺癌组织中浸润的高表达基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN的CD8+T细胞处于耗竭状态。所述CD8+T细胞亚群在浸润到肺癌中的T细胞中的占比越大，预示着患者浸润到肿瘤中的T细胞杀伤肿瘤细胞的能力越弱，患者预后越差。
一种肺癌组织中浸润的CD4+T细胞亚群，其高表达基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN。
所述CD4+T细胞亚群可进一步高表达基因IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4中的至少一种。
一种肺癌组织中浸润的CD4+T细胞亚群，其高表达基因IL1R2。
所述CD4+T细胞亚群可进一步高表达基因TNFRSF9、TNFRSF18、LAYN、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4中的至少一种。
所述CD4+T细胞亚群是有活性的调节性T细胞。本发明的发明人通过对比研究首次发现，肺癌组织中浸润的高表达基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN的CD4+T细胞是有活性的调节性T细胞，对细胞毒性T细胞产生抑制性调节作用。所述CD4+T细胞亚群在浸润到肿瘤中的T细胞中的占比越大，预示着患者浸润到肿瘤中的T细胞杀伤肿瘤细胞的能力越弱，患者预后越差。
富集前述T细胞亚群的方法，该方法包括以下步骤：
1)使浸润到肺癌的免疫细胞与至少一种结合剂接触，所述结合剂的每一个能与各个目标基因或其编码的蛋白或蛋白片段分别相应结合；
2)分选与所述结合剂结合的免疫细胞，以提供富集的T细胞亚群；
所述目标基因选自TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN；或者所述目标基因为IL1R2。
优选，所述目标基因进一步包括CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7、ALOX5AP、IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4中的至少一种。
所述的结合剂包括核酸、配体、酶、底物、抗体等。
所述核酸可以是能与所述基因结合的探针。
所述结合剂可以是能结合所述基因编码的蛋白或蛋白片段的抗体。
所述结合剂可进一步结合指示分子，所述指示分子例如：荧光物质、放射性物质、酶等。
优选，所述分选步骤包括荧光激活细胞分选、磁辅助细胞分选、底物辅助细胞分选、激光介导切割、荧光测定法、流式细胞术或显微技术。
作为本发明的一个实施方式，富集一种CD8+T细胞亚群的方法，该方法包括以下步骤：使浸润到肺癌的CD8+T细胞群与至少一种结合剂接触，所述结合剂的每一个与各个目标基因或其编码的蛋白或蛋白片段分别相应结合；并且，分选与所述结合剂结合的免疫细胞，以提供富集的CD8+T细胞亚群。
所述目标基因包括TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN。
优选，所述目标基因进一步包括CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP中的至少一种。
更优选，所述目标基因进一步包括CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP。
作为本发明的另一个实施方式，富集一种CD4+T细胞亚群的方法，该方法包括以下步骤：使浸润到肺癌的CD4+T细胞群与至少一种结合剂接触，所述结合剂的每一个与各个目标基因或其编码的蛋白或蛋白片段分别相应结合；并且，分选与所述结合剂结合的免疫细胞，以提供富集的CD4+T细胞亚群。
所述目标基因包括TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN。
优选，所述目标基因进一步包括IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4中的至少一种。
更优选，所述目标基因进一步包括1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4。
作为本发明的再一个实施方式，富集一种CD4+T细胞亚群的方法，该方法包括以下步骤：使浸润到肺癌的CD4+T细胞群与至少一种结合剂接触，所述结合剂的每一个与各个目标基因或其编码的蛋白或蛋白片段分别相应结合；并且，分选与所述结合剂结合的免疫细胞，以提供富集的CD4+T细胞亚群。
所述目标基因包括IL1R2。
优选，所述目标基因进一步包括TNFRSF9、TNFRSF18、LAYN、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4中的至少一种。
更优选，所述目标基因进一步包括TNFRSF9、TNFRSF18、LAYN、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4。
根据本发明，所述富集细胞的方法在体外进行，富集后的细胞可用于药物筛选等用途。
本发明的有益效果：
本发明利用单细胞转录组分析技术，通过分析肺癌组织中浸润的T细胞的单细胞基因表达谱，发现了新的能反映肺癌机体肿瘤免疫状态的T细胞特征基因。
本发明发现CD8+T细胞高表达基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN，意味着该T细胞处于耗竭状态，基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN是本发明首次发现的与肺癌中CD8+T细胞的耗竭状态相关的基因，并且高表达TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN基因的CD8+T细胞与肿瘤预后之间存在关联。
本发明发现CD4+T细胞高表达基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN，意味着该调节性T细胞转变为在癌组织中有活性的状态，基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN是本发明首次发现的与肺癌中调节性T细胞的活性状态相关的基因，并且高表达TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN的CD4+T细胞与肿瘤预后之间存在关联。
此外，本发明还发现CD4+T细胞高表达基因IL1R2，也意味着该调节性T细胞转变为在癌组织中有活性的状态，并且基因IL1R2的表达情况与患者的预后有极其密切的关联。
本发明中的术语说明：
在本发明中，“T细胞耗竭相关基因”和“耗竭性T细胞特征基因”含义相同，是耗竭性T细胞相对于非耗竭T细胞差异高表达的基因，55个T细胞耗竭相关基因指表1中所列的55个基因。“调节性T细胞抑制功能相关基因”和“激活调节性T细胞的特征基因”含义相同，是有活性的调节性T细胞相对于其他调节性T细胞差异高表达的基因，21个调节性T细胞抑制功能相关基因指表2中所列的21个基因。
在本发明中，术语“选择”、“分选”、“划分”或“分离”所选择的细胞、细胞群或细胞亚群可以互换地使用，并且除非上下文另有说明，表示将所选择的细胞或定义的细胞子集从组织样品中移出。
术语“富集”可以宽泛地解释为被处理的细胞群，其含有比未处理的、另外的等同的细胞群或样品中更高百分比的所选择的细胞类型。在一些优选的实施例中，富集细胞群是指与起始细胞群相比增加细胞群中的一种细胞类型的大约50％或大于50％的百分比。在其他优选实施例中，本发明的富集细胞群将包括至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、98％或99％所选择的细胞类型。
就特定细胞群而言，术语“基本上纯的”是指相对于构成总细胞群的细胞，具有至少大约75％、优选至少大约85％、更优选至少大约90％、并且最优选至少大约95％纯度的细胞群。
术语“标志物”、“标记”或“细胞标记”含义相同，表示处于化学或生物实体形式的任何性状或特征。标记可以在性质上是形态的、功能的或生物化学的。在优选的实施例中，标记是差异性或优先地由特定细胞类型(例如，耗竭性CD8+T细胞)表达(或不表达)，或由细胞在某些条件(例如，在细胞周期的特定时点或在特定细胞外基质)下表达的细胞因子或表面抗原或膜蛋白或胞浆蛋白等。在本发明中更具体地指那些可借助其存在(阳性)或不存在(阴性)来指示细胞或细胞亚群的标记。
类似地，在组织、细胞或细胞群的背景下，术语“标记表型”表示可以用来表征、鉴定、定量、分开、分离、纯化或富集特定细胞或细胞群的任何标记或标记组合。在具体的优选实施例中，标记表型是可以通过检测或鉴定细胞表面标记组合的表达来确定细胞表面表型。
术语“结合剂”、“结合分子”和“结合实体”是同义的，可以互换使用。在本发明的上下文中，结合剂结合、识别本发明所述T细胞亚群的生物标志物，与之相互作用、反应或以别的方式发生关联，但基本上不识别或结合除所述生物标志物之外的其他分子。示例性结合剂可以包括但不限于抗体或其片段、抗原、适配体、核酸(例如DNA和RNA)、蛋白质(例如受体、酶、酶抑制剂、酶底物、配体)、肽、凝集素、脂肪酸或脂质和多糖。例如，在本发明的一些实施例中，结合剂包括抗体或其片段、核酸(例如DNA和RNA)。同样，术语“结合”是指结合剂识别并粘附所述生物标志物，但基本上不识别或粘附其他分子。
术语“寡核苷酸”或“多核苷酸”或“核酸”是指由两个或更多个，优选地超过三个并且通常超过十个脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸组成的分子。精确的大小将取决于许多因素，其继而取决于寡核苷酸最终的功能或用途。寡核苷酸可以以多种方式产生，包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。本发明中的核酸含有2-100个核苷酸。
本文中术语“核苷酸”和“碱基”可以互换使用，是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，以及任何其他经修饰的/未经修饰的嘌呤/嘧啶碱基的N-糖苷。所述嘌呤或嘧啶可以是但不限于腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和/或尿嘧啶，以及其他经修饰的、非标准或衍生的碱基。
术语“抗体”以最宽泛的意义使用，具体地涵盖合成抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、胞内抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、单价抗体、多价抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、灵长类化抗体、Fab片段、F(ab')片段、单链FvFc(scFvFc)、单链Fv(scFv)、抗独特型(抗Id)抗体和任何其他免疫活性抗体片段，只要它们展示出所希望的生物活性(即，标记相关或结合)即可。在更广的意义上，本发明的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子(即，含有抗原结合部位的分子)的免疫活性片段，其中这些片段可以或可以不与另一个免疫球蛋白结构域(包括但不限于Fc区或其片段)融合。此外，如在此更详细地概述的，术语抗体和多种抗体具体地包括Fc变体或其片段，包括全长抗体和包含Fc区的变体Fc-融合物，其任选地包含至少一个氨基酸残基修饰并且与免疫球蛋白的免疫活性片段融合。本发明的一些实施方式中，特别优选是单克隆抗体。
分子的“片段”意思是指分子的任何连续多肽或核苷酸子集。例如跨膜蛋白的片段可以包括仅包含胞外结构域或其某个部分的构建体。就本发明而言，标记片段或衍生物可以包括选择标记的任何免疫反应性或免疫活性部分。
分子(如标记)的“类似物”意思是指在功能上与整个分子或与其片段相似的分子。如在此使用的，当分子含有通常不是该分子的一部分的另外的化学部分时，将所述分子称为另一种分子的“化学衍生物”。这样的部分可以改善分子的溶解度、吸收、生物半衰期，等等。这些部分可以替代地降低分子的毒性、消除或减弱分子的任何不良副作用，等等。
术语“受试者”或“患者”可互换使用，包括但不限于人、非人类动物，例如非人灵长类如黑猩猩和其他猿类和猴种类；农场动物如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养受试者如狗和猫；实验室动物，包括啮齿类如小鼠、大鼠和豚鼠，等等。该术语不指示具体的年龄或性别。
术语“恶性肿瘤”、“肿瘤”和“癌症”可互换使用，是指以细胞不受控制、过度增生性或异常生长或转移为特征的疾病或失调。
术语“诊断剂”、“诊断试剂”在本发明中具有相同含义，是指用于诊断疾病或失调目的的任何分子、化合物、和/或物质。在优选的实施例中，诊断剂应当包含与报告分子结合的结合剂。诊断剂的其他非限制性实例包括抗体、抗体片段、或其他蛋白质，包括与报告分子结合的那些。
术语“报告分子”是指通过本领域技术人员可获得的任何方法学可检测的任何分子、化合物、和/或物质，非限制性实例包括染料、荧光标记、气体、金属、或放射性同位素。
术语“检测试剂”是指能检测到目标物质的试剂，其包含能结合目标物质的结合剂(例如探针、引物或抗体等)，显示或指示出所述结合的报告分子(例如酶、显色剂、荧光物质、放射性物质等)，任选还包含能放大所述结合的化学物质(例如PCR用试剂)等。本发明可采用本领域已知的各种检测RNA或蛋白质的方法以及相应的检测试剂，来检测本发明所述的生物标志物组存在与否以及量的多少，例如采用定量RT-PCR、基因芯片、Northern印迹法、原位杂交、狭缝印迹法、酶联免疫吸附法、免疫组化法、west-blot、流式细胞技术、蛋白质组技术、二维凝胶电泳、质谱法等。
术语“受试化学物质”是指被测定活性的化学物质，包括但不限于小分子化合物，核酸(DNA或RNA)，蛋白质或多肽(例如配体、抗体、融合蛋白等)，多糖等。术语“抑制”是指与没有抑制剂的情况相比，蛋白质或细胞的活性降低。在一些实施方式中，术语“抑制”是指活性降低至少约25％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、或至少约95％。在其它实施方式中，抑制是指活性降低约25％至约50％、约50％至约75％、或约75％至100％。在一些实施方式中，抑制是指活性降低约95％至100％，例如活性降低95％、96％、97％、98％、99％、或100％。可使用多种本领域技术人员公知的技术来测量这样的降低。
术语“表达”和“基因表达”含义相同，是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中的遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。
术语“表达增高”和“高表达”含义相同，是指与正常水平相比，基因转录的拷贝数增高，和/或翻译增高。
术语“表达降低”和“低表达”含义相同，是指与正常水平相比，基因转录的拷贝数降低，和/或翻译降低。
在本发明的一个实施方式中，在判断一个细胞或一类细胞中某个基因是否表达增高时，是以该基因在不同细胞或不同类细胞中mRNA表达量绝对值差异(Fold Change)大于等于4倍，BH矫正的P<0.01为标准。例如，耗竭性T细胞相对于非耗竭T细胞差异表达的基因中，以表达量绝对值差异(Fold Change)大于等于4倍，BH矫正的P<0.01为标准，符合该标准的基因为耗竭性T细胞差异高表达的基因。
在本发明的一个实施方式中，在判断受试者的某个基因是否高表达时，是指所述基因的表达水平与所述基因在给定人群中的平均表达水平相比，如果增高为高表达，如果降低为低表达。例如，在本发明的实施例中，给定人群中的平均表达水平是根据TCGA的LUAD数据集中所有肺癌患者的所述基因的表达水平计算出的平均值。对于55个T细胞耗竭相关基因的集合而言，该平均值为3.21(log2(TPM+1)＝3.21)；对于21个调节性T细胞抑制功能相关基因的集合而言，该平均值为3.94(log2(TPM+1)＝3.94)；对于IL1R2而言，为1.88(log2(TPM+1)＝1.88)；对于TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN而言，为2.27(log2(TPM+1)＝2.27)。
术语“预后”是指预测疾病的可能病程和结局，既包括判断疾病的特定后果(如康复，某种症状、体征和并发症等其它异常的出现或消失及死亡)，也包括提供时间线索，如预测某段时间内发生某种结局的可能性。
附图说明
图1肿瘤组织、正常组织和外周血T细胞的流式细胞分析图。第一行：外周血中T细胞；第二行：正常组织中的T细胞；第三行：肿瘤组织中T细胞。
图2、图3合格的单细胞cDNA示例。96个细胞同时使用LifeTech Real-TimePCR仪7500检测所得的结果图。对象RT-PCR的CT值低于26(图2黑框所示)；对象溶解曲线的峰值在85℃到90℃之间(图3黑框所示)。
图4合格的单细胞cDNA示例。基于毛细管电泳的Fragment Analysis的检测结果。1700左右的峰是全长转录组的片段大小，1100左右的峰是作为内参的ERCC。
图5合格的cDNA文库示例。基于毛细管电泳的Fragment Analysis检测结果。
图6CD8+T细胞基因表达的热图。根据基因表达的情况，聚成6类CD8+T细胞亚群。其中cluster6是耗竭性T细胞。
图7CD4+T细胞基因表达的热图。根据基因表达的情况，聚成9类CD4+T细胞亚群。其中cluster9是有活性的调节性T细胞。
图8～图15分别显示TNFRSF18、TNFRSF9、LAYN和IL1R2在CD8+和CD4+T细胞的不同细胞亚群中的表达量。图中灰阶代表相应基因在不同细胞亚群中表达量的高低，灰阶越深表达量越高，横坐标是聚类得到的每种T细胞亚群的类别，纵坐标是相应基因的表达量TPM(log2转化)。
图16耗竭性T细胞特征基因的表达与肺癌患者生存的相关性Kaplan-Meier曲线，所述特征基因为表1中所列的55个基因。
图17激活调节性T细胞特征基因的表达与肺癌患者生存的相关性Kaplan-Meier曲线，所述特征基因为表2中所列的21个基因。
图18TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN基因的表达与肺癌患者生存的相关性Kaplan-Meier曲线。
图19IL1R2基因的表达与肺癌患者生存的相关性Kaplan-Meier曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
以下实施例是以肺癌患者为例，开展的T细胞的单细胞转录组信息分析方法的示例说明。
需要说明的是，实施例不能作为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员理解，任何在本发明基础上所作的改进和变化都在本发明的保护范围之内。
以下实施例所用化学试剂都是常规试剂，均可商购获得。
所用分析软件及其来源如下：
GSNAP(http://research-pub.gene.com/gmap/)；
统计软件R(https://www.r-project.org/)；
HTSeqGenie,DESeq2,SC3,monocle,ComplexHeatmap,ggplot2,Rtsne andsurvival(https://www.bioconductor.org/)
肺癌单细胞序列数据库：EGA(https://www.ebi.ac.uk/ega/home)accessionnumber EGAS00001002430
TCGA数据：cBioportal(http://www.cbioportal.org/)和(https://gdc.cancer.gov/)。
实施例1T细胞的单细胞转录组数据获取
1、临床样本收集
在北京大学肿瘤医院和北京大学第三医院采集患者的手术组织和外周血，包括癌组织和癌旁正常组织，并采集外周血(3ml)。患者为非小细胞肺癌，包括鳞癌和腺癌，未经受术前辅助放疗或化疗，共9例。本项研究符合赫尔辛基宣言的医学伦理标准，并通过北京大学医学伦理委员会的审核。
血样在手术前采集于EDTA抗凝管中暂时于冰上保存；癌组织和癌旁正常组织样本在手术中采集，其中癌症组织剔除坏死组织；癌旁组织为远离癌组织至少5cm处的正常组织。癌组织和癌旁组织在离体30分钟以内置于冰上和RNAlater(Qiagen)溶液中，当日内完成单细胞分离操作。
2、单细胞悬液制备
外周血：采用密度梯度离心法分离外周血单核细胞。具体操作为将3ml全血缓慢加到3ml-1077分离液(Sigma，cat.no.1077)上，400g室温离心30分钟，小心吸取白色层单核细胞，用10ml PBS清洗，4℃离心15分钟，重复上述清洗步骤一次。最后将细胞溶解于0.5ml PBS，并加入1％小牛血清(FBS)。
癌组织和癌旁正常组织：采用组织消化法获得癌组织和癌旁正常组织的单细胞。首先将手术离体的组织剪成1mm3大小的碎块，浸泡于RPMI-1640培养基中，并加入10％小牛血清。使用Tumor Dissociation Kit,human(Miltenyi,130-095-929)试剂盒消化组织成单细胞悬液，通过40μm筛除组织碎片，400g离心10分钟收集单细胞悬液。使用红细胞裂解液进一步去除组织中混入的红细胞。同样用10ml PBS清洗两次，最后将细胞溶解于0.5ml PBS，并加入1％小牛血清。
3、目的T细胞单细胞分离
分离的目的细胞包括细胞毒T细胞(CD3阳性，CD8阳性)，辅助性T细胞(CD3阳性，CD4阳性，CD25阴性)和调节性T细胞(CD3阳性，CD4阳性，CD25阳性)。
这三种细胞分别用不同抗体进行荧光标记，抗体来自eBioscience公司，每106个细胞使用5μl抗体：
兔抗CD3抗体(FACS，Cat#48-0037-41)
兔抗CD4抗体(FACS，Cat#11-0048-41)
小鼠抗CD8抗体(FACS，Cat#17-0086-41)
小鼠抗CD25抗体(FACS，Cat#12-0259-42)
7AAD(FACS，Cat#00-6993-50)，7AAD用于标记死亡细胞。
96孔板的每个孔中预先加入反应溶液：
引物序列为：
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTTVN
目的T细胞的分离结果如图1所示。根据细胞表面的分子标记，选择细胞毒T细胞，辅助性T细胞和调节性T细胞，用流式细胞仪分别将单个细胞收集入相应的96孔板的每个孔中。
4、mRNA反转录和cDNA扩增
对于分离至96孔板中的单细胞进行反转录获得cDNA，操作步骤按照SMART-seq2方法(Picelli,S.et al.Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.Nat.Protoc.9,171–181(2014).)，如下：
1)单细胞裂解：将上述溶液中的单细胞旋涡震荡至少10秒。在PCR仪上72℃孵育3分钟。
2)加入内参RNA(ERCC RNA Spike-In Mix，Invitrogen，cat.no.4456740)。事先需要稀释350倍，加入1μl。内参RNA有助于对基因表达量的定量计算。
3)反转录：反应体系为：
TSO引物的序列为：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G
反应条件为：
4)PCR扩增：反应体系为：
KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2x) 12.5μl
IS PCR引物(10μM) 0.25μl
无核酸酶的超纯水 2.25μl。
IS PCR引物序列为：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
反应条件为：
经扩增后的PCR产物用Agencourt AMPure XP磁珠(Beckman)进行纯化，方法如下：
(1)在25μl上一步反应溶液中加入25μl磁珠，吹打混匀；
(2)室温放置5分钟；
(3)把盛有溶液的试管或板子放于磁力架上5分钟；
(4)移除液体；
(5)用100μl 80％的乙醇清洗磁珠，放置30秒后移除，重复此过程一次；
(6)从磁力架上拿下，加入20μl EB溶液，吹吸混匀；
(7)放置2分钟后，置于磁力架上，放置2分钟后，再吸出液体。
研究中发现，上述过程中残留在溶液中的引物会降低文库构建的效率，使文库包含非细胞cDNA的成分。为此需要再增加一遍纯化操作，除将磁珠用量变成50μl之外，纯化过程与前述一致。
进行质量检测，即通过RT-PCR检测T细胞特别表达的基因CD3，判断扩增的有效性。
反应体系为：
CD3的引物序列为：TCATTGCCACTCTGCTCC(正向)和
GTTCACTTGTTCCGAGCC(反向)。
反应条件为：
判断cDNA是否可用的标准有两条：一是对象RT-PCR的CT值低于26；二是对象溶解曲线的峰值在85℃到90℃之间。图2和图3给出了本实施例获得的合格的cDNA示例。
另一项质量控制手段为Fragment Analysis，基于毛细管电泳检测样本DNA的片段大小和浓度。图4给出了本实施例获得的合格的cDNA示例。
5、测序文库构建
cDNA文库构建采用TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2for试剂盒(vazyme，cat.no.TD501/502/503)；分别匹配双端index为TruePrepTM IndexKit V2for(vazyme，cat.no.TD202)。按照试剂盒说明书操作，用1μgcDNA起始建库。用磁珠做片段大小的选择，获得目的片段大小为400bp～600bp的cDNA文库，最后经FragmentAnalysis进行质量控制，经测定，文库构建合格，相应的分析结果参见图5。
采用Illumina Hiseq4000测序，测序模式为双端150bp，通常一个细胞的数据量需要1百万条读段。
实施例2生物信息分析
1、数据比对与质量控制
对于从测序仪获得的读段(reads)，首先去除低质量的部分，保留的标准如下：①未知碱基占给定读段总序列不能超过10％，②质量值低于5的碱基不能超过50％，③不能含有接头序列。使用GSNAP软件完成比对，人类基因组参考序列版本为hg19，参数选择--novelsplicing 1-n 10-i 1-M 2。计算基因表达量时，使用的参考基因集合来自UCSC的“knownGene.txt”，使用R语言包“findOverlaps”统计读段在基因上的归属，使用TPM值标定每个基因在每个细胞中的表达量，使用的公式为：
其中Cij表示为基因i在细胞j中的读段的数量。
数据量和数据质量低的T细胞需要被过滤掉。保留符合以下标准的细胞：①CD3D的TPM大于3；②当分离CD4+T细胞时，CD4的TPM需要大于3，同时CD8的TPM小于30；③分离CD8+T细胞时，CD8的TPM需要大于3，同时CD4的TPM小于30；④线粒体基因上的读段占所有读段的比例不高于10％。
另外，在文库容量(library size)和基因表达数量上也设定了一些参考标准。当一个基因在所有细胞中被检测到的读段平均数量大于1才用于后续分析。对所有基因的表达量进行log2转化，并将每个基因在每个患者中表达的log2转化后平均值设定为0，从而便于比较给定基因在不同患者中的表达差异，具体使用R语言包computeSumFactors。一般来讲，每个细胞能检测到的表达基因的数量约为3000个上下。
2、单细胞表达谱识别
针对上一步获得的每个细胞每个基因表达量的矩阵，进行T细胞类型的判别。
首先利用软件SC3进行迭代的非监督聚类(Kiselev VY,Kirschner K,Schaub MT,Andrews T,Yiu A,Chandra T1,Natarajan KN,Reik W,Barahona M8,Green AR,HembergM.SC3:consensus clustering of single-cell RNA-seq data.Nat Methods.2017May；14(5):483-486.doi:10.1038/nmeth.4236.Epub 2017Mar 27.)。具体来说，筛选方差最大的n个基因进行谱聚类：计算Spearman相关系数作为细胞间距离的测度；细胞间的距离可以用图来表示，通过图的拉普拉斯矩阵及其特征向量，可以将细胞变换到d维的特征图空间中；在d维的特征图空间中进行k-means聚类。维度数d的取值从细胞总数的4％到7％，每取一个d得到一个运行结果，将所有d取值的运行结果平均可以得到一个一致性矩阵。一致性矩阵的元素表示相应行的细胞和相应列的细胞在多少比例的运行结果中聚在一个类里面。再在这个一致性矩阵上利用层次聚类得到k个类。k是SC3软件的一个参数。尝试k从2到6，n为1000、1500、2000、2500和3000，从这些不同的SC3运行结果中，根据一致性矩阵、silhouette统计量、Dunn统计量等方面选择一个最好的作为聚类结果。得到聚类结果后，再对每一类进行以上过程，以得到更精细的聚类，直到找到有意义的聚类结果。
同时，我们对同样的数据采用基于Hclust和K-means的聚类方法进行了对比分析，分别包含是否进行主成分分析的前处理。比较的方法为计算Dunn和Silhouette的数值。Dunn的计算公式为即比较同一类中距离最远的点和不同类中距离最近点。而Silhouette的计算公式为Si＝(bi-ai)/max(ai，bi)，即比较一组内任意两点的距离和最远的聚类。当这两个值越大时表示细胞类别之间的边界越清晰，同时类别内细胞的紧密程度越高。
经过对比，发现不同聚类方法，即：SC3、Hclust和k-means，得到的Dunn和Silhouette值不同，SC3的结果优于Hclust和k-means的方法，因此本发明中采用SC3聚类方法。
当采用SC3分析时，取k＝4时结果相对最优，故用此聚类结果进行后续的特征基因的识别。
图6和7分别给出了采用SC3软件对CD8+T细胞和CD4+T细胞进行聚类后获得各类亚群的矩阵图。
使用R语言包(aov)识别每一组中的特征表达基因，通过特征表达基因推断细胞的功能类别，包括细胞毒性T细胞，调节性T细胞等。
通过特征表达基因，共识别出6类CD8+T细胞，包括：1)初始CD8+T细胞CD8-C1-LEF1，其高表达经典的特征基因如LEF1，SELL及CCR7；2)中央记忆T细胞和早期效应T细胞的混合群体CD8-C2-CD28，该类细胞高表达特征基因CD28，DUSP2等；3)来自外周血的效应T细胞CD8-C3-CX3CR1，高表达毒性效应基因如NKG7，GZMA，GZMB及PRF1等；4)耗竭前T细胞CD8-C4-GZMK,该类T细胞既有毒性效应基因的表达，如GZMK，GZMA等，又有耗竭相关基因的表达，如PDCD1；5)组织常驻记忆T细胞CD8-C5-ZNF683，高表达组织贮存特征基因如ZNF683，ITGAE，CD69及ITGA1等；6)耗竭T细胞CD8-C6-LAYN,高表达T细胞耗竭相关基因如PDCD1，CTLA4，LAG3，TIGIT及TIM3。
此外，通过TCR序列，识别出MAIT细胞CD8-C7-SLC4A10，其高表达特征基因SLC4A10。
而通过特征基因表达，共识别出9类CD4+T细胞，分别为：1)初始CD4+T细胞CD4-C1-CCR7，高表达特征基因CCR7，TCF7及LEF1；2)来自外周血的效应CD4+T细胞CD4-C2-GNLY，该类细胞高表达毒性效应功能相关基因如NKG7，GZMH，GNLY及PRF1；3)来自外周血的调节性T细胞CD4-C3-FOXP3，高表达特征基因FOXP3，IL2RA及RTKN2；4)记忆T细胞CD4-C4-CD69，该类细胞高表达特征基因CD69；5)记忆T细胞及效应T细胞的混合类CD4-C5-EOMES，高表达特征基因GZMK，GZMA及PDCD1；6)组织驻留记忆T细胞CD4-C6-GZMA，高表达特征基因CAPG，GZMA等；7)CD4耗竭T细胞CD4-C7-CXCL13，高表达耗竭相关基因PDCD1，CXCL13及TFH特征基因BCL6，CD200等；8)癌旁来源的调节性T细胞CD4-C8-FCRL3，高表达特征基因FCRL3，FOXP3，IL2RA等；9)癌组织来源的具有抑制功能的调节性T细胞CD4-C9-CCR8，高表达抑制功能相关基因CCR8，CTLA4，TNFRSF18，TNFRSF9等。
为了鉴定CD8+T细胞中的耗竭性T细胞的特征基因，用软件limma对癌组织中的耗竭性和非耗竭性T细胞进行差异分析。设定标准为表达量绝对值差异(Fold Change)大于等于4倍，BH矫正的P<0.01。最后在肺癌中获得了55个耗竭性T细胞的特征表达基因(表1，表中E为科学计数法)。
表1肺癌组织中浸润的耗竭性T细胞特征表达的基因
同样，为了识别有活性的调节性CD4+T细胞的特征表达基因，使用limma软件进行差异表达分析。设定标准为表达量在活性调节性T细胞和非活性调节性T细胞间的绝对值差异均需要大于等于4倍，BH矫正的P<0.01。最后在肺癌中获得了21个有活性的调节性T细胞的特征表达基因(表2，表中E为科学计数法)。
表2肺癌组织中浸润的调节性T细胞特征表达的基因
| 基因名称 | 基因编号(UCSC) | 表达差异倍数(log转化) | 表达量(TPM) | 显著性(FDR) |
| TNFRSF9 | 3604 | 7.51 | 5.06 | 5.96E-266 |
| IL1R2 | 7850 | 3.55 | 5.40 | 1.06E-16 |
| CCR8 | 1237 | 2.87 | 8.23 | 2.72E-13 |
| LAYN | 143903 | 2.62 | 4.70 | 1.61E-11 |
| TNFRSF4 | 7293 | 2.52 | 7.59 | 3.12E-09 |
| LGALS1 | 3956 | 2.47 | 5.74 | 1.48E-08 |
| SDC4 | 6385 | 2.42 | 3.80 | 9.84E-11 |
| MAP2K3 | 5606 | 2.26 | 4.37 | 2.12E-08 |
| CRADD | 8738 | 2.26 | 3.36 | 6.51E-09 |
| IL21R-AS1 | 283888 | 2.23 | 4.59 | 1.27E-08 |
| ZBTB32 | 27033 | 2.23 | 2.61 | 1.67E-08 |
| DNPH1 | 10591 | 2.23 | 6.67 | 2.05E-10 |
| TNFRSF18 | 8784 | 2.21 | 8.47 | 1.28E-09 |
| GCNT1 | 2650 | 2.17 | 2.57 | 7.40E-12 |
| MIR4632 | 100616438 | 2.12 | 8.96 | 2.97E-05 |
| ICOS | 29851 | 2.10 | 8.26 | 1.12E-09 |
| BST2 | 684 | 2.09 | 6.81 | 1.78E-06 |
| HSPB1 | 3315 | 2.07 | 5.28 | 3.05E-07 |
| ATP1B3 | 483 | 2.04 | 4.42 | 2.22E-06 |
| SYNGR2 | 9144 | 2.02 | 6.97 | 5.90E-07 |
| DUSP4 | 1846 | 2.02 | 4.97 | 1.67E-08 |
最后，比较两个列表发现，有三个基因重复出现在两组特征基因中，分别为TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN。它们在肺癌的各类相关T细胞中的表达量如下图(图8～图13)。
TNFRSF18，TNF receptor superfamily member 18，又名GITR,AITR,CD357。该基因编码蛋白属于TNF受体超家族。该受体在T细胞活化过程中被诱导表达，并在CD25+CD4+T细胞限制自身免疫反应中发挥重要作用。在小鼠中的敲除实验证实该受体可以调节CD3驱动的T细胞激活过程并抑制细胞凋亡。已知该基因包含三种剪切体。
TNFRSF9,TNF receptor superfamily member 9,又名4-1BB；CD137。该基因编码蛋白属于TNF受体超家族。这一受体在T细胞发育、维持生存和克隆扩增中发挥作用。同时它可以诱导外周血单核细胞的增殖，诱导TCR/CD3引发的活化T细胞发生凋亡，调控CD28共刺激下的Th1细胞的应答。该蛋白在T细胞被激活时表达。TRAF接头蛋白可以与该受体结合，并激活细胞内的NF-kappaB信号通路的活化。
LAYN,layilin。该基因编码蛋白的表达与细胞表面、配体尚不清楚，可以被TNFɑ激活表达，近期被发现在调节性T细胞中特异表达提升，可能在癌细胞诱导的免疫编辑中发挥作用。
另外，IL1R2是在调节性T细胞中发现的一个有潜在功能的基因(图14和15)。它的全称是interleukin 1receptor type 2。该基因编码蛋白为细胞因子受体，属于白介素1受体家族。该蛋白结合的配体为白介素ɑ和白介素β(对应基因分别为IL1A和IL1B)。IL1R1和IL1RA也可以与IL1A和IL1B结合并开启免疫细胞内的信号转导，而IL1R2是一个缺陷性受体，与IL1A或IL1B结合后不能启动胞内信号途径。这个基因和上述其他基因位于染色体2q12上，具有多种剪切体形态，可以分别表达为膜蛋白和分泌型蛋白。
3、预后判断中的效用
对于上述识别的T细胞功能组别的特征基因，分析其在患者疾病预后上的使用价值。使用的数据集合为TCGA(The Cancer Genome Atlas)肺腺癌(LUAD)的数据，因为这项研究收集整理了患者的随访信息。患者癌组织基因表达量的数据从UCSC Xena(http://xena.ucsc.edu/)下载，患者随访(生存)信息从GDC Data Portal(https://gdc-portal.nci.nih.gov/)下载。
预后显著基因及基因组合的发现阶段：
为了排除患者非肿瘤浸润性T细胞的细胞中某个基因表达量对分析的干扰，将TCGA数据库中获得的基因表达(以TPM为单位)信息，以log2(TPM+1)和z-score(该基因的表达值减去该基因在所有样本中的平均表达值，然后除以标准差)转换后的值作为基因表达量的度量，对于经上述工作识别的耗竭性CD8+T细胞和活性调节性CD4+T细胞的特征基因，在每个样本中对特定的基因集合取平均值，并用CD3基因(CD3D、CD3E、CD3G)的平均表达值做标准化(该基因集合的平均表达值减去CD3基因的平均表达值)，以反应T细胞在癌组织中的浸润程度。
对于单个基因，在每个患者中，计算出该基因的表达值，以所有患者该基因的表达值的中位值作为阈值，将患者分为高表达组和低表达组，比较两组病人之间生存时间的差异。对于基因集合，在每个患者中，计算出基因集合中所有基因的表达值的平均值，以所有患者该基因集合的表达平均值的中位值作为阈值，将患者分为高表达组和低表达组，比较两组病人之间生存时间的差异。使用Kaplan-Meier曲线表现患者生存差异，使用log-rank检验生存差异是否显著(P＜0.05)。
对特征基因进行了单独的和组合的分析，即分别把耗竭性CD8+T细胞和活性调节性CD4+T细胞的特征基因作为一个基因集合，对两组集合共同出现的3个基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN作为一个基因集合，及各单个基因进行预后分析。
分析后发现：
耗竭性CD8+T细胞及活性调节性CD4+T细胞的各自特征基因集合均有显著的预后预测效能(图16和17)，高表达组的生存时间显著短于低表达组的生存时间。
两个特征基因集合中共同出现的3个基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN的组合也有显著的预后预测效能，高表达组的生存时间显著短于低表达组的生存时间；并且这3个基因组合的预后预测的显著性高于前述两个基因集合(图18，3个基因组合的风险比为1.49，P＝0.01，而耗竭性T细胞特征性基因组合的风险比为1.37，P＝0.045，活性调节性T细胞特征性基因组合的风险比为1.43，P＝0.024)，虽然它们每一个单独计算与患者预后的相关性时，结果分别为TNFRSF9P＝0.06、TNFRSF18P＝0.28、LAYN P＝0.22。
单个基因IL1R2的预后显著性最高(图19；其风险比为1.68，P＝1.06e-03)。
预后显著基因及基因组合的应用阶段：
在临床应用时，对于上述分析得到的预后显著基因及基因集合作为诊断指标时的定量值，在本实施例中是以相应基因或基因集合在TCGA数据库的LUAD病人mRNA表达数据中的表达阈值为标准：对LUAD的表达数据做log2(TPM+1)转换，之后分别以单个基因或基因组合在所有样本中的平均表达值的中位值作为判断指标，即以基因或基因集合平均表达值的中位值作为阈值区分高/低表达：55个T细胞耗竭相关基因集合的阈值为3.21(log2(TPM+1)＝3.21)，21个调节性T细胞抑制功能相关基因集合的阈值为3.94(log2(TPM+1)＝3.94)，TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN基因集合的阈值为2.27(log2(TPM+1)2.27)，IL1R2的阈值为1.88(log2(TPM+1)＝1.88)。对于其他的人群或数据库信息，可以采用类似的方式进行处理。
Claims (12)
1.一种用于识别、检测或监测肺癌组织中浸润的CD4+T细胞的生物标志物组，其包含基因IL1R2，或者所述基因编码的蛋白或蛋白片段；优选，所述生物标志物组为基因IL1R2或其编码的蛋白或蛋白片段。
2.一种用于识别、检测或监测肺癌组织中浸润的T细胞的生物标志物组，其包含基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN，或者所述三个基因所编码的蛋白或蛋白片段；
优选，所述T细胞是CD8+T细胞；
优选，所述T细胞是CD4+T细胞；
优选，所述T细胞是CD8+T细胞时，所述生物标志物组进一步包含基因CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP中的至少一种，或者所述至少一种基因所编码的蛋白或蛋白片段；
更优选，所述T细胞是CD8+T细胞时，所述生物标志物组进一步包含基因CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP，或者所述各基因所编码的蛋白或蛋白片段；
优选，所述T细胞是CD4+T细胞时，所述生物标志物组进一步包含基因IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4中的至少一种，或者所述至少一种基因所编码的蛋白或蛋白片段；
更优选，所述T细胞是CD4+T细胞时，所述生物标志物组进一步包含基因IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4，或者所述各基因所编码的蛋白或蛋白片段。
3.基因IL1R2或其编码的蛋白或蛋白片段在制备肺癌患者预后判断的试剂中的应用。
4.一组生物标志物组在制备肺癌患者预后判断的试剂中的应用，所述生物标志物组包含基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN，或者所述三个基因所编码的蛋白或蛋白片段；
优选，所述生物标志物组进一步包含基因CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP，或者所述各基因所编码的蛋白或蛋白片段；
优选，所述生物标志物组进一步包含基因IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4，或者所述各基因所编码的蛋白或蛋白片段。
5.一种用于识别、检测或监测肺癌组织中浸润的T细胞，或用于肺癌的分子分型、辅助诊断或预后判断的检测试剂，所述试剂包含能与基因IL1R2或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂。
6.一种用于识别、检测或监测肺癌组织中浸润的T细胞，或用于肺癌的分子分型、辅助诊断或预后判断的检测试剂，所述试剂包含能与基因TNFRSF9或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂，能与基因TNFRSF18或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂，以及，能与基因LAYN或其编码的蛋白或蛋白片段相结合的结合剂；
优选，所述检测试剂进一步包含一个或多个结合剂，所述每个结合剂能与各个目标基因或其编码的蛋白或蛋白片段分别相应结合，所述目标基因为T细胞耗竭相关基因或调节性T细胞抑制功能相关基因；
优选，所述T细胞耗竭相关基因选自CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP中的至少一种；更优选，所述T细胞耗竭相关基因为CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP；
优选，所述调节性T细胞抑制功能相关基因选自IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4中的至少一种；更优选，所述调节性T细胞抑制功能相关基因为IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4。
7.一种用于识别、检测或监测肺癌组织中浸润的T细胞，或用于肺癌的分子分型、辅助诊断或预后判断的检测试剂，包含多个结合剂，所述多个结合剂的每一个能与以下各个目标基因或其编码的蛋白或蛋白片段分别相应结合，所述目标基因为TNFRSF9、TNFRSF18、LAYN、CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP。
8.一种用于识别、检测或监测肺癌组织中浸润的T细胞，或用于肺癌的分子分型、辅助诊断或预后判断的检测试剂，包含多个结合剂，所述多个结合剂的每一个能与以下各个目标基因或其编码的蛋白或蛋白片段分别相应结合，所述目标基因为TNFRSF9、TNFRSF18、LAYN、IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4。
9.一种用于识别、检测或监测肺癌组织中浸润的T细胞，或用于肺癌的分子分型、辅助诊断或预后判断的检测试剂盒，其包含权利要求5-8任一项所述的检测试剂；
优选，所述检测试剂盒进一步包含用于检测的辅助性试剂；
优选，所述试剂盒进一步包括盛装一种或多种所述检测试剂或辅助性试剂的一个容器或多个容器。
10.能够检测基因IL1R2或其编码的蛋白或蛋白片段的检测试剂在制备肺癌患者预后判断的试剂中的用途；
优选，所述检测试剂包含能特异性扩增基因IL1R2的引物；
优选，所述检测试剂包含能检测基因IL1R2的探针。
11.能够检测一组生物标志物组的检测试剂在制备肺癌患者预后判断的试剂中的用途，所述生物标志物组包含基因TNFRSF9、TNFRSF18和LAYN，或者所述三个基因所编码的蛋白或蛋白片段；
优选，所述生物标志物组进一步包含基因CXCL13、HAVCR2、ITGAE、RGS1、PDCD1、SIRPG、RBPJ、KLRB1、KRT86、CTLA4、ENTPD1、LINC00299、JAML、MYO7A、TIGIT、GZMB、MIR155、ACP5、TOX、IVNS1ABP、MIR155HG、CCL3、CXCR6、CLNK、KRT81、PHLDA1、SRGAP3、BCL2L11、NDFIP2、SARDH、CLECL1、NELL2、DDIT4、GPR25、SAMSN1、CD82、RUNX2、PLPP1、ID2、CHN1、MIR4632、ENTPD1-AS1、NR3C1、TBC1D4、IGFLR1、CAPG、FKBP1A、FUT8、TNFRSF1B、FKBP5、CD7和ALOX5AP，或者所述各基因所编码的蛋白或蛋白片段；
优选，所述生物标志物组进一步包含基因IL1R2、CCR8、TNFRSF4、LGALS1、SDC4、MAP2K3、CRADD、IL21R-AS1、ZBTB32、DNPH1、GCNT1、MIR4632、ICOS、BST2、HSPB1、ATP1B3、SYNGR2和DUSP4，或者所述各基因所编码的蛋白或蛋白片段；
优选，所述检测试剂包含能特异性扩增所述生物标志物组中的各基因的引物组；
优选，所述检测试剂包含能与所述生物标志物组中的各基因发生杂交反应的探针的集合。
12.如权利要求5-8任一项所述的检测试剂或权利要求9所述的检测试剂盒，所述结合剂为核酸、配体、酶、底物和/或抗体；
优选，所述结合剂是能与所述目标基因结合的核酸探针；
优选，所述结合剂是能特异性扩增目标基因的引物；
优选，所述结合剂是能结合所述目标基因编码的蛋白或蛋白片段的抗体；
优选，所述结合剂进一步结合指示分子，所述指示分子例如：荧光物质、放射性物质和/或酶。
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