CN115427585A - 用于鉴定功能性疾病特异性调节性t细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及鉴定功能性疾病特异性，特别是肿瘤特异性调节性T细胞及其标志物的方法。本发明还涉及衍生的功能性肿瘤特异性调节性T细胞、标志物和工程化的调节性T细胞，以及它们用于诊断、预后、监测和治疗癌症的用途。

Description

用于鉴定功能性疾病特异性调节性T细胞的方法
技术领域
本发明涉及特别是癌症的免疫治疗领域。本发明涉及鉴定功能性疾病特异性，特别是肿瘤特异性调节性T细胞及其标志物的方法。本发明还涉及衍生的功能性肿瘤特异性调节性T细胞、标志物和工程化的调节性T细胞，以及它们用于诊断、预后、监测和治疗癌症的用途。
背景技术
CD4+Foxp3+调节性T细胞(Treg)在维持免疫稳态和积极抑制对自身、肿瘤、微生物和移植物的免疫应答中起关键作用(Sakaguchi et al.,Int.Immunol.,2009,21,1105–1111)。因此，理解Treg的生物学和功能是免疫学家的关键挑战，并且是改进用于疾病(特别是癌症)的诊断、预后、监测和治疗的当前方法的先决条件。
在许多人癌症中发现Treg的频率升高并且与不良的临床结果相关。在小鼠模型中，Treg的操作给出了令人印象深刻的结果。一方面，添加治疗性Treg或加强内源性Treg显示出抑制自身免疫(Churlaud et al.,Clin.Immunol.Orlando Fla,2014,151,114–126；Gringer-Bleyer et al.,J.Clin.Invest.,2010,120,4558–4568)或炎症(Gaidot et al.,Blood,2011,117,2975–2983；Pérol et al.,Immunol.Lett.,Dutch Society forImmunology,2014,162,173–184)。另一方面，已经证明耗尽/失活Treg对于增加抗肿瘤(Alonso et al.,Nat.Commun.,2018,9,2113；Caudana et al.,Cancer Immunol.Res.,2019,7,443–457；Fontenot et al.,Nat.Immunol.,2003,4,330–336)或抗疫苗反应非常有价值。因此，已经提出将靶向Treg的治疗策略用于癌症治疗，包括但不限于：(i)基于Treg细胞的方法，包括在造血干细胞移植后注射耗尽Treg的供体淋巴细胞，用于治疗血液恶性肿瘤(Maury et al.,Sci.Transl.Med.,2010,2,41ra52-41ra52)和(ii)诱导Treg细胞的选择性耗尽或功能改变的方法，包括；调节Treg相关途径的化学药品，如环磷酰胺(Lutsiak etal.,Blood,2005,105,2862–2868)、氟达拉滨、吉西他滨和米托蒽醌(Dwarakanath et al.,Cancer Rep.,2018,1,e21105；Wang et al.,Cell Rep.,2018,23,3262–3274)；耗尽Treg的抗体(如抗CTLA-4、抗CD25、抗CCR5、抗CCR4；Dwarakanath et al.,Cancer Rep.,2018,1,e21105)；细胞因子和修饰的细胞因子，包括例如高剂量IL-2(刺激癌症中的效应细胞)和对Treg或效应细胞具有特异性选择性的IL-2衍生物(IL-2/抗IL-2复合物、聚乙二醇化IL-2；表面重构的IL-2变体(Pérol,L.,Piaggio,E.,2016.New Molecular and CellularMechanisms of Tolerance:Tolerogenic Actions of IL-2,in:Cuturi,M.C.,Anegon,I.(Eds.),Suppression and Regulation of Immune Responses.Springer New York,NewYork,NY,pp.11–28)。
然而，基于细胞的疗法非常昂贵和麻烦；并且尽管临床前数据已经给出了使用上述方法的坚实理由，并且一些正在进行临床评价，但是仍然存在发现用于治疗自身免疫/炎性疾病以及癌症的有效且选择性的靶向Treg的免疫疗法的医学需求。
阻碍翻译进入临床的主要障碍之一是难以鉴定独特的Treg标志物。实际上，Treg表达高水平的CD25和Foxp3(Hori et al.,Science,2003,299,1057–1061；Tran et al.,Blood,2007,110,2983–2990)，但常规人CD4+T细胞(Tconvs)也可在活化后获得CD25和Foxp3，因此在Treg和活化的Tconvs的表型中存在大的重叠(Tran et al.,Blood,2007,110,2983–2990)。
此外，Treg构成由微环境线索塑造的异质群体(Campbell and Koch,Nat.Rev.Immunol.,2011,11,119–130；Feuerer et al.,Nat.Immunol.,2003,4,330–336)。实际上，随着出现Treg转录组标签的研究，显然Treg不具有独特的分子标签。事实上，在稳态下，从不同组织(血液、淋巴组织、非淋巴组织)获得的Treg的独特分子模式表明Treg可以容易地响应周围的微环境，获得不同的迁移能力，激活不同的功能和代谢途径，并显示不同的功能；确定不同的Treg亚群。
此外，与不同病理相关的炎性环境可明显影响Treg分子特征和相关功能(Burzynet al.,Nat.Immunol.,2013,14,1007–1013；Chaudhry et al.,Science,2009,326,986–991；Zhou et al.,Nat.Immunol.,2009,10,1000–10074)。因此，为了有效地操纵Treg用于治疗目的，必须理解与每种病理学相关的独特Treg性状。
Treg和人癌症确实是要解决的一大难题。存在于肿瘤中的Treg可以具有不同的来源并通过多种机制抑制。文献中不断增长的数据表明肿瘤-Treg可通过多种机制促进癌症进展，范围从效应T和NK细胞的直接抑制和骨髓细胞重编程为耐受性细胞，到不同基质细胞诱导产生抑制性分子(例如VEGF、IDO、前列腺素)，整体印记抑制性肿瘤-微环境。此外，肿瘤特异性Treg可衍生自胸腺(tTreg)或它们可由天然T细胞转化成“外周诱导的”Treg(pTreg)而产生(Lee,H.-M.,Bautista,J.L.,Hsieh,C.-S.,2011.Chapter 2-Thymic andPeripheral Differentiation of Regulatory T Cells,in:Alexander,R.,Shimon,S.(Eds.),Advances in Immunology,Regulatory T-Cells.Academic Press,pp.25–71；Leeet al.,Exp.Mol.Med.,2018,50,e456)。如今，tTreg与pTreg的区别仅限于使用具有有限特异性的少数标志物(Helios、Nrp-1、CD31、Fopx3启动子甲基化)(Lin et al.,J.Clin.Exp.Pathol.,2013,6,116–123)。肿瘤特异性Treg是tTreg还是pTreg仍然未知。理解tTreg和pTreg的独特特征应给出精细操纵肿瘤-Treg用于治疗目的的新可能性。
关于人中癌症相关Treg生物学的信息是有限的。对不同癌症类型中的Treg细胞的研究表明：i)与健康供体相比，癌症患者血液中FOXP3+CD4+Treg的比例增加(Liyanage etal.,J.Immunol.,2002,169,2756–2761；Wolf et al.,Clin.Cancer Res.,2003,9,606–612)，和ii)肿瘤中高比例的FOXP3+CD4+Treg与不良预后相关(Bates et al.,J.Clin.Oncol.,2006,24,5373–5380；Mahmoud et al.,J.Clin.Oncol.,2011,29,1949–1955；Merlo et al.,J.Clin.Oncol.,2009,27,1746–1752；Mouawad et al.,J.Clin.Oncol.,2011,29,1935–1936；Ohara et al,Cancer Immunol.Immunother.,2009,58,441–447；Sun et al.,Cancer Immunol.Immunother.,2014,63,395–406)。
仅最近才进行了纯化自人肿瘤的Treg的首次大量RNAseq分析(Plitas et al.,Immunity,2016,45,1122–1134)，并且最近，进行了纯化自人肿瘤的Treg的单细胞(sc)分析(De Simone et al.,Immunity,2016,45,1135–1147)。甚至更近的，首次报道了肝癌、乳腺癌、结肠直肠癌和非小细胞肺癌的T细胞转录组和TCR关联的sc数据(Azizi et al.,Cell,2018,174,1293-1308；Guo et al.,Nat.Med.,2018,24,978；Zemmour et al.,Nat.Immunol.19,2018,291–301；Zhang et al.,Nature,2018,564,268)。这些类型的研究已经揭示了正常和病理条件下Treg细胞之间空前的异质性，使得肿瘤特异性Treg分析对于科学家来说是技术上困难的任务。此外，在这些研究中，分析了相对低数量的Treg，给出了检测或定义肿瘤特异性Treg细胞的低能力和定义肿瘤特异性Treg细胞的低水平解决方法。
尽管如此，对肿瘤的免疫应答的免疫调节不仅发生在肿瘤床中的效应T细胞阶段，而且发生在肿瘤引流淋巴结(TDLN)中的T细胞引发水平(Chen and Mellman,Immunity,2013,39,1–10)。重要的是，尽管存在于TDLN中的Treg将在很大程度上形成抗肿瘤T细胞应答，但是关于存在于癌症患者的TDLN中的Treg细胞的表型和功能的数据非常有限(Faghiget al.,Immunol.Lett.,2014,158,57–65；Gupta et al.,Cancer Invest.,2011,29,419–425；Kohrt et al.,PLOS Med.,2005,2,e284；Nakamura et al.,Eur.J.Cancer,2009,45,2123–2131；Zuckerman et al.,Int.J.Cancer,2013.132,2537–2547)。
因此，缺少用于治疗癌症和其它疾病的鉴定肿瘤特异性Treg的可靠方法和可靠的肿瘤特异性Treg标志物。
本发明通过提供鉴定功能性疾病特异性调节性T细胞，特别是功能性肿瘤特异性调节性T细胞及其标志物的方法解决了该问题。本发明还提供通过该方法鉴定的功能性肿瘤特异性调节性T细胞和Treg标志物，包括可用于癌症的诊断、预后、监测和治疗的生物标志物和候选治疗性靶标。本发明还提供衍生自所述功能性肿瘤特异性调节性T细胞和Treg标志物的工程化Treg细胞。
发明概述
发明人已使用与来自血液、肿瘤引流淋巴结(TDLN)和癌症患者的肿瘤的Treg和Tconvs的TCR偶联的转录组的单细胞RNA测序来将Treg分类为功能性亚群并从Treg的异质库区分功能性肿瘤-Treg簇(FT-Treg)。FT-Treg簇被鉴定为在肿瘤或肿瘤引流淋巴结(与血液相比)中积聚的Treg细胞簇，其在克隆扩增的细胞中富集，并且在具有TCR介导的活化的转录组学特征的细胞中富集。使用TCR作为“分子标签”来研究FT-Treg在三种组织中的克隆动态，并完成对不同Treg亚群的组织适应性的理解，以设计有效和选择性的操纵FT-Treg的方法。通过差异基因表达分析鉴定特异性阻断FT-Treg而不是所有Treg的新治疗性靶标(分子或途径)，并使用候选分子的Treg敲除和功能性体外和/或体内测试验证靶标以了解它们在Treg生物学中的作用。产生的FT-Treg分子靶标可用于指导候选治疗策略的选择，包括基于细胞疗法；基于诱导Treg细胞的选择性耗尽或功能改变的抗体、细胞因子或化学药品的方法。选择性抑制肿瘤特异性Treg，同时保留来自健康组织的效应T细胞和Treg(维持免疫稳态和控制自身免疫)，代表更有效和更安全的策略，其应导致有效抗肿瘤免疫的增强，而不引起全身性自身免疫。
此外，该方法可用作表征与任何确定的人病理学相关的Treg的研究工具。该方法可鉴定具有潜在价值的Treg相关分子作为诊断、预后或毒性的生物标志物。可以用该方法获得的新的Treg相关分子的生物学作用的理解可以用于设计新的治疗策略以改进疫苗接种方法和治疗广泛范围的免疫介导的病理，包括自身免疫、炎性和免疫代谢疾病、变态反应、感染性疾病、GVHD、移植、胎儿排斥和癌症。
因此，本发明涉及鉴定功能性疾病特异性调节性T细胞标志物的方法，其包括以下步骤：
(a)从至少患者病变组织样品和患者外周血样品制备相似比例的分离的调节性T(Treg)细胞和常规T(Tconv)细胞的混合物；
(b)对来自至少病变组织和外周血的分离的Treg和Tconv细胞的每种混合物进行单细胞基因表达谱分析与T细胞受体(TCR)谱分析的组合；
(c)鉴定Treg细胞和Tconv细胞的簇，其中所述簇包含彼此差异表达的基因或基因特征；
(d)在所鉴定的Treg细胞簇中确定至少一个功能性疾病特异性Treg细胞簇，其中所述至少一个簇包含：
(i)相对于外周血，病变组织中具有较高比例的Treg细胞；
(ii)病变组织中具有克隆扩增TCR特异性的较高比例的Treg细胞；以及
(iii)病变组织中具有TCR触发、细胞活化和扩增的转录组特征的较高比例的Treg细胞；和
(e)鉴定与所有其它鉴定的Treg和Tconv细胞簇相比在功能性疾病特异性Treg细胞簇中差异表达的基因。
在本发明方法的一些实施方案中，患者病变组织样品是患者肿瘤样品和/或患者样品包括患者病变组织样品、患者组织引流淋巴结样品和患者外周血样品，特别是患者肿瘤样品、患者肿瘤引流淋巴结样品和患者外周血样品。
在本发明方法的一些优选实施方案中，混合物由约50％的Tconv细胞和约50％的Treg细胞组成。
在本发明方法的一些实施方案中，步骤(b)中组合的单细胞基因表达谱分析和T细胞受体(TCR)谱分析通过单细胞RNA测序方法进行。
在本发明方法的一些实施方案中，至少一个功能性疾病特异性Treg细胞簇包含较高比例的过度表达以下一种或多种的Treg细胞：REL、NKKB2、NR4A1、OX-40、4-1BB、MHC II类分子，特别是HLA-DR、CD39、CD137和GITR。
在本发明方法的一些优选实施方案中，所述疾病是癌症。优选地，癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)；乳腺癌；皮肤癌；卵巢癌；肾癌和头颈癌；和横纹肌样瘤；更优选非小细胞肺癌(NSCLC)。
在本发明方法的一些实施方案中，所述疾病选自急性或慢性炎性疾病、变应性疾病、自身免疫性疾病或感染性疾病、移植物抗宿主病、移植排斥反应。
在一些实施方案中，本发明的方法还包括根据以下步骤对用于治疗目的的肿瘤特异性Treg标志物进行鉴定和排序：
-步骤1：鉴定和选择编码细胞膜蛋白，优选具有细胞外结构域的跨膜或GPI锚定蛋白的n个差异表达基因的部分；
-步骤2：测定n个所选基因在正常组织中的平均表达水平，并在正常组织中从具有最低表达水平的基因为-1到具有最高表达水平的基因为-n对每个基因分配至少一个得分A；
-步骤3：测定肿瘤组织中n个所选基因的平均表达水平，并在肿瘤组织中从具有最高表达水平的基因为+n到具有最低表达水平的基因为+1对每个基因分配至少一个得分B；
-步骤4：测定除Treg外的正常PBMC的n个所选基因的平均表达水平，并在除Treg外的正常PBMC中从具有最低表达水平的基因为+n到具有最高表达水平的基因为+1对每个基因分配至少一个得分C；
-步骤5：测定除Treg外的肿瘤环境的n个所选基因的平均表达水平，并在除Treg外的肿瘤环境中从具有最低表达水平的基因为+n到具有最高表达水平的基因为+1对每个基因分配至少一个得分D；
-步骤6：测定i)肿瘤-Treg与正常组织-Treg相比，和ii)Treg与Tconvs相比n个所选基因的相对表达水平，并在i)(得分E)肿瘤Treg与正常相邻组织Treg相比，和ii)(得分F)Treg与Tconvs相比中从具有最高倍数变化表达水平的基因为+n到具有最低倍数变化的基因为+1对每个基因分配两个得分E和F；
-步骤7：对所分配的得分求和以获得每个基因的累积评估值(SUMSCORE)；和
-步骤8：基于所述累积评估值来确定所述候选治疗性靶标。
本发明的另一个目的是通过根据本公开的方法鉴定的用于检测、失活或耗尽肿瘤特异性Treg细胞的分子标志物，其选自表1的基因及其RNA或蛋白质产物。在一些特定的实施方案中，分子标志物是选自下组的细胞表面标志物：ADORA2A、CALR、CCR8、CD4、CD7、CD74、CD80、CD82、CD83、CSF1、CTLA4、CXCR3、HLA-B、HLA-DQA1、HLA-DR，特别是HLA-DRB5、ICAM1、ICOS、IGFLR1、IL12RB2、IL1R2、IL21R、IL2RA、IL2RB、IL2RG、LRRC32、NDFIP2、NINJ1、NTRK1、SDC4、SLC1A5、SLC3A2、SLC7A5、SLCO4A1、TMPRSS6、TNFRSF18、TNFRSF1B、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TSPAN13和TSPAN17；或所述分子标志物是VDR；优选选自下组：CCR8、CD80、ICOS、IL12RB2、CTLA-4、4-1BB(TNFRS9)、TNFRSF18(GITR)、HLA-DR，特别是HLA-DRB5、ICAM1、CSF1、CD74、OX-40(TNFRSF4)、CXCR-3、VDR和TNFR2(TNFRSF1B)；更优选选自下组：CD74、VDR、IL12RB2、HLA-DR，特别是HLA-DRB5、ICAM1和CSF1。
在一些实施方案中，根据本公开的分子标志物是治疗性靶标；优选地，其调节功能性肿瘤特异性Treg细胞的存活力、增殖、稳定性或抑制功能。
本发明的另一个目的是在治疗癌症的方法中用作Treg-失活剂或Treg-耗尽剂的试剂，其中所述试剂是根据本公开的治疗性靶标的调节剂；优选选自下组：有机小分子、适体、抗体、反义寡核苷酸、干扰RNA、核酶和其它激动剂或拮抗剂，例如治疗性靶蛋白的显性失活突变体或功能性片段。
在一些实施方案中，所述试剂是细胞毒性剂，其包含结合表1的肿瘤特异性Treg细胞表面标志物的分子，所述分子与细胞毒性化合物偶联。结合所述肿瘤特异性Treg细胞表面标志物的分子优选是包含抗原结合位点的抗体或其功能片段。来自表1的肿瘤特异性Treg细胞表面标志物优选选自根据本公开的上列肿瘤特异性Treg细胞表面标志物。
在一些实施方案中，所述试剂用于在体内或离体使肿瘤特异性Treg细胞失活或耗尽。
本发明的另一个目的是诊断、预后或监测癌症的体外方法，其包括在来自受试者的肿瘤样品中以及最终还在来自受试者的肿瘤引流淋巴结样品中检测至少一种根据本公开的分子标志物的存在或表达水平的步骤；优选地，其中所述方法还包括基于所述标志物的存在、不存在或表达水平将受试者分类为有利或不利结果类别的步骤。
本发明的另一个目的是工程化的Treg细胞，其对于至少一个表1的上调基因是有缺陷的或其过度表达至少一个表1的下调基因。在具体的实施方案中，工程化的Treg细胞对于至少一种上文列出的根据本公开的肿瘤特异性Treg细胞表面标志物是有缺陷的。
在一些实施方案中，工程化的Treg细胞还包含特异性结合靶抗原的至少一种基因工程化的抗原受体。
发明详述
定义
如本文所用，“调节性T细胞”或“Treg”是指CD4+Foxp3+细胞。
如本文所用，“功能性疾病特异性调节性T细胞”或“FD-Treg”是指不同的CD4+Foxp3+细胞群(或组、亚群或簇)，其与Treg的异质库的区别在于：(i)相比于外周血，其在病变组织中增加；(ii)其在病变组织中富集克隆性扩增的TCR特异性；和(iii)其富集T细胞受体(TCR)触发、细胞活化和扩增的转录组学标签。
如本文所用，“功能性肿瘤特异性调节性T细胞”或“FT-Treg”是指不同且分离的CD4+Foxp3+细胞群(或组、亚群或簇)，其与Treg的异质库的区别在于：(i)其在肿瘤中增加，并且最终也在肿瘤引流淋巴结中增加；(ii)其在病变组织中富集克隆性扩增的TCR特异性；和(iii)其富集T细胞受体(TCR)触发、细胞活化和扩增的转录组学标签。
如本文所用，“基因标签”或“基因表达标签”是指细胞中具有独特特征性基因表达模式的单个或组合的基因组，所述独特特征性基因表达模式由于改变或未改变的生物过程或病原性医学病症而发生。
本文所用的术语“标志物”是指“分子标志物”或“分子标签”，并且是指特定基因或基因产物(RNA或蛋白质)。术语“标志物”包括生物标志物和/或治疗靶标。
如本文所用，“生物标志物”是指过程、事件或条件的独特的生物学或生物学衍生的指示物。
如本文所用，术语“疾病”是指任何免疫病症，例如但不限于：急性或慢性炎性；变应性、自身免疫性或感染性疾病；移植物抗宿主病；移植物排斥反应和癌症。
如本文所用，术语“癌症”是指以细胞不受控制的分裂和这些细胞通过侵入直接生长到邻近组织中或通过转移植入到远处部位中而侵入其它组织的能力为特征的一类疾病或病症的任何成员。转移定义为其中癌细胞通过血流或淋巴系统转运的阶段。根据本发明的术语癌症还包括癌症转移和癌症复发。癌症根据肿瘤相似的细胞类型进行分类，因此，组织被认为是肿瘤的起源。例如，癌是衍生自上皮细胞的恶性肿瘤。该组代表最常见的癌症，包括常见形式的乳腺癌、前列腺癌、肺癌和结肠癌。淋巴瘤和白血病包括衍生自血液和骨髓细胞的恶性肿瘤。肉瘤是衍生自结缔组织或间充质细胞的恶性肿瘤。间皮瘤是衍生自腹膜和胸膜内衬的间皮细胞的肿瘤。神经胶质瘤是衍生自最常见类型的脑细胞的神经胶质的肿瘤。生殖细胞瘤是衍生自生殖细胞的肿瘤，通常在睾丸和卵巢中发现。绒毛膜癌是衍生自胎盘的恶性肿瘤。如本文所用，“癌症”是指任何癌症类型，包括实体和液体肿瘤。
术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用并且是指人和非人动物。如本文所用，术语“患者”表示哺乳动物，例如但不限于啮齿动物、猫科动物、犬科动物、牛科动物、绵羊科动物、马科动物和灵长类动物。优选地，根据本发明的患者是人。
术语“患者样品”是指衍生自患者的任何生物样品。这样的样品的实例包括流体、组织、细胞样品、器官、活组织检查。优选的生物学样品为肿瘤样品。
如本文所用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指逆转、减轻、抑制该术语适用的失调或病症的进展或预防该术语适用的失调或病症，或逆转、减轻、抑制该术语适用的失调或病症的一种或多种症状的进展或预防该术语适用的失调或病症的一种或多种症状。如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”是指预防性或防止性治疗以及治愈性或疾病改善性治疗，包括治疗处于感染疾病风险或怀疑已感染疾病的患者以及患病或已被诊断患有疾病或医学症状的患者，包括抑制临床复发。该治疗可以施用于患有医学病症或最终可能患有该病症的患者，以便预防、治愈、延缓病症或复发性病症的一种或多种症状的发作、减轻其严重程度或改善其症状，或以便延长患者的生存期，使其超过在没有此类治疗的情况下预期的生存期。
“治疗癌症”包括但不限于减少患者中癌细胞的数目或肿瘤的大小、减少癌症向更具侵袭性的形式的进展(即以对治疗剂敏感的形式维持癌症)、减少癌细胞的增殖或降低肿瘤生长的速度、杀死癌细胞、减少癌细胞的转移或降低受试者中癌症复发的可能性。如本文所用的治疗受试者是指对患有癌症或处于发展癌症的风险或面临癌症复发的受试者赋予益处的任何类型的治疗。治疗包括改进受试者的状况(例如，一种或多种症状)、延迟疾病的进展、延迟症状的发作、减缓症状的进展等。
如本文所用，“药物”或“治疗剂”是指当施用于人或动物时提供所需生物学或药理学作用，特别是在机体上产生预期的治疗效果或反应以治疗或预防病症或疾病的化合物或试剂。治疗剂包括任何合适的生物活性化合物或生物衍生组分。
如本文所用，“治疗反应”或“对药物治疗的反应”是指以客观参数或标准为特征的阳性医学反应，所述客观参数或标准诸如疾病的客观临床体征、患者自我报告的参数和/或存活增加。评价对药物治疗的反应的客观标准将因疾病而异，并且本领域技术人员可以通过使用临床得分容易地确定。对药物的阳性医学反应可容易地在本领域熟知的疾病的适当动物模型中验证。
“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另外明确指出。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”或“至少一个”在本文中可互换使用；除非另外规定，否则“或”意指“和/或”。
鉴定功能性疾病特异性Treg及其标志物的方法
本发明涉及鉴定功能性疾病特异性调节性T细胞标志物的方法，其包括以下步骤：
(a)从至少患者病变组织样品和患者外周血样品制备相似比例的分离的调节性T(Treg)细胞和常规T(Tconv)细胞的混合物；
(b)对来自至少病变组织和外周血的分离的Treg和Tconv细胞的每种混合物进行单细胞基因表达谱分析与T细胞受体(TCR)谱分析的组合；
(c)鉴定Treg细胞和Tconv细胞的簇，其中所述簇包含彼此差异表达的基因或基因特征；
(d)在所鉴定的Treg细胞簇中确定至少一个功能性疾病特异性Treg细胞簇，其中所述至少一个簇包含：
(i)相对于外周血，病变组织中具有较高比例的Treg细胞；
(ii)病变组织中具有克隆扩增TCR特异性的较高比例的Treg细胞；以及
(iii)病变组织中具有TCR触发、细胞活化和扩增的转录组特征的较高比例的Treg细胞。
本发明还涉及鉴定功能性疾病特异性调节性T细胞标志物的方法，其包括进行上述鉴定功能性疾病特异性调节性T细胞的方法的步骤(a)至(d)并进行进一步的步骤：
(e)鉴定与所有其它鉴定的Treg和Tconv细胞簇相比在功能性疾病特异性Treg细胞簇中差异表达的基因。
本发明方法与现有技术方法的不同之处在于它们允许鉴定异质性Treg群中功能性疾病特异性Treg，特别是功能性肿瘤特异性Treg的簇。因此，预期通过本发明的方法鉴定的标志物是可靠且是有效的疾病特异性，特别是肿瘤特异性Treg标志物，其可用作有效且选择性的生物标志物、治疗靶标或研究工具。特别地，预期由鉴定的标志物提供的功能性疾病特异性，特别是肿瘤特异性Treg的检测、失活或耗尽、分类或研究是有效的和选择性的，并且比现有技术方法更加高效。
该方法至少在外周血液样品和病变组织样品，特别是肿瘤样品上进行。如本文所用，术语“病变组织”包括病变组织引流淋巴结。因此，除非另有说明，“患者病变组织样品”是指“患者病变组织样品或患者病变组织引流淋巴结样品”。如本文所用，“组织”是指实体组织或组织液。例如，实体组织可以是胰腺组织(糖尿病)、软骨/关节组织(关节炎)、实体瘤组织(癌症)和其它实体组织。组织液包括但不限于：腹水、支气管肺泡灌洗、胸膜灌洗、尿液、胸膜液、脑脊液(CSF)、滑液、心包液、软骨/关节液和腹膜液。如本文所用，“肿瘤”包括肿瘤组织和肿瘤流体。肿瘤组织包括：原发性肿瘤、转移和肿瘤引流淋巴结，特别是转移性肿瘤引流淋巴结。肿瘤流体包括排出肿瘤的所有流体。该方法优选在患者病变组织样品和患者组织引流淋巴结样品上进行，特别是在患者肿瘤组织样品和患者肿瘤引流淋巴结样品上进行。
该方法通常在来自至少2名，优选3名，4名，5名或更多患者的样品上进行。可以单独处理来自每个患者的每个样品，即，该方法在来自单个患者的样品上进行，或者，混合来自不同患者的样品并在患者样品池上进行方法。使用本领域公知的和本申请实施例中公开的标准细胞分离技术，从外周血液和病变组织(病变组织和/或引流淋巴结)，特别是肿瘤(肿瘤和/或引流淋巴结)中分离Treg和Tconv细胞。组织处理后，使用针对特异性细胞表面标志物(例如CD4、CD45、CD25和CD127)的抗体通过FACS分选分离Treg和Tconv。Tregs可以定义为CD45+CD4+CD25hi CD127lo细胞，并且Tconvs定义为CD45+CD4+CD25lo CD127lo/hi。此外，可以使用合适的标志物例如DAPI(活细胞是DAPI-)测量分离细胞的存活力。通常通过FACS分析同时测定样品中Treg和Tconvs的百分比。例如，图1A显示分析的肿瘤样品包含95.1％的Tconvs和4.63％的Tregs。然后将分离的Treg和Tconvs以相似的比例混合以获得混合物。如本文所用，“相似比例”是指Treg和Tconvs以约35％至约65％(35％、40％、45％、50％、55％、60％或65％)的百分比；优选约40％至约60％(40％、45％、50％、55％或60％)；更优选为约45％至约55％，其中混合物中Treg的百分比和Tconvs的百分比之和等于约100％。术语“约”是指可测量的值并且旨在涵盖指定值±0.1％至5％(0.1％；0.5％；1％；1.5％；2％；2.5％；3％；3.5％；4％；4.5％或5％)的变化。混合物包含至少100个细胞，通常500-10000(500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000)个细胞或更多个细胞，包括至少100个Treg细胞，优选至少200、300、400、500或更多个Treg。
在本发明方法的一些实施方案中，所述患者病变组织样品是患者肿瘤样品。
在本发明方法的一些实施方案中，步骤(a)进一步在患者病变组织引流淋巴结样品上进行；优选患者肿瘤-引流淋巴结样品。
在本发明方法的一些实施方案中，分离的Treg是CD45+CD4+CD25hi CD127lo细胞并且分离的Tconvs是CD45+CD4+CD25lo CD127lo/hi细胞；优选地，分离的Treg是DAPI-CD45+CD4+CD25hi CD127lo细胞并且分离的Tconvs是DAPI-CD45+CD4+CD25lo CD127lo/hi细胞。
在一些优选的实施方案中，混合物由等比例的Treg和Tconv组成，这意味着约50％的Tconv细胞和约50％的Treg细胞。
步骤(b)中组合的单细胞基因表达分析和T细胞受体(TCR)分析通过本领域公知的和本申请实施例中公开的标准方法进行。基因表达分析通常基于转录组分析(转录组分析)，优选通过RNA测序技术。RNA-seq(RNA-测序)是可以使用下一代测序(NGS)检查样品中RNA的量和序列的技术。其分析RNA中编码的基因表达模式的转录组。RNA-seq已经适用于单细胞分析，并且单细胞RNAseq首次报道于Tang et al.(Nat.Methods,2009,6,377–382)；综述于Wang et al.,Nature Reviews Genetics,2009,10,57–63和Svensson et al.(NatProtoc.2018Apr；13(4):599-604)。TCR分析包括对单个细胞中成对的TCRα和β链进行测序，以确定通过V(D)J重组的体细胞重排的最终产物，特别包括CDR3序列以及V、J和C区域的使用。转录组和TCR分析可以使用单细胞RNA-seq组合来识别每个细胞的匹配表达谱和TCR。
步骤(c)中包含差异表达的基因或标签的Treg细胞和Tconv细胞的簇(细胞群)的鉴定通过使用本领域公知和本申请实施例中公开的生物信息学方法的sc-RNA-seq转录组数据分析进行。将样品的转录组测序数据使用适当的软件(如Cell Ranger和Seurat)进行处理和整合。可以使用MAST(Finak,McDavid,Yajima et al.,2015)用FindAllMarkers函数鉴定簇之间差异表达的基因(标签)。聚类的结果可以通过UMAP(Uniform ManifoldApproximation and Projection for Dimension Reduction；McInnes,L.and Healy,J.(2018)可视化。簇可仅包含Tconvs，仅包含Tregs或可如图2所示混合。
在一些实施方案中，步骤(c)还包括鉴定包含彼此之间差异表达的基因的Treg和Tconv细胞的混合簇。
步骤(d)中鉴定的Treg细胞簇中功能性疾病特异性Treg细胞簇的测定通过scTCR分析，随后通过TCR扩增分析进行。scTCR分析确定每个组织中的克隆型并分析不同组织之间的克隆型。TCR扩增分析通过组织测定克隆扩增。根据克隆型确定每种组织的细胞数。当克隆包含多于一个细胞时，认为它们是扩增的。计算每个患者的组织扩增克隆的百分比。从scRNA-seq转录组分析和TCR信息获得的配对簇允许通过簇计算具有肿瘤扩增克隆型的细胞的百分比。
功能性肿瘤特异性Treg(FT-Treg)被定义为属于具有所有以下特征的簇(或细胞群)的细胞：(i)CD4+FOXP3+Treg的簇：(i)其在病变组织(特别是肿瘤)中或在引流LN(特别是转移性肿瘤-引流LN)中以高于在血液中的比例被发现(即，其在肿瘤或TDLN中积聚)；(ii)其在具有特异性(TCR)的细胞中富集，所述TCR在来自病变组织(特别是肿瘤)的Treg细胞中克隆性扩增，和(iii)其在具有最近TCR触发、细胞活化和扩增的转录组标签的细胞中富集。在通过其TCR识别抗原，特别是肿瘤抗原后，Treg细胞被激活、分裂和局部积聚。因此，它们的转录组反映了这些生物学途径。例如，通过其TCR识别同源抗原诱导TCR活化下游基因(如REL、NKKB2、NR4A1、OX-40、4-1BB)和Treg活化的已知基因(如MHC II类分子(HLA-DR)、CD39、CD137、GITR)的上调。在一些实施方案中，在病变组织(特别是肿瘤)中，并且最终还在引流LN(特别是肿瘤引流LN，例如转移性肿瘤引流LN)中以高于在血液中的比例发现FT-Treg(即，其在肿瘤中并且最终还在TDLN中积聚)。
在一些实施方案中，步骤(a)和步骤(b)对于每个患者单独进行，并且在步骤(b)中获得的来自所有患者的数据被整合以进行步骤(c)至(e)。
在一些实施方案中，根据本发明鉴定功能性疾病特异性调节性T细胞标志物的方法还包括对用于治疗目的的肿瘤特异性Treg标志物进行鉴定和排序。
-步骤1：鉴定和选择编码细胞膜蛋白的n个差异表达基因的部分；
-步骤2：测定n个所选基因在正常组织中的平均表达水平，并正常组织中从具有最低表达水平的(最好)基因为-1到具有最高表达水平的(最差)基因为-n对每个基因分配至少一个得分A；
-步骤3：测定肿瘤组织中n个所选基因的平均表达水平，并在肿瘤组织中从具有最高表达水平的(最好)基因为+n到具有最低表达水平的(最差)基因为+1对每个基因分配至少一个得分B；
-步骤4：测定除Treg外的正常PBMC的n个所选基因的平均表达水平，并在除Treg外的正常PBMC中从具有最低表达水平的(最好)基因为+n到具有最高表达水平的(最差)基因为+1对每个基因分配至少一个得分C；
-步骤5：测定除Treg外的肿瘤环境的n个所选基因的平均表达水平，并在除Treg外的肿瘤环境中从具有最低表达水平的(最好)基因为+n到具有最高表达水平的(最差)基因为+1对每个基因分配至少一个得分D；
-步骤6：测定i)肿瘤-Treg与正常组织-Treg相比，和ii)Treg与Tconvs相比n个所选基因的相对表达水平，并在i)(得分E)肿瘤Treg与正常相邻组织Treg相比，和ii)(得分F)Treg与Tconvs相比中从具有最高倍数变化表达水平的基因为+n到具有最低倍数变化的基因为+1对每个基因分配两个得分E和F；
-步骤7：对所分配的得分求和以获得每个基因的累积评估值(总得分)；和
-步骤8：基于所述累积评估值来确定所述候选治疗性靶标。
该方法的各个步骤可以使用本领域公知和在本实施例中公开的公知方法来进行。
细胞膜蛋白是指细胞表面蛋白。细胞膜蛋白优选为具有细胞外结构域的跨膜或GPI锚定蛋白。
步骤1可以使用可从公共数据库获得的蛋白质序列注释数据进行，所述公共数据库例如Uniprot、Gene Ontology、人蛋白质图谱等，或可用于确定蛋白质膜定位的各种网络工具。
步骤2可以使用来自可从公共数据库获得的健康(正常)组织中的基因表达谱的数据进行，所述公共数据库例如基因型-组织表达(GTEx)数据库。免疫相关组织如全血和脾可在步骤2中从健康组织中删除，因为它们可在步骤4中更好地评价，如本实施例所公开。
步骤3可以使用来自可从公共数据库获得的肿瘤中基因表达谱的数据进行，所述公共数据库例如癌症基因组图谱(TCGA)RNAseq数据。与正常(健康)组织相比，几种主要癌症，特别是肺癌、乳腺癌和结肠癌中的表达水平的倍数变化可用于给n个靶基因分配得分。
步骤4可以使用来自可从公共数据库获得的正常PBMC中的基因表达谱的数据，优选来自单细胞表达水平的数据进行。优选地，在血液中鉴定步骤(d)中鉴定的功能性肿瘤特异性Treg簇，并从数据集中除去来自该簇的所有细胞。在剩余的细胞上，对步骤(c)中鉴定的每个其它簇单独计算每个靶标的平均表达，然后对每个数据集中的每个靶标计算簇平均值的平均值。
步骤5可以使用来自可从公共数据库获得的肿瘤环境中基因表达谱的数据，优选来自单细胞表达水平的数据进行。有利地使用来自多种肿瘤(NSCLC、乳腺癌、PDAC、黑素瘤、HCC、SCC、BCC等)以及多种细胞类型(所有免疫细胞以及肿瘤细胞、上皮、内皮、癌症相关的成纤维细胞和组织特异性细胞类型)的数据。对于步骤4中的PBMC，可以测定肿瘤环境中每个靶标的平均表达。
步骤6可以使用来自肿瘤Treg和来自肿瘤和正常邻近组织的Tconv中的基因表达谱的数据，例如来自大量RNAseq的数据进行。可以测定2个得分，肿瘤中Treg与Tconv相比表达的倍数变化和肿瘤Treg与正常邻近组织的Treg相比表达的倍数变化。
在步骤7(数据整合)中，对所有得分进行平均(平均值)以对每个参数仅定义一个值。通过将所分配的得分(A、B、C、D和E)求和以获得每个基因的累积评估值(总得分)来确定每个基因的总得分。然后，可以通过它们的总得分对基因进行排序。每个靶标可以在安全性(GTEx平均得分)和兴趣(所有参数的总得分)方面进一步表征。为了定义两者的截止值，可以使用所述活化的Treg靶标的列表(IL2RA、ICOS、TNFRSF18、CCR8、CCR4、CTLA4、HAVCR2、ENTPD1、TNFRSF9)。安全性和兴趣的截止值可以设定为最低等级参考基因的值。
在一些实施方案中，用于治疗目的的肿瘤特异性Treg标志物的上述鉴定和排序方法还包括用结构、功能、试剂的可用性和竞争性格局方面的信息来完成用于治疗性靶向的每个基因的潜能的概况。可以手动整理(数据挖掘)信息并呈现在标准化文件中。
在一些实施方案中，根据本发明的鉴定功能性疾病特异性调节性T细胞标志物的方法还包括以下步骤：
f1)抑制步骤(e)中鉴定的所述分子标志物在功能性疾病特异性(特别是肿瘤特异性)的Treg中的表达或活性或使其失活；和
g1)鉴定由标志物组成的候选治疗靶标，所述标志物的抑制或失活调节所述功能性疾病特异性特别是肿瘤特异性Treg细胞的存活力、增殖、稳定性或抑制功能。
本文所用的“抑制所述分子标志物的表达或活性”包括直接或间接抑制。直接抑制特异性针对分子标志物。间接抑制针对分子标志物生物或信号传导途径的任何效应物，例如但不限于：所述分子标志物的配体或共配体、受体或共受体；所述分子标志物生物或信号传导途径的辅因子或共效应物。例如，如果分子标志物是转录因子或涉及激酶的信号级联下游的分子，则蛋白激酶抑制剂可用于抑制分子标志物。调节可以是增加(刺激)或降低(抑制)所述肿瘤特异性Treg细胞的存活力、增殖或抑制功能。所述肿瘤特异性Treg细胞的存活力、增殖或抑制功能的增加或刺激表明靶标是应当用激活剂靶向的Treg抑制剂。所述肿瘤特异性Treg细胞的存活力、增殖或抑制功能的降低或抑制表明靶标是应当用抑制剂靶向的Treg激活剂。
在一些实施方案中，根据本发明的方法还包括以下步骤：
f2)检测步骤(e)中鉴定的所述分子标志物在功能性疾病特异性，特别是肿瘤特异性Treg上的表面表达；和
g2)鉴定功能性疾病特异性(特别是肿瘤特异性)Treg的细胞表面标志物。在一些优选实施方案中，所述疾病是癌症。优选地，癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)；乳腺癌，皮肤癌，卵巢癌，肾癌和头颈癌；和横纹肌样瘤；更优选非小细胞肺癌(NSCLC)。
在一些实施方案中，所述疾病选自急性或慢性炎性、过敏性疾病、自身免疫性疾病或感染性疾病、移植物抗宿主病、移植排斥反应。自身免疫性疾病的非限制性实例包括：1型糖尿病、类风湿性关节炎、银屑病和银屑病关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮(狼疮)、炎性肠病(诸如克罗恩病和溃疡性结肠炎)、艾迪生病、格雷夫斯病、斯耶格伦病、斑秃、自身免疫性甲状腺病(诸如桥本甲状腺炎)、重症肌无力、血管炎(包括HCV相关的血管炎和系统性血管炎)、葡萄膜炎、肌炎、恶性贫血、乳糜泻、格林-巴利综合征、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、硬皮病、溶血性贫血、肾小球肾炎、自身免疫性脑炎、纤维肌痛、再生障碍性贫血等。炎性疾病和过敏性疾病的非限制性实例包括：神经变性病症(诸如帕金森病)、慢性感染(诸如寄生虫感染)或疾病(如克氏锥虫感染)、过敏(诸如哮喘)、动脉粥样硬化、慢性肾病等。该疾病可以是同种异体移植物排斥，包括移植排斥反应、移植物抗宿主病(GVHD)和自发流产。
上述鉴定功能性疾病特异性特别是肿瘤特异性Treg标志物的方法也可用于将Treg分类为功能性亚群，并从Treg的异质库区分功能性疾病特异性特别是肿瘤特异性Treg簇(FT-Treg)。在一些优选实施方案中，所述疾病是癌症。
功能性肿瘤特异性Treg及其分子标志物
本发明还涉及通过本发明的方法鉴定的功能性肿瘤特异性Treg及其分子标志物，以及它们的各种应用，特别包括作为生物标志物、治疗靶标或研究工具。分子生物标志物特别用于功能性肿瘤特异性Treg的检测、失活或耗尽、分类或研究。
特别地，本发明涉及功能性肿瘤特异性Treg的基因标签，其包含表1中所列上调和下调基因的组合。
本发明涉及具有表1所示基因标签的分离的功能性肿瘤特异性Treg群。
本发明还涉及选自表1的基因及其RNA或蛋白质产物的功能性肿瘤特异性Treg的分子标志物。
表1提供了功能性肿瘤特异性Treg的分子标志物的列表(第1栏)；人基因ID号(第2栏)；公共序列数据库中人mRNA(第3栏)和蛋白质序列(第4和5栏)的登录号的说明性实例；上调(+)或下调基因(-)(第6栏)；细胞膜状态(第7栏)；细胞跨膜状态(第8栏)和细胞表面表达(第9栏)。本发明涵盖所述基因或基因产物的功能性变体，例如由遗传多态性产生的变体。表1中列出的179个基因在FT-Treg中都是上调的，除了下调的4个基因：PPP2R5C、MT-ND4(同义词：ND4)、GIMAP7、GIMAP4。
在一些实施方案中，分子标志物是功能性肿瘤特异性Treg的细胞表面标志物。这种标志物可用于用包含抗原结合位点的抗体或其功能片段或衍生物检测或靶向(活化/失活或耗尽)肿瘤特异性Treg。
在一些优选实施方案中，功能性肿瘤特异性Treg的细胞表面标志物选自表1的列表，所述功能性肿瘤特异性Treg的细胞表面标志物选自由以下组成的组或包含以下：ADORA2A、CALR、CCR8、CD4、CD7、CD74、CD80、CD82、CD83、CSF1、CTLA4、CXCR3、HLA-B、HLA-DQA1、HLA-DR、特别是HLA-DRB5、ICAM1、ICOS、IGFLR1、IL12RB2、IL1R2、IL21R、IL2RA、IL2RB、IL2RG、LRRC32、NDFIP2、NINJ1、NTRK1、SDC4、SLC1A5、SLC3A2、SLC7A5、SLCO4A1、TMPRSS6、TNFRSF18、TNFRSF1B、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TSPAN13和TSPAN17；优选CCR8、CD80、ICOS、IL12RB2、CTLA-4、4-1BB(TNFRS9)、TNFRSF18(GITR)、HLA-DR、特别是HLA-DRB5、ICAM1、CSF1、CD74、OX-40(TNFRSF4)、CXCR-3和TNFR2(TNFRSF1B)；更优选CD74、IL12RB2、HLA-DR、特别是HLA-DRB5、ICAM1和CSF1。
在一些特定的实施方案中，功能性肿瘤特异性Treg的细胞表面标志物选自表1和表2的列表，所述功能性肿瘤特异性Treg的细胞表面标志物选自由以下组成的组或包含以下：CD177、CCR8、CD80、ICOS、CD39(ENTPD1)、HAVCR2(TIM3)、IL2RA、IL12RB2、CTLA-4、4-1BB(TNFRS9)、TNFRSF18(GITR)、HLA-DR、ICAM1、CSF1、CD74、OX-40(TNFRSF4)、CXCR-3、CCR4和TNFR2(TNFRSF1B)；优选CD177、CCR8、CD80、ICOS、CD39、IL12RB2、CTLA-4、4-1BB(TNFRS9)、TNFRSF18(GITR)、HLA-DR、ICAM1、CSF1、CD74、OX-40(TNFRSF4)、CXCR-3和TNFR2(TNFRSF1B)。
Treg上标志物的细胞表面表达可以通过本领域已知和在本申请的实施例中公开的标准测定来测试，例如使用针对标志物的细胞外结构域的抗体的FACS分析。
在一些具体实施方案中，分子标志物选自：CD177、CCR8、CD80、ICOS、CD39(ENTPD1)、HAVCR2(TIM3)、IL2RA、IL12RB2、CTLA-4、4-1BB(TNFRS9)、TNFRSF18(GITR)、HLA-DR、ICAM1、CSF1、CD74、OX-40(TNFRSF4)、CXCR-3、VDR、CCR4和TNFR2(TNFRSF1B)；优选CD177、CCR8、CD80、ICOS、CD39、IL12RB2、CTLA-4、4-1BB(TNFRS9)、TNFRSF18(GITR)、HLA-DR、ICAM1、CSF1、CD74、OX-40(TNFRSF4)、CXCR-3、VDR和TNFR2(TNFRSF1B)。
在一些优选实施方案中，分子标志物选自：CCR8、CD80、ICOS、IL12RB2、CTLA-4、4-1BB(TNFRS9)、TNFRSF18(GITR)、HLA-DR、特别是HLA-DRB5、ICAM1、CSF1、CD74、OX-40(TNFRSF4)、CXCR-3、VDR和TNFR2(TNFRSF1B)；更优选CD74、VDR、IL12RB2、HLA-DR、特别是HLA-DRB5、ICAM1和CSF1。
在一些实施方案中，功能性肿瘤特异性Treg的标志物是候选治疗靶标。特别地，功能性肿瘤特异性Treg的标志物调节功能性肿瘤特异性Treg细胞的存活力、增殖、去稳定和/或抑制功能。该候选治疗靶标可以通过本领域已知和本申请的实施例中公开的标准测定来确定。Treg去稳定公开于Munn et al.、Cancer Res.、2018、78、18、5191-5199。
例如，可以使用包括以下步骤的方法选择候选治疗靶标：
a)抑制所述分子标志物在功能性疾病特异性(特别是肿瘤特异性)Treg中的表达或活性或使其失活；和
b)鉴定由标志物组成的候选治疗靶标，所述标志物的抑制或失活调节所述功能性疾病特异性(特别是肿瘤特异性)Treg细胞的存活力、增殖、稳定性或抑制功能。
调节可以是增加(刺激)或降低(抑制)所述肿瘤特异性Treg细胞的存活力、增殖、抑制功能或稳定性。所述肿瘤特异性Treg细胞的存活力、增殖、稳定性或抑制功能的增加或刺激表明靶标是应当用激活剂靶向的Treg抑制剂。所述肿瘤特异性Treg细胞的存活力、增殖、稳定性或抑制功能的降低或抑制表明靶标是应当用抑制剂靶向的Treg激活剂。
表1中上调的标志物是应当用抑制剂靶向的候选Treg激活剂。来自表1下调的标志物是应当用激活剂靶向的候选Treg抑制剂。在一些优选实施方案中，候选治疗靶标选自：CD74、维生素D受体(VDR)和其它；优选CD74、VDR、IL12RB2、HLA-DR，特别是HLA-DRB5、ICAM1和CSF1。
例如，CD74的抑制可以通过用小分子或抗MIF抗体阻断其共受体MIF来进行。VDR的抑制可以通过抑制VDR信号传导途径(VDR之外)来进行。
在一些具体的实施方案中，治疗靶标是选自表1和表2的列表的功能性肿瘤特异性Treg的细胞表面标志物，所述治疗靶标选自由以下组成的组或包含以下：CD177、CCR8、CD80、ICOS、CD39、HAVCR2(TIM3)、IL2RA、IL12RB2、CTLA-4、4-1BB(TNFRS9)、TNFRSF18(GITR)、HLA-DR、ICAM1、CSF1、CD74、OX-40(TNFRSF4)、CXCR-3、CCR4和TNFR2(TNFRSF1B)；优选CD177、CCR8、CD80、ICOS、CD39、IL12RB2、CTLA-4、4-1BB(TNFRS9)、TNFRSF18(GITR)、HLA-DR、ICAM1、CSF1、CD74、OX-40(TNFRSF4)、CXCR-3和TNFR2(TNFRSF1B)。
在一些优选实施方案中，治疗靶标是选自表1列表的功能性肿瘤特异性Treg的细胞表面标志物，所述治疗靶标选自由以下组成的组或包含以下：ADORA2A、CALR、CCR8、CD4、CD7、CD74、CD80、CD82、CD83、CSF1、CTLA4、CXCR3、HLA-B、HLA-DQA1、HLA-DR、特别是HLA-DRB5、ICAM1、ICOS、IGFLR1、IL12RB2、IL1R2、IL21R、IL2RA、IL2RB、IL2RG、LRRC32、NDFIP2、NINJ1、NTRK1、SDC4、SLC1A5、SLC3A2、SLC7A5、SLCO4A1、TMPRSS6、TNFRSF18、TNFRSF1B、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TSPAN13和TSPAN17；优选CCR8、CD80、ICOS、IL12RB2、CTLA-4、4-1BB(TNFRS9)、TNFRSF18(GITR)、HLA-DR、特别是HLA-DRB5、ICAM1、CSF1、CD74、OX-40(TNFRSF4)、CXCR-3和TNFR2(TNFRSF1B)；更优选CD74、IL12RB2、HLA-DR、特别是HLA-DRB5、ICAM1和CSF1。
在一些具体实施方案中，治疗靶标选自：CD177、CCR8、CD80、ICOS、CD39(ENTPD1)、HAVCR2(TIM3)、IL2RA、IL12RB2、CTLA-4、4-1BB(TNFRS9)、TNFRSF18(GITR)、HLA-DR、ICAM1、CSF1、CD74、OX-40(TNFRSF4)、CXCR-3、VDR、CCR4和TNFR2(TNFRSF1B)；优选CD177、CCR8、CD80、ICOS、CD39、IL12RB2、CTLA-4、4-1BB(TNFRS9)、TNFRSF18(GITR)、HLA-DR、ICAM1、CSF1、CD74、OX-40(TNFRSF4)、CXCR-3、VDR和TNFR2(TNFRSF1B)。
在一些具体实施方案中，治疗靶标选自：CCR8、CD80、ICOS、IL12RB2、CTLA-4、4-1BB(TNFRS9)、TNFRSF18(GITR)、HLA-DR、特别是HLA-DRB5、ICAM1、CSF1、CD74、OX-40(TNFRSF4)、CXCR-3、VDR和TNFR2(TNFRSF1B)；更优选CD74、VDR、IL12RB2、HLA-DR、特别是HLA-DRB5、ICAM1和CSF1。
本发明还涵盖包含功能性肿瘤特异性Treg的至少2个，例如2-10个(2、3、4、5、6、7、8、9、10)或更多个标志物的标志物组合。在一些实施方案中，所述组合包含至少2个来自表1或表1和表2的不同标志物，优选选自功能性肿瘤特异性Treg的上述细胞表面标志物。在一些优选实施方案中，所述组合包含2-10个(2、3、4、5、6、7、8、9、10)或更多个来自表1或表1和表2的标志物，优选选自功能性肿瘤特异性Treg的上述细胞表面标志物。在一些实施方案中，标志物的组合是生物功能、途径(例如代谢状态、抑制性细胞因子的产生或其它)的簇标签；或转录因子和上游调节子的簇标签。
癌症的诊断、预后、监测
Treg主动抑制抗肿瘤免疫应答，并且在许多人癌症中发现Treg的频率升高，并且与不良的临床结果相关。因此，根据本发明的功能性肿瘤特异性Treg及其标志物(包括所述标志物的组合)可用作癌症诊断、预后和监测的生物标志物。
因此，本发明涉及根据本公开的功能性肿瘤特异性Treg或其标志物或标志物组合作为用于诊断、预后和监测癌症的生物标志物的体外用途。
本发明还涉及癌症的体外诊断、预后或监测方法，包括在来自受试者的肿瘤样品中检测根据本公开的功能性肿瘤特异性Treg的存在的步骤。可以根据本公开的FT-Treg的鉴定方法的步骤(a)至(d)进行检测。检测可以是半定量或定量的，并且可以包括检测功能性肿瘤特异性Treg的存在或水平。
本发明还涉及癌症的体外诊断、预后或监测方法，其包括在来自受试者的肿瘤样品中检测根据本公开的功能性肿瘤特异性Treg的至少一种标志物的表达的步骤。
在一些实施方案中，功能性肿瘤特异性Treg的分子标志物选自表1的基因及其RNA或蛋白质产物。
在一些特定的实施方案中，分子标志物是选自表1和表2的列表的功能性肿瘤特异性Treg的细胞表面标志物，所述治疗靶标选自由以下组成的组或包含以下：CD177、CCR8、CD80、ICOS、CD39、HAVCR2(TIM3)、IL2RA、IL12RB2、CTLA-4、4-1BB(TNFRS9)、TNFRSF18(GITR)、HLA-DR、ICAM1、CSF1、CD74、OX-40(TNFRSF4)、CXCR-3、CCR4和TNFR2(TNFRSF1B)；优选CD177、CCR8、CD80、ICOS、CD39、IL12RB2、CTLA-4、4-1BB(TNFRS9)、TNFRSF18(GITR)、HLA-DR、ICAM1、CSF1、CD74、OX-40(TNFRSF4)、CXCR-3和TNFR2(TNFRSF1B)。
在一些具体实施方案中，所述分子是选自表1列表的功能性肿瘤特异性Treg的细胞表面标志物，所述治疗靶标选自：ADORA2A、CALR、CCR8、CD4、CD7、CD74、CD80、CD82、CD83、CSF1、CTLA4、CXCR3、HLA-B、HLA-DQA1、HLA-DR如HLA-DRB5、ICAM1、ICOS、IGFLR1、IL12RB2、IL1R2、IL21R、IL2RA、IL2RB、IL2RG、LRRC32、NDFIP2、NINJ1、NTRK1、SDC4、SLC1A5、SLC3A2、SLC7A5、SLCO4A1、TMPRSS6、TNFRSF18、TNFRSF1B、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TSPAN13和TSPAN17；优选CCR8、CD80、ICOS、IL12RB2、CTLA-4、4-1BB(TNFRS9)、TNFRSF18(GITR)、HLA-DR如HLA-DRB5、ICAM1、CSF1、CD74、OX-40(TNFRSF4)、CXCR-3和TNFR2(TNFRSF1B)；更优选CD74、IL12RB2、HLA-DR如HLA-DRB5、ICAM1和CSF1。
在一些具体实施方案中，分子标志物选自：CD177、CCR8、CD80、ICOS、CD39(ENTPD1)、HAVCR2(TIM3)、IL2RA、IL12RB2、CTLA-4、4-1BB(TNFRS9)、TNFRSF18(GITR)、HLA-DR、ICAM1、CSF1、CD74、OX-40(TNFRSF4)、CXCR-3、VDR、CCR4和TNFR2(TNFRSF1B)；优选CD177、CCR8、CD80、ICOS、CD39、IL12RB2、CTLA-4、4-1BB(TNFRS9)、TNFRSF18(GITR)、HLA-DR、ICAM1、CSF1、CD74、OX-40(TNFRSF4)、CXCR-3、VDR和TNFR2(TNFRSF1B)。
在一些优选实施方案中，分子标志物选自：CCR8、CD80、ICOS、IL12RB2、CTLA-4、4-1BB(TNFRS9)、TNFRSF18(GITR)、HLA-DR、特别是HLA-DRB5、ICAM1、CSF1、CD74、OX-40(TNFRSF4)、CXCR-3、VDR和TNFR2(TNFRSF1B)；更优选CD74、VDR、IL12RB2、HLA-DR、特别是HLA-DRB5、ICAM1和CSF1。
在一些实施方案中，所述方法包括检测来自表1的至少2个不同标志物的组合。在一些特定的实施方案中，来自表1的至少2个不同标志物的组合包含至少一个如上所列的来自表1或表1和表2的分子标志物，优选至少一个如上所列的细胞表面标志物。
在一些实施方案中，在根据本公开的FT-Treg的鉴定方法的步骤(a)至(d)鉴定的FT-Treg的亚群中检测分子标志物。
检测可以是半定量或定量的，并且可以包括检测标志物的存在或表达水平。可以对整个肿瘤或包含Treg或由Treg组成的分离细胞的部分进行检测。可以以RNA或蛋白质水平测定表达。表达水平可以指标志物RNA或蛋白质的量或表达所述RNA或蛋白质的细胞数。将待分析的测试样品中的表达水平与预定值或与用平行测试的对照样品获得的值进行比较。典型地，如果所述患者中所述标志物的表达水平与所述预定值的表达水平的比率高于或低于1.2，优选1.5，甚至更优选2，甚至更优选5、10或20，则认为患者样品中的表达水平高于或低于从一般群体或从健康受试者获得的预定值。
如本文所用，术语“标志物的预定值”是指从一般群体或从选定的受试者群体获得的生物样品中的标志物的量。例如，一般人群可以包括表面健康的受试者，例如之前没有任何体征或症状表明存在癌症的个体。本文所用的术语“健康受试者”是指未患有任何已知病症，特别是未患有任何癌症的受试者群体。在另一个实例中，预定值可以是从具有确定的癌症但是当用癌症药物治疗时显示出癌症类型的临床上显著的缓解的选定的受试者群体获得的标志物的量。预定值可以是阈值或范围。预定值可以基于表面健康的受试者和患有确定的癌症的受试者之间的比较测量来确定。
所述标志物的表达可以通过技术人员已知的任何合适的方法来测定。通常，这些方法包括测定mRNA或蛋白质的数量。用于测定mRNA量的方法是本领域熟知的。例如，首先根据标准方法提取，例如使用裂解酶或化学溶液，或根据制造商的说明书通过核酸结合树脂提取样品中所含的mRNA。然后通过杂交(例如，Northern印迹分析)和/或扩增(例如，RT-PCR)检测提取的mRNA。优选定量或半定量RT-PCR。在一个优选实施方案中，通过RNAseq方法，更优选通过单细胞RNA-seq测量mRNA表达水平。RNAseq可用于分析细胞转录组。RNAseq，优选单细胞RNAseq可以在例如本申请实施例中公开的板、微孔或纳米孔、基于液滴的微流体、微流体、管中进行。
蛋白质表达可以通过技术人员已知的任何合适的方法测定。通常，这些方法包括使细胞样品，优选细胞裂解物与能够选择性地与样品中存在的蛋白质相互作用的结合配偶体接触。结合配偶体通常是多克隆或单克隆抗体，优选单克隆抗体。蛋白质的量可以例如通过半定量Western印迹、酶标志物和介导的免疫测定如ELISA、生物素/抗生物素蛋白型测定、放射免疫测定、免疫电泳或免疫沉淀或通过蛋白质或抗体阵列来测量。反应通常包括显示标志物，如荧光、化学发光、放射性、酶标志物或染料分子，或其它用于检测抗原和与其反应的一种或多种抗体之间复合物形成的方法。
在上述癌症诊断、预后或监测方法的一些实施方案中，检测步骤进一步在来自受试者的肿瘤引流淋巴结样品和/或血液样品上进行。血液样品可用作对照。
在一些实施方案中，所述方法包括检测来自受试者的肿瘤样品中，并且最终还检测肿瘤引流淋巴结样品和/或血液样品中标志物的表达水平。
患者样品中标志物的存在或水平指示在经历癌症治疗之前或在癌症治疗过程中患者的癌症的不利结果。不利的结果包括患者的存活时间减少、癌症的肿瘤进展增加、转移增加或复发增加中的一种或多种。
在一些实施方案中，所述方法还包括从所述标志物的存在、不存在或表达水平确定患者中癌症的结果是有利的还是不利的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括基于患者肿瘤样品中功能性肿瘤特异性Treg的所述标志物的存在、不存在或表达水平将患者分类为有利或不利结果类别的步骤。
该步骤通过确定处于不利结果风险中并应受益于更积极或靶向治疗的患者来改进治疗。
在一些实施方案中，标志物是治疗靶标或治疗靶标的组合，特别是选自表1或表1和表2中所列的治疗靶标；更优选来自如上所列的表1或表1和表2的细胞表面标志物。在该实施方案中，患者样品中标志物的存在或水平指示患者是靶向所述治疗靶标的疗法的应答者。该方法通过在施用所述治疗之前确定可能是治疗的应答者的患者而提高了癌症治疗的效率。
如本文所用，术语“癌症”是指可影响以下组织或器官中的任一种的任何癌症：乳房；肝脏；肾脏；心脏，纵隔，胸膜；口底；唇部；唾液腺；舌部；齿龈；口腔；腭；扁桃体组织；喉；气管；支气管，肺；咽，下咽，口咽，鼻咽；食道；消化器官，诸如胃、肝内胆管、胆道、胰腺、小肠、结肠；直肠；泌尿器官，诸如膀胱、胆囊、输尿管；直肠乙状结肠接合部；肛门，肛管；皮肤；骨；关节，四肢关节软骨；眼和附件；大脑；外周神经，自主神经系统；脊髓，颅神经，脑膜；以及中枢神经系统的各个部分；结缔组织，皮下组织和其他软组织；腹膜后腔，腹膜；肾上腺；甲状腺；内分泌腺及相关结构；女性生殖器官，诸如卵巢、子宫、子宫颈；子宫体，阴道，外阴；男性生殖器官，诸如阴茎、睾丸和前列腺；造血和网状内皮系统；血液；淋巴结；胸腺。
根据本发明的术语“癌症”包括白血病、精原细胞瘤、黑素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤、腺癌、间皮瘤(包括胸膜间皮瘤、腹膜间皮瘤、心包间皮瘤和末期间皮瘤)、直肠癌、子宫内膜癌、甲状腺癌(包括乳头状甲状腺癌、滤泡性甲状腺癌、髓样甲状腺癌、未分化甲状腺癌、多发性内分泌腺瘤2A型、多发性内分泌腺瘤2B型、家族性髓样甲状腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤)、皮肤癌(包括恶性黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波济氏肉瘤、角化棘皮瘤、痣、发育不良痣、脂肪瘤、血管瘤和皮肤纤维瘤)、神经系统癌、脑癌(包括星形细胞瘤、髓母细胞瘤、神经胶质瘤、低级神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤(松果体瘤)、多形性胶质母细胞瘤、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤、脊髓神经纤维瘤、胶质瘤或肉瘤)、颅骨癌(包括骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄色瘤或变形骨炎)、脑膜癌(包括脑膜瘤、脑膜肉瘤或胶质瘤病)、头颈癌(包括头颈鳞状细胞癌和口腔癌(例如，口腔癌、唇癌、舌癌、口癌或咽癌))、淋巴结癌、胃肠癌、肝癌(包括肝细胞瘤、肝细胞癌、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤和血管瘤)、结肠癌、胃(stomach)癌或胃(gastric)癌、食道癌(包括鳞状细胞癌、喉、腺癌、平滑肌肉瘤或淋巴瘤)、结肠直肠癌、肠癌、小肠(small bowel)癌或小肠(small intestines)癌(例如，腺癌淋巴瘤、类癌瘤、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤或纤维瘤)、大肠(large bowel)癌或大肠(large intestines)癌(例如，腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤或平滑肌瘤)、胰腺癌(包括导管腺癌、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌鼻喉(ENT)癌、乳腺癌(包括富含HER2的乳腺癌、腔A型乳腺癌、腔B型乳腺癌和三阴性乳腺癌)、子宫癌(包括子宫内膜癌(诸如子宫内膜癌)、子宫内膜间质肉瘤和恶性混合性米勒管瘤、子宫肉瘤、平滑肌肉瘤和妊娠滋养细胞疾病)、卵巢癌(包括无性细胞瘤、颗粒-膜细胞瘤和支持间质细胞瘤)、子宫颈癌、阴道癌(包括鳞状细胞阴道癌、阴道腺癌、透明细胞阴道腺癌、阴道生殖细胞瘤、阴道葡萄状肉瘤和阴道黑色素瘤)、外阴癌(包括鳞状细胞外阴癌、疣状外阴癌、外阴黑色素瘤、基底细胞外阴癌、前庭大腺癌、外阴腺癌和增殖性红斑)、生殖泌尿道癌、肾癌(包括透明肾细胞癌、嫌色肾细胞癌、乳头状肾细胞癌、腺癌、威姆尔氏瘤、肾母细胞瘤，淋巴瘤或白血病)、肾上腺癌、膀胱癌、尿道癌(例如，鳞状细胞癌、移行细胞癌或腺癌)、前列腺癌(例如，腺癌或肉瘤)和睾丸癌(例如，精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎性癌、畸胎瘤、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤或脂肪瘤)、肺癌(包括小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)，包括鳞状细胞肺癌、肺腺癌(LUAD)和大细胞肺癌、支气管癌、肺泡癌、细支气管癌、支气管腺瘤、肺肉瘤、软骨瘤性错构瘤和胸膜间皮瘤)、肉瘤(包括阿金氏肿瘤、类肉瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤和软组织肉瘤)、软组织肉瘤(包括肺泡软部肉瘤、血管肉瘤、叶状囊性肉瘤、突起性皮肤纤维肉瘤、硬纤维瘤、结缔组织增生性小圆细胞瘤、上皮样肉瘤、骨外软骨肉瘤、骨外骨肉瘤、纤维肉瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴肉瘤、恶性外周神经鞘瘤(MPNST)、神经纤维肉瘤、丛状纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤和未分化的多形性肉瘤、心脏癌(包括肉瘤，例如血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤或脂肪肉瘤、粘液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤)、骨癌(包括成骨性肉瘤、骨肉瘤、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因肉瘤、恶性淋巴瘤和网状细胞肉瘤、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤、骨软骨外生骨疣、良性软骨瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液样纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤)、血液和淋巴癌、血液癌(包括急性髓细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤和脊髓发育不良综合征)、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤和多毛细胞和淋巴障碍、及其转移。
在一些实施方案中，癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)；乳腺癌，皮肤癌，卵巢癌，肾癌和头颈癌；和横纹肌样瘤；优选非小细胞肺癌(NSCLC)。
癌症治疗
Treg主动抑制抗肿瘤免疫应答并且耗尽/失活Treg已被证明对于增加抗肿瘤应答非常有价值。因此，根据本公开的作为候选治疗靶标的功能性肿瘤特异性Treg的标志物可用于开发新的抗癌剂和癌症疗法，包括例如基于细胞疗法(包括过继性细胞疗法)、基于诱导Treg细胞的选择性耗尽或功能性改变的抗体、细胞因子或化学药品的方法。选择性抑制肿瘤特异性Treg，同时保留来自健康组织的效应T细胞和Treg(维持免疫稳态和控制自身免疫)，代表了更有效和更安全的策略，其应导致有效抗肿瘤免疫的增强，而不引起全身性自身免疫。
因此，本发明涉及在治疗癌症的方法中用作Treg失活剂或Treg耗尽剂的试剂或试剂组合。
在一些实施方案中，所述试剂是根据本公开的治疗靶标的调节剂，其用于使Treg失活。
在一些实施方案中，治疗靶标选自表1或表1和表2的基因，以及它们的RNA或蛋白质产物。在一些特定的实施方案中，治疗靶标选自如上列出的表1或表1和表2的细胞表面标志物，以及它们的RNA或蛋白质产物。在一些优选实施方案中，治疗靶标选自包含以下的组：CD74、维生素D受体(VDR)和其它；更优选CD74、VDR、IL12RB2、HLA-DR，特别是HLA-DRB5、ICAM1和CSF1。
在一些实施方案中，试剂组合包含靶向选自表1或表1和表2的至少2个不同基因(包括其RNA或蛋白质产物)的治疗靶标的调节剂的组合。在一些特定的实施方案中，所述组合靶向至少一个如上列出的表1或表1和表2的细胞表面标志物及其RNA或蛋白质产物。
调节剂可抑制或刺激治疗性靶标的活性或表达。本文所用的“抑制或刺激所述分子标志物的表达或活性”包括直接或间接的抑制或刺激。直接抑制或刺激特异性针对分子标志物。间接抑制或刺激针对分子标志物生物或信号传导途径的任何效应物，例如但不限于：所述分子标志物的配体或共配体、受体或共受体；所述分子标志物生物或信号传导途径的辅因子或共效应物。例如，可以通过使用小分子或抗MIF抗体来抑制作为MIF共受体的CD74功能。VDR的抑制可以通过抑制VDR信号传导途径(VDR之外)来进行。
调节剂抑制或降低(功能性)肿瘤特异性Treg细胞的存活力、增殖、稳定性和/或抑制功能。试剂对治疗靶标的表达或活性的抑制或刺激活性或其对(功能性)肿瘤特异性Treg细胞的存活力、增殖、稳定性和/或抑制功能的抑制或降低活性可以通过本领域已知和本申请的实施例中公开的标准测定来测试。
在一些优选实施方案中，调节剂抑制或刺激治疗靶标的活性。活性调节剂可以选自：小有机分子、适体、抗体和其它激动剂或拮抗剂，例如治疗靶蛋白的显性失活突变体或功能片段。
术语“有机小分子”是指大小与药物中通常使用的有机分子相当的分子。该术语不包括生物大分子(例如，蛋白质，核酸等)。优选的有机小分子的大小为至多约5000Da，更优选至多2000Da，最优选至多约1000Da。各种有机小分子抑制剂或拮抗剂是本领域已知的。新的小分子抑制剂的鉴定可以根据本领域的经典技术实现。目前鉴定命中化合物的主要方法是通过使用高通量筛选(HTS)。
适体是一类在分子识别方面代表抗体的替代物的分子。适体是能够以高亲和力和特异性识别几乎任何种类的靶分子的寡核苷酸或寡肽序列。这种配体可以通过随机序列文库的指数富集(SELEX)系统进化配体来分离，如Tuerk C.和Gold L.,1990所述，并且可以任选地进行化学修饰。
如本文所用，术语“抗体”是指包括免疫球蛋白的至少一个抗原结合区的蛋白质。抗原结合区可以包含一个或两个可变结构域，例如VH结构域和V结构域或单个VHH或VNAR结构域。术语“抗体”涵盖任何同种型的全长免疫球蛋白，包含至少抗原结合区的其功能片段及其衍生物。抗体的抗原结合片段包括例如Fv、scFv、Fab、Fab’、F(ab')2、Fd、Fabc和sdAb(VHH、V-NAR)。抗体衍生物包括但不限于多特异性或多价抗体、内抗体和免疫缀合物。内抗体是在同一细胞中产生后在细胞内与其抗原结合的抗体(综述参见例如Marschall AL,Dübel S and
Figure BDA0003881277930000331
T“Specific in vivo knockdown of protein function byintrabodies”,MAbs.2015；7(6):1010-35)。抗体可以是糖基化的。抗体对于抗体依赖性细胞毒性和/或补体介导的细胞毒性可以是功能性的，或者对于这些活性中的一种或两种可以是非功能性的。抗体通过本领域熟知的标准方法制备，如杂交瘤技术、选择性淋巴细胞抗体法(SLAM)、转基因动物、重组抗体文库或合成生产。
在一些特定实施方案中，调节剂抑制治疗靶标的活性。
在一些其它特定实施方案中，调节剂抑制治疗靶标的表达。在一些优选实施方案中，抑制剂选自：反义寡核苷酸、干扰RNA分子、核酶和基因组或表观基因组编辑系统。
反义寡核苷酸是RNA、DNA或混合的，并且可以被修饰。干扰RNA分子包括但不限于siRNA、shRNA和miRNA。基因组和表观基因组编辑系统可以基于任何已知的系统，例如CRISPR/Cas、TALEN、锌指核酸酶和大范围核酸酶。反义寡核苷酸、干扰RNA分子、核酶、基因组和表观基因组编辑系统是本领域公知的，并且根据这些技术，使用本领域公知的治疗靶标的序列，可以容易地设计本发明的治疗靶标的抑制剂。
在一些其他实施方案中，所述试剂包含与根据本公开的功能性肿瘤特异性Treg的细胞表面标志物结合的分子和使Treg失活或不稳定的化合物，所述化合物用于使Treg失活。
结合功能性肿瘤特异性Treg的所述细胞表面标志物的分子优选是包含抗原结合位点的抗体或其功能性片段。抗体针对功能性肿瘤特异性Treg的细胞表面标志物的细胞外结构域。
使Treg失活或不稳定的化合物是本领域公知的，并且包括但不限于调节Treg相关途径的化学药品，如环磷酰胺(Lutsiak et al.,Blood,2005,105,2862–2868)、氟达拉滨、吉西他滨和米托蒽醌(Dwarakanath et al.,Cancer Rep.,2018,1,e21105；Wang et al.,Cell Rep.,2018,23,3262–3274)；耗尽Treg的抗体(如抗CTLA-4、抗CD25、抗CCR5、抗CCR4；Dwarakanath et al.,Cancer Rep.,2018,1,e21105)；细胞因子和修饰的细胞因子，包括例如高剂量IL-2(刺激癌症中的效应细胞)和对Treg或效应细胞具有特异性选择性的IL-2衍生物(IL-2/抗IL-2复合物，聚乙二醇化IL-2；表面重构的IL-2变体(Pérol,L.,Piaggio,E.,2016.New Molecular and Cellular Mechanisms of Tolerance:Tolerogenic Actionsof IL-2,in:Cuturi,M.C.,Anegon,I.(Eds.),Suppression and Regulation of ImmuneResponses.Springer New York,New York,NY,pp.11–28)。
所述试剂可以是免疫缀合物、双特异性抗体或抗体，其与抑制Treg的蛋白质化合物(如细胞因子)或修饰的细胞因子包括例如对Treg或效应细胞具有特异性选择性的IL-2和IL-2衍生物(IL-2/抗IL-2复合物、表面重构的IL-2变体)融合。
在一些其他实施方案中，所述试剂是细胞毒性剂，其包含与根据本公开的功能性肿瘤特异性Treg的细胞表面标志物结合的分子和用于耗尽Treg的细胞毒性化合物。
结合功能性肿瘤特异性Treg的所述细胞表面标志物的分子优选是包含抗原结合位点的抗体或其功能性片段。抗体针对功能性肿瘤特异性Treg的细胞表面标志物的细胞外结构域。细胞毒性化合物是用于免疫毒素(如毒素、抗生素、放射性同位素和溶核酶)的任何细胞毒性化合物。
在一些其他实施方案中，所述试剂是针对根据本公开的功能性肿瘤特异性Treg的细胞表面标志物的细胞毒性抗体，其用于耗尽Treg。细胞毒性抗体可具有CDC或ADCC活性。
在一些实施方案中，试剂通过重组载体递送。重组载体包括用于基因工程和基因治疗的常用载体，包括例如质粒和病毒载体。
试剂可用于在体内或离体(基于细胞的疗法)失活或耗尽肿瘤特异性Treg细胞。基于细胞的疗法包括使用本领域熟知的标准方法从患者肿瘤活检组织制备肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。TIL通常在用根据本发明的失活或耗尽患者肿瘤中存在的功能性肿瘤特异性Treg的试剂治疗之前在体外扩增。治疗后，将TIL再注射给患者。
本发明还涵盖对至少一个表1或表1和表2的上调基因有缺陷的，或过表达至少一个表1或表1和表2的下调基因，特别是至少一个如上列出的表1或表1和表2的细胞表面标志物的工程化Treg细胞。根据本公开的Treg的遗传修饰导致有效抗肿瘤免疫的增强，而不引起全身性自身免疫。
在一些实施方案中，工程化Treg细胞还包含特异性结合靶抗原的至少一种基因工程化的抗原受体。靶抗原优选在癌细胞中表达和/或是通用肿瘤抗原。基因工程化抗原受体优选为嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
本发明还涉及产生根据本公开的工程化Treg细胞的方法，其包括以下步骤：破坏Treg细胞中至少一个表1或表1和表2的上调基因，或引入表1或表1和表2的下调基因，特别是如上列出的表1或表1和表2的至少一个细胞表面标志物，或其功能构建体。优选地，该方法还包括向所述Treg细胞中引入特异性结合靶抗原的基因工程化抗原受体的步骤。该方法通过标准敲入和敲除技术进行，优选使用基因编辑系统，如CRISPR/Cas、TALEN和大范围核酸酶。
在一些实施方案中，Treg细胞是肿瘤特异性Treg细胞，其可以是自体Treg细胞或同种异体Treg细胞。根据本公开，Treg细胞优选是功能性肿瘤特异性Treg。FT-Treg分离自患者肿瘤活组织检查。
本发明还涉及根据本公开的工程化Treg细胞或根据本公开的方法获得的工程化Treg细胞，或包含所述工程化Treg细胞的药物组合物或试剂盒，其用于癌症的过继细胞治疗。
所述试剂或工程化Treg有利地以药物组合物的形式使用，所述药物组合物包含作为活性物质的本发明的试剂、载体或工程化Treg和至少一种药学上可接受的媒介物和/或载体。
将药物组合物配制用于通过多种途径施用，包括但不限于口服、肠胃外和局部。药物赋形剂是本领域熟知的适于计划施用途径的那些。
药物组合物包含治疗有效量的试剂、载体或工程化Treg，其足以在施用药物组合物的个体中显示阳性医学应答。阳性医学应答是指减少随后的(预防性治疗)或确定的(治疗性治疗)疾病症状。阳性医学应答包括疾病症状的部分或全部抑制。阳性医学应答可通过测量各种客观参数或标准(诸如疾病的客观临床体征和/或生存增加)来确定。对根据本发明的组合物的医学应答可以容易地在本领域熟知的以及在本申请的实施例中说明的疾病的适当动物模型中验证。
药物有效剂量取决于所用的组合物、施用途径、经治疗的哺乳动物(人或动物)的类型、所考虑的特定哺乳动物的身体特征、同时用药和医学领域技术人员将认识到的其它因素。
“治疗方案”是指疾病的治疗模式，例如治疗期间使用的给药模式。治疗方案可包括诱导方案和维持方案。短语“诱导方案”或“诱导期”是指用于疾病的初始治疗的治疗方案(或治疗方案的部分)。诱导方案的一般目的是在治疗方案的最初阶段向患者提供高水平的药物。诱导方案可采用(部分或全部)“负荷方案”，其可包括施用比医师在维持方案期间将采用的药物剂量更大的药物、施用比医师在维持方案期间将施用的药物更频繁的药物，或两者。短语“维持方案”或“维持期”是指治疗方案(或治疗方案的部分)，其用于在疾病治疗期间维持患者，例如使患者长期(数月或数年)保持缓解。维持方案可以采用连续治疗(例如，以规则的间隔施用药物，例如，每周、每月、每年等)或间歇治疗(例如，间断治疗、间歇治疗、复发治疗或在达到特定预定标准[例如，疼痛、疾病表现等]时的治疗)。
本发明的药物组合物通常根据已知方法以有效地在个体中诱导有益效果的剂量和时间段施用。施用可以通过注射或通过口服、舌下、鼻内、直肠或阴道施用、吸入或透皮施用。注射可以是皮下、肌内、静脉内、腹膜内、皮内等。
在一些实施方案中，药物组合物包含另一种活性剂，例如特别是免疫调节剂、抗癌剂或肿瘤抗原。
本发明的药物组合物有利地与另外的癌症疗法组合使用，例如但不限于：免疫疗法，包括免疫检查点疗法和免疫检查点抑制剂、共刺激抗体、CAR-T细胞疗法、抗癌疫苗；化疗和/或放疗。组合治疗可以是分开的、同时的和/或顺序的。
在一些优选实施方案中，癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)；乳腺癌，皮肤癌，卵巢癌，肾癌和头颈癌；和横纹肌样瘤；更优选非小细胞肺癌(NSCLC)。
在一些实施方案中，该药物组合物用于治疗人。
在一些实施方案中，该药物组合物用于治疗动物。
除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术范围内的常规技术。这些技术在文献中有充分的解释。
现在将参考附图通过以下实施例举例说明本发明，这些实施例不是限制性的，其中：
附图说明
图1：数据描述
A.将5000个Tconvs(DAPI-CD45+CD4+CD25lo CD127lo/hi)和5000个Tregs(DAPI-CD45+CD4+CD25hi CD127lo)进行FACS分选并以相等数量混合，用于使用10X基因组学的scRNAseq分析。B.每个患者和组织中回收的总细胞数。C.使用Cell Ranger V3和Seurat 2管线分析样品，并且显示的是CCA批效应校正后聚集的所有细胞的UMAP可视化。使用0.9的分辨率(Louvain算法)，其定义了21个簇(用不同颜色可视化)。由虚线界定的上区和下区分别包括Treg和Tconv，并且使用差异表达的基因、基因和标签表达的热图定义(参见图2中的实施例)。
图2：鉴定T细胞簇
通过从文献中提取的选定基因(“特征”)或标签的UMAP投影来定义T细胞簇。A.图显示CD4+T conv细胞如何被鉴定为表达CD40L和CD127：并且Treg被鉴定为表达FOXP3、CD25以及表达公开的Treg标签的基因(*Zemmour et al.,2018and**Azizi et al,2018)。B.图显示如何使用Stubbington et al.,2015公开的标签鉴定显示天然表型的CD4+T细胞；使用Azizi et al,2018公开的标签鉴定终末分化细胞；中央记忆细胞如Abbas AR et al.,2009中鉴定，循环细胞如Chung et al.,2017中鉴定，具有IFNα应答标签的细胞如MSigDB(HALLMARK_INTERFERON_ALPHA_RESPONSE,M5911)中鉴定，T滤泡辅助细胞如Kenefeck R etal；2015鉴定，以及Th17细胞如Zhang W et al；2012鉴定。C.图显示了T细胞的最终簇分类：共鉴定出7个纯Tconv细胞簇(Tconv簇1-7)，共鉴定出5个纯Treg簇(Treg簇1-5)，以及共鉴定出9个“混合T细胞”簇，其由具有Treg和Tconv特征的细胞的混合物组成(Tmix 1-9)。
图3：与血液相比，在肿瘤或LN中鉴定积聚的Treg簇
比较3种组织中5个Treg簇中每一个的总Treg百分比。与血液相比，在TDLN或肿瘤中仅Treg簇4和5的比例在统计学上显著增加(配对t检验<0.05)。
图4：鉴定携带在肿瘤中克隆性扩增的TCR的Treg
A.所有患者的克隆型信息表。B-D.显示了患者4的结果。B.患者4的总克隆和扩增克隆的分布。C.显示的是在各Treg簇的位置(血液、肿瘤引流淋巴结和肿瘤)扩增的具有TCR的克隆的％(左图)和在肿瘤中扩增的具有TCR的克隆的％(右图)。D.发现表达TCR的细胞的UMAP投影在肿瘤细胞中扩增。每个点是细胞。从左到右突出显示血液、TDLN、肿瘤和所有组织中的扩增克隆。
图5：鉴定具有TCR触发、细胞活化和扩增的转录组标签的CD4+FOXP+Treg簇
表达所选标签或基因的细胞的UMAP投影(黑点)。从MSigDB(REACTOME_DOWNSTREAM_TCR_SIGNALING,MI3166)提取TCR活化标签。
图6：差异表达基因分析(DEG)
将具有肿瘤扩增克隆型且存在于Treg簇4(来自所有患者)中的细胞相对于属于单个簇的细胞(Treg1-5；Tconv1-7，Tmix1-7)的细胞的DEG分析相交。总是上调或总是下调的基因被认为是肿瘤特异性Treg特征。
图7：鉴定肿瘤特异性Treg的所选标志物
表达一些选定基因的细胞的UMAP投影(黑点)。
图8：已开发管线的图形总结
图9：选择管线输出。
每个点代表一个靶标。根据其基因等级(选择管线的最终得分)对靶标进行排序，并相对于其GTEx安全性得分进行绘图。红色表示已知的Treg参考基因。ENTPD1(CD39)是安全性和得分最低的Treg参照品，因此选择两个截止值。
图10：显示从血液(PBMC)、肿瘤引流淋巴结(TDLN)和来自NSCLC患者的肿瘤获得的Treg细胞(门控为CD4+FOXP3 T细胞)上的模型候选肿瘤特异性Treg标志物CCR8的表达的代表性FACS点图。
门中的数字表示CCR8阳性Treg的百分比。
图11：描绘来自PBMC的匹配CD4+T细胞和来自未治疗NSCLC患者的肿瘤中所选基因的表达的代表性点图。
A.描绘来自同一患者的PBMC和肿瘤的CD4+CD3+活细胞中FOXP3+的表达的代表性点图(数字表示所示门中细胞的百分比)，和B.来自2个分析组织的Treg和Tconv群体中CD4、FOXP3和CD25的表达水平(MFI)(数字是MFI值)。描绘来自同一患者的PBMC和肿瘤的Treg细胞中CD74(C)、CD80(D)、4-1BB(E)、OX40(F)、CXCR3(G)和VDR(H)的表达的代表性点图(数字表示所示门中细胞的百分比)。
图12：肿瘤特异性Treg靶标在来自PBMC的CD8+T细胞、CD4+T常规细胞(Tconv)和Treg细胞以及来自NSCLC患者的肿瘤中的表达。
离体FACS染色的代表性图显示在来自同一患者的匹配PBMC和肿瘤中表达所示标志物的活CD8+T细胞和CD4+T常规细胞(Tconv)和T调节细胞(Tregs、CD4+FOXP3+)的几何平均表达(A)或频率(B)。(A)中的数字表示CD4、FOXP3和CD25的几何平均表达。(B)中的数字表示CD177、CTLA-4、GITR、TNFR2、VDR、CCR8、41BB、OX40、CD39、CSF1、CD80、HLA-DR、CXCR3、IL12RB2、CD74、ICOS和ICAM1的阳性细胞百分比。基因选自表1和表2。
图13：OX-40、41BB和CCR8鉴定功能性肿瘤特异性Treg。
将NSCLC患者的肿瘤细胞悬液在37℃下用含或不含抗人HLA-DR阻断抗体的自体肿瘤细胞裂解物刺激12小时，然后进行FACS染色。代表性的图显示来自NSCLC患者的肿瘤的Treg表面上标志物表达的频率。
图14：在用Mock(左图)或CD74(右图)RNA引导的核转染后12天，CD74的Treg KO中CD74的CD74和FoxP3表达的代表性点图，门控为FSC-SSC/单峰/Aqua-/CD3+CD4+/FOXP3+。
从健康供体PBMC获得的新鲜FACS分选的Treg(DAPI-CD4+CD25hiCD127lo)在培养物中用αCD3/αCD28珠(与细胞的比例为1:1)和IL-2扩增7天。使用CRISPR/Cas9方法敲除Treg用于CD74。12天后分析细胞。
图15：如图14所示产生CD74 KO或WT Treg。
A.核转染后扩增的WT或CD74 KO Treg的细胞计数。
B.核转染20天后扩增的WT或CD74 KO Treg的FACS分析。代表性的图显示表达CD25、ICOS、OX-40、PD1 CD38、HLA-DR、4-1BB和Ki67的CD74+和CD74-Treg(FOXP3+细胞)的频率。
图16：CD74与MIF共受体在Treg表面的共表达。
左图：CD74+Foxp3+Treg的门控策略的代表性图。右图：CD74+Treg上CXCR4、CXCR2和CD44共表达的频率。
具体实施方式
实施例1：鉴定功能性肿瘤特异性Treg(FT-Treg)标志物
1.步骤1：临床样品收集
从经历标准护理手术切除的5名非小细胞肺癌(NSCLC)患者收集血液、肿瘤引流淋巴结(TDLN)和肿瘤的匹配样品。通过IHC、NGS表征样品并通过Cytoscan检测基因组异常。按照欧洲伦理指南，患者签署书面同意书。
2.步骤2：细胞分离
在初次手术后4小时内处理样品，切成小片段，在0.1mg/ml DNase(Roche)存在下用0.1mg/ml Liberase TL(Roche)消化30分钟，然后添加CO2非依赖性培养基(GIBCO)。然后将细胞过滤并用2.5mL注射器的活塞在40-μm细胞过滤器(BD)上机械解离并用CO2非依赖性培养基(GIBCO)0.4％人BSA洗涤。
3.步骤3：scRNAseq(转录组和TCR)
对于每种组织，将Treg(DAPI-CD45+CD4+CD25hi CD127lo)和Tconv(DAPI-CD45+CD4+CD25lo CD127lo/hi)进行FACS分选并以50/50的比例混合，然后加载到10X铬(10XGenomics)上。对于2名患者，使用单细胞3'试剂盒(V2 chemistry,10X Genomics)制备文库；对于另外3名患者，使用单细胞5'试剂盒(Immunoprofiling Kit,10XGenomics)制备文库，其中根据制造商的方案进行另外的步骤以富集V(D)J读数。在两种方案中，装载芯片以回收每个样品10000个细胞(5000个Treg和5000个Tconv)。
将单细胞与包被有独特条形码、独特分子标识符(UMI)、poly(dT)序列(单细胞3'试剂盒)或switch oligo(TSO)序列(单细胞5'试剂盒)的凝胶珠一起捕获成液滴，并且所有试剂用于逆转录以产生条形码化cDNA(分别为单细胞3'和5'试剂盒)。用以下方案在微滴中发生逆转录。随后从液滴中回收cDNA，用DynaBeads MyOne Silane Beads(Thermo FisherScientific)清洗，并用扩增主混合物和酶(分别为单细胞3'和5'试剂盒)扩增。用SPRI选择试剂盒(Beckman Coulter)清除扩增的cDNA产物。使用dsDNA高灵敏度测定试剂盒和生物分析仪安捷伦2100系统实现cDNA定量和质量评估。然后，按照这些步骤构建索引文库：(1)片段化、末端修复和A-加尾；(2)用SPRI选择珠的大小选择；(3)适体连接；(4)SPRI选择珠连接后清除；(5)样品索引PCR和用SPRI选择珠的最终清除。使用dsDNA高灵敏度测定试剂盒和生物分析仪Agilent2100系统实现文库定量和质量评估。测试索引文库的质量，变性，按照Illumina测序平台的推荐稀释，并使用配对末端26×98bp作为测序模式(转录组或基因表达，GEX)在Illumina HiSeq2500上测序，靶向每个细胞至少50000个读数。
单细胞TCR扩增和测序在5'GEX产生后使用单细胞V(D)J试剂盒根据制造商的说明书(10X Genomics)进行。简言之，通过两个人TCR靶PCR从扩增的cDNA中富集V(D)J片段，随后进行特异性文库构建。使用dsDNA高灵敏度测定试剂盒和生物分析仪安捷伦2100系统实现TCR富集的cDNA和文库定量和质量评估。使用末端配对的150bp作为测序模式在IlluminaHiseq或Miseq上对V(D)J文库测序。
4.步骤4：scRNA-seq转录组和TCR数据分析
4.1.步骤4.1：通过样品的scRNA-seq转录组分析
来自HiSeq Illumina测序仪的末端配对的26×98bp输出用用于产生计数矩阵的Cell ranger管线并用于进一步分析的Seuratv3处理。
Cell ranger
管线Cellranger mkfastq(默认参数)在Cell Ranger版本2.1.1中运行，以解复用来自Illumina测序仪的原始基本调用(BCL)文件并生成FASTQ文件。
然后，用Cell Ranger 3.0.2版管线进行测序数据处理。在每个GEM上运行Cellranger计数功能。使用具有进一步MAPQ调节的STAR，转录组比对，每个基因的UMI计数并调用细胞条形码将GEM读数绘制在人基因组上(GRCh38/hg38；2013年12月17日提交的Genome Reference Consortium Human Build 38；Genbank汇编登录号：GCA_000001405.15)。
然后，将Cellranger的输出加载到R中。
Seurat
R3.6.1中的Seurat 3.1.1(Butler et al.,2018；Stuart,Butler et al.,2019)。在从计数矩阵创建Seurat对象之后，数据遵循预处理工作流程，用于基于QC度量、数据归一化和缩放以及高度可变特征的检测来选择和过滤细胞。之后，按照Seurat v3管线的默认参数单独分析样品。
-QC和选择细胞进行进一步分析
过滤具有很少基因的细胞(碎片、死亡细胞)：除去具有少于200个基因的细胞。
通过％线粒体基因和总计数UMI/细胞过滤死细胞或双联体：当可能时，通过1)log2％线粒体基因和2)log2细胞的总计数UMI的细胞计数分布通过多峰函数拟合。该函数的最大值和最小值通过代数寻找顶点或转折点而确定。选择对应于两个最高最大值之间的函数的最低最小值的线粒体基因的％和细胞的UMI总计数作为截止值。具有高于相应的截止值的线粒体基因百分比或每细胞总UMI计数的所有细胞被认为是死细胞或双联体并被消除。当不能产生线粒体基因％分布的多峰函数时，10％用作截止值。
-归一化
每个细胞的每个基因的UMI计数通过总表达标准化。默认地，Seurat使用全局缩放归一化方法“LogNormalize”，其通过总表达归一化每个细胞的特征表达测量，将其乘以比例因子(默认为10，000)，并对结果进行对数转换。
-识别高度可变的特征(特征选择)
接下来，使用函数FindVariableFeatures来识别在数据集中表现出高的细胞到细胞变化的2000个特征的子集。FindVariableFeatures(方法：vst，分散截止值＝0.5；平均表达的截断值＝0)(按样品计)。
-缩放数据
然后，使用缩放函数对数据进行线性变换(“缩放”)，所述缩放函数1)移位每个基因的表达，使得跨细胞的平均表达为0；2)缩放每个基因的表达，使得细胞间的差异为1。该步骤在下游分析中给出了每个基因的相等权重，减少了高表达基因的影响。
-线性尺寸减小
为了克服scRNA-seq数据的任何单个特征中的大量技术噪声，对缩放数据进行主成分分析(PCA)。PCA将表达式矩阵转换为以方差(从最高到最低)为函数排序的称为主分量(PC)的线性不相关变量的一组值。因此，顶部主成分表示数据集的鲁棒压缩。为了选择大量成分的数量，将方差对PC的百分比(ElbowPlot)可视化，并计算两个连续值之间的线性函数的斜率。发明人发现，对于每个样品，上述斜率稳定的PC在评价所有样品后决定保持最高50个PC。
4.2步骤4.2：整合数据的scRNA-seq转录组分析
-整合
为了将不同的样品(组织和患者)整合到它们独特的包含Treg和Tconv多样性的数据集中，发明人使用Seurat v3整合方法。简而言之，该方法鉴定用于协调数据集对或将信息从一个传送到另一个的各个细胞(被识别为“锚”)之间的成对对应关系。
-设置具有2000个最可变基因Log的Seurat对象，其如上所述被归一化。
-使用FindIntegrationAnchors(在前30个PC上)鉴定每个样品中的锚(总共15个：5名患者x 3个组织)。
-使用锚的整合数据(在前30个PC上)整合样品。函数返回包含新测定条目的Seurat对象作为整合表达式矩阵。
-缩放数据(如上所述)
-线性尺寸减小(如上所述)
-聚类细胞
使用surat v3，应用基于图的聚类方法。简言之，基于PCA空间中的欧几里德距离构建KNN图，并且根据在任意两个细胞的局部邻域中的特征重叠(在前50个PC中的findneighbors函数)来细化它们之间的边缘权重。这允许在高度连接的群体中区分细胞。然后，优化簇的模块性，利用发现FindClusters函数对单元进行迭代分组(Louvain算法)。该算法包含称为“分辨率”的参数，其确定“聚类的粒度”，并且其与获得的簇的数量有关。为了识别最佳分辨率，进行Clustree v.0.2.2(Zappia,Oshlack,2018)以可视化聚类树，从而允许跨不同分辨率询问聚类行为(当聚类分辨率增加时细胞在簇之间移动的图形表示)。
前五十个PC上的FindNeighbors函数；FindClusters用于鉴定分辨率为0-2的簇(对于每个小数：0.1,0.2,…,2)。
-非线性尺寸减小(UMAP)
为了可视化它们的高维数据，发明人使用均匀流形近似和投影(UMAP)用于二维可视化，这是一种新的算法，其创建信息簇并以有意义的方式组织这些簇。McInnes,L.andHealy,J.(2018).UMAP:用于尺寸减小的均匀流形近似和投影。
-全局差异分析
使用MAST(Finak,McDavid,Yajima et al.,2015)，以0.25的最小对数倍数变化和在整合基质上两组细胞中的任一组中表达该基因的细胞的最小分数(min.pct)＝0.25，用FindAllMarkers函数鉴定簇之间差异表达的基因。
FindAllMarkers的参数：在整合数据上进行，仅.pos＝TRUE,min.pct＝0.25,logfc.threshold＝0.25。
-鉴定和消除污染物
将不表达T细胞标志物(CD3E、CD3G、TRAC、TRBC1和TRBC2)和表达其它群体的标志物(B细胞为CD79A，单核细胞为CD14，树突细胞为CD11c)的细胞鉴定为污染物并除去。
-整合(无污染物)
-使用FindVariableFeatures(方法：vst，分散截止值＝0.5；平均表达的截断值＝0)(按样品计)对整合方法进行了重新处理。测试了更多数量的可变基因的整合，但2000个足以有效区分CD4+T细胞群体的多样性。
-使用FindIntegrationAnchors(在前30个PC上)鉴定每个样品中的锚(总共15个：5名患者x 3个组织)。
-使用锚的整合数据(在前30个PC上)整合样品。该函数返回包含新测定条目的Seurat对象作为整合表达式矩阵。
-聚类细胞(无污染物)
-用前50个PC计算基于图的聚类分析。前五十个PC上的FindNeighbors函数；FindClusters函数用于鉴定分辨率为0-2的簇(对于每个小数：0.1,0.2,…)。
-构建Clustree v.0.2.2(Zappia,Oshlack,2018)
-基于前50个PC上的PCA减小，使用RunUMAP函数构建尺寸减小可视化。
-改编发明人数据
-分辨率：发明人选择了分辨率0.9，因为它在稳定性和具有生物学兴趣的簇的数目之间表现出良好的折衷。
-簇概述：发明人检查了每个样品和/或患者的细胞百分比，以便鉴定和去除不包括一个样品或患者的细胞簇用于进一步分析。发明人发现含有98％的细胞的簇19仅来自一个样品(肿瘤18P05408)，并且发明人没有考虑将其用于进一步分析。
-非线性尺寸减小(UMAP)
-表征簇
-全局差异分析：使用MAST(Finak,McDavid,Yajima et al.,2015)，以0.25的最小对数倍数变化(FC)和在两组细胞的任一组中表达基因的细胞的最小分数(min.pct)＝0.25，用FindAllMarkers函数鉴定簇中差异表达的基因。
-FindAllMarkers函数的参数：对象：整合数据，仅.pos＝TRUE,min.pct＝0.25,logfc.threshold＝0.25。
-探索细胞身份
-使用标志物基因表达和相关标志物的富集确定每个簇的细胞身份。使用基因数量/2作为ctrl参数，用AddModuleScore函数计算每个相关标签的标签得分。
-发明人证实，簇2和18在表达谱中与真正少数差异表达的基因高度重叠，并且是统一的。注意，它们以分辨率0.8融合。
-使用Treg标签和关键基因(对于Treg为FOXP3、IL2RA、CTLA4和TNFRSF1B，和对于Tconvs为IL7R和CD40L)将簇分类为Treg、Tconvs和Tmix。当簇中细胞显示Treg的标签和基因的富集得分和Tconvs的基因和标签的低得分时，将其分类为“纯”Treg(1-5)。类似地，分类“纯”Tconv(1-7)。具有混合特性的簇称为Tmix。使用转移标签函数证实Tmix注释：作为参考的两个大簇：所有Treg作为单一簇(Treg簇：1-5)和所有Tconvs簇作为单一簇(Tconv1-7)；并将各个混合簇作为查询。
4.3步骤4.3：scTCR分析
将单细胞5'基因表达和V(D)J测序多路分配并使用GRCh38/hg38作为函数cellranger mkfastq的参照与Cell Ranger v.2.1.1比对。然后，在Cell Ranger v.3.0.2中运行Cellranger vdj函数，并用于进行V(D)J序列组装。发明人获得以下作为输出：TCRα(TRA)和β(TRB)V(D)J序列、细胞条形码和CDR3序列(核苷酸)。
为了产生克隆型调用，发明人创建了分别考虑TRA和TRB链的CDR3核苷酸序列数据库。发明人的数据库包含通过精确匹配共享一组生产性CDR3序列的细胞的每种克隆型或集合的不同标识符：TRB标识符(ID)基于TRB-CDR3独特序列，并且TRA亚标识符(亚ID)基于TRA-CDR3独特序列。
发明人使用他们的数据库来改进克隆型的调用并更好地鉴定属于相同克隆型的细胞，克服了常见的TRA丢失并考虑了TRA重排中不存在等位基因排斥。按患者：
-具有多于2个亚ID(TRA-CDR3序列)和/或多于1个ID(TRB-CDR3序列)的细胞作为可能的双联体被排除。
-如果在共享相同ID的全部细胞中存在最多2个亚ID(TRA-CDR3序列)，则将含有相同ID的细胞(TRB-CDR3序列)视为克隆型。
-在数据库中检索包含1或2个亚ID(TRA-CDR3序列)和0个ID(TRB-CDR3序列)的克隆型。
-如果没有发现它们，则不包括它们用于TCR分析。
-如果发现它们，评估它们与TRB-CDR3配对的关系：
-如果它们是独特的，我们分配在数据库中找到的配对ID。
-如果它们不是独特的，则不包括它们用于TCR分析。
用我们的策略还鉴定了来自同一患者的肿瘤、淋巴结和PBMC样品之间的常见克隆型。使用细胞条形码通过样品对转录组学和V(D)J信息进行配对。
4.4步骤4.4：克隆TCR扩增分析
利用细胞的TCR信息，发明人首先研究了组织的克隆扩增。发明人通过组织鉴定了独特克隆的列表，并通过该组织中的克隆型计数了细胞数。当克隆含有多于一个细胞时，认为它们是扩增的。每个患者的组织扩增克隆百分比计算为：
按组织的扩增克隆％＝扩增克隆/总克隆#
利用配对的簇(获自scRNA-seq转录组分析)和TCR信息，发明人然后通过簇计算肿瘤扩增克隆的百分比。根据之前获得的独特肿瘤扩增克隆型的列表，发明人选择了存在于所有3种组织中的细胞并根据它们的簇标签将它们分类。
具有肿瘤扩增克隆型的细胞的百分比按簇(对于每个患者)计算为：
簇N中肿瘤扩增克隆型细胞％＝簇N中肿瘤扩增克隆型细胞#/簇N中总细胞#；
5.步骤5：鉴定功能性肿瘤特异性Treg
功能性肿瘤特异性Tregs(FT-Tregs)被定义为属于具有以下所有特征的簇(或细胞群)的细胞：
5.1具有CD4+FOXP3+Treg特征的细胞簇，和
5.2CD4+FOXP3+Treg簇，其以高于血液的比例在肿瘤引流LN(特别是转移性肿瘤引流LN)中发现(即在肿瘤或TDLN中积聚)，和
5.3CD4+FOXP3+Treg簇，其在被发现在来自肿瘤的Treg细胞中克隆性扩增的具有特异性的细胞(TCR)中富集，和
5.4CD4+FOXP3+Treg簇，其在具有来自肿瘤的Treg细胞中最近的TCR触发、细胞活化和扩增的转录组标签的细胞中富集。
因此，该方法有助于将功能性亚群中的Treg分类并将功能性肿瘤-Treg簇与Treg的异质库区分开。
6.步骤6：鉴定肿瘤特异性Treg特异性标志物
将肿瘤特异性Treg定义为具有Treg簇4中存在的肿瘤扩增克隆型的细胞，并通过分析该群体中独特差异表达的基因(DEG)鉴定它们的转录组。首先，使用统计工具MAST(Finak,McDavid,Yajima et al.,2015)处理数据的零计数和异质性。第二，为了处理由少数细胞组成的簇和大簇之间DEG的分析将数据偏向最大簇的事实，发明人设计了两步策略。首先，发明人单独定义了肿瘤特异性Treg(如上定义：所有患者的Treg簇4中存在肿瘤扩增克隆型的细胞)和其他每个簇之间的DEG。其次，发明人将所有DEG相加(所有比较的交集)。使用原始数据(未整合)和使用MAST的FindMarkers函数进行细胞组之间差异表达的基因分析，Bonferroni p值校正小于或等于0.05，最小Log倍数变化为0.2，并且min.pct＝0.05。
7.步骤7：用于治疗目的的肿瘤特异性Treg标志物的鉴定和排序
为了选择肿瘤特异性Treg标志物，发明人使用具有MAST的FindMarkers函数定义了肿瘤特异性Treg(如上定义：所有患者的Treg簇4中存在肿瘤扩增克隆型的细胞)和所有其它簇(除Treg4之外的所有Tconvs簇和所有Treg簇)之间的DEG的更大列表，并且Bonferroni p值校正小于或等于0.05，最小Log倍数变化为0.12，并且min.pct＝0.05。
该新列表包括STEP6的所有基因和其它基因，然后使用如图8所示的由6个阶段组成的新生物信息学管线对其进行优先级排序：
BIOIT阶段1：过滤所有差异表达基因的初始列表，以仅提取编码具有确认的细胞外结构域的跨膜或GPI锚定蛋白的那些基因。
为此，使用为3个来源提取的信息创建注释表，并使用以下命令：
-来源：Uniprot：亚细胞定位含有“细胞膜”：TRUE/FALSE
-亚细胞定位含有“GPI-锚”：TRUE/FALSE
-拓扑域含有“Extracell”：TRUE/FALSE
-跨膜包含“TRANSMEM”：TRUE/FALSE
-来源：基因本体
-细胞组分含有“质膜”：TRUE/FALSE
-来源：人蛋白质图谱：
-蛋白质类含有“膜”：TRUE/FALSE
-蛋白质主要定位包含“质膜”：TRUE/FALSE
-蛋白质额外定位包含“质膜”：TRUE/FALSE
使用Protter(https://wlab.ethz.ch/protter/)，即允许给定蛋白质氨基酸方式及其膜定位的可视化的网络工具研究至少具有一个阳性关键字的所有基因。使用这种方法，证实了n＝333个基因(相当于所有差异表达的基因的约10％)编码具有证实的细胞外结构域的潜在跨膜蛋白。
BIOIT阶段2：加权正常组织中的靶表达
首先在健康组织的组织水平上测定每个靶的表达谱。基因组组织表达(GTEx)数据库(V8版本，TPM)用于计算健康组织中每个靶的表达得分。首先对来自GTEx的所有组织(除了免疫相关组织“全血”和“脾”，对于它们我们使用单细胞数据具有更好的分辨率)在每种组织类型上进行平均，以避免来自具有若干入口(对应于组织内的亚定位)的组织的偏差。然后，沿着所有总结的组织计算每个靶的平均表达。一个罚分归因于333个靶的每一个(1为最佳，333为最差)，以说明它们在健康组织中的表达。
BIOIT阶段3：加权肿瘤组织中的靶表达
使用癌症基因组图谱(TCGA)RNAseq数据分析病变组织中的每个靶表达。考虑到对于几种组织类型，比较癌症样品与健康样品的数量是不够的，TCGA数据补充有从GTEx数据库提取的健康样品的数据。为了校正两个数据库的比较所固有的批效应，已经开发了归一化方法，包括使用来自TCGAbiolinks的recount2资源的归一化计数(Mounir et al.,PLoSComput.Biol.,2019,15,e1006701)，使用edgeR校正文库大小、RNA组成和基因长度(McCarthy et al.,Nucleic Acids Res.,2012,10,4288-4297)，然后使用Limma再次校正批效应(Ritchie et al.,Nucleic Acids Res.,2015,43,e47)。通过主成分分析在若干组织中验证了两个数据库的正确对齐。对于每个靶标，在3种主要癌症类型中计算癌症样品(来自TCGA)的中值相对于健康样品(包括TCGA和GTEx样品)的中值的倍数变化：肺、乳腺和结肠。根据它们在先前提到的癌症中癌症/健康的平均倍数变化的等级，为每个靶标打分(最好为333，最差为1)。
BIOIT阶段4：在从健康供体PBMC的单细胞RNA测序获得的数据中加权靶表达
最初的差异分析导致鉴定由功能性肿瘤Treg差异表达的基因，但没有给出关于这些基因由其它免疫细胞表达的信息。因此，已经开发了工作流程来鉴定不仅由功能性肿瘤Treg差异表达而且在所有PBMC中以非常低的水平表达的基因。为此，使用两个公众可获得的PBMC的不同数据集分析外周血单核细胞(PBMC)的单细胞水平上的每个靶标的表达模式，所述数据集使用10x基因组学描述并分别包含5,000和10,000个细胞。
首先，分析PBMC数据集至允许鉴定血液中Treg簇的深度。然后，从数据集中除去来自该簇的所有细胞。在剩余的细胞上，分别在每个簇上计算每个靶标的平均表达，然后计算每个数据集中每个靶标的簇平均值的平均值。该中间步骤避免了分析中的任何簇大小偏差。对于在两个数据集中的所有PBMC(除去的Treg除外)中的平均表达，为每个靶标提供依赖于其等级的得分(最小表达为333，最大表达为1)。
BIOIT阶段5：在来自肿瘤微环境的细胞的单细胞RNA测序获得的数据中加权靶表达
为了表征肿瘤微环境中每个靶标在单细胞水平上的表达模式，使用来自7篇出版物的8个数据集获得公众可获得的单细胞RNAseq(Azizi et al.,Cell,2018,174,1293-1308；Li et al.,Cell,2019,176,775-789；Yost et al.,Nat.Med.,2019,8,1251-1259；Guo et al.,Nat.Med.,2018,24,978-985；Zheng et al.,Cell.,2017,169,1342-1356；Sade-Feldman et al.,Cell.,2018,175,998-1013；Peng et al.,Cell.Res.,2019,9,725-738)，涵盖多种肿瘤类型(NSCLC、乳腺癌、PDAC、黑素瘤、HCC、SCC、BCC…)以及多种细胞类型(所有免疫细胞以及肿瘤细胞、上皮、内皮、癌症相关成纤维细胞和组织特异性细胞类型)。采用与用于PBMC(STEP4)的方法类似的方法。因为该阶段的目的是鉴定Treg特异性靶，所以每个数据集已经被处理到可以鉴定Treg簇的分辨率。然后，从数据集中除去Treg，并计算所有细胞(没有Treg)中每个靶标的平均表达。根据其在所有8个数据集中肿瘤微环境的所有细胞(除去的Treg除外)中的平均表达等级，为每个靶标打分(最小表达为333，最大表达为1)。
BIOIT阶段6：加权肿瘤与正常相邻组织中的靶表达
为了测量i)每个靶标区分Treg和Tconv的能力，和ii)评价靶标在肿瘤-Treg和正常组织-Treg中的分布，分析来自分选细胞群的大量RNAseq数据。为此，从2项乳腺癌、肺癌和结肠癌研究中恢复了公众可获得的大量RNAseq数据(Plitas et al.,Immunity,2016,45,1122-1134；De Simone et al.,Immunity,2016,45,1135-1147)。对于每个数据集，给每个靶标2个得分。当计算Treg/Tconv表达的倍数变化时，第一个得分反映其等级，并且当计算肿瘤Treg/正常邻近组织Treg表达的倍数变化时，第二个得分反映其等级(最高倍数变化为333，最低为1)。
BIOIT阶段7：数据整合
在所有这些分析中，每个靶标的特征如下：
1GTEx表达的罚分
1TCGA表达的得分
2用于正常单细胞RNAseq PBMC表达的得分
8单细胞RNAseq癌症表达得分
4整体RNAseq癌症表达得分
由于需要对所有分析进行同等加权，因此对所有得分进行平均(平均值)，以对每个参数仅定义一个值。
然后，根据它们的总得分对基因进行排序：
得分＝Σ(TCGA得分,scPBMC得分,scTUMOR得分,bulkTUMOR得分)–GTEX罚分
然后，以安全性(GTEx平均得分)和兴趣(所有参数的总得分)表征每个靶标。为了定义两者的截止值，使用所述活化的Treg靶标的列表(IL2RA、ICOS、TNFRSF18、CCR8、CCR4、CTLA4、HAVCR2、ENTPD1、TNFRSF9)。将安全性和兴趣的截止值设定为最低等级参考基因的值。
按照上述整个过程，将n＝83个靶标定义为“潜在感兴趣的”。
BIOIT阶段8：每个靶标的相关注释
为了完成每个基因用于治疗性靶向的潜力的概况，将关于结构、功能、试剂的可获得性和竞争性格局的信息手动校正(数据挖掘)并呈现在标准化文件中。
结果
步骤5.1-鉴定具有CD4+FOXP3+Treg特征的细胞簇
发明人聚焦于非小细胞肺癌(NSCLC)，因为它仍然是成人中最常见的癌症之一，目前用免疫疗法治疗，Treg与较差的临床结果相关。发明人建立了具有与转录组偶联的TCR的10X基因组sc-RNAseq(@Chromium 10X Immunoprofiling kit)和使用上述新方法分析的生物信息学管线。
对从5名未经治疗的NSCLC患者(48303个单细胞)获得的15个样品(血液、TDLN和肿瘤)分选的CD4+T细胞进行的分析结果示于图1中。
CD4+T细胞被鉴定为表达CD40L和CD127，并且Treg被鉴定为表达FOXP3、CD25、以及表达公布的Treg标签的基因(*Zemmour et al.,2018and**Azizi et al,2018；图2A)。使用Stubbington et al.,2015中公开的标签鉴定显示天然表型的CD4+T细胞；使用Azizi etal,2018中公开的标签鉴定终末分化细胞；中央记忆细胞如Abbas AR et al.,2009中鉴定，循环细胞如Chung et al.,2017中鉴定，具有IFN-应答标签的细胞如MSigDB中鉴定，T滤泡辅助细胞如Kenefeck R,JCI,2014鉴定，以及Th17细胞如Zhang W et al；2012鉴定(图2B)。T细胞的最终簇分类显示共鉴定了7个纯Tconv细胞簇(Tconv簇1-7)，共鉴定了5个纯Treg簇(Treg簇1-5)，以及共鉴定了9个“混合T细胞”簇，其由具有Treg和Tconv特征的细胞的混合物组成(Tmix1-9；图2C)。
对于剩余的分析，为了鉴定含有肿瘤特异性Treg的簇，仅考虑纯Treg簇；即，Treg簇1、2、3、4和5，因为含有混合Treg和Tconv群体的簇对于肿瘤特异性Treg的选择不是信息性的。
步骤5.2-CD4+FOXP3+Treg簇，其以高于血液的比例存在于肿瘤或转移性肿瘤引流LN中(即在肿瘤或TDLN中积聚)
发明人假设与血液相比，肿瘤特异性Treg应当以增加的比例存在于肿瘤组织或TDLN中(其中肿瘤特异性Treg将在具有其它特异性的Treg中稀释)。为了鉴定在肿瘤中以增加的比例发现哪些Treg簇，发明人比较了3种组织中每个纯Treg簇的总Treg的百分比。如在图3中所观察，与血液相比，在肿瘤中仅簇4和5的比例在统计学上显著增加，并且簇5也在TDLN中显著增加(配对t检验<0.05)，表明肿瘤特异性Treg应当在簇4和/或5中富集。
步骤5.3-在具有特异性的细胞(TCR)中富集的CD4+FOXP3+Treg簇，所述TCR被发现在来自肿瘤的Treg细胞中克隆性扩增
发明人假设肿瘤特异性Treg应当克隆扩增，因为在通过其TCR识别肿瘤抗原后，它们应当被活化、分裂和局部积聚。为了研究Treg的克隆多样性，发明人研究了它们的TCR库。在19572个细胞中成功进行了TCR库分析。图4A显示了每个单细胞的转录组和TCR数据的整合结果。
如一个患者示例(图4-D)，5432个检测到的具有配对TCR(含有α和βTCR链两者)的细胞和转录组呈现3881个不同的TCR(克隆)。所有克隆的19.7％(763个)被扩增(当检测到2个或更多个具有相同TCR的细胞时，认为一个克隆被扩增)。在肿瘤中，超过20％的T细胞克隆被扩增(未显示)。
为了鉴定哪些Treg簇在肿瘤中克隆扩增的特异性中富集，发明人分析了每个Treg簇中携带肿瘤扩增TCR的细胞的比例。如图4C所示，在5个纯Treg簇中，簇1、3和4显示出更高比例的携带肿瘤扩增的TCR的T细胞，簇4是肿瘤-TCR特异性中最富集的，这可以通过携带肿瘤-TCR扩增的克隆的细胞的UMAP投影来理解(图4D)。对于其它患者获得了类似的结果(未示出)。
在步骤5.2中，发明人定义肿瘤特异性Treg应富集在簇4和/或簇5中。鉴于Treg簇4(而不是Treg簇5)在肿瘤-TCR扩增的克隆型中富集，发明人推断Treg簇4在肿瘤特异性Treg中富集。
发明人还观察到相同克隆的T细胞同时存在于不同组织中(证实血液、TDLN和肿瘤中的T细胞循环)，并且一些Tconv和Treg共享相同的TCR，从而允许研究人中的Treg转化。
步骤5.4-细胞中富集的CD4+FOX3P+Treg簇具有来自肿瘤的Treg细胞中最近TCR触发、细胞活化和扩增的转录组特征。
在该方法中，肿瘤特异性Treg应该克隆扩增，因为在通过它们的TCR识别肿瘤抗原后，它们应该被活化、分裂和局部积聚。因此，它们的转录组应反映这些生物学途径。例如，通过其TCR识别同源抗原尤其应诱导TCR活化下游基因(如REL、NKKB2、NR4A1、OX-40、4-1BB)和Treg活化的已知基因(如MHCII类分子(HLA-DR)、CD39、CD137、GITR)的上调。如在图5中所观察，这些特征在Treg簇4中富集(如在UMAP投影中观察到)。此外，这些基因在该簇中差异上调(参见以下结果)，指出Treg簇4为“肿瘤特异性Treg簇”。
步骤6：鉴定肿瘤特异性Treg特异性标志物
肿瘤特异性Treg被定义为具有存在于Treg簇4中的肿瘤扩增克隆型的细胞，并且通过分析该群体中独特差异表达的基因(DEG)来鉴定它们的转录组，如上文材料和方法部分中所述。
如图6所示，进行DEG分析，将Treg簇4(来自所有患者)中存在的具有肿瘤扩增克隆型的细胞与属于单个簇的细胞(Treg 1-5；Tconv 1-7,Tmix 1-7)进行比较。从所有这些19个DEG的交叉来看，发明人仅保留了总是以相同方向改变(总是上调或总是下调)的基因。总是上调或总是下调的基因被认为是肿瘤特异性Treg特征。肿瘤特异性基因的示例性和非详尽列表包括在表1中。
图7显示了来自表1列表的一些选定基因的UMAP投影。如上所述，在“扩增的Treg簇4”中特异性上调的差异表达基因(DEG)包括TCR活化基因和Treg活化标志物，并且该列表中的一些基因先前未与Treg生物学相关。
步骤7：用于治疗目的的肿瘤特异性Treg标志物的鉴定和排序
为了选择肿瘤特异性Treg标志物，发明人使用具有MAST的FindMarkers函数定义了肿瘤特异性Treg(如上定义：所有患者的Treg簇4中存在肿瘤扩增克隆型的细胞)和所有其它簇(除Treg4之外的所有Tconvs簇和所有Treg簇)之间的DEG的更大列表，并且Bonferroni p值校正小于或等于0.05，最小Log倍数变化为0.12，并且min.pct＝0.05。
按照上述整个过程，将n＝83个靶标定义为“潜在感兴趣的”(图9)。
实施例2：验证肿瘤特异性Treg标志物
1.验证肿瘤特异性Treg标志物的蛋白质表达水平
为了验证方法学方案，通过FACS评估候选肿瘤特异性基因的蛋白质表达水平，比较来自血液的Treg与来自TDLN和肿瘤的Treg的表达水平。如图10所示，我们对来自一名NSCLC患者的血液、TDLN和肿瘤的Treg分析了CCR8(作为Treg4簇中存在的模型候选肿瘤特异性Treg基因)的蛋白表达水平。可以观察到，如scRNAseq结果所预测，该候选蛋白阳性的Treg细胞的百分比从血液到TDLN和肿瘤是增加的。
如图11所示，发明人分析了来自表1列表的其它候选肿瘤特异性标志物的蛋白质表达水平，即：CD4、FOXP3、CD25、CD74、CD80、4-1BB(TNFRSF9)、OX40(TNFRSF4)、CXCR3，其中一些在Treg生物中的作用的信息很少(Cantorna et al.,Nutrients,2015,7,3011–3021；Chambers and Hawrylowicz,Curr.Allergy Asthma Rep.,2011,11,29–36；Xu et al.,Front.Immunol.2018,9)。如通过它们的方法所预测，所有示例性基因在肿瘤Treg中比在血液Treg中表达更多，这可以在表达水平(平均荧光强度、MFI，图11A-B)和/或在表达标志物的细胞百分比(图11C-G中细胞％)观察到。这些结果突出了我们的方法的有效性。此外，如图12所示，发明人分析了表1和表2中列表的一些候选肿瘤特异性标志物在来自PBMC的CD8+T细胞、CD4+T常规细胞(Tconv)和Treg细胞以及来自NSCLC患者的肿瘤中的蛋白质表达水平。如通过它们的方法所预测，所有示例性基因在肿瘤Treg中比在血液Treg中和在来自血液和肿瘤的CD8+T细胞中表达更多，这可以在表达水平(平均荧光强度、MFI，图12A)和/或在表达标志物的细胞百分比(图12B中的细胞％)观察到。这些结果突显了我们的方法的有效性。
2.确认所鉴定的肿瘤相关Treg标志物与肿瘤特异性Treg相关。
评价人Treg的特异性的一种方法是将它们与自体肿瘤细胞的裂解物共培养，并分析诱导分子的表达并控制在存在针对HLA-cII分子的封闭抗体的情况下不诱导其表达。如图13所示，发明人分析了特异性识别自体肿瘤抗原的细胞中来自列表的所选标志物的表达，并且他们可以观察到OX-40、41BB和CCR8有效地标记肿瘤特异性Treg。
3.评价靶蛋白在人Treg的生物学中的作用
评价靶标标志物在人Treg生物学中的作用的一种方法是例如通过使用CRISP/CAS9技术敲除原代人Treg中的候选基因。作为实例，本发明人使用CRISPR(成簇的规则间隔的短回文重复序列)/Cas9(CRISPR相关蛋白)在原代人Treg中敲除选自其列表的一个示例性候选基因：CD74。为此，将来自健康供体PBMC的Treg(CD4+CD127-CD25高)进行FACS分选，并用CD3/CD28珠和IL-2体外扩增2天。然后，使用一种向导RNA和示踪RNA，用化学修饰的合成靶基因特异性CRISPR RNA(crRNA)转染2×106个Treg，后者介导与Cas9的相互作用。用未经dsRNA处理的细胞(Mock)作为阴性对照(WT)。通过测量失去靶蛋白表达的细胞百分比(FACS)评价敲除的功效。然后，通过用CD3/CD28珠和IL-2刺激几轮来扩增Treg细胞WT或KO。
如在图14中观察到的，用CRISPR/Cas9KO技术在40％的Treg中有效消除CD74-基因表达。
为了分析其候选基因CD74对人Treg生物学的作用，发明人研究了存活力、增殖和表型(Treg相关蛋白的FACS表达：即HLA-DR、Ki67、CD25、OX40和4-1BB)。
发明人观察到，与其WT对应物相比，CD74KO Treg在体外扩增中显示出缺陷以及较低水平的Ki67表达，并且表达较低水平的CD25、OX40、HLA-DR和较高水平的4-1BB(图15)。
4.验证CD74介导的Treg迁移的功能性抑制可以通过用小分子或抗MIF抗体阻断其共配体MIF。
发明人评估了CD74与MIF共受体在Treg表面的共表达，并观察到Treg有效地与已知的MIF共受体(即CXCR4、CXCR2和CD44)共表达CD74(图16)。
5.通过将基因修饰的Treg与其WT对应物进行比较来研究它们的抑制功能
可以使用候选基因的Treg KO或WT进行交叉实验。对于抑制试验，发明人建立了两种测定：从小鼠和/或异源供体获得的抗原呈递细胞中Tconv增殖的经典抑制试验和共刺激标志物(CD86、CD80、CD40L、HLA-DR)的调节。
表1：本申请中鉴定的功能性肿瘤特异性Treg标志物的列表
上调(+)；下调(-)；CM：细胞膜；M：膜；CS：细胞表面
TM：跨膜；EC：细胞外；NA：不适用
Figure BDA0003881277930000601
Figure BDA0003881277930000611
Figure BDA0003881277930000621
Figure BDA0003881277930000631
Figure BDA0003881277930000641
Figure BDA0003881277930000651
Figure BDA0003881277930000661
Figure BDA0003881277930000671
Figure BDA0003881277930000681
Figure BDA0003881277930000691
Figure BDA0003881277930000701
Figure BDA0003881277930000711
Figure BDA0003881277930000721
Figure BDA0003881277930000731
Figure BDA0003881277930000741
Figure BDA0003881277930000751
表2：未列于表1中的本申请中鉴定的功能性肿瘤特异性Treg标志物的列表(在用于治疗目的的肿瘤特异性Treg标志物的鉴定和排序的步骤7中鉴定)
Figure BDA0003881277930000761
参考文献
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Claims (23)

1.一种鉴定功能性疾病特异性调节性T细胞标志物的方法，其包括以下步骤：
(a)从至少患者病变组织样品和患者外周血样品制备相似比例的分离的调节性T(Treg)细胞和常规T(Tconv)细胞的混合物；
(b)对来自至少病变组织和外周血的分离的Treg和Tconv细胞的每种混合物进行单细胞基因表达谱分析与T细胞受体(TCR)谱分析的组合；
(c)鉴定Treg细胞和Tconv细胞的簇，其中所述簇包含彼此差异表达的基因或基因特征；
(d)在所鉴定的Treg细胞簇中确定至少一个功能性疾病特异性Treg细胞簇，其中所述至少一个簇包含：
(i)相对于外周血，病变组织中具有较高比例的Treg细胞；
(ii)病变组织中具有克隆扩增TCR特异性的较高比例的Treg细胞；以及
(iii)病变组织中具有TCR触发、细胞活化和扩增的转录组特征的较高比例的Treg细胞；和
(e)鉴定与所有其它鉴定的Treg和Tconv细胞簇相比在功能性疾病特异性Treg细胞簇中差异表达的基因。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者病变组织样品是患者肿瘤样品和/或步骤(a)中的患者样品包括患者病变组织样品、患者组织引流淋巴结样品和患者外周血样品，特别是患者肿瘤样品、患者肿瘤引流淋巴结样品和患者外周血样品。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述混合物由约50％的Tconv细胞和约50％的Treg细胞组成。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中步骤(b)中组合的单细胞基因表达谱分析和T细胞受体(TCR)谱分析通过单细胞RNA测序方法进行。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述至少一个功能性疾病特异性Treg细胞簇包含较高比例的过度表达以下一种或多种的Treg细胞：REL、NKKB2、NR4A1、OX-40、4-1BB、MHC II类分子，特别是HLA-DR、CD39、CD137和GITR。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述疾病是癌症；优选地，癌症选自：非小细胞肺癌(NSCLC)；乳腺癌；皮肤癌；卵巢癌；肾癌和头颈癌；和横纹肌样瘤；更优选非小细胞肺癌。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述疾病选自急性或慢性炎性疾病、变应性疾病、自身免疫性疾病或感染性疾病、移植物抗宿主病、移植排斥反应。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，还包括根据以下步骤对用于治疗目的的肿瘤特异性Treg标志物进行鉴定和排序：
-步骤1：鉴定和选择编码细胞膜蛋白，优选具有细胞外结构域的跨膜或GPI锚定蛋白的n个差异表达基因的部分；
-步骤2：测定n个所选基因在正常组织中的平均表达水平，并在正常组织中从具有最低表达水平的基因为-1到具有最高表达水平的基因为-n对每个基因分配至少一个得分A；
-步骤3：测定肿瘤组织中n个所选基因的平均表达水平，并在肿瘤组织中从具有最高表达水平的基因为+n到具有最低表达水平的基因为+1对每个基因分配至少一个得分B；
-步骤4：测定除Treg外的正常PBMC的n个所选基因的平均表达水平，并在除Treg外的正常PBMC中从具有最低表达水平的基因为+n到具有最高表达水平的基因为+1对每个基因分配至少一个得分C；
-步骤5：测定除Treg外的肿瘤环境的n个所选基因的平均表达水平，并在除Treg外的肿瘤环境中从具有最低表达水平的基因为+n到具有最高表达水平的基因为+1对每个基因分配至少一个得分D；
-步骤6：测定i)肿瘤-Treg与正常组织-Treg相比，和ii)Treg与Tconvs相比n个所选基因的相对表达水平，并在i)(得分E)肿瘤Treg与正常相邻组织Treg相比，和ii)(得分F)Treg与Tconvs相比中从具有最高倍数变化表达水平的基因为+n到具有最低倍数变化的基因为+1对每个基因分配两个得分E和F；
-步骤7：对所分配的得分求和以获得每个基因的累积评估值(SUM SCORE)；和
-步骤8：基于所述累积评估值来确定所述候选治疗性靶标。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法鉴定的功能性肿瘤特异性Treg细胞的基因标签，其包含表1中所列上调和下调基因的组合。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法鉴定的用于检测、失活或耗尽肿瘤特异性Treg细胞的分子标志物，其选自表1的基因及其RNA或蛋白质产物。
11.根据权利要求10所述的分子标志物，其是选自下组的细胞表面标志物：ADORA2A、CALR、CCR8、CD4、CD7、CD74、CD80、CD82、CD83、CSF1、CTLA4、CXCR3、HLA-B、HLA-DQA1、HLA-DR，特别是HLA-DRB5、ICAM1、ICOS、IGFLR1、IL12RB2、IL1R2、IL21R、IL2RA、IL2RB、IL2RG、LRRC32、NDFIP2、NINJ1、NTRK1、SDC4、SLC1A5、SLC3A2、SLC7A5、SLCO4A1、TMPRSS6、TNFRSF18、TNFRSF1B、TNFRSF4、TNFRSF8、TNFRSF9、TSPAN13和TSPAN17。
12.根据权利要求10或11所述的分子标志物，其是选自下组的细胞表面标志物：CCR8、CD80、ICOS、IL12RB2、CTLA-4、TNFRS9、TNFRSF18、HLA-DR，如HLA-DRB5、ICAM1、CSF1、CD74、TNFRSF4、CXCR-3和TNFRSF1B。
13.根据权利要求10-12任一项所述的分子标志物，其是选自下组的细胞表面标志物：CD74、IL12RB2、HLA-DR，如HLA-DRB5、ICAM1和CSF1。
14.根据权利要求10所述的分子标志物，其是维生素D受体(VDR)。
15.根据权利要求10-14任一项所述的分子标志物，其是治疗性靶标。
16.根据权利要求15所述的分子标志物，其调节功能性肿瘤特异性Treg细胞的存活力、增殖、稳定性或抑制功能。
17.在治疗癌症的方法中用作Treg-失活剂或Treg-耗尽剂的试剂，其中所述试剂是根据权利要求15或16所述的治疗性靶标的调节剂；优选选自下组：有机小分子、适体、抗体、反义寡核苷酸、干扰RNA、核酶和其它激动剂或拮抗剂，例如治疗性靶蛋白的显性失活突变体或功能性片段。
18.在治疗癌症的方法中用作Treg-失活剂或Treg-耗尽剂的试剂，其中所述试剂是细胞毒性剂，其包含结合表1的肿瘤特异性Treg细胞表面标志物的分子，所述分子与细胞毒性化合物偶联；优选地，其中结合所述肿瘤特异性Treg细胞表面标志物的分子是包含抗原结合位点的抗体或其功能片段。
19.根据权利要求18所述的用于其用途的试剂，其中所述来自表1的肿瘤特异性Treg细胞表面标志物选自权利要求11至13中任一项所述的列表。
20.根据权利要求18或19所述的用于其用途的试剂，其用于体内或离体使肿瘤特异性Treg细胞失活或耗尽。
21.一种诊断、预后或监测癌症的体外方法，其包括在来自受试者的肿瘤样品中以及最终还在来自受试者的肿瘤引流淋巴结样品中检测至少一种根据权利要求10至14中任一项所述的分子标志物的存在或表达水平的步骤；优选地，其中所述方法还包括基于所述标志物的存在、不存在或表达水平将受试者分类为有利或不利结果类别的步骤。
22.一种工程化Treg细胞，其对于至少一个表1的上调基因是有缺陷的或其过度表达至少一个表1的下调基因；优选还包含至少一种特异性结合靶抗原的基因工程化抗原受体。
23.根据权利要求22所述的工程化Treg细胞，其对于权利要求11-14中任一项列出的基因之一是有缺陷的。
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