CN110343667A

CN110343667A - 工程化的免疫细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110343667A
Application number: CN201910644764.7A
Authority: CN
Inventors: 许中伟; 张�浩
Original assignee: Beicelt (beijing) Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beicelt (beijing) Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-07-17
Filing date: 2019-07-17
Publication date: 2019-10-18

Abstract

本发明公开一种工程化的免疫细胞及其制备方法和应用。本发明的工程化的免疫细胞内含有特异性结合蛋白的编码核酸和可选的与编码核酸可操作地连接的指导其在免疫细胞内产生特异性结合蛋白的调控序列，和/或免疫细胞以使特异性结合蛋白的至少一部分暴露于免疫细胞的表面外侧的方式结合有特异性结合蛋白；在免疫细胞的基因组内存在至少一个基因片段的缺失，从而下调或阻断胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白在免疫细胞内的表达/产生，或者降低/消除该盒蛋白活性；并且工程化的免疫细胞丧失或下调原有的抑制或者关闭免疫应答的功能。

Description

工程化的免疫细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及工程化免疫细胞，具体涉及具有抑制免疫细胞耗竭功能的工程化的免疫细胞及其制备方法和应用。

背景技术

编码胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白的基因位于8q12.1(第8号染色体1区2带第1亚带)，全长313791bp，共9个外显子，该基因的cDNA全长4076bp。该盒蛋白共包含526个氨基酸，定位在细胞核中，在该分子的第261-310部位含有HMG(High Mobility Group)盒子，胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白家族共有4个家族成员；该分子的表达在Calcineurin(CaN)激活NFATC3后被激活。胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白的HMG box可与染色体DNA结合，但与DNA的结合没有序列特异性，它可使T细胞CD8基因启动子去甲基化，促进T细胞中CD8的表达，在CD8+T细胞发育中起重要作用，也有研究提示胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白在T细胞淋巴瘤和其它实体瘤的发生过程中发挥重要作用，此外，胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白也参与CD4+T细胞、NK细胞等免疫细胞发育过程。

发明内容

胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白在病毒慢性感染和肿瘤细胞介导的T细胞衰竭中具有重要调节作用，病毒和肿瘤细胞的长期刺激使该盒蛋白在CD8+T细胞中的表达量显著增加，进一步升高免疫抑制性受体PD-1、TIM3、LAG3、CTL4等分子的表达，其分泌IFN-r、IL-2、TNF-a水平则显著降低；通过基因敲除小鼠获得的CD8+T细胞受肿瘤细胞长期刺激，这些免疫抑制性受体的表达升高现象消失，提示胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白在CD8+T细胞对肿瘤的作用中具有重要调节作用。为此，本发明提供一种工程化的免疫细胞，从而促进了胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白在肿瘤、慢性病毒感染等疾病的过继性免疫疗法中的研究及应用。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种工程化的免疫细胞，其具有以下性质或功能(1)-(3)：

(1)在所述免疫细胞内含有特异性结合蛋白的编码核酸和可选的与所述编码核酸可操作地连接的指导其在所述免疫细胞内产生所述特异性结合蛋白的调控序列，和/或所述免疫细胞以使所述特异性结合蛋白的至少一部分暴露于所述免疫细胞的表面外侧的方式结合有所述特异性结合蛋白；

(2)在所述免疫细胞的基因组内存在通过基因编辑产生的至少一个基因片段的缺失，从而下调或阻断胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白在所述免疫细胞内的表达/产生，或者降低/消除胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白的活性；

(3)所述工程化的免疫细胞丧失或下调原有的抑制或者关闭免疫应答的功能。

在某些实施方案中，所述免疫细胞包括T细胞、NK细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞和巨噬细胞；或能够产生此类细胞的未分化细胞或者免疫记忆细胞。

在某些实施方案中，所述特异性结合蛋白包括嵌合抗原受体和基因修饰的T细胞受体。

在某些实施方案中，所述嵌合抗原受体包含配体或受体结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域；其中，所述配体和/或受体选自肿瘤特异性抗原和病原体抗原中的至少一种；所述胞内信号结构域包含共刺激结构域和/或初级信号结构域。

在某些实施方案中，所述肿瘤特异性抗原包括CD19、CD123、ERRB2、间皮素和新抗原；所述病原体抗原包括源自HAV、HBV、HCV、CMV、HIV、EB病毒、登革热病毒、HPV、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、HTLV-1、流行性感冒病毒、BLV、百日咳病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、天花、带状疱疹病毒、炭疽病毒、破伤风病毒、轮状病毒、狂犬病毒、禽痘病毒、脑膜炎球菌、肺炎球菌、链球菌、葡萄球菌、奈瑟氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、利什曼虫、呼吸道合胞病毒、副流感、腺病毒、水痘、黄病毒、结核分枝杆菌和疟原虫的抗原。

在某些实施方案中，所述基因修饰的T细胞受体通过基因改造从而使T细胞受体与肿瘤相关抗原TAA的亲和力增强。

在某些实施方案中，所述基因片段为源自SEQ ID No.1-4所示任一序列的由2-100个连续碱基序列组成的基因片段；或者所述基因片段为源自SEQ ID No.5-13所示任一序列的由2-100个连续碱基序列组成的基因片段。

本发明的第二方面，提供一种工程化的免疫细胞的制备方法，其包括以下步骤(a)和(b)以及可选的步骤(c)和(d)：

a.提供起始免疫细胞的步骤，其中起始免疫细胞具有抑制或者关闭免疫应答的功能，且所述起始免疫细胞内含有特异性结合蛋白的编码核酸和可选的与所述编码核酸可操作地连接的指导其在细胞内产生所述特异性结合蛋白的调控序列，和/或所述起始免疫细胞以使所述特异性结合蛋白的至少一部分暴露于细胞表面外侧的方式结合有所述特异性结合蛋白；

b.将基因编辑系统导入所述起始免疫细胞得到工程化的免疫细胞的步骤，其中，所述基因编辑系统包括Cas蛋白和gRNA，所述gRNA具有与靶序列互补的识别区，所述靶序列为源自SEQ ID No.1-4所示任一序列的由多个连续碱基组成的序列，其中，所述工程化的免疫细胞的基因组中存在至少一个基因片段的缺失，从而下调或阻断胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白在所述免疫细胞内的表达/产生，或降低/消除该盒蛋白活性；

c.起始免疫细胞的制备步骤，将特异性结合蛋白的编码核酸和可选的与所述编码核酸可操作地连接的指导其在细胞内产生所述特异性结合蛋白的调控序列导入宿主免疫细胞，并使其表达或产生特异性结合蛋白，从而得到起始免疫细胞；

d.基因编辑系统的制备步骤，将包含用于产生Cas蛋白和gRNA的病毒载体导入包装细胞得到包装病毒作为基因编辑系统。

本发明的第二方面，还提供工程化的免疫细胞的第二制备方法，其包括以下步骤(a’)和(b’)以及可选的(c’)

a’.提供宿主免疫细胞的步骤，其中所述宿主免疫细胞具有抑制或者关闭免疫应答的功能；

b’.将基因编辑系统导入所述宿主免疫细胞得到起始免疫细胞的步骤，其中，所述基因编辑系统包括Cas蛋白和gRNA，所述gRNA具有与靶序列互补的识别区，所述靶序列为源自SEQ ID No.1-4所示任一序列的由多个连续碱基组成的序列，其中，所述起始免疫细胞的基因组中存在至少一个基因片段的缺失；

c’.将特异性结合蛋白的编码核酸和可选的与所述编码核酸可操作地连接的指导其在细胞内产生特异性结合蛋白的调控序列导入所述起始免疫细胞内，从而在所述起始免疫细胞表达或产生所述特异性结合蛋白。

在某些实施方案中，本发明的基因编辑系统包括第一基因编辑系统和第二基因编辑系统；其中，所述第一基因编辑系统包括第一Cas蛋白和第一gRNA，所述第二基因编辑系统包括第二Cas蛋白和第二gRNA；所述第一gRNA具有与第一靶序列互补的第一识别区，所述第二gRNA具有与第二靶序列互补的第二识别区；其中，所述第一靶序列与所述第二靶序列分别位于选自SEQ ID No.1-4所示序列中的同一序列内，且所述第一靶序列与所述第二靶序列之间的距离为5-1000个碱基。

在某些实施方案中，本发明的第一Cas蛋白和第二Cas蛋白为相同的蛋白。

在某些实施方案中，本发明的gRNA包含选自由SEQ ID No.14-27所示的序列组成的组的序列。

本发明的第四方面，提供一种在免疫细胞内进行基因编辑的方法，所述基因编辑能够下调或阻断免疫细胞内胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白的表达，或者降低/消除胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白的活性，基因编辑方法包括使基因编辑系统进入宿主免疫细胞或起始免疫细胞，从而在基因组水平上产生基因片段的缺失，其中，所述基因编辑系统包括Cas蛋白和gRNA，所述gRNA具有与靶序列互补的识别区，所述靶序列为源自SEQ IDNo.1-4所示任一序列的由多个连续碱基组成的序列。

本发明的第五方面，提供一种药物组合物，其包含第一方面所述的工程化的免疫细胞和可选的药物学或生理上可接受载体。

本发明的第六方面，提供一种预防或治疗疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用预防或治疗有效量的工程化的免疫细胞，或本发明第五方面所述的药物组合物。

在某些实施方案中，工程化的免疫细胞相对于所述受试者为自体细胞或异体细胞。

在某些实施方案中，预防或治疗疾病的方进一步包括向所述受试者联合施用选自免疫检查点分子抑制剂、共刺激分子激动剂和抗肿瘤剂中的至少一种药剂。

在某些实施方案中，本发明所述的疾病为肿瘤或病原体感染病。

附图说明

图1为本发明示例性gRNA的测定结果图。

图2为基因编辑后的Western blot实验结果。

图3为基因编辑后流式细胞仪的分析结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“％”为基于重量的百分数。

本发明中，术语“免疫细胞”是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，其实例包括但不限于淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。优选地，免疫细胞为例如，T细胞、NK细胞、NKT细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞和巨噬细胞。在某些实施方案中，本发明的免疫细胞包括T细胞，例如CD4+T细胞和CD8+T细胞。本发明中，免疫细胞可以是终末分化的细胞，也可以是分化方向上的不同阶段的细胞，如免疫记忆细胞，甚至可以是未分化的细胞。在某些实施方案中，本发明的免疫细胞为能够产生具有上述性质(1)-(3)的工程化的免疫细胞的未分化细胞，例如干细胞和祖细胞。在这种情况下，优选地，当该免疫细胞被引入机体内时可进一步形成终末分化的细胞。另外，免疫细胞的来源不限定，可以是人类来源的免疫细胞，也可以是哺乳动物来源的免疫细胞。例如，大鼠、小鼠、猪、狗、猴、猩猩来源的免疫细胞。

本发明中，术语“宿主免疫细胞”是指未经人工改造过的野生型免疫细胞。其中，此处的“未经人工改造”是指未对细胞的性质或功能进行过实质性的改变，包括性质或功能的增加、减少，也包括性质或功能的增强或降低，但是不包括将细胞从其天然环境中分离、纯化或提取出来。宿主免疫细胞包括在其天然环境存在的状态的宿主免疫细胞，也包括从天然环境中分离、纯化或提取后处于人工环境的宿主免疫细胞，还包括传代培养后得到的宿主免疫细胞。

本发明中，术语“起始免疫细胞”是指对宿主免疫细胞进行初步改造，或在得到本发明的工程化的免疫细胞的过程中处于未完成状态的免疫细胞。由于工程化方式不同以及工程化阶段不同，起始免疫细胞并非一种特定类型的细胞，而是具有不同性质或功能的一类细胞的总称。根据工程化方式不同，起始免疫细胞可以是具有本发明所述三种性质或功能中任意一种或两种的免疫细胞。

本发明中，术语“工程化的免疫细胞”是指在宿主免疫细胞或起始细胞的基础上经工程化操作手段而得到的具有至少下述三种性质或功能的免疫细胞：(1)在工程化的免疫细胞内含有特异性结合蛋白的编码核酸和可选的与所述编码核酸可操作地连接的指导其在细胞内产生特异性结合蛋白的调控序列，和/或免疫细胞以使特异性结合蛋白的至少一部分暴露于免疫细胞的表面外侧的方式结合有特异性结合蛋白；(2)在免疫细胞的基因组内存在至少一个基因片段的缺失，从而下调或阻断胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白(即，Thymocyte selection-associated HMG box protein，缩写TOX)在所述免疫细胞内的表达/产生，或者降低/消除胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白的活性；(3)工程化的免疫细胞丧失或下调原有的抑制或者关闭免疫应答的功能。

本发明中，术语“特异性结合蛋白”是指相对于其他蛋白而言，本发明的蛋白优先选择性结合目标配体/受体(也称作“靶配体/受体”)。本发明的特异性结合蛋白是通过基因工程改造的蛋白，其不仅能够与配体/受体特异性结合，而且还能在结合后将信号传导至细胞内，并引起免疫效应。优选地，“特异性结合蛋白”对于目标配体/受体的亲和力大于其他蛋白质。例如，通过表面等离振子共振测定的平衡解离常数(KD)值小于10^-7M，优选小于10^- ⁸M，更优选小于10^-9M。

本发明中，术语“抑制或者关闭免疫应答的功能”是指免疫细胞功能耗竭。即，在例如病毒感染或肿瘤发生后，免疫细胞增殖分化成为例如病毒特异性的或肿瘤特异性的效应细胞，由于例如慢性病毒或肿瘤持续存在，效应细胞免疫功能逐渐降低，增殖能力下降，细胞存活率下降，并且不能分化形成记忆性细胞。

[工程化的免疫细胞]

本发明的第一方面，提供一种工程化的免疫细胞，其至少具有本发明所述的三种性质或功能。本发明的三种性质或功能在原来的宿主免疫细胞中不存在，而是通过人工改造增加的性质或功能。下面详细说明三种性质或功能。

性质或功能(1)

本发明的性质或功能(1)是指在工程化的免疫细胞内含有特异性结合蛋白的编码核酸和可选的与编码核酸可操作地连接的指导其在细胞内产生特异性结合蛋白的调控序列，和/或免疫细胞以使特异性结合蛋白的至少一部分暴露于免疫细胞的表面外侧的方式结合有特异性结合蛋白。

本发明中，特异性结合蛋白可以是嵌合抗原受体和基因修饰的T细胞受体。

嵌合抗原受体

本发明的嵌合抗原受体是一种工程化蛋白分子，其具有识别感兴趣的细胞表面的抗原，并诱导免疫细胞活化的功能。优选地，嵌合抗原受体为将识别癌细胞的细胞表面抗原的单链抗体与诱导T细胞活化的信号转导区融合而得到的人工嵌合蛋白。更优选地，嵌合抗原受体包含配体/受体结合结构域(本文有时简称为“结合结构域”)、跨膜结构域和胞内信号结构域。

本发明中，配体/受体结合结构域是指能够与所需的配体或受体结合的区域。结合结构域一般以位于免疫细胞的表面，并暴露至表面的外侧的方式设置，从而能够有利于结合结构域与配体/受体的结合。配体/受体结合结构域可以是源自抗体的抗原结合区。例如,scFv。本发明的嵌合抗原受体可包含多个配体/受体结合结构域，例如2、3、4、或5个。每个配体/受体结合结构域可结合至一个靶配体/受体，例如，抗原。在这种情况下，一个嵌合抗原受体可以结合多个不同的配体/受体或者相同的配体/受体，例如，相同抗原上的相同或不同表位。多个配体/受体结合结构域之间可以串联连接。任选地，在两个结合结构域之间可设置接头或铰链。

本发明中，能够与结合结构域特异性结合的配体/受体的实例包括肿瘤特异性抗原和病原体抗原。

其中，肿瘤特异性抗原(TSA)是指仅表达在肿瘤细胞表面而不存在于正常细胞的抗原。这类抗原可存在于不同个体同一组织类型的肿瘤中，如人恶性黑色素瘤基因编码的黑色素瘤特异性抗原，可存在于不同个体的黑色素瘤细胞，但正常的黑色素细胞不表达。TSA也可以为不同组织学类型的肿瘤所共有，如突变的Ras基因产物可常见于肺癌、消化道肿瘤等，但由于其氨基酸序列与正常的原癌基因Ras的表达产物不一致，可以被机体的免疫系统识别，激发机体的免疫反应。通常，这类由突变产生的抗原，称之为新抗原(neoantigen)。肿瘤特异性抗原的实例包括但不限于CD19、CD123、ERRB2、间皮素和新抗原。

其中，病原体抗原可为任何类型的抗原，其实例包括但不限于源自HAV、HBV、HCV、CMV、HIV、EB病毒、登革热病毒、HPV、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、HTLV-1、流行性感冒病毒、BLV、百日咳病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、天花、带状疱疹病毒、炭疽病毒、破伤风病毒、轮状病毒、狂犬病毒、禽痘病毒、脑膜炎球菌、肺炎球菌、链球菌、葡萄球菌、奈瑟氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、利什曼虫、呼吸道合胞病毒、副流感、腺病毒、水痘、黄病毒、结核分枝杆菌和疟原虫的抗原。本发明的病原体抗原可以是上述抗原中的一种或多种的组合。

本发明中，跨膜结构域是指能够横跨细胞膜的厚度方向的化学结构，从而使特异性结合蛋白束缚或固定于细胞表面。跨膜结构域一般为源自蛋白质的疏水性跨膜多肽片段。例如，CD8a的跨膜结构域。跨膜结构域可使用本领域已知的结构。此类结构的实例包括但不限于源自下述蛋白质的疏水性跨膜片段：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、SLAM蛋白、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp和CD19a。

本发明中，胞内信号结构域是指结合结构域与配体/受体结合后能够向细胞内转导信号的区域。一般而言，胞内信号结构域位于细胞膜的内侧，从而有利于向细胞内转导信号。本发明可使用任何已知的胞内信号结构域。优选地，胞内信号结构域包含选自CD28、4-1BB(CD137)、GITR、CD27、OX40、HVEM、CD3ζ、KIAS2、NKG2D、DAP10、DAP12的多肽中的至少1种或2种以上，更优选地，含有CD28、4-1BB、及CD3ζ这3种的细胞内区的多肽。

本发明中，胞内信号结构域可包含共刺激结构域，也可包括初级信号结构域。示例性初级胞内信号结构域的实例包括但不限于源自负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子。示例性共刺激胞内信号结构域的实例包括但不限于源自负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子。

在某些实施方案中，本发明的初级信号结构域包含T细胞受体的胞质序列，共刺激胞内信号结构域包含来自共同受体或共刺激分子的胞质序列。可选地，本发明的初级信号结构域包含免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM的信号基序。本发明的共刺激胞内信号结构域是共刺激分子的胞内部分。胞内信号结构域可以包含其来源分子的完整胞内部分，或完整的天然胞内信号结构域，或其功能性片段。

基因修饰的T细胞受体

本发明的基因修饰的T细胞受体(TCR)是指针对T细胞受体的胞外结构进行改造，使其具有改造，特别是增强的识别并结合肿瘤相关抗原TAA的能力，从而使基因修饰后的T细胞受体能够大大提高与TAA的亲和力。本发明中，TAA是指在肿瘤细胞和正常细胞都存在的抗原分子，其实例包括：胚胎性蛋白、糖蛋白抗原、鳞状细胞抗原等。TAA并非肿瘤细胞所特有，正常细胞也可以微量合成，而在肿瘤细胞增殖时高度表达。

编码核酸

本发明的编码核酸是指能够表达/产生特异性结合蛋白的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。一般而言，本发明的编码核酸包含至少一个开放阅读框。该开放阅读框对应于本发明的特异性结合蛋白。本发明可以常规基因工程技术克隆、扩增、顺序拼接多个不同基因，从而得到所需的特异性结合蛋白。在示例性实施方案中，本发明将靶细胞表面抗原的scFv编码基因、跨膜域编码基因和CD3胞内域编码基因(可加入CD28胞内域编码基因和4-1BB编码基因等辅助的共刺激信号)构建为融合基因，从而得到编码核酸。

调控序列

本发明的工程化的免疫细胞中，可选地，进一步包括调控序列，调控序列可操作地连接至本发明的编码核酸，用于指导编码核酸在免疫细胞内产生特异性结合蛋白。调控序列的实例包括启动子(例如，H1或U6衍生的启动子)、增强子和终止子等。本发明的调控序列可位于编码核酸的上游，也可位于编码核酸的下游。例如，启动子和增强子等位于编码核酸的上游，终止子位于编码核酸的下游。本发明的调控序列可以包含于载体或构建体内。例如，调控序列可以包含于慢病毒内。优选地，本发明的调控序列能够使编码核酸在除终末分化细胞外的其他分化阶段的细胞中处于沉默状态，而当免疫细胞进入终末分化状态时启动其表达。

性质或功能(2)

本发明的性质或功能(2)是指免疫细胞的基因组内存在通过基因编辑产生的至少一个基因片段的缺失，从而下调或阻断胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白在所述免疫细胞内的表达或产生，或者降低/消除该盒蛋白的活性。

本发明的基因片段是指与胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白的表达或产生相关的基因片段，其可以是编码胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白的基因片段，也可以是调节此类蛋白表达或产生的调控序列的片段。本发明的基因片段源自位于人类基因组8q12.1(第8号染色体1区2带第1亚带)的全长313791bp中的片段。经分析该序列中共存在9个外显子，产生全长4076bp的cDNA。因此，优选本发明的基因片段可以是源自该cDNA(SEQID No.1)的基因片段。由于该区域内的序列存在不同的亚型，例如SEQ ID No.2-4所示的亚型。因此，本发明的基因片段还可以是源自SEQ ID No.2-4中的基因片段。

在某些实施方案中，本发明的免疫细胞为哺乳动物，在此情况下，基因片段是指来源于与人类基因组8q12.1的全长313791bp的区域，特别是其中的外显子对应的区域的基因片段。此时，基因片段是指源自与SEQ ID No.1-4所示任一序列同源性为60％以上，优选70％以上，更优选80％以上，进一步优选90％以上，还优选95％以上，甚至99％以上的序列的基因片段。

本发明的基因片段的长度不特别限定，只要能够引起胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白的表达或产生下调或阻断即可。一般而言，此类基因片段的长度为2-100nt，优选2-80nt，更优选2-50nt。

性质或功能(3)

本发明的性质或功能(3)是指工程化的免疫细胞丧失或下调原有的抑制或者关闭免疫应答的功能。即，本发明的工程化的免疫细胞能够抵抗免疫耐受。

与天然免疫细胞容易经受耗竭相比，本发明的工程化的免疫细胞能够免受此类耗竭的影响，从而能够长期刺激产生免疫效应功能。该性质或功能是由于免疫细胞内胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白的产生或表达被下调或阻断，或者降低/消除其活性而引起的。

[工程化的免疫细胞的制备方法]

本发明的第二方面，提供工程化的免疫细胞的制备方法，也可简称为本发明的制备方法。本发明的制备方法包括以宿主免疫细胞(即，野生型免疫细胞或天然存在的免疫细胞)为基础进行的工程化，也可包括以起始免疫细胞(即，经初步改造得到的免疫细胞)为基础进行的工程化。上述两种制备方法分别称作第一制备方法和第二制备方法。

以宿主免疫细胞为基础的制备方法

本发明的第一制备方法为以宿主免疫细胞(即，野生型免疫细胞或天然存在的免疫细胞)为基础进行工程化。为了得到本发明的工程化的免疫细胞，第一制备方法一般包括两次免疫细胞的基因改造。即，1).将特异性结合蛋白的编码核酸导入免疫细胞的改造，和2).将基因编辑系统导入免疫细胞的改造。两种改造进行的顺序不特别限定，可以按步骤1)、步骤2)的先后顺序进行，也可以按步骤2)、步骤1)的先后顺序进行。另外，在不影响本发明的目的情况下，步骤1)和步骤2)还可以同时进行。

在示例性实施方案中，本发明的第一制备方法包括：提供宿主免疫细胞的步骤，其中所述宿主免疫细胞具有抑制或者关闭免疫应答的功能；将基因编辑系统导入所述宿主免疫细胞得到起始免疫细胞的步骤，其中，所述基因编辑系统包括Cas蛋白和gRNA，所述gRNA具有与靶序列互补的识别区，所述靶序列为源自SEQ ID No.1-4所示任一序列的由多个连续碱基组成的序列，其中，所述起始免疫细胞的基因组中存在至少一个基因片段的缺失；将特异性结合蛋白的编码核酸和可选的与所述编码核酸可操作地连接的指导其在细胞内产生特异性结合蛋白的调控序列导入所述起始免疫细胞内，从而在所述起始免疫细胞表达或产生所述特异性结合蛋白。

在另外的示例性实施方案中，本发明的第一制备方法包括：将特异性结合蛋白的编码核酸和可选的与编码核酸可操作地连接的指导其在细胞内产生特异性结合蛋白的调控序列导入宿主免疫细胞，并使其表达或产生特异性结合蛋白，从而得到起始免疫细胞的步骤；将基因编辑系统导入该起始免疫细胞得到工程化的免疫细胞的步骤。

本发明中，基因编辑系统是指能够在基因组水平上对DNA进行永久性敲除的系统，此类永久性敲除能够稳定地存于细胞中，并且可经传代。本发明的基因编辑系统可使用本领域已知的那些，其一般包括Cas蛋白和gRNA。Cas蛋白的类型不特别限定，只要其具有核酸酶和解旋酶活性即可。Cas蛋白可以是天然存在的酶，也可以是重组酶。Cas蛋白不仅包含本申请日之前已鉴定的任何蛋白，还包含基于目前已知的知识能够确定可能具有该蛋白活性，并在本申请日之后鉴定其活性的蛋白。还优选地，本发明使用对天然Cas蛋白进行改造，以达到所需功能或目的的突变体。在示例性实施方式中，本发明的Cas蛋白是Cas9蛋白家族或其突变体，例如高精确(High-fidelity，SpCas9-HF1)、高特异(enhanced specificity，eSpCas9(1.1))和超精确(hyper-accurate Cas9，HypaCas9)Cas9蛋白。由于这些蛋白均为源自Cas9的突变体，可大大降低脱靶效应，安全性大为提高，因此优选这些蛋白。

本发明中，gRNA的结构是已知的，其包括与靶序列互补的识别区。本发明中，可以针对源自SEQ ID No.1-4所示任一序列作为靶序列的来源设计识别区。靶序列的长度不特别限定，一般为2-100nt，优选3-80nt，更优选5-60nt。

本发明中，在设计gRNA时，优先选择胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白基因前三个外显子的序列为靶序列。设计识别区时可遵循本领域已知的原则。这些原则包括：1)对于gRNA的长度，一般应为20nt左右；2)对于gRNA序列的碱基组成，可选3'末端含GG的gRNA，同时gRNA种子序列尽量避免以4个以上的T结尾，GC％含量最佳为40％～60％；3)gRNA的种子序列与脱靶位点的匹配数尽可能低；4)如果构建U6或T7启动子驱动gRNA的表达载体，需考虑gRNA的5'碱基为G或GG，以提高其转录效率；5)对于gRNA靶向基因的结合位置，如需造成基因移码突变，需尽量靠近基因编码区的ATG下游，最好位于第一或第二外显子；6)检查gRNA靶向结合位点基因组序列是否存在SNPs；7)全基因脱靶效应分析，需考虑脱靶位点最大允许几个错配碱基数，建议最少5个碱基。重点考察种子序列和非种子序列碱基错配数，以及脱靶位点是否位于基因编码区，另外还可考察是否存在碱基缺失或缺失的脱靶位点。优选地，gRNA的靶序列位于第三外显子，例如第三外显子第24-43位之间、第500-200位(优选第130-149位)之间、第177-196位之间、第189-208位之间、第197-216位之间、第75-94位之间。还优选地，gRNA的靶序列位于第二外显子，例如第二外显子的第40-59位核苷酸等。在示例性实施方案中，gRNA包含SEQ ID No.14-27任一项所示的序列，或者包含这些序列中两种以上的组合。

本发明的基因编辑系统可以装载于表达载体，例如质粒、慢病毒载体、腺病毒载体和逆转录病毒载体中。本发明可使用已知的基因编辑系统，并通过设计特定的靶识别区来进行本发明的制备方法。本发明还可以使用已知技术手段来构建或制备基因编辑系统。

在示例性实施方案中，本发明通过将表达Cas蛋白和gRNA的病毒载体导入包装细胞来得到基因编辑系统。通过包装细胞得到含载体的病毒颗粒并进行导入的方法可以使免疫细胞内包含gRNA和Cas蛋白，但是不包含用于表达gRNA和/或编码Cas蛋白的基因。例如，免疫细胞内不包含用于产生gRNA和/或Cas蛋白的任何表达载体或质粒。此时的免疫细胞具有确定量的gRNA和/或Cas蛋白，不能通过转录或翻译而产生新的gRNA或Cas蛋白。由于通过该方式可以对基因编辑系统的量进行控制，因而是优选地。

本发明中，将特异性结合蛋白的编码核酸或基因编辑系统导入细胞的方式可以采用本领域已知的任何方式。

以起始免疫细胞为基础的制备方法

本发明的第二制备方法包括以起始免疫细胞为基础进行工程化的步骤。其中起始免疫细胞具有抑制或者关闭免疫应答的功能，并且起始免疫细胞内含有特异性结合蛋白的编码核酸和可选的调控序列，和/或在起始免疫细胞的外表面以使特异性结合蛋白的至少一部分暴露于外侧的方式结合有特异性结合蛋白。本发明中所使用的起始免疫细胞可以是已知的任何类型，例如，通过商业渠道可自由获得的那些。本发明也可使用通过已知技术手段利用已知宿主细胞人工改造的那些。

本发明的第二制备方法包括将基因编辑系统导入起始免疫细胞得到工程化的免疫细胞。其中，基因编辑系统已在上面进行的详细说明，在此不再赘述。

需要说明的是，本领域技术人员已知，无论第一制备方法还是第二制备方法均可包括一次性同时，或多次分别向免疫细胞内导入多个或多种基因编辑系统，从而在多个目标位置分别进行编辑，产生多个基因片段的缺失。在示例性实施方案中，本发明的基因编辑系统包括第一基因编辑系统和第二基因编辑系统。其中，第一基因编辑系统包括第一Cas蛋白和第一gRNA，第二基因编辑系统包括第二Cas蛋白和第二gRNA。第一gRNA具有与第一靶序列互补的第一识别区，第二gRNA具有与第二靶序列互补的第二识别区。其中，第一靶序列与第二靶序列位于同于选自SEQ ID No.1-4所示序列中的同一序列，且第一靶序列与第二靶序列之间的距离为2-100个碱基。另外，在第一基因编辑系统中的第一Cas蛋白和第二编辑系统中的第二Cas蛋白可以相同，也可以不同。

[在免疫细胞内进行基因编辑的方法]

本发明的第三方面，提供在免疫细胞内进行基因编辑的方法，有时也称作本发明的敲除方法。通过本发明的方法可使免疫细胞的基因组内产生永久性基因片段缺失，从而能够使免疫细胞内胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白的表达下调或阻断，或者降低/消除该盒蛋白活性。本发明中，作为待基因编辑的靶细胞的免疫细胞是指体外细胞，并非体内的活性细胞。此类免疫细胞可以是自体细胞，也可以是异体细胞。本发明优选为自体细胞。

本发明的基因编辑方法包括使基因编辑系统进入宿主免疫细胞或起始免疫细胞的步骤。此处的基因编辑系统中的gRNA具有与靶序列互补的识别区，该靶序列为源自SEQID No.1-4所示任一序列的由多个连续碱基组成的序列。优选地，gRNA包含SEQ ID No.14-27任一项所示的序列，或者包含这些序列中两种以上的组合。

[药物组合物]

本发明的第四方面，提供一种药物组合物，其包含本发明所述的工程化的免疫细胞和可选的药物学或生理上可接受载体。本发明的药物组合物可用于肿瘤或病原体感染，特别是慢性感染的预防和治疗。工程化的免疫细胞已在上文中进行了详细说明，在此不再赘述。下面说明药物组合物的其他成分。

本发明的药物组合物包含可选的药物学或生理上可接受载体。药物学可接受载体在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。此类载体可以是一种，也可以是多种，药物学可接受载体包括稀释剂和赋形剂，其具体实例包括但不限于缓冲液如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；糖如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。

本发明的药物组合物的形式不特别限定，可以是适于施用的任何形式。其中适于施用的形式包括能够提供适于待治疗(或预防)疾病的量和频率的形式。本发明的药物组合物的剂型包括，例如，注射剂、悬浮剂、乳化剂等。本发明的药物组合物可通过已知的方式施用至体内。例如，通过肌肉注射递送到感兴趣组织中，可选地经由静脉内、经皮、鼻内、经口、粘膜、或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本文有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

除了工程化的免疫细胞外，本发明的药物组合物还可包含其他活性成分。这些其他活性成分的实例包含但不限于免疫检查点分子的抑制剂、共刺激分子激动剂和抗肿瘤剂。

本发明中，免疫检查点分子的抑制剂的实例包含但不限于PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷或TGFR例如TGFRβ。

本发明中，共刺激分子的激动剂的实例包括但不限于OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD30、CD40、BAFFR、HVEM、CD7、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3和CD83配体。

本发明中，抗肿瘤剂的实例包括但不限于环磷酰胺、苯达莫司汀、异环磷酰胺、达卡巴嗪(dacarbazine)等烷基化药物、喷司他丁(pentostatin)、氟达拉滨(fludarabine)、克拉屈滨(cladribine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、依诺他滨(enocitabine)等代谢拮抗药、利妥昔单抗、西妥昔单抗、曲妥单抗(Trastuzumab)等分子靶向药物、伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、阿法替尼(afatinib)、达沙替尼(dasatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、曲美替尼(trametinib)等激酶抑制剂、硼替佐米(bortezomib)等蛋白酶体抑制剂、环孢菌素、他克莫司等钙调神经磷酸酶抑制剂、伊达比星(idarubicin)、多柔比星、丝裂霉素C等抗癌性抗生素、依立替康、依托泊苷(etoposide)等植物生物碱、顺铂、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂(carboplatin)等铂制剂、他莫昔芬和比卡鲁胺(bicalutamide)。

[预防或治疗疾病的方法]

本发明的第五方面，提供一种用于预防或治疗疾病的方法，其包括向有需要的受试者施用预防或治疗有效量的工程化的免疫细胞或药物组合物的步骤。本发明的疾病是指涉及免疫细胞耗竭的疾病，其实例包括但不限于肿瘤或病原体感染病，特别是慢性感染病。

本发明的预防或治疗有效剂量依赖于如预防或治疗环境和目标。本领域技术人员将理解合适的治疗剂量水平因此将高低不同，部分依赖于输送分子、待使用的免疫细胞的使用指导、给药途径、以及患者的体格(体种、体表面积或器官体积)和条件(年龄和总体健康状况)。因此临床医生可改变剂量并调整给药途径已达到最优治疗效果。根据上述因素，典型剂量范围可为单剂量约1×10⁷-1×10⁹个细胞，优选1×10⁸-1×10⁹个细胞，更优选1×10⁸-6×10⁸个细胞。

需要说明的是，精确剂量要根据需要治疗的受试者的相关因素来确定。调整剂量和给药方式以提供足够水平的活性化合物，或保持所需效果。被纳入考虑范围的因素可包括疾病状态的严重程度、受试者的总体健康状况、年龄、体重、性别、给药的时机和频率、药物化合物、反应敏感性和治疗反应。根据特定组合物的半衰期和清除速率，长效药物组合物的给药频率可为每3天或4天一次，每周一次，或两周一次。

本发明的给药频率要依赖于所用剂型中结合剂的药代动力学参数。一般而言，施用药物组合物直至药物达到所需效果为止。因此可单次给予组合物，或者在一个时期内多次给药(以相同或不同浓度/剂量)，或者持续灌输。精确确定合适的剂量将是例行工作。可通过使用合适的给药反应数据来估计合适的剂量。

本发明的预防或治疗时给药途径可采用已知方式。例如口服、静脉注射、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌内、眼内、动脉内、门静脉、病灶内途径、髓内、脑脊髓膜内、穿皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部给药、舌下和通过持续释放系统。如果需要，可使用静脉推注或持续灌注。

在一些情况下，可能需要以先体外后体内方式使用药物组合物。在这种方式下，从患者取出细胞、组织或器官然后暴露在体外环境进行处理，再移植回患者体内。

本发明的预防或治疗方法还可进一步包括向受试者联合施用选自免疫检查点分子的抑制剂、共刺激分子激动剂和抗肿瘤剂中的至少一种药剂。此类药剂已在上文中进行了详细说明，在此不再赘述。

实施例

一、实验材料及方法：

核酸限制性内切酶BsmBI为NEB公司产品、T4多核苷酸激酶为Takara公司产品、T4DNA快速连接酶为Promega公司产品、polybrene、PEI为Sigma公司产品、细胞培养瓶、一次性10ml吸管为Corning公司产品、0.2μm微孔滤膜为Millpore公司产品，细胞培养用DMEM、RPMI1640、0.025％胰酶、胎牛血清为Gibco公司产品、PE标记TOX抗体为Thermo Scientific公司产品、未标记αR-TOX抗体为Abclonal公司、细胞破膜剂为Thermo Scientific公司产品，PE标记αR二抗购自Jackson Lab、Western blot发光液购自普利来公司，β-actin抗体为CST公司产品。

主要仪器：超速离心机为Thermo Scientific公司、全自动化学发光图像分析仪为天能生物科技有限公司产品、流式细胞仪为ACEA Biosciences公司产品。

实施例中使用由上海生物工程有限公司合成的下述引物：

gRNA-1 130-149第三外显子

正向引物：5’-CACCGAGCAGGCCATTATGGTTCAT-3’(SEQ ID No.14)

反向引物：5’-AAACATGAACCATAATGGCCTGCTC-3’(SEQ ID No.15)

gRNA-2 177-196第三外显子

正向引物：5’-CACCGTGGAGACTGTGATTTCAGGG-3’(SEQ ID No.16)

反向引物：5’-AAACCCCTGAAATCACAGTCTCCAC-3’(SEQ ID No.17)

gRNA-3 189-208第三外显子

正向引物：5’-CACCGAGTCTCCAATATGCTGGGCC-3’(SEQ ID No.18)

反向引物：5’-AAACGGCCCAGCATATTGGAGACTC-3’(SEQ ID No.19)

gRNA-4 197-216第三外显子

正向引物：5’-CACCGTCCATCCTGGCCCAGCATAT-3’(SEQ ID No.20)

反向引物：5’-AAACATATGCTGGGCCAGGATGGAC-3’(SEQ ID No.21)

gRNA-5 75-94第三外显子

正向引物：5’-CACCGCATTCAGGTGCACCAGCGAG-3’(SEQ ID No.22)

反向引物：5’-AAACCTCGCTGGTGCACCTGAATGC-3’(SEQ ID No.23)

gRNA-6 40-59第二外显子

正向引物：5’-CACCG GCTGGCACATAGTCCTGGCT-3’(SEQ ID No.24)

反向引物：5’-AAACAGCCAGGACTATGTGCCAGCC-3’(SEQ ID No.25)

gRNA-7 24-43第二外显子

正向引物：5’-CACCGGAGCATGACAGAGCCGAGCC-3’(SEQ ID No.26)

反向引物：5’-AAACGGCTCGGCTCTGTCATGCTCC-3’(SEQ ID No.27)

gRNA-GFP

正向引物：5’-CACCGGAAGTTCGAGGGCGACACCC-3’

反向引物：5’-AAACGGGTGTCGCCCTCGAACTTCC-3’

1、含靶向HMG盒蛋白基因的gRNA慢病毒载体的构建：

(1)引物设计：将合适的接头(5’-CACCG)置于在编码gRNA序列的正向引物的5’端，同时合成反向引物(其5’端含AAAC序列，除去接头序列，其余序列与正向引物互补)。

(2)引物退火：将正反向引物用0.1×TE稀释为10μM，按如下体系进行退火反应：退火缓冲液12.5μl，正反向引物各6.25μl；94℃3min、70℃10min(PCR仪中进行)，然后关闭电源自然冷却至室温；

(3)退火引物的磷酸化：8μl退火引物、2μl T4多核苷酸磷酸激酶缓冲液、2μl 10mMATP、1μl T4多核苷酸磷酸激酶，补dH₂O至20μl；37℃30min、70℃10min(PCR仪中进行)；

(4)基因克隆：与用BsmBI酶切的含Cas9编码序列及U6启动子和TrancRNA序列的慢病毒表达载体片段进行连接、转化后提取质粒，用U6启动子引物(hu6-F，序列为：5’-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3’)进行测序反应。

2、病毒包装、浓缩、滴度测定、细胞感染

(1)取1.7×10⁷个293T细胞接种于T175细胞培养瓶中，24小时后，待细胞铺满80％左右时开始准备包装；

(2)对每种待包装的病毒而言，取出2支15ml离心管，每支加入1.15ml无血清DMEM，分别标记质粒组及PEI组；

(3)在质粒组加入30μl(0.523μg/μl)主质粒，33μl包装辅助质粒，室温放置5分钟；

(4)在PEI组加入186μl PEI，混匀，室温放置5分钟；

(5)将PEI组与质粒组溶液混匀，室温孵育20分钟；

(6)取出细胞，倒掉培养基，将包装混合液加入细胞培养液中，再加入20ml DMEM，于培养箱中培养；

(7)4小时后弃掉液体，加入35ml含10％FBS的DMEM细胞培养基；

(8)24和48小时后分别吸取细胞培养上清，与超速离心机中离心，离心条件为：4℃，25000rpm，2小时；

(9)吸弃上清，加入10ml 10％FBS的DMEM重悬，于-80℃保存

(10)取少量的病毒上清液进行病毒低毒测定(分别取对应于0.01μl、0.1μl、1μl的病毒上清于培养的HT1080细胞中，加入嘌呤霉素0.5μg/ml筛选，两周后根据细胞培养孔中的克隆数计算病毒的低度。

(11)按MOI＝15标准感染1×10⁶个Jurket细胞，在含5ml T25细胞培养瓶中加入10μl4mg/ml polybrene，6小时后1500rpm离心5分钟，弃掉上清，加入5ml含10％FBS的DMEM于T25细胞培养瓶中培养。

3、细胞总蛋白提取

细胞感染10天后，各取3×10⁶的细胞1500rpm/min离心5分钟，用预冷的1×PBS洗1次，加入100μl RIPA细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂1×COCKTAIL)，用枪头将细胞沉淀混匀，冰浴10min，超声破碎仪超声后(超声10s，暂停5s，20个循环)，冰浴10min，12000rpm离心10min，取蛋白上清，BSA法进行蛋白定量。

4、Western blot检测细胞总蛋白中胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白的表达量各取20μg细胞总蛋白进行SDS-PAGE(12％)蛋白电泳，电泳结束后运用半干转移槽将PAGE胶中蛋白转移至硝酸纤维素膜中，含5％脱脂奶粉的封闭液中室温封闭1小时，加入抗体(1:200)室温反应1小时，洗膜三次后，加入HRP标记的抗兔二抗室温反应1小时，后洗膜3次，加入反应底物后在全自动化学发光图像分析仪捕获反应条带；反应结束后，将PVDF膜用1×TBST洗3×7min，加入β-actin抗体反应1小时，洗膜三次后，加入HRP标记的抗小鼠二抗室温反应1小时，后洗膜3次，加入反应底物后在全自动化学发光图像分析仪捕获β-actin反应条带。

5、流式细胞仪检测细胞内胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白的表达水平

取5×10⁵的细胞2000rpm离心5min，用室温1×PBS洗1次，加入细胞破膜剂处理于4℃孵育20min，2000rpm离心5min，加入100倍稀释的洗液洗2次后，加入PE标记的抗体(0.3μg)室温反应30min，加入1×PBS洗2次，将抗体染色的细胞样品进行流式细胞仪检测，实验同时设不加抗体以及加抗兔二抗做同型对照。

二、实验结果

如图1所示，通过测序结果表明，设计的靶向胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白基因前三个外显子的7条gRNA均正确克隆如慢病毒表达载体中。

如图2所示，Western blot实验结果表明，和对照GFP的gRNA感染组细胞相比，3组感染胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白gRNA的细胞中胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白的表达水平明显下降，其中gRNA-1组降低的最明显。提示该序列具有较强的基因编辑活性。

如图3所示，通过流式细胞仪分析结果表明，和对照GFP的gRNA感染组细胞相比，感染胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白gRNA的细胞中胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白表达阳性的细胞比例明显降低：对照组胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白表达阳性的细胞为65.73％、gRNA-1感染组表达阳性的细胞为15.4％、gRNA-2感染组表达阳性的细胞为16.86％、gRNA-3感染组表达阳性的细胞为22.05％，表明设计的胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白gRNA在细胞内对胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白基因组进行了基因编辑，在大部分细胞中敲除了胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白的表达水平。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

序列表

<110> 贝赛尔特（北京）生物技术有限公司

<120> 工程化的免疫细胞及其制备方法和应用

<130> BH1900152-1

<141> 2019-07-17

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4076

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ctcttcttct taaacaaacc acaaacggat gtgagggaag gaaggtgttt cttttactcc 60

tgagcccaga cacctcactc tgttccgtct aagcttgttt tgctgaacac ttttttttaa 120

aaaaggaaaa agaaaaggag ttgcttgatg tgagagtgaa atggacgtaa gattttatcc 180

acctccagcc cagcccgccg ctgcgcccga cgctccctgt ctgggacctt ctccctgcct 240

ggacccctac tattgcaaca agtttgacgg tgagaacatg tatatgagca tgacagagcc 300

gagccaggac tatgtgccag ccagccagtc ctaccctggt ccaagcctgg aaagtgaaga 360

cttcaacatt ccaccaatta ctcctccttc cctcccagac cactcgctgg tgcacctgaa 420

tgaagttgag tctggttacc attctctgtg tcaccccatg aaccataatg gcctgctacc 480

atttcatcca caaaacatgg acctccctga aatcacagtc tccaatatgc tgggccagga 540

tggaacactg ctttctaatt ccatttctgt gatgccagat atacgaaacc cagaaggaac 600

tcagtacagt tcccatcctc agatggcagc catgagacca aggggccagc ctgcagacat 660

caggcagcag ccaggaatga tgccacatgg ccagctgact accattaacc agtcacagct 720

aagtgctcaa cttggtttga atatgggagg aagcaatgtt ccccacaact caccatctcc 780

acctggaagc aagtctgcaa ctccttcacc atccagttca gtgcatgaag atgaaggcga 840

tgatacctct aagatcaatg gtggagagaa gcggcctgcc tctgatatgg ggaaaaaacc 900

aaaaactccc aaaaagaaga agaagaagga tcccaatgag ccccagaagc ctgtgtctgc 960

ctatgcgtta ttctttcgtg atactcaggc cgccatcaag ggccaaaatc caaacgctac 1020

ctttggcgaa gtctctaaaa ttgtggcttc aatgtgggac ggtttaggag aagagcaaaa 1080

acaggtctat aaaaagaaaa ccgaggctgc gaagaaggag tacctgaagc aactcgcagc 1140

atacagagcc agccttgtat ccaagagcta cagtgaacct gttgacgtga agacatctca 1200

acctcctcag ctgatcaatt cgaagccgtc ggtgttccat gggcccagcc aggcccactc 1260

ggccctgtac ctaagttccc actatcacca acaaccggga atgaatcctc acctaactgc 1320

catgcatcct agtctcccca ggaacatagc ccccaagccg aataaccaaa tgccagtgac 1380

tgtctctata gcaaacatgg ctgtgtcccc tcctcctccc ctccagatca gcccgcctct 1440

tcaccagcat ctcaacatgc agcagcacca gccgctcacc atgcagcagc cccttgggaa 1500

ccagctcccc atgcaggtcc agtctgcctt acactcaccc accatgcagc aaggatttac 1560

tcttcaaccc gactatcaga ctattatcaa tcctacatct acagctgcac aagttgtcac 1620

ccaggcaatg gagtatgtgc gttcggggtg cagaaatcct cccccacaac cggtggactg 1680

gaataacgac tactgcagta gtgggggcat gcagagggac aaagcactgt accttacttg 1740

agaatctgaa cacctcttct ttccactgag gaattcaggg aagtgttttc accatggatt 1800

gctttgtaca gtcaaggcag ttctccattt tattagaaaa tacaagttgc taagcactta 1860

ggaccatttg agcttgtggg tcacccactc tggaagaaat agtcatgctt ctttattatt 1920

tttttaatcc tttatggaca ttgtttttct tcttccctga aggaaatttg gaccattcag 1980

attttatgtt ggttttttgc tgtgaagtgc tgcgctctag taactgcctt agcaactgta 2040

gatgtctcgg ataaaagtcc tggattttcc attggttttc ataatgggtg tttatatgaa 2100

actactaaag actttttaaa tggcttgatg tagcagtcat agcaagtttg taaatagcat 2160

ctatgttaca ctctcctaga gtataaaatg tgaatgtttt tgtagctaaa ttgtaattga 2220

aactggctca ttccagttta ttgatttcac aataggggtt aaattggcaa acattcatat 2280

ttttacttca tttttaaaac aactgactga tagttctata ttttcaaaat atttgaaaat 2340

aaaaagtatt cccaagtgat tttaatttaa aaacaaattg gctttgtctc attgatcaga 2400

caaaaagaaa ctagtattaa gggaagcgca aacacattta ttttgtactg cagaaaaatt 2460

gcttttttgt atcacttttt gtgtaatggt tagtaaatgt catttaagtc cttttatgta 2520

taaaactgcc aaatgcttac ctggtatttt attagatgca gaaacagatt ggaaacagct 2580

aaattacaac ttttacatat ggctctgtct tattgtttct tcatactgtg tctgtattta 2640

atcttttttt atggaacctg ttgcgcctat ttatgaaata ataaatatag gtgtttgtaa 2700

gtaaatttgt tagtatttga aagaggtttc tttgatgttt taacttttgc tggcaaaaaa 2760

aaattcacgc ttggtgtgaa tactttatta tttagttttt acagtaacat gaataaagcc 2820

aaacctgctt ttcatttagc agcaaattaa agtaaccagt ccttatttct gcatttcttt 2880

ggttgatgca aacaaaaaac tattatattt aagaacttta tttcttcata cgacataaca 2940

gaattgccct ccaagtcaca caagctccaa gactaaacaa acagacaggt cctctgtctt 3000

aaaaaggtta cttcttggtt ctcagctggt tctagtcaat tctgaaccac caccccccgc 3060

cccccgcaaa aaagtaaaag tcaaaccaaa cttcctcaag ctgcatgctt ttcacaaaat 3120

ccagaaagca tttaagaatt gaactagggg ctggaagaag tgaaagggaa gcatctaaaa 3180

atgaaaggtg agtaaccaga tagcaaaaga aaagggaaag ccatccaaat ttgaaagctg 3240

ttgatagaaa ttgagattct tgctgtcttt tgtgcctcta caagctacta ctcattccag 3300

aattcctggg tcttccaaga ggattcttaa ggtaccagag atttgctagg gaaccaaaag 3360

tgcttgagaa tctgcctgag ggcttgcata gctttcacat taaaaaaaga aaaagctagc 3420

agatttactc ctttttaggg gatcatatca agaaagttag tctggttgga aaccaagaga 3480

atggctgatg tctctttctt ggaatatgtg aaataaattt agcagtttaa ctaaatacaa 3540

atatatgcat tgtgtaatcc actcagaatt aaacagacaa aaggtatgct tgctttggaa 3600

tgattttagg cattgtacaa ccttgaatca cttgagcatg taataactaa taaataatgc 3660

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<210> 2

<211> 2491

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 2

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<212> DNA

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aggtaagtat agagaaaaaa gtaatcgctt ttttgagggg gctagaacta gctgggtatt 3660

gtaatgttat tgcgattaaa atagatggtg aatgctaatt cttaagccaa aataattatt 3720

tcggtgccca tttattcccc ccttttcttg ctctgtagcg gttcctcttt gagagcagtg 3780

tgaccactat ccccagttgt cttgcatgat taattacagc atctgtcctg tcagaagcta 3840

taatgaagag gtcttgataa aaattgcaaa ttaccactgg caacagtctt aaactgctta 3900

tgataaaatg aaaattaaaa acagcaagtg tcaaccctga ccagaatcct aatctggaaa 3960

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<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 10

gtctataaaa agaaaaccga ggctgcgaag aaggagtacc tgaagcaact cgcagcatac 60

agagccagcc ttgtatccaa g 81

<210> 11

<211> 387

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 11

agctacagtg aacctgttga cgtgaagaca tctcaacctc ctcagctgat caattcgaag 60

ccgtcggtgt tccatgggcc cagccaggcc cactcggccc tgtacctaag ttcccactat 120

caccaacaac cgggaatgaa tcctcaccta actgccatgc atcctagtct ccccaggaac 180

atagccccca agccgaataa ccaaatgcca gtgactgtct ctatagcaaa catggctgtg 240

tcccctcctc ctcccctcca gatcagcccg cctcttcacc agcatctcaa catgcagcag 300

caccagccgc tcaccatgca gcagcccctt gggaaccagc tccccatgca ggtccagtct 360

gccttacact cacccaccat gcagcaa 387

<210> 12

<211> 152

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 12

ggatttactc ttcaacccga ctatcagact attatcaatc ctacatctac agctgcacaa 60

gttgtcaccc aggcaatgga gtatgtgcgt tcggggtgca gaaatcctcc cccacaaccg 120

gtggactgga ataacgacta ctgcagtagt gg 152

<210> 13

<211> 2372

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 13

gggcatgcag agggacaaag cactgtacct tacttgagaa tctgaacacc tcttctttcc 60

actgaggaat tcagggaagt gttttcacca tggattgctt tgtacagtca aggcagttct 120

ccattttatt agaaaataca agttgctaag cacttaggac catttgagct tgtgggtcac 180

ccactctgga agaaatagtc atgcttcttt attatttttt taatccttta tggacattgt 240

ttttcttctt ccctgaagga aatttggacc attcagattt tatgttggtt ttttgctgtg 300

aagtgctgcg ctctagtaac tgccttagca actgtagatg tctcggataa aagtcctgga 360

ttttccattg gttttcataa tgggtgttta tatgaaacta ctaaagactt tttaaatggc 420

ttgatgtagc agtcatagca agtttgtaaa tagcatctat gttacactct cctagagtat 480

aaaatgtgaa tgtttttgta gctaaattgt aattgaaact ggctcattcc agtttattga 540

tttcacaata ggggttaaat tggcaaacat tcatattttt acttcatttt taaaacaact 600

gactgatagt tctatatttt caaaatattt gaaaataaaa agtattccca agtgatttta 660

atttaaaaac aaattggctt tgtctcattg atcagacaaa aagaaactag tattaaggga 720

agcgcaaaca catttatttt gtactgcaga aaaattgctt ttttgtatca ctttttgtgt 780

aatggttagt aaatgtcatt taagtccttt tatgtataaa actgccaaat gcttacctgg 840

tattttatta gatgcagaaa cagattggaa acagctaaat tacaactttt acatatggct 900

ctgtcttatt gtttcttcat actgtgtctg tatttaatct ttttttatgg aacctgttgc 960

gcctatttat gaaataataa atataggtgt ttgtaagtaa atttgttagt atttgaaaga 1020

ggtttctttg atgttttaac ttttgctggc aaaaaaaaat tcacgcttgg tgtgaatact 1080

ttattattta gtttttacag taacatgaat aaagccaaac ctgcttttca tttagcagca 1140

aattaaagta accagtcctt atttctgcat ttctttggtt gatgcaaaca aaaaactatt 1200

atatttaaga actttatttc ttcatacgac ataacagaat tgccctccaa gtcacacaag 1260

ctccaagact aaacaaacag acaggtcctc tgtcttaaaa aggttacttc ttggttctca 1320

gctggttcta gtcaattctg aaccaccacc ccccgccccc cgcaaaaaag taaaagtcaa 1380

accaaacttc ctcaagctgc atgcttttca caaaatccag aaagcattta agaattgaac 1440

taggggctgg aagaagtgaa agggaagcat ctaaaaatga aaggtgagta accagatagc 1500

aaaagaaaag ggaaagccat ccaaatttga aagctgttga tagaaattga gattcttgct 1560

gtcttttgtg cctctacaag ctactactca ttccagaatt cctgggtctt ccaagaggat 1620

tcttaaggta ccagagattt gctagggaac caaaagtgct tgagaatctg cctgagggct 1680

tgcatagctt tcacattaaa aaaagaaaaa gctagcagat ttactccttt ttaggggatc 1740

atatcaagaa agttagtctg gttggaaacc aagagaatgg ctgatgtctc tttcttggaa 1800

tatgtgaaat aaatttagca gtttaactaa atacaaatat atgcattgtg taatccactc 1860

agaattaaac agacaaaagg tatgcttgct ttggaatgat tttaggcatt gtacaacctt 1920

gaatcacttg agcatgtaat aactaataaa taatgcagat ccatgtgatt attaaaatga 1980

ctgtagctga gagctctaat tttcctgtct tgaaactgta taagaactca tgtgattaag 2040

ttcacagttt attgtttgtc tgtttagtat tttagaaata taccagcact actaattaac 2100

taatgtcttt tatttattat attatgataa agtaaaaatt tcacttgcat taagtctaaa 2160

ctgagaaggt aattactggg aggagaatga gcagctttga ctttgacagg cggtttgtgc 2220

aggaaagcac agtgccgtgt tgtttacagc ttttctagag cagctgtgcg accagggtag 2280

agagtgttga aattcaatac caaatacagt aaaaacaaat gtaaataaaa gaaaacacat 2340

catcaataaa actgttatta tgcgtgaccg ta 2372

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

caccgagcag gccattatgg ttcat 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

aaacatgaac cataatggcc tgctc 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

caccgtggag actgtgattt caggg 25

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

aaacccctga aatcacagtc tccac 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

caccgagtct ccaatatgct gggcc 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

aaacggccca gcatattgga gactc 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

caccgtccat cctggcccag catat 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

aaacatatgc tgggccagga tggac 25

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

caccgcattc aggtgcacca gcgag 25

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

aaacctcgct ggtgcacctg aatgc 25

<210> 24

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

caccggctgg cacatagtcc tggct 25

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

aaacagccag gactatgtgc cagcc 25

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

caccggagca tgacagagcc gagcc 25

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

aaacggctcg gctctgtcat gctcc 25

Claims

1.一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞具有以下性质或功能(1)-(3)：

(2)在所述免疫细胞的基因组内存在通过基因编辑技术产生的至少一个基因片段的缺失，从而下调或阻断胸腺细胞选择相关的高迁移率盒蛋白在所述免疫细胞内的表达/产生，或者降低/消除所述盒蛋白活性；

2.根据权利要求1所述的工程化的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞包括T细胞(γδ及αβ T细胞)、NK细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)和巨噬细胞等可对靶细胞(肿瘤细胞或病毒感染细胞)发挥效应功能(抑制增殖、杀伤、分泌细胞因子)的免疫细胞(天然或经基因工程改造)；或能够产生此类细胞的未分化细胞或免疫记忆细胞；或

所述特异性结合蛋白包括嵌合抗原受体、基因修饰的T细胞受体或者表达的抗原。

3.根据权利要求2所述的工程化的免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含配体或受体结合结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域；其中，所述配体和/或受体选自肿瘤特异性抗原和病原体抗原中的至少一种；所述胞内信号结构域包含共刺激结构域和/或初级信号结构域；优选地，

所述肿瘤特异性抗原包括CD19、CD123、ERRB2、EGFR、EGFRvIII、Mesothelin、IL13-Rα2、B7-H3、PSMA、ROR1、MUC1、MUC16、GD2、FAP、FR-A、EpCAM和其它新抗原；所述病原体抗原包括源自HAV、HBV、HCV、CMV、HIV、EB病毒、登革热病毒、HPV、呼吸道合胞病毒、鼻病毒、HTLV-1、流行性感冒病毒、BLV、百日咳病毒、脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒、天花、带状疱疹病毒、炭疽病毒、破伤风病毒、轮状病毒、狂犬病毒、禽痘病毒、脑膜炎球菌、肺炎球菌、链球菌、葡萄球菌、奈瑟氏菌、大肠杆菌、志贺氏菌、利什曼虫、呼吸道合胞病毒、副流感、腺病毒、水痘、黄病毒、结核分枝杆菌和疟原虫的抗原。

4.根据权利要求2所述的工程化的免疫细胞，其特征在于，所述基因修饰的T细胞受体通过基因改造从而使T细胞受体与肿瘤相关抗原TAA或肿瘤的亲和力增强。

5.根据权利要求1所述的工程化的免疫细胞，其特征在于，所述基因片段为源自SEQ IDNo.1-4所示任一序列的由2-100个连续碱基序列组成的基因片段；或者所述基因片段为源自SEQ ID No.5-13所示任一序列的由2-100个连续碱基序列组成的基因片段。

6.一种工程化的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述制备包括以下步骤(a)和(b)以及可选的步骤(c)和(d)：

7.一种工程化的免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(a’)和(b’)以及可选的(c’)

8.根据权利要求6或7所述的工程化的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述基因编辑系统包括第一基因编辑系统和第二基因编辑系统；

其中，所述第一基因编辑系统包括第一Cas蛋白和第一gRNA，所述第二基因编辑系统包括第二Cas蛋白和第二gRNA；所述第一gRNA具有与第一靶序列互补的第一识别区，所述第二gRNA具有与第二靶序列互补的第二识别区；

其中，所述第一靶序列与所述第二靶序列分别位于选自SEQ ID No.1-4所示序列中的同一序列内，且所述第一靶序列与所述第二靶序列之间的距离为5-1000个碱基；

优选地，所述第一Cas蛋白和所述第二Cas蛋白为相同的蛋白；进一步优选地，所述gRNA包含选自由SEQ ID No.14-27所示的序列组成的组的序列。

9.一种药物组合物，其特征在于，包含根据权利要求1-5任一项所述的工程化的免疫细胞和可选的药物学或生理上可接受载体。

10.一种预防或治疗疾病的方法，其特征在于，包括向有需要的受试者施用预防或治疗有效量的根据权利要求1-5任一项所述的工程化的免疫细胞，或根据权利要求9所述的药物组合物；

优选地，所述工程化的免疫细胞相对于所述受试者为自体细胞或异体细胞。

优选地，所述方法进一步包括向所述受试者联合施用选自免疫检查点分子抑制剂、共刺激分子激动剂和抗肿瘤剂中的至少一种药剂。

优选地，所述疾病为肿瘤或病原体感染病。