CN112823011A - 基于t细胞的免疫疗法的基因靶标 - Google Patents

基于t细胞的免疫疗法的基因靶标 Download PDF

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J·卡内瓦利
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Abstract

本文提供了相较于野生型T细胞经刺激时展现出增殖增加的遗传修饰的T细胞，生成这类T细胞的方法，和使用该T细胞治疗疾病诸如癌症的方法。

Description

基于T细胞的免疫疗法的基因靶标
相关申请的交叉引用
该申请要求2018年7月9日提交的美国临时专利申请号62/695,672的优先权权益，其通过引用纳入本文。
背景技术
细胞毒性T细胞在免疫介导的肿瘤控制和自身免疫中起着重要作用。免疫疗法，诸如检查点阻断或基于工程改造的细胞的疗法，正在彻底改变癌症治疗，在患有其他难治性恶性疾病的部分患者中实现持久的反应。然而，尽管在一些患者中取得了显著的效果，但是大多数患者对可用的免疫疗法没有反应。
下一代过继细胞疗法正在利用CRISPR-Cas9基因组工程改造进行开发。可以将Cas9核糖核蛋白递送至原代人T细胞以高效地敲除检查点基因(Ren等,2017；Rupp等,2017；Schumann等,2015)或甚至重写内源性基因组序列(Roth等)。虽然缺失编码PD-1的典型检查点基因可以增强对某一些癌症的反应(Ren等,2017；Rupp等,2017)，但是一组扩大的靶标将提供额外的治疗机会。免疫疗法中的进展取决于对于确定T细胞在遇到其靶抗原时如何反应的遗传程序的进一步了解。有希望的基因靶标可以在刺激后增强细胞增殖和有效效应子反应。此外，免疫抑制细胞和可溶性分子诸如细胞因子和代谢物可以在肿瘤内累积并阻碍有效抗肿瘤T细胞反应。影响T细胞克服免疫抑制性肿瘤微环境能力的基因靶标可以将过继性细胞疗法扩展到实体器官癌症。
数十年的动物模型和细胞系研究已经鉴定了T细胞抑制和激活的调节剂，但是仍然缺少系统的策略来全面分析调节人T细胞反应的基因的功能。使用选定的RNA干扰文库进行基因敲减指向增强小鼠模型中体内抗原反应性T细胞增殖的靶标(Zhou等,2014)。最近，CRISPR-Cas9开创了功能性遗传学研究的新纪元(Doench，2018)。容易设计单向导RNA(sgRNA)的大文库，以靶向基因组序列。用编码这些sgRNA的慢病毒转导细胞产生具有不同基因组修饰的细胞池，所述基因修饰可以通过整合的前病毒中的sgRNA序列追踪。该方法已用于经稳定的Cas9表达工程改造的细胞系以及Cas9转基因小鼠模型中(Parnas等,2015；Shang等,2018)。汇集CRISPR筛选已经揭示了人癌细胞中调节T细胞免疫疗法反应的基因靶标(Manguso等,2017；Pan等,2018；Patel等,2017)。
发明内容
本公开(部分)基于一种新方法，即用Cas9蛋白电穿孔的sgRNA慢病毒转染(SLICE)，来鉴定原代人T细胞中刺激反应的调节剂。全基因组功能丧失筛选鉴定了在刺激后对增殖产生负面调节的重要T细胞受体信号组件和基因。靶向消融单个候选基因验证了命中(hit)并鉴定了增强癌细胞杀伤的扰动(perturbation)。与单细胞RNA-seq偶联的SLICE揭示了由关键遗传扰动改变的特征性刺激-反应基因程序。SLICE全基因组筛选也适用于鉴定免疫抑制的介导物，这揭示了控制腺苷信号传导反应的基因。因此，本文提供了经修饰以抑制靶基因表达的造血细胞，诸如干细胞和T细胞。因此，例如，在本公开中所述的遗传修饰可以用于调节CD8+T细胞增殖和功能。
在一个方面中，本文提供了遗传修饰的造血细胞，其包含对T细胞抑制性基因的遗传修饰，其抑制由所述T细胞抑制性基因编码的多肽产物的表达或活性，其中相较于对照野生型造血细胞，所述多肽产物的表达或活性被抑制至少60％。在一些实施方式中，对T细胞抑制性基因的遗传修饰使基因失活。在一些实施方式中，遗传修饰的造血细胞是造血干细胞。在一些实施方式中，遗传修饰的造血细胞是造血T细胞。在一些实施方式中，T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。在一些实施方式中，使用成簇规律间隔性短回文重复序列(CRISPR)系统抑制T细胞抑制性基因。或者，可以使用转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)系统、锌指核酸酶系统或大范围核酸酶系统抑制T细胞抑制性基因。在一些实施方式中，使用反义RNA、siRNA、微小RNA或短发夹RNA抑制T细胞抑制性基因。在一些实施方式中，经修饰的T细胞抑制性基因是RASA2、TCEB2、SOCS1、CBLB、FAM105A、ARID1A或TMEM222。在一些实施方式中，经修饰的T细胞抑制性基因是CBLB、CD5、SOCS1、TMEM222、TNFAIP3、DGKZ、RASA2、TCEB2、UBASH3A或ARID1A。在一些实施方式中，T细胞抑制性基因是CD5、SOCS1、TMEM222、TNFAIP3、RASA2或TCEB2；或者T细胞抑制性基因是SOCS1、TCEB2、RASA2或CBLB。在一些实施方式中，T细胞抑制性基因是SOCS1、TCEB2或RASA2。在一些实施方式中，T细胞抑制性基因是RASA2。在一些实施方式中，T细胞抑制性基因是TCEB2。在一些实施方式中，T细胞抑制性基因是SOCS1。在一些实施方式中，T细胞抑制性基因是CBLB。在一些实施方式中，T细胞抑制性基因是FAM105A。在一些实施方式中，T细胞抑制性基因是ARID1A。在一些实施方式中，T细胞抑制性基因是TMEM222。在一些实施方式中，T细胞抑制性基因是AGO1、ARIH2、CD8A、CDKN1B、DGKA、FIBP、GNA13、MEF2D或SMARCB1。在另一方面中，本文提供了这样的细胞群，其包含如本文所述(例如在本段中所述)的遗传修饰的造血细胞，例如T细胞。在一些实施方式中，造血细胞(例如，T细胞)可以包含如本文所述的两种或多种遗传修饰。
在另一方面中，本文提供了治疗癌症的方法，其包括给予这样的细胞群，所述细胞群包含如本文所述(例如在本段中所述)的遗传修饰的造血细胞。
在另一方面中，本文提供了遗传修饰的T细胞，其具有相较于对照野生型T细胞而言经调节(例如，降低)的免疫功能，并且包含遗传修饰，以抑制由T基因编码的多肽的表达，其中相较于所述对照野生型T细胞，所述多肽的表达被抑制至少60％；并且该基因选自下组：CYP2R1、LCP2、RPP21、VAV1、EIF2B3、RPP21、EXOSC6、RPN1、VARS、CD3D、GRAP2、TRMT112、ALG8、VAV1、EXOSC6、SH2D1A、HSPA8、ZAP70、DDX54、CD247、ALDOA、ZNF131、WDR36、AK2、LCP2、CD247、VHL、EIF2B2、PRELID1、GRPEL1、NAA10、ALDOA、ALG2、MARS、C4orf45、RAC2、LCK、SUPT4H1、SLC25A3、LUC7L3、C3orf17、RPP21、HARS、ZNRD1、CCNH、MYC、CCDC25、EEF1G、CCND2、GCLC、TAF2、EIF6、SEC63、EXOSC6、RPS19BP1、SEC61B、VHL、DAD1、BEND6、FBL、VARS、EIF2B4、RAC2、PAGR1、MYC、CD3E、LCP2、MYC、ENOSF1、POLR3H、NOP14、CLNS1A、POLR2L、ZPR1、CARD11、SLC35B1、TRMT112、FARSA、PRELID1、LARS、NOP16、POLR2L、HSPA8、CD247、GEMIN8、TTC27、PMPCA、PWP2、TAF1C、DDOST、ZNF654、FAU、EIF2B3、YARS、DDX20、DDX56、DDX49、UTP20、EPRS、RSL1D1、ATP1B3、EXOSC4、ARMC7、EIF2B4、AUP1、VAV1、PAK1IP1、EIF6、FAM157A、HSPE1-MOB4、LAT、DCAF13、PPP1R10、EXOSC2、SRP9、POLR3K、TAF6、EIF3H、ABCF1、FLJ44635、PTP4A2、EIF3CL、ABCB7、GTF2H4、MARS、TAF4、RPL5、FTSJ3、CD28、ALG13、CARD11、EIF4G1、UTP3、GARS、CACNB4、HSPA8、POP7、ERCC3、GDPD2、SUPT5H、POLR3D、RPP30、C12orf45、DPH3、EIF3B、LACTBL1、THAP11、IMP4、EXOSC7、NOB1、EIF4E、PLCG1、HUWE1、RBM19、GATA3、CCND2、TTI2、THG1L、TAF1C、URI1、TRMT112、EIF3H、CCND2、GCLM、RBSN、QARS、POP7、TAF4、HUWE1、CARS、PTP4A2、PES1、ZNF785、WDR26、PRR20D、STK11、PIK3CD、YARS、STRAP、WDR77、NANS、TARS、HSPA8、TMEM127、FAM35A、ZBTB8OS、BPTF、INO80D、NOP14、KARS、SH2D1A、RHOH、DIMT1、CMPK1、TAF6、QTRT1、LCK、NOL10、MYBBP1A、NHP2、DDX54、LAT、TAF2、MBTPS1、GNL3、DEF6、BCL10、NFKBIA、PHB、CD3G、CD3D、QARS、EIF3C、GRPEL1、MBTPS2、ORAOV1、SLC4A2、GATA3、ODF3、SLC7A6OS、ORAOV1、ALG13和TAF1B。在一些实施方式中，基因是下述基因之一：HSPA8、RPP21、EXOSC6、LCP2、MYC、CD247、NOP14、VAV1、RHOH、TAF1C、TRMT112、CCND2、SH2D1A、MARS、CD3D、NELFCD LCK、LUC7L3、EIF2B4、ORAOV1.VARS、NOL10、ZBTB8OS、SLC35B1、NAA10、EIF2B3、DHX37、LAT、EMG1、ALDOA、GRPEL1、ARMC7、POLR2L、NOP56、PSENEN、RELA、SUPT4H1、VHL、GFER、BPTF、RAC2、TSR2、TAF6、PMPCA、EIF6、STT3B、POP7、GMPPB、TP53RK、CCNH、TEX10、DHX33、QARS、EID2、IRF4、TAF2、IARS、GTF3A、NOP2、IMP3、RPL28、UTP3.EIF4G1、GPN1、UTP6、DAD1、ALG2、CDK6、MED19、RASGRP1、PHB2、NFS1、POLR2E、CDIPT、POLR3H、HARS、SEH1L、EIF2B5、TTC27、RRP12、JUNB、HSPE1、GMPS、EIF2S3、SRP14、FAM96B、RPL8、RRP36、MED11、ISG20L2、ROMO1、ATP6V1B2、RPN2或WASH1。在一些实施方式中，基因是失活的。在一些实施方式中，使用CRISPR系统、TALEN系统、锌指核酸酶系统、大范围核酸酶系统、siRNA、反义RNA、微小RNA或发夹RNA抑制基因。在另一方面中，本发明提供了这样的细胞培养物，其包含遗传修饰的T细胞，例如，如本段落中所述的那些。
在另一方面中，本文提供了治疗自体免疫疾病或治疗或预防移植物排斥的方法，所述方法包括给予患有自体免疫疾病或正在进行组织移植的对象如之前段落中所述的T细胞群，例如CD8+或CD4+T细胞群。
在其他方面中，本文提供了生成用于治疗患有癌症的对象的遗传修饰的细胞群的方法，所述方法包括：由患者获得造血细胞；抑制选自下组的T细胞抑制性基因的表达：RASA2、TCEB2、SOCS1、CBLB、FAM105A、ARID1A和TMEM222；选择其中T细胞抑制性基因被抑制的造血细胞；和离体扩增选定的造血细胞群。在一些实施方式中，造血细胞是造血干细胞。在一些实施方式中，造血细胞是T细胞，例如CD8+或CD4+T细胞。在一些实施方式中，使用CRISPR系统、TALEN系统、锌指核酸酶系统、大范围核酸酶系统、siRNA、反义RNA、微小RNA或短发夹RNA抑制T细胞抑制性基因。
在其他方面中，本文提供了生成用于治疗患有癌症的对象的遗传修饰的细胞群的方法，所述方法包括：由患者获得造血细胞；抑制选自下组的T细胞抑制性基因的表达：CBLB、CD5、SOCS1、TMEM222、TNFAIP3、DGKZ、RASA2、TCEB2、UBASH3A和ARID1A；选择其中T细胞抑制性基因被抑制的造血细胞；和离体扩增选定的造血细胞群。在一些实施方式中，造血细胞是造血干细胞。在一些实施方式中，造血细胞是T细胞，例如CD8+或CD4+T细胞。在一些实施方式中，使用CRISPR系统、TALEN系统、锌指核酸酶系统、大范围核酸酶系统、siRNA、反义RNA、微小RNA或短发夹RNA抑制T细胞抑制性基因。
定义
如本文所用，除非文中另有明确说明，单数形式的“一个”、“一种”和“该/所述”也旨在指代复数形式。
术语“多核苷酸”和“核酸”可互换使用，并且是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。该术语包括RNA、DNA和合成形式以及上述内容混合的聚合物。在特定实施方式中，核苷酸指核糖核苷酸，脱氧核苷酸，或者核苷酸任意类型的修饰形式或类似物，和其组合。此外，多核苷酸可以包括通过天然产生的和/或非天然产生的核苷酸键连接在一起的天然产生的和修饰的核苷酸中的一个或两者。核酸分子可经化学或生物化学修饰，或者可包含非天然或衍生的核苷酸碱基。这类修饰包括，例如，标记物、甲基化、用类似物取代一个或多个天然产生的核苷酸、核苷酸间修饰，诸如不带电荷连接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)，带电荷连接(例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯等)，侧基部分(例如，多肽)，嵌入剂(例如，吖啶、补骨脂素等)，螯合剂，烷基化剂和修饰的连接(例如，α-异头核酸等)。“多核苷酸”和“核酸”还旨在包括任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双链、三链、发夹、环状和锁式(padlock)构象。除非另有明确说明，述及核酸序列包括其补体。因此，述及具有特定序列的核酸分子应理解为涵盖其互补链及其互补序列。述及编码多肽序列的“多核苷酸”或“核酸”还包括包含编码相同多肽序列的替代密码子的核酸和经密码子优化的核酸。
本文中，“互补”或“互补性”指核苷酸之间或核酸之间特定的碱基配对。碱基配对可以是完全互补的，也可以是部分互补的。
术语“基因”可以表示参与产生或编码多肽链的DNA区段。它可以包括编码区之前和之后的区域(前导区和尾区)以及个体编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。基因由针对人基因的符号和命名法来定义，如HUGO基因命名委员会(HUGO Gene NomenclatureCommittee)所指定。
“启动子”定义为指导核酸转录的一种或多种核酸控制序列。如本文所用，启动子包括靠近转录起始位点的必需的核酸序列。启动子还任选地包括远端增强子或阻抑物元件，其可位于距转录起始位点多达几千个碱基对处。
术语“抑制表达”指抑制或减少基因或蛋白质的表达。为了抑制或减少基因(即，编码转录因子的基因或由转录因子调节的基因)的表达，可以修饰该基因的序列和/或结构，使得该基因不会被转录(对于DNA)或翻译(对于RNA)，或不会被转录或翻译以产生功能性蛋白质(例如，转录因子)。本文进一步详细描述了用于抑制或减少基因表达的各种方法。一些方法可以将核酸取代、添加和/或缺失引入野生型基因。一些方法也可能将单链或双链断裂引入基因。为了抑制或减少蛋白质(例如，T细胞抑制性蛋白)的表达，可以抑制或减少编码该蛋白质的基因或多核苷酸的表达，如上所述。在其它实施方式中，可以使用例如抗体或蛋白酶直接靶向蛋白质以抑制或减少蛋白质的表达。“抑制”表达指相较于参比对照水平而言减少至少10％，例如减少至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％，或至少约90％或更高并包括减少100％(即相较于参比样品而言不存在的水平)。如本文所用，术语“失活(的)”指阻止由该基因编码的多肽产物的表达。失活可以在基因表达的任何阶段或过程发生，包括但不限于：转录、翻译和蛋白质表达，并且失活可以影响任何基因或基因产物，包括但不限于：DNA、RNA、诸如mRNA和多肽。在一些实施方式中，“抑制(的)表达”反映了修饰的细胞中一定百分比的失活，例如，还包含其中靶基因未失活的细胞的群体中至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％或更多的细胞。
本文所用短语“修饰”在修饰细胞的基因组的上下文中指在靶基因组区域处诱导基因组序列的结构改变。例如，修饰可以采取将核苷酸序列插入细胞基因组的形式。例如，可以将编码多肽的核苷酸序列插入编码T细胞中内源性细胞表面蛋白的基因组序列中。核苷酸序列可以编码功能结构域或其功能片段。这类修饰可以例如通过诱导靶基因组区域内的双链断裂，或位于相对链且侧接靶基因组区域的单链切口对进行。在靶基因组区域处或其中诱导单链或双链断裂的方法包括使用核酸酶结构域(例如，Cas9)或其衍生物和针对靶基因组区域的向导(例如，向导RNA)。
术语“患者”、“对象”、“个体”等本文中可互换使用，并且指任何动物，例如，哺乳动物，诸如灵长类动物。在某些非限制性实施方式中，患者、对象或个体为人。
本文所用术语“治疗”、“处理”等通常指获得所需的药理学和/或生理学作用。就完全或部分防止疾病、病症或其症状的方面而言，这种作用可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病或病症和/或由该疾病或病症所致不良影响如症状而言，这种作用可以是治疗性的。本文所用术语“治疗/处理”包括对象疾病或病症的任何治疗/处理，并且包括：(a)在可能易患该疾病或病症但尚未诊断患有该疾病或病症的对象中防止该疾病或病症的发生；(b)抑制该疾病或病症(例如，阻滞其发展)；或(c)缓解该疾病或病症(例如，引起该疾病或病症消退，提供一种或多种症状的改善)。
附图说明
图1A-C。使用汇集的CRISPR筛选进行T细胞增殖调节剂无偏倚发现的框架。A部分提供了sgRNA慢病毒感染和Cas9电穿孔(SLICE)杂交系统的图表，其能够在原代T细胞中进行汇集CRISPR筛选。B部分提供了说明性数据，其显示了用SLICE编辑CD8A基因将在两个独立的供体中产生高效蛋白敲减。C部分描述了来自靶向筛选的说明性数据(约5,000个向导(guide))，显示靶向CBLB和CD5的sgRNA在增殖性T细胞中富集，而LCP2和CD3D却被耗尽。非靶向sgRNA在群体中平均分布。
图2A-F.A部分：上图：全基因组(GW)文库中，>75,000个向导的分裂细胞相对非分裂细胞的log2倍数变化(LFC)值的分布。下图：靶向3个富集的基因(CBLB、CD5、UBASH3A)和3个耗竭的基因(VAV1，CD3D，LCP2)的全部4个sgRNA的LFC，覆盖在描绘整体分布的灰色梯度上。值是两个供体的平均值。B部分：来自初级GW筛选的命中的火山图。X轴显示基因水平LFC的Z评分(ZS)(各基因所有sgRNA的LFC中值)。Y轴显示通过MAGeCK计算的p值。LFC-Z评分小于“0”的标记的基因为阴性命中(在分裂细胞中耗尽，FDR<0.2和|ZS|>2)，这通过基因本体论(Gene Ontology，GO)注释了TCR信号传导通路。LFC-Z评分大于“0”的标记的基因为阳性命中(排名<20和|ZS|>2)。计算两个供体的所有值，作为生物学重复。C部分：来自两个独立供体中的次级GW筛选的基因命中与初级筛选正相关。显示了是正向和负向上排名前25位的靶标的重叠命中。D部分：对于TCR刺激效价增加(1X＝(B)中的数据)的3个GW筛选，(B)在各方向上前100个命中的缩放的LFC的箱线图。对于两个组图，LFC值都趋于0，这表明选择压力随着TCR信号增加而减小。水平线是中值，垂直线是数据范围。E部分：基因集富集分析显示两个选定的基因列表中筛选命中的LFC排名显著倾斜：(上组图)黑色素瘤小鼠模型中通过shRNA筛选先前发现的命中和(下组图)通过KEGG的TCR信号传导途径。各集富集前边缘的前8个基因成员在右侧的文本框中显示。x轴上的垂直线是基因集的成员，按其在GW筛选中的LFC排名排序。FDR＝错误发现率，排列检验。F部分：GW筛选中检测到的TCR信号传导和T细胞激活的调节剂。左侧显示的是在我们的GW筛选中发现的TCR途径的正调节剂(FDR<0.25)。TCR途径基于Wikipathways WP69和文献综述。右侧显示的是在GW筛选中发现的负调节基因(已知和未知)(FDR<0.25)，并且代表促进T细胞增殖的候选靶标。细胞定位和相互作用边缘基于文献综述。基因节点(node)通过其在GW筛选中的LFC表示(红色表示正LFC值，而蓝色表示负LFC值)。
图3A-E。使用RNP阵列验证调节T细胞增殖的基因靶标。A部分：使用Cas9 RNP电穿孔的正交验证策略的概述。B部分：使用CFSE染色的CD8 T细胞的增殖试验。各组图显示了来自TCR刺激的(左峰)或未刺激的(最右峰)人CD8 T细胞的CFSE信号。显示的是与NT CTRL和阴性命中LCP2比较的两个阳性命中的两个向导CBLB和CD5的数据。C部分：B部分中数据的总结：基因靶靶标(y轴)按其在GW汇集筛选中的排名进行排序。X轴是相对于各供体中NT CTRL计算的增殖指数(实验程序)(log2转换)。条带显示2个独立实验的平均值，并各实验中有2个供体。误差线为SEM。D部分：刺激后6小时通过流式细胞仪测量的早期激活标志物。显示的是针对CD154(左)和CD69(右)的各个靶基因(y轴)两个向导的代表性分布。E部分：(D)中所有经测试的基因靶标的数据的总结(y轴)。X轴是标志物阳性(CD69/CD154)群相对于NTCTRL的倍数变化增加。垂直线是平均值，误差线是SEM；对于4个供体，各基因2个向导。
图4A-F。将SLICE与单细胞RNA-Seq配对，用于对原代细胞中的基因敲除进行高维分子表型分析；A部分：在来自两个人供体的经刺激和未经刺激的T细胞中，具有经鉴定的sgRNA的所有单细胞的UMAP图。未经刺激的细胞在左侧；经刺激的细胞在右侧。B部分：具有针对4个基因的基因表达缩放的UMAP，所述基因显示与激活状态(IL7R，CCR7)、细胞周期(MKI67)和效应子功能(GZMB)相关的簇。C部分：基于基因表达对单细胞进行无监督式聚类，13个簇鉴定为经标记的。D部分：在UMAP表示(representation)上对表达针对CBLB、CD5、LCP和NT CTRL的sgRNA的细胞进行聚类。E部分：Y轴显示各簇(组图)之间表达sgRNA的细胞的表示过度(over representation)或表示不足(under representation)(y轴)，通过卡方检验确定。部分F：热图显示具有不同sgRNA靶标的细胞(x轴)之间的平均基因表达(y轴)。数据代表一个供体。
图5A-D。最佳筛选命中通过工程改造的人T细胞促进体外肿瘤杀伤。A部分：测试促进体外肿瘤杀伤的基因靶标的高通量实验策略的图。部分B：在人CD8 T细胞和A375肿瘤细胞共培养后36小时拍摄的代表性图像。显示的是代表孔的红色荧光通道，在各组图左下方注释。比例尺是500um。C部分：36小时后通过抗原特异性CD8 T细胞清除A375。将值标准化为无T细胞的孔中的A375细胞计数。对于4个供体和两个技术重复中各基因靶标2个向导，水平线是平均值，误差线是SEM。***表示p<0.001，维尔克松(Wilcoxon)秩和检验。D部分：A375细胞计数的时间轨迹，通过针对选定的命中的IncuCyte软件测量。线是4个供体的平均值，各靶基因2个向导。误差线为SEM。
图6A-C。改变SLICE以揭示原代T细胞中对免疫抑制信号的抗性。A部分：全基因组筛选对腺苷A2A选择性激动剂CGS-21680抗性的z评分的散点图。B部分：上图：经CGS-21680处理的T细胞的GW文库中所有sgRNA的log2倍数变化分布。下图：相较于CGS-21680抗性筛选(红色)，仅刺激(载剂)筛选(绿色)sgRNA中个别sgRNA的LFC。C部分：用RNP编辑的T细胞验证来自腺苷抗性筛选的基因靶标。相较于NT CTRL，敲除ADORA2A或FAM105A允许细胞在腺苷激动剂存在的情况下增殖。各组图显示了2个供体的两个独立的sgRNA。
图7A-J。在原代人T细胞中建立SLICE，与图1相关。A部分：为了大规模筛选优化SLICE，我们研究了使用聚凝胺增加感染率(mCherry报道物)是否会产生更高绝对数量具有活力的经编辑的细胞。虽然添加聚凝胺适当增加了转导效率(底部标记)——忽略其活力改善，并且导致更高的转导细胞总数(顶部标记)。B部分：FACS图，其显示了相较于靶向的蛋白质CD8A的抗体染色(BV-570，y轴)，来自转导的原代人CD8+T细胞的荧光报告物的表达(x轴)。电穿孔Cas9蛋白(3ul于20ul细胞悬浮液，储液20uM)后，表达sgRNA的细胞大部分为CD8阴性。C部分：编辑来自(A)的细胞的CD8A蛋白(y轴)，用不同储液浓度的Cas9蛋白电穿孔。以成功转导的细胞中CD8阴性细胞与CD8阳性细胞的比例来计算编辑。效价显示编辑效率对Cas9浓度的依赖性。数据显示2个人供体。D部分：增殖染料VPD450根据SLICE系统中的第一刺激(第0天)来测量对通过抗CD3和抗CD28复合物的第二刺激(第9天)的反应。用抗CD3/CD28珠(下图)以1:1珠与T细胞比进行刺激将阻碍CD8 T细胞对再刺激反应的能力，可能是由于激活诱导的耗尽和细胞死亡。使用结合平板的抗体的第一刺激(上图)保持了细胞反应的能力，允许进行TCR依赖性增殖筛选。E部分：图1B部分显示的细胞的门选策略。F部分：SLICE可有效敲除原代人CD8+和CD4+T细胞中的候选靶标(CD45)。无靶向对照sgRNA(NT.CTRL，灰色)表示敲除对经CD45靶向向导(蓝色)转导的细胞具有特异性。G部分：先导筛选中预分选细胞的CFSE信号如图1C。H部分：在先导筛选中的两个供体中，对分选的细胞群的sgRNA进行深度测序后的读数计数的分布。I部分：前两个向导的丰度的绝对倍数变化，对于图1C中的命中。各条线是靶向给定基因的独特sgRNA，在各组图的顶部标记。在两个向导和两个供体之中，向导富集和耗尽模式是一致的。J部分：来自平行筛选的Log倍数变化排名比较，所述平行筛选使用与图1C相同的实验时间线和sgRNA文库，但没有使用基于CFSE的富集分选。这种基于生长的筛选具有低信噪比，通过图1C中与TCR相关的向导的对角线附近表示。灰色点是单独的靶向向导，黑色点是非靶向对照(NT.CTRL)向导。
图8A-F。原代T细胞中的全基因组汇集CRISPR筛选，与图2相关。A部分：门控策略，用于通过嘌呤霉素滴定估算初级GW筛选中的转导效率。B部分：在各种接种密度中，在使用或不使用嘌呤霉素的情况下培养A部分中转导的细胞2天。在各种接种稀释度中，比较两个条件之间如A部分所述活细胞的总数。拟合线为线性回归，斜率为0.51(R2＝0.99)，表明高效的转导。C部分：用于GW筛选的代表性样品的门控和分选策略。我们如CFSE组中所示对群体进行了分选，从而使分选箱(bin)之间的分隔清晰可见。D部分：比较使用两个供体的初级GW筛选中发现的命中(绿色柱)，以及来自使用两个供体的重复筛选的合并数据(橙色柱)。命中定义为在各个方面上FDR<0.25，通过MAGeCK RRA算法。柱顶部的标记是各组中命中数的数值。E部分：TCR刺激效价(x轴)在基因水平的倍数变化上对T细胞刺激的3个正调节剂和负调节剂的作用。F部分：通过GSEA富集基因水平的倍数变化导致FDR<0.01的KEGG途径。此外，包括来自公开的T细胞肿瘤浸润的shRNA的基因集。各点是带注释的基因集(y轴)，x轴显示标准化的富集评分(NES)，其与相同大小的随机化基因集的平均值比较。各点的大小与各富集的p值成反比。
图9A-D。RNP阵列验证来自全基因组筛选的命中，与图3相关。A部分：图3的C部分中命中的CFSE轨迹。各组图显示两个技术重复中各基因靶标的两个独特向导。数据代表一个供体。B部分：代表性CFSE轨迹的曲线拟合，如图3的C部分。组图显示CFSE峰的拟合高斯，通过flowFit R软件包确定。提取的参数是增殖指数，定义为所有世代中细胞的总计数除以原始亲本细胞计算出的数量。C部分：在测试的所有靶标中，激活标志物CD154的分布。线显示了测量的经刺激的(红色)和未经刺激的(蓝色)细胞的表达，其经用靶向各组图顶部标记的基因的2个向导编辑。数据代表一个供体。D部分：对于CD69，与B部分相同。
图10A-F。与单细胞RNA-Seq偶联的SLICE，与图4相关。A部分：通过嘌呤霉素选择测量CropSeq实验的转导效率。通过线性回归，我们估计感染率为13.9％(R2＝0.76，蓝线，阴影区域为95％CI)。预期这种有意的低转导率将富集仅具有单一整合的sgRNA盒的细胞。B部分：经刺激细胞相较于未经刺激的细胞的合成批料RNA-Seq图谱(各样品塌陷的UMI计数)的DESeq2差异基因表达的火山图。点是基因，y轴表示富集的显著性，x轴表示转录本丰度中log2倍数变化(LFC)的大小和方向。将具有|LFC|>2.5且调整后的p值<1e-18的点着色，蓝色表示在经刺激细胞中上调的基因，红色表示下调的基因。C部分：簇中基因注释基于单细胞RNA表达概况的富集。各点表示各簇(x轴)中REACTOME注释(y轴)的富集。通过差异基因表达测试确定与各簇相关的基因，将簇中所有的细胞与所有其他细胞进行比较。各点的大小与富集的显著性成正比，颜色表示各簇中相应注释中基因的平均表达水平是上调还是下调的(分别为红色和蓝色)。D部分：CROP-Seq实验在单细胞水平上的基因编辑。各组图显示了文库中靶向的基因独特分子标识物(UMI)计数的平均值和平均值的标准误差(SEM)。针对所有细胞的各靶标转录本进行计算，所述细胞表达中靶sgRNA(靶标)或非靶向对照向导(NT.CTRL)。计算四个样品的平均值，各基因两个向导。相较于对照向导，大多数基因靶标显示较低水平表达靶向的向导的细胞的转录本，这表明成功敲除。我们注意到一些基因靶标以低水平表达，因此在单细胞水平上可能难以检测到编辑。部分E：第二供体选定的sgRNA的基因表达概况，与图4的F部分相同。显示的基因在与刺激的细胞相关的簇8-12中富集(|logFC|>1且调整后的p<0.05)。系统树状图基于如R中hclust中所实现的欧几里得距离，使用Ward D2算法。F部分：表达靶向sgRNA的细胞的簇相关性中的相似性。显示的是所有簇中卡方残差的皮尔逊相关系数。系统树状图计算如E部分中所述，分为三个水平。
图11A-D。工程改造的人T细胞的体外肿瘤杀伤，与图5相关。A部分：根据使用HLA-A2+限制性NY-ESO-1肽葡聚糖-PE的染色，使用1G4TCR慢病毒转导后的T细胞显示出高转导率。对细胞进行分选以获得四聚体阳性肿瘤特异性CD8+T细胞的纯群体。B部分：在IncuCyte上测量的半胱天冬酶水平证明在T细胞与肿瘤细胞比例增加的滴定中，T细胞诱导表达靶标NY-ESO的A375黑素瘤细胞的细胞凋亡(上组图)。对于相同T细胞与肿瘤细胞比，该肿瘤细胞杀伤对应随时间变化的A375 RFP标记的核计数(下组图)。C部分：测试的所有基因靶标的A375清除。Y轴表示通过IncuCyte软件的A375计数，其通过各供体、时间点和基因靶标的NT.CTRL孔中的计数进行标准化。线显示两个向导和两个技术重复中各供体的平均值(n＝4)。误差线为SEM。D部分：在36小时针对两个CD8与A375比率对(B)中的数据进行定量。1:4是图5C中汇总的数据。点代表所有供体(n＝4)的阵列中的单个孔，两个向导和两个重复。
图12A-E。使用SLICE筛选原代T细胞中对免疫抑制信号的抗性，与图6相关。A部分：腺苷受体激动剂CGS-21680对T细胞增殖抑制的最佳作用的剂量滴定确定20μM具有足够的抑制性。显示了不同浓度的CGS-21680(如各组图顶部所标记)的代表性CFSE曲线。数据针对来自两个人供体的CFSE标记的CD8+T细胞。B部分：图6A中显示了全基因组筛选的分选门控和CFSE概况。C部分：两个筛选条件(CGS-21680和载剂)重叠的前25个命中的比较。我们注意到，虽然来自载剂筛选的许多命中在免疫抑制腺苷激动剂存在的情况下也促进增殖(沿对角线方向)，但是ADORA2A和FAM105A sgRNA在腺苷激动剂的环境中被选择性富集。ADORA2A和FAM105A是CGS-21680处理的条件下前0.1％LFC中以及CGS-21680和载剂GW筛选条件之间前0.1％LFC差异中仅有的命中。D部分：旁系同源基因FAM105A和OTULIN(FAM105B)具有40％的同源性，并在染色体5上相邻位点编码。它们共有OTU去泛素化酶结构域，预测其在FAM105A中为无催化活性的。通过全基因组关联研究，已经将FAM105A中的非同义单核苷酸多态性(SNP)与过敏性疾病关联(Ferreira等，2017)。OTULIN中的罕见突变与单基因严重炎症性疾病有关(Damgaard等，2016)。E部分：在CGS-21680剂量增加的情况下通过抗原特异性CD8T细胞的RFP标记的A375细胞的清除，所述抗原特异性CD8T细胞经靶向ADORA2A、FAM105A的sgRNA和非靶向对照编辑。Y轴显示各CGS-21680浓度下相较于载剂的相对清除水平。X轴显示靶向的不同sgRNA。水平线是中位数，须状线(whisker)是数据界限，其在各靶标两个向导和4个供体中。
图13A-B。用于人源化小鼠模型中体内汇集筛选免疫疗法的SLICE。A部分：针对收集自转移后7天的脾脏(最左边的四个点)和肿瘤(最右边的四个点)的T细胞的向导计数的主成分分析(principal competent analysis)。各点是一个样品(4只小鼠中2个供体)。对于各组织中富集的向导，明显存在清晰的分离。B部分：体内SLICE实验的log倍数变化。垂直线是平均值，水平线是SEM(各组织n＝2，各基因靶标n＝2个向导)。
具体实施方式
在一个方面中，本公开提供了对感兴趣的靶标(例如肿瘤细胞)展现出细胞毒性增强的工程改造的T细胞。这类T细胞经修饰以抑制T细胞抑制性基因的表达。如本文所用，“T细胞抑制性”基因指在刺激后将对增殖产生负面影响的基因。根据本发明对T细胞抑制性基因进行的修饰不必仅对T细胞进行。虽然修饰具有T细胞受体(TCR)依赖性，但它们可以应用于其他造血细胞。因此，在一些实施方式中，根据本发明修饰的细胞是T细胞，诸如CD8+T细胞。在一些实施方式中，细胞是造血干细胞。在其他实施方式中，T细胞是干记忆T细胞、效应记忆T细胞、中央记忆T细胞或原初T细胞。在一些实施方式中，根据本发明的修饰对CD4+T细胞或NK细胞或γΔT细胞进行。T细胞亚组的综述在例如Sallusto等,AnnualRev.Immunol.22745-763,2004；Mueller等,Annual Rev.Immunol 31:137-161,2013中提供，对于记忆干T细胞的综述，于Gattinoni,等,Nature Med.23:18-27,2018。能够在OMIPWiley在线文库(参见例如，Wingender和Kronenberg,OMIP-030：通过表面标志物表征人T细胞亚组(OMIP-030:Characterization of human T cell subsets via surface markers)Cytometry Part A 87A:1067-1069,2015)中找到通过标志物对亚组的描述。
靶基因的表达可以被抑制，或者在一些实施方式中，可以是失活的，从而使基因不表达活性蛋白质产物。在一些实施方式中，可以针对其中基因失活的细胞富集细胞群。
在一些实施方式中，经修饰以抑制表达的T细胞抑制性基因是CBLB、CD5、SOCS1、TMEM222、TNFAIP3、DGKZ、RASA2、TCEB2(在HUGO命名中也称为ELOB，延伸蛋白B)、UBASH3A或ARID1A。在一些实施方式中，T细胞抑制性基因是CD5、SOCS1、TMEM222、TNFAIP3、RASA2或TCEB2。在一些实施方式中，T细胞抑制性基因是SOCS1、TCEB2、RASA2或CBLB。在一些实施方式中，T细胞抑制性基因是SOCS1、TCEB2或RASA2。在一些实施方式中，经修饰以抑制表达的T细胞抑制性基因是RASA2、TCEB2、SOCS1、CBLB、FAM105A、ARID1A或TMEM222。在一些实施方式中，经修饰以抑制表达的T细胞抑制性基因是AGO1、ARIH2、CD8A、CDKN1B、DGKA、FIBP、GNA13、MEF2D或SMARCB1。在一些实施方式中，造血细胞(例如，T细胞)还包含抑制T细胞抑制性基因表达的第二修饰。
可以使用任何数量的试验来评价功能。示例性试验测量T细胞增殖反应，例如，响应T细胞受体(TCR)刺激。示例性试验述于实施例部分。试验包括但不限于：CFSE(或其他类似染料)稀释，基于生长的试验，特定位点的体内扩增，或分选激活或效应子功能(例如细胞因子产生，细胞表面标志物的诱导，或颗粒酶产生)的其他标志物。
在另一方面中，本公开提供了工程改造的T细胞，所述工程改造的T细胞被修饰为抑制T细胞基因表达，以抑制T细胞功能，例如，靶向用于治疗自身免疫疾病或者希望抑制T细胞功能的其他疾病(例如移植物排斥)的基因。在一些实施方式中，待修饰的T细胞基因为：CYP2R1、LCP2、RPP21、VAV1、EIF2B3、RPP21、EXOSC6、RPN1、VARS、CD3D、GRAP2、TRMT112、ALG8、VAV1、EXOSC6、SH2D1A、ZAP70、DDX54、CD247、ALDOA、ZNF131、WDR36、AK2、LCP2、CD247、VHL、EIF2B2、PRELID1、GRPEL1、NAA10、ALDOA、ALG2、MARS、C4orf45、RAC2、LCK、SUPT4H1、SLC25A3、LUC7L3、C3orf17、RPP21、HARS、ZNRD1、CCNH、MYC、CCDC25、EEF1G、CCND2、GCLC、TAF2、EIF6、SEC63、EXOSC6、RPS19BP1、SEC61B、VHL、DAD1、BEND6、FBL、VARS、EIF2B4、RAC2、PAGR1、MYC、CD3E、LCP2、MYC、ENOSF1、POLR3H、NOP14、CLNS1A、POLR2L、ZPR1、CARD11、SLC35B1、TRMT112、FARSA、PRELID1、LARS、NOP16、POLR2L、CD247、GEMIN8、TTC27、PMPCA、PWP2、TAF1C、DDOST、ZNF654、FAU、EIF2B3、YARS、DDX20、DDX56、DDX49、UTP20、EPRS、RSL1D1、ATP1B3、EXOSC4、ARMC7、EIF2B4、AUP1、VAV1、PAK1IP1、EIF6、FAM157A、HSPE1-MOB4、LAT、DCAF13、PPP1R10、EXOSC2、SRP9、POLR3K、TAF6、EIF3H、ABCF1、FLJ44635、PTP4A2、EIF3CL、ABCB7、GTF2H4、MARS、TAF4、RPL5、FTSJ3、CD28、ALG13、CARD11、EIF4G1、UTP3、GARS、CACNB4、HSPA8、POP7、ERCC3、GDPD2、SUPT5H、POLR3D、RPP30、C12orf45、DPH3、EIF3B、LACTBL1、THAP11、IMP4、EXOSC7、NOB1、EIF4E、PLCG1、HUWE1、RBM19、GATA3、CCND2、TTI2、THG1L、TAF1C、URI1、TRMT112、EIF3H、CCND2、GCLM、RBSN、QARS、POP7、TAF4、HUWE1、CARS、PTP4A2、PES1、ZNF785、WDR26、PRR20D、STK11、PIK3CD、YARS、STRAP、WDR77、NANS、TARS、TMEM127、FAM35A、ZBTB8OS、BPTF、INO80D、NOP14、KARS、SH2D1A、RHOH、DIMT1、CMPK1、TAF6、QTRT1、LCK、NOL10、MYBBP1A、NHP2、DDX54、LAT、TAF2、MBTPS1、GNL3、DEF6、BCL10、NFKBIA、PHB、CD3G、CD3D、QARS、EIF3C、GRPEL1、MBTPS2、ORAOV1、SLC4A2、GATA3、ODF3、SLC7A6OS、ORAOV1、ALG13和TAF1B。在一些实施方式中，基因是下述基因中的任一个：HSPA8、RPP21、EXOSC6、LCP2、MYC、CD247、NOP14、VAV1、RHOH、TAF1C、TRMT112、CCND2、SH2D1A、MARS、CD3D、NELFCD LCK、LUC7L3、EIF2B4、ORAOV1.VARS、NOL10、ZBTB8OS、SLC35B1、NAA10、EIF2B3、DHX37、LAT、EMG1、ALDOA、GRPEL1、ARMC7、POLR2L、NOP56、PSENEN、RELA、SUPT4H1、VHL、GFER、BPTF、RAC2、TSR2、TAF6、PMPCA、EIF6、STT3B、POP7、GMPPB、TP53RK、CCNH、TEX10、DHX33、QARS、EID2、IRF4、TAF2、IARS、GTF3A、NOP2、IMP3、RPL28、UTP3.EIF4G1、GPN1、UTP6、DAD1、ALG2、CDK6、MED19、RASGRP1、PHB2、NFS1、POLR2E、CDIPT、POLR3H、HARS、SEH1L、EIF2B5、TTC27、RRP12、JUNB、HSPE1、GMPS、EIF2S3、SRP14、FAM96B、RPL8、RRP36、MED11、ISG20L2、ROMO1、ATP6V1B2、RPN2或WASH1。
在另一方面中，T细胞被修饰为抑制这样的基因的表达，所述基因涉及对免疫抑制剂的抗性。在一些实施方式中，基因是FAM105A(在HUGO命名中也称为OTULINL(具有线性连接特异性样的OTU去泛素酶))。
在一些实施方式中，T细胞抑制性基因通过基因缺失而失活。如本文所用，“基因缺失”指去除基因的或邻近基因处的至少部分DNA序列。在一些实施方式中，经历基因缺失的序列包含基因的外显子序列。在一些实施方式中，经历基因缺失的序列包含基因的启动子序列。在一些实施方式中，经历基因缺失的序列包含基因的侧接序列。一些实施方式中，部分基因序列从基因中去除。在一些实施方式中，完整的基因序列从染色体中去除。在一些实施方式中，宿主细胞包含基因缺失，如本文所述任一实施方式所述。在一些实施方式中，基因通过缺失基因序列中至少一个核苷酸或核苷酸碱基对而失活，产生非功能性基因产物。在一些实施方式中，基因通过基因缺失而失活，其中基因序列的至少一个核苷酸缺失产生不再具有原始基因产物功能或活性的基因产物；或者基因是功能失调基因产物。在一些实施方式中，基因通过基因添加或取代而失活，其中添加或取代基因序列中至少一个核苷酸或核苷酸碱基对产生非功能性基因产物。在一些实施方式中，基因通过基因失活而失活，其中向基因序列纳入或取代至少一个核苷酸产生不再具有原始基因产物功能或活性的基因产物；或者基因是功能失调基因产物。在一些实施方式中，基因通过基因添加或取代而失活，其中将至少一个核苷酸纳入基因序列或取代产生功能失调基因产物。在一些实施方式中，宿主细胞包含基因缺失，如本文所述任一实施方式所述。
用于使宿主细胞中T细胞抑制性基因失活或者使本文所述抑制T细胞功能的靶基因失活的方法和技术包括但不限于：小干扰RNA(siRNA)，小发夹RNA(shRNA；也称为短发夹RNA)，成簇规律间隔性短回文重复序列(CRISPR)，转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，锌指核酸酶(ZFN)，同源重组，非同源末端连接和大范围核酸酶。参见例如，O'Keefe,MaterMethods,3,2013；Doench等,Nat Biotechnol,32,2014；Gaj等,Trends Biotechnol,31,2014；和Silva等,Curr Gene Ther,11,2011。
抑制性RNA
在一些实施方式中，通过小干扰RNA(siRNA)系统灭活T细胞抑制性基因，或者待修饰以抑制T细胞功能的基因。可以使用诸如下述考虑因素来鉴定使靶基因失活的siRNA序列：siRNA的长度，例如，21-23个核苷酸或更少个核苷酸；避免具有50-100个核苷酸的起始密码子和终止密码子的区域，避免内含子区域；避免四个或更多个相同的核苷酸的一段；避免GC含量小于30％或大于60％的区域；避免重复和低序列复杂性区域；避免单核苷酸多态性位点，和避免与其他脱靶基因中的序列互补的序列(参见例如，用于RNA干扰的siRNA设计规则(Rules of siRNA design for RNA interference),Protocol Online,2004年5月29日；和Reynolds等,Nat Biotechnol,22:3236-330 2004)。
在一些实施方式中，siRNA系统包含siRNA核苷酸序列，所述siRNA核苷酸序列的长度为约10-200个核苷酸，或长度为约10-100个核苷酸，或长度为约15-100个核苷酸，或长度为约10-60个核苷酸，或长度为约15-60个核苷酸，或长度为约10-50个核苷酸，或长度为约15-50个核苷酸，或长度为约10-30个核苷酸，或长度为约15-30个核苷酸。在一些实施方式中，siRNA核苷酸序列的长度约为10-25个核苷酸。在一些实施方式中，siRNA核苷酸序列的长度约为15-25个核苷酸。在一些实施方式中，siRNA核苷酸序列的长度为至少约10、至少约15、至少约20或至少约25个核苷酸。在一些实施方式中，siRNA系统包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与靶mRNA分子至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％互补。在一些实施方式中，siRNA系统包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与靶前mRNA(pro-mRNA)分子至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％互补。在一些实施方式中，siRNA系统包含双链RNA分子。在一些实施方式中，siRNA系统包含单链RNA分子。在一些实施方式中，宿主细胞包含siRNA系统，如本文所述任一实施方式所述。在一些实施方式中，宿主细胞包含前siRNA核苷酸序列，所述前siRNA核苷酸序列被加工成活性siRNA分子，如本文所述任一实施方式所述。在一些实施方式中，宿主细胞包含siRNA核苷酸序列，所述siRNA核苷酸序列与靶mRNA分子至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％互补。在一些实施方式中，宿主细胞包含编码siRNA分子的表达载体，如本文所述任一实施方式所述。在一些实施方式中，宿主细胞包含编码前siRNA分子的表达载体，如本文所述任一实施方式所述。
在一些实施方式中，siRNA系统包含递送载体。在一些实施方式中，宿主细胞包含递送载体。在一些实施方式中，递送载体包含前siRNA和/或siRNA分子。
在一些实施方式中，T细胞抑制性基因通过小发夹RNA(shRNA；也称为短发夹RNA)系统而失活。能够通过shRNA系统使基因失活。在一些实施方式中，shRNA系统包含这样的核苷酸序列，所述核苷酸序列的长度为约10-200个核苷酸，或长度为约10-100个核苷酸，或长度为约15-100个核苷酸，或长度为约10-60个核苷酸，或长度为约15-60个核苷酸，或长度为约10-50个核苷酸，或长度为约15-50个核苷酸，或长度为约10-30个核苷酸，或长度为约15-30个核苷酸。在一些实施方式中，shRNA核苷酸序列的长度约为10-25个核苷酸。在一些实施方式中，shRNA核苷酸序列的长度约为15-25个核苷酸。在一些实施方式中，shRNA核苷酸序列的长度为至少约10、至少约15、至少约20或至少约25个核苷酸。在一些实施方式中，shRNA系统包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与T细胞抑制性核酸mRNA分子的区域至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％互补。在一些实施方式中，shRNA系统包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与前mRNA分子至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％互补。在一些实施方式中，shRNA系统包含双链RNA分子。在一些实施方式中，shRNA系统包含单链RNA分子。在一些实施方式中，宿主细胞包含shRNA系统，如本文所述任一实施方式所述。在一些实施方式中，宿主细胞包含前shRNA核苷酸序列，所述前shRNA核苷酸序列被加工成活性shRNA核苷酸序列，如本文所述任一实施方式所述。在一些实施方式中，前shRNA分子由DNA组成。在一些实施方式中，前shRNA分子是DNA构建体。在一些实施方式中，宿主细胞包含shRNA核苷酸序列，所述shRNA核苷酸序列与T细胞抑制性基因mRNA分子至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或100％互补。在一些实施方式中，宿主细胞包含编码shRNA分子的表达载体，如本文所述任一实施方式所述。在一些实施方式中，宿主细胞包含编码前shRNA分子的表达载体，如本文所述任一实施方式所述。
在一些实施方式中，shRNA系统包含递送载体。在一些实施方式中，宿主包含递送载体。在一些实施方式中，递送载体包含前shRNA和/或shRNA分子。在一些实施方式中，递送载体是病毒载体。在一些实施方式中，递送载体是慢病毒。在一些实施方式中，递送载体是腺病毒。在一些实施方式中，载体包含启动子。
CRISPR
在一些实施方式中，抑制T细胞抑制性基因的表达使用CRISPR/CAS方法实现。使用CRISPR/Cas系统减少基因表达的说明性方法述于多份公开中，例如，美国专利申请公开号2014/0170753。CRISPR/Cas系统包括Cas蛋白和至少1-2个核糖核酸，其杂交至T细胞抑制性基因中的靶基序并指导Cas蛋白至靶基序。可以使用能够改变细胞中靶多核苷酸序列的任何CRISPR/Cas系统。在一些实施方式中，CRISPR Cas系统是I型CRISPR系统，在一些实施方式中，CRISPR/Cas系统是II型CRISPR系统。在一些实施方式中，CRISPR/Cas系统是V型CRISPR系统。
用于本发明的Cas蛋白是天然产生的Cas蛋白或其功能性衍生物。“功能性衍生物”包括但不限于：天然序列的片段和天然序列多肽的衍生物及其片段，前提是它们与相应的天然序列多肽具有共同的生物活性。本文设想的生物活性是功能性衍生物将DNA底物水解成片段的能力。术语“衍生物”包括多肽的氨基酸序列变体，共价修饰物，和其融合体，例如衍生的Cas蛋白。Cas多肽的合适衍生物或其片段包括但不限于Cas蛋白的突变体、融合体、共价修饰形式或其片段。
存在3种主要类型的Cas核酸酶(I型、II型和III型)，以及10种亚型，包括5种I型蛋白，3种II型蛋白和2种III型蛋白(参见例如，Hochstrasser和Doudna,Trends BiochemSci,2015:40(1):58-66)。II型Cas核酸酶包括Cas1、Cas2、Csn2和Cas9。本领域技术人员熟知这些Cas核酸酶。例如，酿脓链球菌野生型Cas9多肽的氨基酸序列示于，例如，NBCI序列编号NP_269215，并且嗜热链球菌野生型Cas9多肽的氨基酸序列示于，例如，NBCI序列编号WP_011681470。可以用于本文所述方法的一些CRISPR相关内切核酸酶公开于例如美国专利申请公开号2014/0068797、2014/0302563和2014/0356959。Cas核酸酶的非限制性示例包括：Cas1，Cas1B，Cas2，Cas3，Cas4，Cas5，Cas6，Cas7，Cas8，Cas9(也称为Csn1和Csx12)，Cas10，Csy1，Csy2，Csy3，Cse1，Cse2，Csc1，Csc2，Csa5，Csn2，Csm2，Csm3，Csm4，Csm5，Csm6，Cmr1，Cmr3，Cmr4，Cmr5，Cmr6，Csb1，Csb2，Csb3，Csx17，Csx14，Csx10，Csx16，CsaX，Csx3，Csx1，Csx15，Csf1，Csf2，Csf3，Csf4，其同源物，其变体，其突变体和其衍生物。
Cas9同源物存在于多种真细菌，包括但不限于，下述分类学组的细菌：放线菌(Actinobacteria)、产水菌(Aquificae)、拟杆菌-绿菌(Bacteroidetes-Chlorobi)、衣原体-疣微菌(Chlamydiae-Verrucomicrobia)、绿屈挠菌(Chlroflexi)、蓝藻细菌(Cyanobacteria)、厚壁菌(Firmicutes)、变形菌(Proteobacteria)、螺旋体(Spirochaetes)、和热孢菌(Thermotogae)。示例性的Cas9蛋白是酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9蛋白。其他Cas9蛋白和其同源物述于，例如，Chylinksi,等,RNA Biol.2013年5月1日；10(5):726–737；Nat.Rev.Microbiol.2011年6月；9(6):467-477；Hou,等,Proc Natl Acad Sci U S A.2013年9月24日；110(39):15644-9；Sampson等,Nature.2013年5月9日；497(7448):254-7；和Jinek,等,Science.2012年8月17日；337(6096):816-21。本文所提供的任何Cas9核酸酶的变体可以经优化以在宿主细胞中提供高效活性或增强稳定性。因此，还考虑了工程改造的Cas9核酸酶。来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9包含2个内切核酸酶结构域，包括切割与crRNA不互补的靶DNA的RuvC样结构域和切割与crRNA互补的靶DNA的HNH核酸酶结构域。Cas9的双链内切核酸酶活性还涉及短保守序列(2-5个核苷酸)，称之为原型间隔子相关基序(protospacer-associated motif，PAM)，其紧随靶序列中靶基序的3'之后。
此外，Cas核酸酶，例如Cas9多肽，可衍生自多种细菌物种，包括但不限于：非典型韦荣球菌(Veillonella atypical)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、龈沟产线菌(Filifactor alocis)、莫瑞单细菌(Solobacterium moorei)、凯氏粪球菌(Coprococcuscatus)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、杜氏嗜胨菌(Peptoniphilus duerdenii)、米氏链型杆菌(Catenibacterium mitsuokai)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、无害利斯特菌(Listeria innocua)、假中间葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius)、肠氨基酸球菌(Acidaminococcus intestine)、齿龈欧氏菌(Olsenella uli)、北原酒球菌(Oenococcus kitaharae)、比菲德氏菌(Bifidobacterium bifidum)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、运动支原体(Mycoplasma mobile)、鸡败血支原体(Mycoplasmagallisepticum)、绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)、犬支原体(Mycoplasmacanis)、滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae)、直肠真杆菌(Eubacterium rectale)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、细长真杆菌(Eubacterium dolichum)、棒状乳杆菌亚种扭曲乳杆菌(Lactobacillus coryniformis subsp.Torquens)、营养泥杆菌(Ilyobacter polytropus)、白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)、嗜粘蛋白艾克曼菌(Akkermansia muciniphila)、解纤维热酸菌(Acidothermus cellulolyticus)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、小迷踪菌(Elusimicrobium minutum)、硝化裂化器菌(Nitratifractor salsuginis)、螺旋体球菌(Sphaerochaeta globus)、琥珀酸纤维杆菌亚种产琥珀酸拟杆菌(Fibrobacter succinogenes subsp.Succinogenes)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、黄褐二氧化碳嗜纤维菌(Capnocytophaga ochracea)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、彩虹普雷沃菌(Prevotella micans)、瘤胃普雷沃氏菌(Prevotella ruminicola)、柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、少食氨基单胞菌(Aminomonas paucivorans)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、候选海洋谱尼螺杆菌(Candidatus Puniceispirillum marinum)、蚯蚓蚯蚓肾杆菌(Verminephrobactereiseniae)、蒲桃雷尔氏菌(Ralstonia syzygii)、芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌(Dinoroseobactershibae)、固氮螺菌(Azospirillum)、汉氏硝化细菌(Nitrobacter hamburgensis)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)、空肠弯曲杆菌空肠亚种(Campylobacter jejuni subsp.Jejuni)、雪貂螺旋杆菌(Helicobacter mustelae)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、食酸铁氧化菌(Acidovorax ebreus)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、肠炎罗斯氏菌(Roseburia intestinalis)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、出血败血性巴斯德氏菌亚种多杀性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida subsp.Multocida)、华德萨特菌(Sutterella wadsworthensis)、变形杆菌(proteobacterium)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、埃氏毛螺旋菌(Parasutterella excrementihominis)、产琥珀酸沃廉氏菌(Wolinella succinogenes)和新凶手弗朗西斯菌(Francisella novicida)。
其他RNA介导的核酸酶包括Cpf1(参见，例如Zetsche等，Cell，第163卷，第3期，p759-771，2015年10月22日)及其同源物。
如本文所用，术语“Cas9核糖核蛋白”复合物等术语指这样的复合物：Cas9蛋白和向导RNA之间的复合物，Cas9蛋白和crRNA之间的复合物，Cas9蛋白和反式激活crRNA(tracrRNA)之间的复合物，或其组合(例如，包含Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA向导RNA的复合物)。应当理解的是，在本文所述的任何实施方式中，可以用另一RNA介导的核酸酶，例如替代性的Cas蛋白或Cpf1核酸酶替代Cas9核酸酶。
在一些实施方式中，Cas蛋白以多肽型式引入T细胞。因此，例如，在某些实施方式中，Cas蛋白可以与本领域熟知的细胞穿透多肽或细胞穿透肽偶联或融合。细胞穿透肽的非限制性示例包括Milletti F,“Drug Discov.Today 17:850-860,2012中提供的那些，其相关公开内容通过引用其全部内容纳入本文。在一些情况中，T细胞可以经工程改造以产生Cas蛋白。
在一些实施方式中，将Cpf1核酸酶或Cas9核酸酶和gRNA以核糖核蛋白(RNP)复合物引入细胞中。
在一些实施方式中，RNP复合物可以引入约1×105-约2×106个细胞(例如，1×105个细胞-约5×105个细胞、约1×105个细胞-约1×106个细胞、1×105个细胞-约1.5×106个细胞、、1×105个细胞-约2×106个细胞、约1×106个细胞s-约1.5×106个细胞或约1×106个细胞-约2×106个细胞)。在一些实施方式中，在有效扩大修饰细胞群的条件下培养细胞。本文还提供了细胞群，其中至少20％,30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％,95％,99％或更多细胞的基因组包含本文所述抑制T细胞抑制性基因表达的遗传修饰或异源多核苷酸。在一些实施方式中，该群体包含细胞亚群，各亚群具有不同的遗传修饰以抑制本文所述T细胞抑制性基因的表达。
在一些实施方式中，RNP复合物通过电穿孔引入T细胞。本领域已知用于电穿孔细胞以引入RNP复合物的方法、组合物和装置，参见例如，WO 2016/123578，WO/2006/001614，和Kim,J.A.等Biosens.Bioelectron.23,1353–1360(2008)。用于电穿孔细胞以引入RNP复合物的其他或另外的方法、组合物和装置可以包括述于下述中的那些：美国专利申请公开号2006/0094095；2005/0064596；或2006/0087522；Li,L.H.等Cancer Res.Treat.1,341–350(2002)；美国专利号：6,773,669；7,186,559；7,771,984；7,991,559；6,485,961；7,029,916；和美国专利申请公开号2014/0017213；和2012/0088842；Geng,T.等,J.ControlRelease 144,91–100(2010)；和Wang,J.,等Lab.Chip 10,2057–2061(2010)。
在一些实施方式中，Cas9蛋白质可以处于激活的内切核酸酶形式，因此当与靶核酸结合作为具有向导RNA的复合物的部分或者具有DNA模板的复合物的部分时，双链断裂导入靶核酸。在本文提供的方法中，可以将Cas9多肽或编码Cas9多肽的核酸引入T细胞。可以用HDR修复双链断裂以将DNA模板插入T细胞的基因组中。本文所述方法可以利用各种Cas9核酸酶。例如，可以利用这样的Cas9核酸酶，所述Cas9核酸酶需要紧邻向导RNA靶向的区域3'的NGG原型间隔子邻近基序(PAM)。这样的Cas9核酸酶可以靶向TRAC的外显子1或TRAB的外显子1的区域，其包含NGG序列。又例如，具有正交PAM基序要求的Cas9蛋白可以用于靶向不具有邻近的NGG PAM序列的序列。具有正交PAM序列特异性的示例性Cas9蛋白包括但不限于在Esvelt等(Nature Methods 10:1116–1121(2013))中所述的那些。
在一些情况中，Cas9蛋白是切口酶，因此在与靶核酸结合作为与向导RNA的复合物的部分时将单链断裂或切口引入靶核酸。各自结合结构不同的向导RNA的一对Cas9切口酶可以靶向靶基因组区域的2个近端位点，并且因此将一对近端单链断裂导入靶基因组区域，例如，TRAC基因的外显子1或TRBC基因的外显子1。切口酶对可以提供增强的特异性，因为脱靶作用有可能导致单一切口，这通常通过碱基切除修复机制在无损伤的情况下修复。说明性Cas9切口酶包括具有D10A或H840A突变的Cas9核酸酶(参见例如，Jinek等,Science 337:816-821,2012；Qi等,Cell,152(5):1173-1183,2012；Ran等,Cell 154:1380-1389,2013)。在一个实施方式中，来自酿脓链球菌的Cas9多肽包含位置D10、G12、G17、E762、H840、N854、N863、H982、H983、A984、D986、A987或其任意组合处的至少一个突变。这类dCas9多肽和其变体的描述在例如国际专利公开号WO 2013/176772中提供。Cas9酶可以包含D10、E762、H983或D986处的突变，以及H840或N863处的突变。在一些情况中，Cas9酶可以包含D10A或D10N突变。在另一些实施方式中，Cas9酶可以包含H840A、H840Y或H840N。在一些实施方式中，Cas9酶可以包含D10A和H840A；D10A和H840Y；D10A和H840N；D10N和H840A；D10N和H840Y；或D10N和H840N取代。取代可以是保守性或非保守性取代，以使Cas9多肽催化性失活并且能够结合靶DNA。
在一些实施方式中，Cas核酸酶可以是高保真或特异性增强Cas9多肽变异体，并具有降低的脱靶作用和稳健的中靶裂解。中靶特异性改善的Cas9多肽变体的非限制性示例包括SpCas9(K855A)，SpCas9(K810A/K1003A/R1060A)(也称为eSpCas9(1.0))，和述于Slaymaker等,Science,351(6268):84-8(2016)中的SpCas9(K848A/K1003A/R1060A)(也称为eSpCas9(1.1))变体，和述于Kleinstiver等,Nature,529(7587):490-5(2016)中的SpCas9变体，其包含1、2、3或4个下述突变：N497A、R661A、Q695A和Q926A(例如，SpCas9-HF1包含所有4个突变)。
在一些实施方式中，可以选择靶基序以使本发明的CRISPR/Cas系统的脱靶作用最小化。例如，在一些实施方式中，选择靶基序以使其相较于细胞中所有其他基因组核苷酸序列而言包含至少两个错配。在一些实施方式中，选择靶基序以使其相较于细胞中所有其他基因组核苷酸序列而言包含至少一个错配。本领域技术人员将意识到的是多种技术可以用于选择合适的靶基序，用于使脱靶作用最小化(例如，生物信息学分析)。
如通篇所用，向导RNA(gRNA)序列是与位点特异性或靶向的核酸酶相互作用并与细胞基因组内的靶核酸特异性结合或杂交的序列，从而使gRNA和靶向的核酸酶共定位于细胞基因组中的靶核酸。每个gRNA包括一个长度约为10至50个核苷酸的DNA靶向序列或原型间隔子序列，该序列与基因组中的靶DNA序列特异性结合或杂交。例如，靶向序列的长度可以为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方式中，gRNA包含crRNA序列和反式激活crRNA(tracrRNA)序列。在一些实施方式中，gRNA不包含tracrRNA序列。
本领域技术人员将理解的是，可以依据采用的特定CRISPR/Cas系统和靶多核苷酸的序列来选择sgRNA。如上所示，在一些实施方式中，还可以选择1-2个核糖核酸，以使除了与靶多核苷酸序列以外的核酸序列的杂交最小化。在一些实施方式中，所述1-2个核糖核酸与靶基序杂交，所述靶基序相较于细胞中所有其他基因组核苷酸序列而言包含至少两个错配。在一些实施方式中，所述1-2个核糖核酸与靶基序杂交，所述靶基序相较于细胞中所有其他基因组核苷酸序列而言包含至少一个错配。在一些实施方式中，所述1-2个核糖核酸设计成与靶基序杂交，所述靶基序与Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序直接相邻。在一些实施方式中，所述1-2个核糖核酸中的各个核糖核酸设计成与靶基序杂交，所述靶基序与Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序直接相邻，所述Cas蛋白侧接位于靶基序之间的突变等位基因。还可以使用容易获得的软件，例如，于website crispr.mit.edu处获得的软件设计向导RNA。可以将一个或多个sgRNA转染到T细胞中，所述T细胞中Cas蛋白通过转染呈递，根据本技术领域已知的方法。
在某些情况中，DNA靶向序列可以纳入摆动或简并碱基以结合多个遗传元件。在某些情况中，结合区3'或5'端的19个核苷酸与一个或多个靶遗传元件完美互补。在某些情况中，可以改变结合区以增加稳定性。例如，可以纳入非天然核苷酸以增加RNA对降解的抗性。在某些情况中，可以改变或设计结合区，以避免或减少结合区中的二级结构形成。在某些情况中，可以设计结合区以优化G-C含量。一些情形中，G-C含量以约40％至约60％(例如40％、45％、50％、55％、60％)为佳。
在一些实施方式中，gRNA的序列或其部分可以设计成与T细胞抑制性基因中的靶区域互补(例如，完美互补)或基本上互补(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％互补)。在一些实施方式中，与多核苷酸中靶向区域互补并结合的gRNA部分的长度为或约为10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40或更多个核苷酸。在一些情况中，与多核苷酸中靶向区域互补并结合的gRNA部分的长度介于约19-约21个核苷酸。在一些情况中，gRNA可以纳入摆动或简并碱基以结合靶区域。在一些情况中，可以改变gRNA以增加稳定性。例如，可以纳入非天然核苷酸以增加RNA对降解的抗性。在一些情况中，可以改变或设计gRNA以避免或减少二级结构形成。在一些情况中，可以设计gRNA以优化G-C含量。在一些情况中，G-C含量为约40％-约60％(例如40％、45％、50％、55％、60％)。在一些情况中，结合区域可以包含修饰的核苷酸，诸如但不限于，甲基化或磷酸化的核苷酸。
在一些实施方式中，可以通过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸针对表达优化gRNA。在一些情况中，可以使这样的核苷酸序列缺失或被取代，所述核苷酸提供低效率的编码模板核酸转录。例如，在一些情况中，gRNA转录自与RNA聚合酶III启动子操作性连接的核酸。在这类情况中，可以使导致RNA聚合酶III低效率转录的gRNA序列缺失或被取代，诸如Nielsen等,Science.2013Jun 28；340(6140):1577-80中所述的那些。例如，可以使gRNA序列的一个或多个连续性尿嘧啶缺失或被删除。在一些情况中，如果尿嘧啶与相应的腺嘌呤氢键结合，那么可以改变gRNA序列以交换腺嘌呤和尿嘧啶。这种“A-U翻转”可以保留gRNA分子的整体结构和功能，同时通过减少连续尿嘧啶核苷酸的数量来改善表达。
在一些实施方式中，可以针对稳定性优化gRNA。可以通过优化gRNA:核酸酶相互作用的稳定性，优化gRNA:核酸酶复合物的组装，去除或改变RNA不稳定序列元件或添加RNA稳定序列元件来增强稳定性。在一些实施方案中，gRNA包含5'茎环结构，其在gRNA介导的核酸酶相互作用的区域近端或附近。优化5'茎环结构可以增强gRNA:核酸酶复合物的稳定性或组装。在一些情况中，通过增加茎环结构的茎部分的长度来优化5'茎环结构。
gRNA可以通过本领域已知的方法来修饰。在一些情况中，修饰可以包括但不限于添加一种或多种下述序列元件：5'帽(例如，7-甲基鸟苷酸帽)；3'聚腺苷酸尾；核糖开关序列；稳定性控制序列；发夹；亚细胞定位序列；检测序列或标记物；或一个或多个蛋白质的结合位点。修饰可以包括引入包括但不限于下述的一种或多种非天然核苷酸：荧光核苷酸和甲基化核苷酸。
本文还提供了表达盒和载体，用于在宿主细胞中产生gRNA。表达盒可以包含操作性连接编码gRNA的多核苷酸的启动子(例如，异源性启动子)。启动子可以是诱导型或组成型的。启动子可以是组织特异性。在一些情况中，启动子是U6，H1或脾病灶形成病毒(SFFV)长末端重复启动子。在一些情况中，相较于人延伸因子1启动子(EF1A)，启动子是弱哺乳动物启动子。在一些情况中，弱哺乳动物启动子是泛素C启动子或磷酸甘油激酶1启动子(PKG)。在一些情况中，在诱导剂不存在的情况下，弱哺乳动物启动子是TetOn启动子。在一些情况中，当使用TetOn启动子时，宿主细胞也与四环素反式激活因子接触。在一些实施方式中，选择选定的gRNA启动子的强度，以表达与Cas9或dCas9的量成比例的gRNA的量。表达盒可以在载体(诸如质粒)、病毒载体或慢病毒载体等中。在一些情况中，表达盒在宿主细胞中。gRNA表达盒可以是游离的或者整合于宿主细胞中。
使用其他靶向的核酸酶系统进行修饰
在一些实施方式中，应用于修饰T细胞以抑制T细胞抑制性基因表达的靶向的核酸酶，转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)，锌指核酸酶(ZFN)和大范围TAL(megaTAL)(参见，例如，Merkert和Martin，“人类多能干细胞的位点特异性基因组工程改造(Site-SpecificGenome Engineering in Human Pluripotent Stem Cells)”，Int.J.Mol.Sci.18(7):1000(2016))。
抑制T细胞抑制性基因表达的锌指核酸酶
在一些实施方式中，通过使用ZFN抑制表达来产生包含T细胞抑制性基因靶向改变的经修饰的T细胞。使用ZFN以减少基因表达的方法述于例如，美国专利号9,045,763，以及Durai等,Nucleic Acid Research 33:5978-5990,2005；Carroll等Genetics Society ofAmerica 188:773-782,2011；和Kim等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1156-1160。
ZFN包含与DNA结合结构域融合的FokI核酸酶结构域(或其衍生物)。在ZFN的情况中，DNA结合结构域包含一个或多个锌指。锌指是通过一个或多个锌离子稳定的小蛋白结构基序。锌指可以包含例如Cys2His2并且可以识别大约3bp的序列。可以组合多种具有已知特异性的锌指以产生识别约6、9、12、15或18bp序列的多指多肽。存在多种选择和模块化组装技术以生成识别特定序列的锌指(和其组合)，包括噬菌体展示，酵母单杂交(one-hybrid)系统，细菌单杂交和双杂交系统，和哺乳动物细胞。
ZFN二聚化以切割DNA。因此，将一对ZFN用于靶向非回文DNA位点。两个单独的ZFN以正确间隔的核酸酶结合DNA的相反链(参见例如，Bitinaite等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10570-5,1998)。ZFN可以在DNA中产生双链断裂，如果修复不当可以产生移码突变，从而导致细胞中靶基因的表达和表达水平降低。
TALEN抑制T细胞抑制性基因
在一些实施方式中，通过使用转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)抑制所需T细胞抑制性基因产生包含靶向的改变的T细胞。TALEN与ZFN类似，因为它们成对地围绕基因组位点结合并引导非特异性核酸酶(例如FoKI)在特定位点处切割基因组，但是不是识别DNA三联体，各结构域识别单核苷酸。使用TALEN来减少基因表达的方法公开于例如，美国专利号9,005,973；Christian等.“Genetics 186(2):757-761,2010；Zhang等2011NatureBiotech.29:149-53,2011；Geibler等2011PLoS ONE 6:e19509,2011；Boch等2009Science326:1509-12；Moscou等2009Science 326:3501。
为了产生TALEN，通常将TALE蛋白与FokI内切核酸酶融合，所述FokI内切核酸酶可以是野生型或突变型FokI内切核酸酶。针对FokI在TALEN中的用途，已经对FokI进行了多种突变；例如，它们将改善切割特异性或活性。Cermak等,Nucl.Acids Res.39:e82,2011；Miller等,Nature Biotech.29:143-8,2011；Hockemeyer等,Nature Biotech.29:731-734,2011；Wood等,Science 333:307,2011；Doyon等,Nature Methods 8:74-79,2010；Szczepek等,Nature Biotech.25:786-793,2007；和Guo等,J.Mol.Biol.200:96,2010。
FokI结构域以二聚体起作用，并且通常利用两个构建体，其具有针对靶基因组中位点的独特DNA结合结构域，并具有适当的方向和间隔。TALE DNA结合结构域和FokI切割结构域之间氨基酸残基的数量以及两个单独的TALEN结合位点之间碱基的数量似乎是实现高水平活性的重要参数(例如，Miller等,2011,引用如上)。
大范围核酸酶(Meganuclease)
“大范围核酸酶”是可以具有高度特异性的稀切内切核酸酶或归巢核酸酶，其识别长度为至少12个碱基对的DNA靶位点，例如，长度为12-40个碱基对或12-60个碱基对。大范围核酸酶可以是模块化DNA结合核酸酶，诸如包含至少一个内切核酸酶催化结构域和至少一个指定核酸靶序列的DNA结合结构域或蛋白的任何融合蛋白。DNA结合结构域可以包含至少一个识别单链或双链DNA的基序。大范围核酸酶可以是单体或二聚体。
在本文所述方法的一些实施方式中，大范围核酸酶可用于抑制T细胞抑制性基因的表达或者抑制本文所述将抑制免疫功能的基因的表达。在一些情况中，大范围核酸酶是天然存在的(存在于自然中)或野生型的，并且在其他情况中，大范围核酸酶是非天然的、人工的、工程改造的、合成的或合理设计的。在某些实施方案中，可以用于本文所述方法的大范围核酸酶包括但不限于：I-CreI大范围核酸酶，I-CeuI大范围核酸酶，I-MsoI大范围核酸酶，I-SceI大范围核酸酶，其变体，其突变体和其衍生物。
有用的大范围核酸酶及其在基因编辑中的应用的详细描述述于例如，Silva等,Curr Gene Ther,2011,11(1):11-27；Zaslavoskiy等,BMC Bioinformatics,2014,15:191；Takeuchi等,Proc Natl Acad Sci USA,2014,111(11):4061-4066，和美国专利号7,842,489；7,897,372；8,021,867；8,163,514；8,133,697；8,021,867；8,119,361；8,119,381；8,124,36；和8,129,134。
使用本文所述方法抑制任何T细胞调节性基因表达的效率可以通过使用本领域众所周知的方法来测量mRNA或蛋白质的量来评估，例如定量PCR，western印迹，流式细胞术等等。在一些实施方式中，评估蛋白质的水平，以评价抑制效率的效率。在某些实施方式中，相较于没有靶向的修饰的相应细胞而言，减少靶基因表达的效率为至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少60％或至少80％，或至少90％或更高。在某些实施方式中，减少的效率为约10％至约90％。在某些实施方式中，减少的效率为约30％至约80％。在某些实施方式中，减少的效率为约50％至约80％。在一些实施方式中，减少的效率大于或等于约80％。
治疗方法和组合物
本文所述的任何方法可以用于修饰获自人对象的T细胞，例如，CD8+T细胞。根据本发明修饰的T细胞可以用于治疗任何数量的疾病或病症，包括癌症，自身免疫疾病，感染性疾病，或者与移植物排斥相关的疾病或病症。
治疗癌症的方法
在一些实施方式中，修饰T细胞，以减少T细胞抑制性基因的表达，如本文所述。在一些实施方式中，经修饰的T细胞抑制性基因是CBLB、CD5、SOCS1、TMEM222、TNFAIP3、DGKZ、RASA2、TCEB2、UBASH3A或ARID1A。在一些实施方式中，T细胞抑制性基因是CD5、SOCS1、TMEM222、TNFAIP3、RASA2或TCEB2。在一些实施方式中，T细胞抑制性基因是SOCS1、TCEB2、RASA2或CBLB。在一些实施方式中，T细胞抑制性基因是SOCS1、TCEB2或RASA2。在一些实施方式中，经修饰的T细胞抑制性基因是RASA2、TCEB2、SOCS1、CBLB、FAM105A、ARID1A或TMEM222。在一些实施方式中，经修饰的T细胞抑制性基因是AGO1、ARIH2、CD8A、CDKN1B、DGKA、FIBP、GNA13、MEF2D或SMARCB1。因此，在一些实施方式中，本文提供了治疗人对象中癌症的方法，该方法包括：a)由对象获得T细胞，例如CD8+T细胞；b)使用本文所提供的任何方法修饰T细胞以减少T细胞抑制性基因(例如，该段落中所公开的基因)的表达；和c)给予对象经修饰的T细胞。
在一些实施方式中，获自患有癌症的对象的T细胞，例如，CD8+T细胞可以离体扩增。对象癌症的特征可以确定一组定制的细胞修饰(例如选择一个或多个抑制性基因靶标)，并且可以使用本文所述的任何方法将这些修饰应用于T细胞。然后可以将修饰的T细胞重新引入对象。该策略利用并增强了对象的癌症特异T细胞自然储库的功能，提供了多样化的治疗库来快速消除诱变的癌细胞。
可以用本文所述遗传修饰的T细胞治疗任何癌症。在一些实施方式中，癌症是癌或肉瘤。在一些实施方式中，癌症是血液癌症。在一些实施方式中，癌症是乳腺癌，前列腺癌，睾丸癌，肾细胞癌，膀胱癌，肝癌，卵巢癌，宫颈癌，子宫内膜癌，肺癌，结肠直肠癌，肛门癌，胰腺癌，胃癌，食道癌，肝细胞癌，肾癌，头颈癌，成胶质细胞瘤，间皮瘤，黑素瘤，软骨肉瘤或骨骼或软组织肉瘤。在一些实施方式中，癌症是肾上腺皮质癌，肛门癌，阑尾癌，星形细胞瘤，基底细胞癌，胆管癌，骨肿瘤，脑干神经胶质瘤，脑癌，小脑星形细胞瘤，脑星形细胞瘤，室管膜瘤，成神经管细胞瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤，视通路和下丘脑神经胶质瘤或支气管腺瘤。在一些实施方式中，癌症是急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞性白血病，伯基特氏淋巴瘤，中枢神经系统淋巴瘤，慢性淋巴细胞性白血病，慢性骨髓性白血病，毛细胞白血病，慢性骨髓增生性疾病，骨髓增生异常综合症，成人急性骨髓增生性疾病，多发性骨髓瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。在一些实施方式中，癌症是增生性小圆形细胞瘤，室管膜瘤，上皮性血管内皮瘤(EHE)，尤因氏肉瘤，颅外生殖细胞瘤，性腺外生殖细胞瘤，肝外胆管癌，眼内黑素瘤，视网膜母细胞瘤，胆囊癌，胃肠道类癌肿瘤，胃肠道间质瘤(GIST)，生殖细胞肿瘤，妊娠滋养细胞肿瘤，胃类癌，心脏病，下咽癌，下丘脑和视通路神经胶质瘤，儿童期，眼内黑色素瘤，胰岛细胞癌，卡波西肉瘤，喉癌，嘴唇和口腔癌，脂肪肉瘤，非小细胞肺癌，小细胞肺癌，巨球蛋白血症，男性乳腺癌，骨恶性纤维组织细胞瘤，成神经管细胞瘤，黑素瘤，默克尔细胞癌，间皮瘤，转移性鳞状颈癌，口腔癌，多发性内分泌肿瘤，蕈样肉芽肿(mycosis fungoides)，慢性，粘液瘤，鼻腔和鼻旁窦癌，鼻咽癌，成神经细胞瘤，少突胶质细胞瘤，口癌，口咽癌，骨肉瘤，卵巢上皮癌，卵巢生殖细胞肿瘤，卵巢低恶性潜能肿瘤，鼻窦和鼻腔癌，甲状旁腺癌，阴茎癌，咽癌，嗜铬细胞瘤，松果体星形细胞瘤，松果体胚细胞，成骨细胞瘤，幕上原始神经外胚层肿瘤，垂体腺瘤，浆细胞瘤，胸膜肺母细胞瘤，原发性中枢神经系统淋巴瘤，肾细胞癌，视网膜母细胞瘤，横纹肌肉瘤，唾液腺癌，子宫肉瘤，Sézary综合症，非黑素瘤皮肤癌，黑素瘤默克尔细胞皮肤癌，小肠癌，鳞状细胞癌，鳞状颈癌，喉癌，胸腺瘤，甲状腺癌，肾盂和输尿管的移行细胞癌，滋养细胞肿瘤，妊娠，尿道癌，子宫癌，阴道癌，外阴癌，瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症和维尔姆斯肿瘤。
在某些实施方式中，经遗传修饰的T细胞，或经遗传修饰的T细胞亚型的个体群，以如下范围给予所述对象：约100万至约1000亿个细胞，例如，100万至约500亿个细胞(例如，约5百万个细胞，约2500万个细胞，约500亿个细胞，约10亿个细胞，约50亿个细胞，约200亿个细胞，约300亿个细胞，约400亿个细胞，或前述任何两个值之间确定的范围)，例如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞，约3000万个细胞，约4000万个细胞，约6000万个细胞，约7000万个细胞，约8000万个细胞，约9000万个细胞，约100亿个细胞，约250亿个细胞，约500亿个细胞，约750亿个细胞，约900亿个细胞，或前述任何两个值之间确定的范围)，和在一些情况中，约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞，约2.5亿个细胞，约3.5亿个细胞，约4.5亿个细胞，约6.5亿个细胞，约8亿个细胞，约9亿个细胞，约30亿个细胞，约300亿个细胞，约450亿个细胞)或这些范围之间任何值。
在一些实施方式中，总细胞剂量和/或细胞个体亚群剂量在如下范围中：介于是或约是104和是或约是109细胞/千克(kg)体重之间，如介于105和106细胞/kg体重之间，例如，至少约1x 105细胞/kg，1.5x 105细胞/kg，2x105细胞/kg，5x 105细胞/kg或1x 106细胞/kg体重。
适当的剂量可根据待治疗癌症的类型，疾病的严重程度和病程，既往治疗，对象的临床病史和对细胞的反应以及主治医师的判断的裁量来确定。在一些实施方式中，组合物和细胞适合在一个时间点或以一系列治疗来给予对象。
所述细胞可通过任何合适的方式给予，例如，通过推注(bolus)输注，通过注射，例如，静脉内或皮下注射、眼内注射、眼底注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、反间隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、巩膜上腔注射、球后注射、眼周注射或球周递送。在一些实施方式中，它们通过胃肠外、肺内的和鼻内，以及如果希望局部治疗，病灶内给予。腹膜外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予。在一些实施方式中，通过单次推注给予细胞来给予给定剂量。在一些实施方式中，通过多次推注给予细胞，例如，在不超过3天的时间内，或通过连续输注给予细胞来给予。
在一些实施方式中，细胞作为联合治疗的一部分给予，例如与另一治疗性干预(如抗体或经工程改造的细胞或受体或药剂(如细胞毒性或治疗性药剂))同时或以任何顺序依次给予。在一些实施方式中，细胞与一种或多种其他治疗剂共同给予或与另一治疗干预联合给予，或者同时或者以任何顺序依次进行。在一些情况中，细胞与其他治疗共同给予，时间上足够接近从而细胞群增强一种或多种其他治疗剂的作用，反之亦然。在一些实施方式中，细胞在一种或多种其他治疗剂之前给予。在一些实施方式中，细胞在一种或多种其他治疗剂之后给予。
治疗自身免疫疾病或移植物排斥情况的方法
本文还提供了治疗自身免疫疾病或希望抑制免疫系统的其他情况(例如，移植物排斥)的方法，所述方法通过给予经修饰以抑制下述基因表达的T细胞(例如CD8+T细胞)：CYP2R1，LCP2，RPP21，VAV1，EIF2B3，RPP21，EXOSC6，RPN1，VARS，CD3D，GRAP2，TRMT112，ALG8，VAV1，EXOSC6，SH2D1A，HSPA8，ZAP70，DDX54，CD247，ALDOA，ZNF131，WDR36，AK2，LCP2，CD247，VHL，EIF2B2，PRELID1，GRPEL1，NAA10，ALDOA，ALG2，MARS，C4orf45，RAC2，LCK，SUPT4H1，SLC25A3，LUC7L3，C3orf17，RPP21，HARS，ZNRD1，CCNH，MYC，CCDC25，EEF1G，CCND2，GCLC，TAF2，EIF6，SEC63，EXOSC6，RPS19BP1，SEC61B，VHL，DAD1，BEND6，FBL，VARS，EIF2B4，RAC2，PAGR1，MYC，CD3E，LCP2，MYC，ENOSF1，POLR3H，NOP14，CLNS1A，POLR2L，ZPR1，CARD11，SLC35B1，TRMT112，FARSA，PRELID1，LARS，NOP16，POLR2L，HSPA8，CD247，GEMIN8，TTC27，PMPCA，PWP2，TAF1C，DDOST，ZNF654，FAU，EIF2B3，YARS，DDX20，DDX56，DDX49，UTP20，EPRS，RSL1D1，ATP1B3，EXOSC4，ARMC7，EIF2B4，AUP1，VAV1，PAK1IP1，EIF6，FAM157A，HSPE1-MOB4，LAT，DCAF13，PPP1R10，EXOSC2，SRP9，POLR3K，TAF6，EIF3H，ABCF1，FLJ44635，PTP4A2，EIF3CL，ABCB7，GTF2H4，MARS，TAF4，RPL5，FTSJ3，CD28，ALG13，CARD11，EIF4G1，UTP3，GARS，CACNB4，HSPA8，POP7，ERCC3，GDPD2，SUPT5H，POLR3D，RPP30，C12orf45，DPH3，EIF3B，LACTBL1，THAP11，IMP4，EXOSC7，NOB1，EIF4E，PLCG1，HUWE1，RBM19，GATA3，CCND2，TTI2，THG1L，TAF1C，URI1，TRMT112，EIF3H，CCND2，GCLM，RBSN，QARS，POP7，TAF4，HUWE1，CARS，PTP4A2，PES1，ZNF785，WDR26，PRR20D，STK11，PIK3CD，YARS，STRAP，WDR77，NANS，TARS，HSPA8，TMEM127，FAM35A，ZBTB8OS，BPTF，INO80D，NOP14，KARS，SH2D1A，RHOH，DIMT1，CMPK1，TAF6，QTRT1，LCK，NOL10，MYBBP1A，NHP2，DDX54，LAT，TAF2，MBTPS1，GNL3，DEF6，BCL10，NFKBIA，PHB，CD3G，CD3D，QARS，EIF3C，GRPEL1，MBTPS2，ORAOV1，SLC4A2，GATA3，ODF3，SLC7A6OS，ORAOV1，ALG13，或TAF1B基因。在一些实施方式中，基因是下述基因中的任一个：HSPA8、RPP21、EXOSC6、LCP2、MYC、CD247、NOP14、VAV1、RHOH、TAF1C、TRMT112、CCND2、SH2D1A、MARS、CD3D、NELFCD LCK、LUC7L3、EIF2B4、ORAOV1.VARS、NOL10、ZBTB8OS、SLC35B1、NAA10、EIF2B3、DHX37、LAT、EMG1、ALDOA、GRPEL1、ARMC7、POLR2L、NOP56、PSENEN、RELA、SUPT4H1、VHL、GFER、BPTF、RAC2、TSR2、TAF6、PMPCA、EIF6、STT3B、POP7、GMPPB、TP53RK、CCNH、TEX10、DHX33、QARS、EID2、IRF4、TAF2、IARS、GTF3A、NOP2、IMP3、RPL28、UTP3.EIF4G1、GPN1、UTP6、DAD1、ALG2、CDK6、MED19、RASGRP1、PHB2、NFS1、POLR2E、CDIPT、POLR3H、HARS、SEH1L、EIF2B5、TTC27、RRP12、JUNB、HSPE1、GMPS、EIF2S3、SRP14、FAM96B、RPL8、RRP36、MED11、ISG20L2、ROMO1、ATP6V1B2、RPN2或WASH1。在一个实施方式中，该方法包括a)由存在所述情况(例如，自身免疫疾病，或移植物)的对象获得T细胞；b)使用本文所提供的任一方法修饰T细胞以抑制下述基因的表达：CYP2R1，LCP2，RPP21，VAV1，EIF2B3，RPP21，EXOSC6，RPN1，VARS，CD3D，GRAP2，TRMT112，ALG8，VAV1，EXOSC6，SH2D1A，HSPA8，ZAP70，DDX54，CD247，ALDOA，ZNF131，WDR36，AK2，LCP2，CD247，VHL，EIF2B2，PRELID1，GRPEL1，NAA10，ALDOA，ALG2，MARS，C4orf45，RAC2，LCK，SUPT4H1，SLC25A3，LUC7L3，C3orf17，RPP21，HARS，ZNRD1，CCNH，MYC，CCDC25，EEF1G，CCND2，GCLC，TAF2，EIF6，SEC63，EXOSC6，RPS19BP1，SEC61B，VHL，DAD1，BEND6，FBL，VARS，EIF2B4，RAC2，PAGR1，MYC，CD3E，LCP2，MYC，ENOSF1，POLR3H，NOP14，CLNS1A，POLR2L，ZPR1，CARD11，SLC35B1，TRMT112，FARSA，PRELID1，LARS，NOP16，POLR2L，HSPA8，CD247，GEMIN8，TTC27，PMPCA，PWP2，TAF1C，DDOST，ZNF654，FAU，EIF2B3，YARS，DDX20，DDX56，DDX49，UTP20，EPRS，RSL1D1，ATP1B3，EXOSC4，ARMC7，EIF2B4，AUP1，VAV1，PAK1IP1，EIF6，FAM157A，HSPE1-MOB4，LAT，DCAF13，PPP1R10，EXOSC2，SRP9，POLR3K，TAF6，EIF3H，ABCF1，FLJ44635，PTP4A2，EIF3CL，ABCB7，GTF2H4，MARS，TAF4，RPL5，FTSJ3，CD28，ALG13，CARD11，EIF4G1，UTP3，GARS，CACNB4，HSPA8，POP7，ERCC3，GDPD2，SUPT5H，POLR3D，RPP30，C12orf45，DPH3，EIF3B，LACTBL1，THAP11，IMP4，EXOSC7，NOB1，EIF4E，PLCG1，HUWE1，RBM19，GATA3，CCND2，TTI2，THG1L，TAF1C，URI1，TRMT112，EIF3H，CCND2，GCLM，RBSN，QARS，POP7，TAF4，HUWE1，CARS，PTP4A2，PES1，ZNF785，WDR26，PRR20D，STK11，PIK3CD，YARS，STRAP，WDR77，NANS，TARS，HSPA8，TMEM127，FAM35A，ZBTB8OS，BPTF，INO80D，NOP14，KARS，SH2D1A，RHOH，DIMT1，CMPK1，TAF6，QTRT1，LCK，NOL10，MYBBP1A，NHP2，DDX54，LAT，TAF2，MBTPS1，GNL3，DEF6，BCL10，NFKBIA，PHB，CD3G，CD3D，QARS，EIF3C，GRPEL1，MBTPS2，ORAOV1，SLC4A2，GATA3，ODF3，SLC7A6OS，ORAOV1，ALG13，或TAF1B基因；和c)给予对象经修饰的T细胞。在一些实施方式中，基因是下述基因中的任一个：HSPA8、RPP21、EXOSC6、LCP2、MYC、CD247、NOP14、VAV1、RHOH、TAF1C、TRMT112、CCND2、SH2D1A、MARS、CD3D、NELFCD LCK、LUC7L3、EIF2B4、ORAOV1.VARS、NOL10、ZBTB8OS、SLC35B1、NAA10、EIF2B3、DHX37、LAT、EMG1、ALDOA、GRPEL1、ARMC7、POLR2L、NOP56、PSENEN、RELA、SUPT4H1、VHL、GFER、BPTF、RAC2、TSR2、TAF6、PMPCA、EIF6、STT3B、POP7、GMPPB、TP53RK、CCNH、TEX10、DHX33、QARS、EID2、IRF4、TAF2、IARS、GTF3A、NOP2、IMP3、RPL28、UTP3.EIF4G1、GPN1、UTP6、DAD1、ALG2、CDK6、MED19、RASGRP1、PHB2、NFS1、POLR2E、CDIPT、POLR3H、HARS、SEH1L、EIF2B5、TTC27、RRP12、JUNB、HSPE1、GMPS、EIF2S3、SRP14、FAM96B、RPL8、RRP36、MED11、ISG20L2、ROMO1、ATP6V1B2、RPN2或WASH1。
在一些实施方式中，将前述段落中所述经修饰的T细胞给予患者以治疗或预防移植物排斥。
在一些实施方式中，将本文所述修饰为抑制免疫功能的T细胞给予患有自身免疫疾病或炎症性病症的患者。在一些实施方式中，自身免疫或炎症性疾病是骨关节炎，类风湿关节炎，青少年类风湿或特发性关节炎，多发性硬化症，牛皮癣，牛皮癣关节炎，克罗恩病，炎性肠病，溃疡性结肠炎，乳糜泻，狼疮，格雷夫斯病，桥本氏甲状腺炎，艾迪森氏病，重症肌无力，干燥综合征，I型糖尿病，血管炎，强直性脊柱炎。
在某些实施方式中，经遗传修饰的T细胞，或经遗传修饰的T细胞亚型的个体群，以如下范围给予所述对象：约100万至约1000亿个细胞，例如，100万至约500亿个细胞(例如，约5百万个细胞，约2500万个细胞，约500亿个细胞，约10亿个细胞，约50亿个细胞，约200亿个细胞，约300亿个细胞，约400亿个细胞，或前述任何两个值之间确定的范围)，例如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞，约3000万个细胞，约4000万个细胞，约6000万个细胞，约7000万个细胞，约8000万个细胞，约9000万个细胞，约100亿个细胞，约250亿个细胞，约500亿个细胞，约750亿个细胞，约900亿个细胞，或前述任何两个值之间确定的范围)，和在一些情况中，约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞，约2.5亿个细胞，约3.5亿个细胞，约4.5亿个细胞，约6.5亿个细胞，约8亿个细胞，约9亿个细胞，约30亿个细胞，约300亿个细胞，约450亿个细胞)或这些范围之间任何值。
在一些实施方式中，总细胞剂量和/或细胞个体亚群剂量在如下范围中：介于是或约是104和是或约是109细胞/千克(kg)体重之间，如介于105和106细胞/kg体重之间，例如，至少约1x 105细胞/kg，1.5x 105细胞/kg，2x105细胞/kg，5x 105细胞/kg或1x 106细胞/kg体重。
适当的剂量可根据待治疗癌症的类型，疾病的严重程度和病程，既往治疗，对象的临床病史和对细胞的反应以及主治医师的判断的裁量来确定。在一些实施方式中，组合物和细胞适合在一个时间点或以一系列治疗来给予对象。
所述细胞可通过任何合适的方式给予，例如，通过推注(bolus)输注，通过注射，例如，静脉内或皮下注射、眼内注射、眼底注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、反间隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、巩膜上腔注射、球后注射、眼周注射或球周递送。在一些实施方式中，它们通过胃肠外、肺内的和鼻内，以及如果希望局部治疗，病灶内给予。腹膜外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予。在一些实施方式中，通过单次推注给予细胞来给予给定剂量。在一些实施方式中，通过多次推注给予细胞，例如，在不超过3天的时间内，或通过连续输注给予细胞来给予。
在一些实施方式中，细胞作为联合治疗的一部分给予，例如与另一治疗性干预(如抗体或其他免疫抑制性试剂)同时或以任何顺序依次给予。在一些实施方式中，细胞与一种或多种其他治疗剂共同给予或与另一治疗干预联合给予，或者同时或者以任何顺序依次进行。在一些情况中，细胞与其他治疗共同给予，时间上足够接近从而细胞群增强一种或多种其他治疗剂的作用，反之亦然。在一些实施方式中，细胞在一种或多种其他治疗剂之前给予。在一些实施方式中，细胞在一种或多种其他治疗剂之后给予。
本文引用的出版物及其中援引相关的材料都具体通过引用整体纳入本文。
实施例
提供以下实施例以说明而非限制所要求的发明。
实施例1.将可追踪遗传扰动引入原代人T细胞中的混合方法
我们着手建立了在离体人造血细胞中直接起作用的高通量CRISPR筛选平台。当前的汇集CRISPR筛选方法依赖于建立具有稳定整合的Cas9表达盒的细胞系。我们尝试通过慢病毒在原代T细胞中稳定表达酿脓链球菌Cas9导致转导效率极低。这种低效率阻碍了对原代细胞的大规模汇集筛选，所述原代细胞未被永生化并且只能在有限的时间内在培养中扩增。我们先前通过电穿孔体外预装有小向导RNA(sgRNA)的Cas9蛋白显示了对原代人T细胞进行高效的基因编辑(Patel等,2017)。我们构想了一个混合系统，其通过慢病毒然后用Cas9蛋白进行电穿孔来引入可追踪sgRNA盒(图1A)。为了测试该策略，我们以编码候选细胞表面蛋白(即CD8受体(CD8A)的α链)的基因为靶标，因为其在人CD8+T细胞中高度且均匀地表达。我们优化了细胞刺激、慢病毒转导和Cas9电穿孔中的多个步骤，以在保持细胞活力的同时高效递送各种组件(图7A-D)。简而言之，CD8+T细胞分离自健康供体的外周血，经刺激，然后用编码sgRNA盒和mCherry荧光蛋白报道基因的慢病毒转导。转导后，通过电穿孔用重组Cas9蛋白转染T细胞。电穿孔后第4天，转导的细胞(mCherry+)大部分(>80％)为CD8阴性(图1B和图7E)，表明Cas9-sgRNA组合成功靶向。CD8蛋白的丧失通过靶向sgRNA专门编程的，因为用非靶向对照sgRNA转导的细胞保留了高水平的CD8表达。通过以相同的递送策略靶向PTPRC(CD45)，我们确认第二靶标处的成功敲除并证明了该CD8+和CD4+T细胞中系统的功效(图7F)。与观察到的靶蛋白表达丧失一致，通过对基因组靶位点进行测序证实了高效的基因编辑(图7G)。我们得出用Cas9蛋白电穿孔进行sgRNA慢病毒感染(SLICE)导致有效和特异性破坏靶基因的结论。
我们接下来测试了是否可以扩展SLICE，以允许在原代细胞中用慢病毒编码的sgRNA库进行大规模功能丧失筛选。我们进行筛选以鉴定响应T细胞受体(TCR)刺激而调节T细胞增殖的基因靶标。为了进行初步研究，我们生成了一个定制的sgRNA质粒文库，其靶向所有带注释的细胞表面蛋白和TCR信号传导途径的多个标准成员(约5000个向导，靶向总计1211个基因，以及48个非靶向向导)。分离自两个健康人供体的CD8+T细胞经编码该sgRNA文库的慢病毒转导，用Cas9电穿孔，然后保持培养(实验程序)。电穿孔后第10天，用CFSE标记细胞以跟踪细胞分裂，然后进行TCR刺激。刺激四天后，CFSE水平显示细胞经历了多次分裂。通过FACS将细胞分选为两个群：(1)非增殖细胞(CFSE高)和(2)高度增殖细胞(CFSE低)(图1A，图7G和实验程序)。我们通过对扩增的sgRNA盒进行深度测序来定量各个群体的sgRNA丰度。与实验步骤中sgRNA的良好覆盖一致，我们能够检测出受感染的CD8+T细胞中的所有文库向导，其中各个供体和整个生物学重复中sgRNA丰度分布相对均匀(图7H)。为了鉴定调节T细胞增殖的sgRNA，我们计算了高度分裂细胞和非分裂细胞之间基于丰度的排名差异。在分裂或非分裂细胞中高度富集的sgRNA指向了关键的生物学途径。我们发现，如所预期，靶向TCR信号传导必要组件如CD3D和LCP2的sgRNA将抑制细胞增殖(de Saint Basile等,2004；Shen等,2009)。我们还发现，可以通过靶向CD5或CBLB增强人T细胞的增殖，已经报道了其在负调节T细胞刺激反应中的作用(Azzam等,2001；Naramura等,2002；Voisinne等,2016)。靶向这些基因的sgRNA的排名差异在两个生物学复制中均为前1％(图1C)。此外，靶向这些基因的多个sgRNA具有一致的作用，增加了我们对表型不是由于脱靶作用所致的信心(图7I)。重要的是，比采用其他相同实验时间线的简单的基于生长的筛选根据CFSE对分裂和非分裂原代细胞进行分选提供了强得多的sgRNA序列富集(图7J)。基于细胞倍增的筛选已经在很大程度上成功地使用了可长时间培养的永生化细胞系，但这并未转用于人原代T细胞中的筛选(Shalem等,2014；Wang等,2014)。综上所述，这些数据表明SLICE汇集CRISPR筛选可以用于发现原代人T细胞增殖中的正向和负向调节剂。
全基因组汇集CRISPR筛选揭示TCR反应的调控因子
为了充分利用该平台，我们将靶向的先导筛选扩大到全基因组(GW)规模(Doench等，2016)，将77,441个sgRNA(19,114个基因)的文库转导到来自两个健康供体的T细胞中。确认成功转导这些原代人T细胞后(图8，A-B)，将细胞重新刺激，然后根据CFSE水平将FACS分选为非增殖和高度增殖群(图8C和实验程序)。MAGeCK软件(Li等，2014)用于系统地识别在增殖的T细胞群体中阳性或阴性选择的基因。在GW筛选的两个生物学重复中确认了来自初步筛选的排名在前的正和负调节剂以及许多其他的命中(图2A、B)。为了训练排名在前的候选物列表，我们在来自另外两个人血液供体的细胞中进行了独立的二次筛选。结果在初次和二次筛选之间具有很好的相关性(图2C)。此外，对总计4个人血液供体进行的两个独立的筛选的综合分析改善了靶标发现的能力，特别是对于T细胞增殖的负调节剂(图8D)。为了确认命中实际上依赖于TCR刺激，我们在增加TCR刺激水平的情况下进行了GW筛选。虽然相似的基因靶标在整个条件下均表现为正调节剂和负调节剂，但是在更高水平的TCR刺激下，作用的强度减弱了，这表明更强的TCR刺激作用可以覆盖这些基因搅动的作用(图2D和图8E)。观察到的剂量反应证实了大多数筛选命依赖于TCR刺激并有助于调节产生的增殖反应。综上所述，这些筛选鉴定了数十种正向和负向调节T细胞增殖的遗传扰动。
整合的筛选分析中鉴定的基因用与TCR刺激相关的注释途径富集。基因集富集分析(GSEA)揭示了TCR信号传导途径中消耗自增殖细胞的基因靶标的过度表达(FDR<0.01，图2E和图8F)。我们还发现了分裂细胞中对于命中丰富的基因的大量富集，所述命中来自设计成发现促进体内肿瘤组织中T细胞增殖的基因靶标(FDR<0.01)的公开shRNA筛选(Zhou等，2014)。这是令人惊讶的，因为研究是在不同生物体中以不同的基因扰动平台进行的，但是藉由体内动物模型中发现的命中列表，我们的筛选中存在对于高排名阳性命中的显著富集。这些全局分析证实，我们的功能筛选可以鉴定关键基因靶标，现在可以在全基因组范围内直接在原代人细胞中实现。
在该GW筛选中消耗自增殖细胞的靶标编码对于TCR信号传导至关重要的关键蛋白复合物(图2F)。例如，损害TCR依赖性增殖的基因靶标包括TCR复合物自身的δ和ζ链(分别为负排名18和6)，LCK(负排名20)，其直接磷酸化并激活TCR ITAM和中央信号传导介质物ZAP70(Dave等，1998；Tsuchihashi等，2000；Wang等，2010)。LCK和ZAP70通过RhoH(负排名2)易位至免疫突触(Chae等，2010)。ZAP70靶标LCP2(负排名4)是TCR诱导的激活所需的衔接子蛋白并通过激活VAV1(负排名8)来介导TCR和CD28共刺激信号的整合，其是TCR诱导的钙通量和信号传导所需的(Dennehy等，2007；Raab等，1997；Tybulewicz，2005)。LAT(负排名38)是另一个ZAP70靶标，其在磷酸化后募集多个关键衔接子蛋白，用于在TCR结合下游进行信号传导(Bartelt和Houtman)。
负调节T细胞增殖的基因具有增强T细胞功能的治疗潜力。虽然已将功能分配给一些负调节剂，但许多负调节剂在标准TCR信号传导途径中的注释不太充分。发现二酰基甘油(DAG)激酶，DGKA(排名17)和DGKZ(排名1)(DAG介导的信号的负调节剂)在刺激后抑制人T细胞增殖(Arranz-Nicolás等,2018；Chen等,2016；Gharbi等,2011)。E3泛素蛋白连接酶CBLB(排名4)及其相互作用伴侣CD5(排名12)共同作用，以通过导致TCR降解的泛素化作用来抑制TCR激活(Voisinne等，2016)。TCEB2(排名5)与RNF7(排名34)、CUL5(排名162)和SOCS1(排名3)复合，其是激活的T细胞中JAK/STAT信号传导的关键抑制剂(Kamura等,1998；Liau等,2018)。UBASH3A(排名10)、TNFAIP3和其伴侣TNIP1(分别为排名13和24)抑制TCR诱导的NFkB信号传导，其是对于CD8+T细胞关键的存活和生长信号(Düwel等,2009；Ge等,2017)。除了这些关键复合物外，还发现了编码其他较少特征的细胞表面受体(例如TMEM222，GNA13)，细胞溶质信号传导组件(例如RASA2，FIBP)和核因子(例如CDKN1B，ARIH2，ZFP36L1)的基因可以抑制增殖(图2F)，这揭示了有希望的候选靶标资源集，以促进T细胞刺激的作用。
Cas9 RNP的阵列传递揭示了命中改变刺激反应
我们接下来通过对单个Cas9核糖核蛋白(RNP)进行阵列电穿孔确认了高分基因在促进T细胞激活和增殖中的生物学作用(Hultquist等，2016；Schumann等，2015)。我们的验证主要集中在一组排名高度靠前的负增殖调节剂，因为它们在靶向时具有增强T细胞功能的治疗潜力。我们进一步检查了在TCR刺激后，阳性命中在多大程度上影响了T细胞增殖。简而言之，来自4个人血液供体的CD8+T细胞经刺激，用RNP电穿孔，静置10天，用CFSE标记并经再次刺激(图3A和实验程序)。高通量流式细胞术基于CFSE稀释确定了经编辑的细胞和对照细胞中的增殖反应。这验证了许多经测试的基因靶标在刺激后增加T细胞增殖的能力，这与其在汇集筛选中的稳健作用相一致(图9A)。例如，相较于对照，CBLB和CD5敲除细胞在刺激后的分裂数显著增加，在向导RNA和血液供体中持续存在(图3B)。为了系统性地定量细胞增殖，我们使用数学模型(Roederer，2011)对我们的样品进行了CFSE分布拟合(图9B)。该分析表明，相较于对照，扰动T细胞刺激的多个负调节剂增加了增殖指数评分(此处显示了10个基因搅动负调节剂中的7个)。相较于非靶向对照细胞，UBASH3A、CBLB、CD5和RASA2敲除T细胞都显示出增殖指数增加超过2倍(图3C)。值得注意的是，靶向这些基因并没有增加未经刺激的细胞的增殖，这表明它们不是增殖的一般调节剂，而是似乎调节通过TCR信号传导诱导的增殖。相反，相较于非靶向对照，针对汇集筛选中增殖细胞中消耗的基因靶标的向导显示出增殖指数降低。因此，我们通过正交基因靶向系统证明了通过我们的筛选鉴定出的大多数排名靠前的基因将稳健地调节人CD8 T细胞中的刺激依赖性增殖。
我们接下来检查了这些命中除了细胞增殖之外还是否调节了对TCR刺激的典型反应。可以使用多个标志物在不同时间点评估以阵列格式编辑的细胞的表型。我们分析了早期CD8+T细胞激活的两个不同细胞表面标志物CD69和CD154(López-Cabrera等,1993；Shipkova和Wieland,2012)。电穿孔后第10天，在重新刺激后6小时评估细胞。我们发现，相较于非靶向对照细胞，工程改造为缺少增殖负调节剂，诸如SOCS1、CBLB、CD5等的T细胞还显示出增加CD69和CD154的表面表达水平(图3D和图8C-D)。相反，靶向TCR信号传导的正调节剂LCP2将降低刺激细胞中CD69和CD154的表达。总之，相较于非靶向对照向导，阳性命中在各种情况下表达这些激活标志物的细胞百分比更高，与各基因两个sgRNA一致，对于4个供体而言(图3E)。因此，阵列编辑和表型分析表征了遗传扰动的影响，并揭示了促进刺激依赖性增殖和激活程序的靶标。
SLICE与单细胞RNA-Seq配对用于对修饰的原代人细胞进行分子表型分析
然后我们更进一步地表征了通过切除人T细胞中关键靶基因改变的刺激依赖性转录程序。最近，将汇集CRISPR筛选与单细胞RNA-seq组合，能够实现高含量分析永生化细胞系(Adamson等,2016；Datlinger等,2017；Dixit等,2016)或来自转基因小鼠的细胞(Jaitin等,2016)中遗传扰动所致的转录变化。在这里，我们将SLICE与基于液滴的单细胞转录组读数结合，用于对人原代T细胞中汇集的扰动进行高维度表型分析。我们选择了CROP-Seq平台，因为其提供了无条形码的汇集CRISPR筛选以及使用容易获得的10X Genomics平台的单细胞RNA-Seq(Datlinger等,2017)。对于总共48个sgRNA，我们生成了定制文库，靶向来自我们GW筛选中排名靠前的命中(各基因2个sgRNA)，已知的检查点基因(PDCD1、TNFRSF9、C10orf54、HAVCR2、LAG3、BTLA)，和8个非靶向对照。用该文库转导来自两个供体的人T细胞，用Cas9蛋白电穿孔，并用嘌呤霉素选择进行富集(实验程序)(图10A)。在进行或不进行重新刺激的情况下，对细胞进行单细胞转录组分析，以表征因各种遗传修饰所致的细胞状态改变和刺激反应。
首先，我们分析了超过15,000个静息和经刺激的单细胞的转录状态，我们可以在其中鉴定sgRNA条码。合成的大量基因表达概况显示，经刺激的细胞上调多个细胞周期基因，表这明对TCR刺激的反应(图10B)。然后，我们使用统一流形近似和投影(UniformManifold Approximation and Projection，UMAP)(McInnes和Healy,2018)以缩小的尺寸显示了这些单细胞转录组的分布(图4A)。虽然未刺激的T细胞具有供体依赖性基础基因表达模式，但是来自两个供体的经刺激的细胞倾向于共有转录特征并聚类在一起。例如，经刺激的细胞通常诱导细胞周期基因(例如：MKI67)和细胞溶解性颗粒酶(例如：GZMB)表达(图4B)。相反，未经刺激的细胞大量表达静息状态的标志物，诸如IL7R和CCR7。因此，TCR刺激在跨生物重复中诱导激活的细胞状态具有强大的作用，虽然供体1中似乎存在比供体2中更多的细胞被强烈刺激。为了系统地估算细胞状态，我们基于单细胞共有的最近邻里通过基因表达将它们聚类(图4C)。经刺激的细胞被富集于簇9-12，其特征在于优先表达有丝分裂细胞周期和T细胞激活细胞程序(图10C)。这种对单细胞转录组的分析揭示了人T细胞在重新刺激之前和之后的细胞状态特征。
我们接下来评估了CRISPR介导的遗传扰动对细胞状态的影响。通过相较于具有非靶向对照sgRNA的细胞中的水平而言减少sgRNA靶转录本的表达来验证大多数基因靶标的高效编辑(图10D)。我们测试了基因扰动是否导致遗传程序改变。具有非靶向对照sgRNA的细胞在簇之间相对均匀地分布。与之相反，具有CBLB和CD5 sgRNA的细胞在与增殖和激活相关的簇中富集，而具有LCP2 sgRNA的细胞大多存在于以静息概况为特征的簇中(图4D)。然后，我们根据其转录概况定量哪些sgRNA靶标将细胞推向了不同的细胞状态簇(图4E)。靶向GW筛选中鉴定的多个负调节剂，诸如CD5、RASA2、SOCS1和CBLB，促进簇10-12程序。负调节剂的扰动诱导激活状态(IL2RA、TNFRSF18/GITR)、细胞周期基因(MKI67、UBE2S、CENPF和TOP2A)和效应子分子(GZMB、XCL1)的标志物(图4F和图10E)。相反，靶向CD3D或LCP2的sgRNA抑制簇10激活程序并促进了簇1-2程序。与单细胞RNA-Seq配对的SLICE揭示了靶基因操作如何塑造刺激依赖性细胞状态。
靶向不同的增殖负调节剂导致不同的转录结果。CBLB的敲除倾向于诱导类似于靶向已知检查点基因BTLA或LAG3的细胞状态特征，如簇表示(representation)中的相似性所证明(图10F)。因为靶向CD5，TCEB2，RASA2或CDKN1B，观察到了不同的共享激活程序。SLICE汇集的CRISPR筛选和单细胞RNA-Seq的整合提供了发现和表征人原代细胞中关键基因途径的一种强大的方法。这些数据还表明，靶向增殖负调节剂还可以诱导专门的刺激依赖性效应子基因程序，其可以增强T细胞效力。
筛选命中通过工程改造的人T细胞促进体外肿瘤杀伤
工程改造为增殖反应增强并促进响应于TCR刺激的增强效应子基因程序的细胞有望为癌症免疫疗法带来希望。我们在抗原特异性体外肿瘤杀伤系统中测试了靶基因敲除的效果(图5A)。具体地，我们使用表达RFP的A375黑素瘤细胞系(其表达肿瘤抗原NY-ESO)作为靶细胞(Robbins等，2008)。通过用NY-ESO1反应性α95：LY TCR转导产生抗原特异性T细胞(Wargo等，2009)(图11A)。这些转导的T细胞能够在靶A375细胞中诱导胱天蛋白酶介导的细胞死亡，其表现为随着时间推移，胱天蛋白酶水平升高和RFP标记的A375核水平降低(图11B)。使用慢病毒转导由4个供体中生成NY-ESO TCR+T细胞，然后在阵列中用RNP进行编辑，所述阵列为24个向导，靶向11个基因，包括非靶向对照(方法)。然后，将具有或不具有基因缺失的抗原特异性T细胞与A375细胞共培养，并通过对RFP标记的A375细胞进行定量来评估杀伤力，所述定量通过为期四天的实时延时显微镜。
我们比较了基因编辑的和对照NY-ESO TCR+T细胞之间的肿瘤杀伤动力学。NY-ESO特异性T细胞在12小时开始聚集在RFP+肿瘤细胞周围，并且相较于非靶向对照，某些sgRNA靶在36小时时肿瘤清除效率更高(图5B)。如所预期，LCP2的敲除(在我们的筛选中被鉴定为对强TCR刺激反应必不可少的)严重破坏了T细胞对A375细胞的杀伤。相比之下，与非靶向向导RNA电穿孔的对照T细胞相比，阴性调节剂SOCS1，TCEB2，RASA2和CBLB的CRISPR消融显着增加了肿瘤细胞的清除率(图5C)。相较于非靶向对照条件，在我们的试验中，这四个基因的靶向缺失导致改善肿瘤清除动力学(图5D和图11C-D)。在它们之中，CBLB已经作为可以在T细胞中靶向以改善小鼠模型中肿瘤控制的胞内免疫检查点进行了最佳研究(Peer等，2017)。靶向T细胞中JAK/STAT信号传导的负调节剂SOCS1显示出相较于CBLB增强的T细胞清除(Liau等，2018)。TCEB2(SOCS1的结合伴侣)的消融还为T细胞提供了肿瘤清除方面的优势，这表明SOCS1/TCEB2复合物抑制T细胞反应并且是免疫疗法的潜在靶标(Ilangumaran等,2017；Kamizono等,2001；Liau等,2018)。RASA2(刺激野生型RAS的GTP酶活性的GTP酶活化蛋白(Maertens和Cichowski，2014))在原代T细胞和免疫系统中尚未得到充分研究，但是我们的发现表明其可能是TCR信号传导和抗肿瘤免疫的调节剂。令人惊讶的是，TCEB2、SOCS1、CBLB和RASA2基因消融的细胞比对照细胞更强烈地激活了关键基因，包括颗粒酶B(GZMB)和白介素-2受体α(IL2RA)(图4F)。总之，在全基因组筛选中针对刺激的增殖反应确定的几个基因靶标也增强了体外肿瘤杀伤活性。
针对免疫抑制腺苷信号传导抗性的SLICE筛选
有效治疗实体器官肿瘤的过继细胞疗法将需要即使在免疫抑制性肿瘤微环境中也能对肿瘤抗原产生稳健反应的细胞。通过基因组编辑，T细胞可以对特定免疫抑制信号(cue)具有抗性，并且其将对于鉴定相关T细胞修饰途径至关重要。我们认为我们的SLICE筛选平台还可以用于鉴定允许T细胞逃脱各种抑制形式的基因缺失。我们关注腺苷，其是肿瘤微环境中的关键免疫抑制因子(Allard等，2017)。我们进行了四天的全基因组增殖筛选，所述筛选通过在相对于载剂对照而言存在抑制剂量为20uM的腺苷受体2(A2A)激动剂(CGS-21680)的情况下刺激T细胞。我们寻找了相较于载剂在A2A治疗条件下富集于增殖细胞群(CFSE低)的sgRNA(图12B)。
虽然许多基因修饰在腺苷受体激动剂存在或不存在的情况下促进了对刺激的TCR增殖反应，但是我们鉴定了多种sgRNA，其仅在CGS-21680存在的情况下在分裂细胞中富集(图6A)。这些基因靶似乎在腺苷受体介导的T细胞抑制中起选择性作用。重要的是，ADORA2A(编码CGS-21680特异性靶向的受体)在两种治疗条件之间显示出较高的排名差异(CGS-21680中的排名19，相对载剂对照中的排名7399)，这表明其敲除提供了对CGS-21680的特异性逃逸(escape)(图6A和图12C)。相反，在暴露于这种选择性A2A激动剂CGS-21680时，ADORA2B未显示任何增殖优势(图6A)。这些发现鼓励我们研究与ADORA2A对CGS-21680选择性抗性相似模式的其他基因靶标。在腺苷响应性信号传导中具有潜在作用的几种鸟嘌呤核苷酸结合蛋白在腺苷激动剂GW筛选中具有较高的阳性排名，包括GCGR(排名35相对1149)、GNG3(排名199相对12976)和GNAS(排名836相对2803)。令人惊讶的是，我们发现靶向先前未表征的基因FAM105A的多个向导(在CGS-21680中为排名15，相对在载剂对照中为排名13390)被特异性地富集至几乎与ADORA2A相同的程度(图6B)。虽然对于FAM105A功能知之甚少，但是过敏性疾病的GWAS暗示该基因存在可信的错义风险变体(Ferreira等,2017)。邻近的旁系同源基因Otulin(FAM105B)编码在免疫调节中起重要作用的去泛素化酶(Damgaard等，2016)(图12D)。该筛选结果表明FAM105A在介导T细胞中腺苷免疫抑制信号中起关键作用。
为了验证我们的发现，我们使用阵列化RNP平台来编辑两个供体中具有CFSE增殖读数的ADORA2A和FAM105A.我们发现，如我们的筛选所预测，用两个不同的sgRNA靶向这些基因中的每一个均导致对CGS-21680抑制的抗性(图6C)。重要的是，在TCR刺激不存在的情况下，这些编辑并不会导致T细胞增殖增加，这表明它们选择性地克服了TCR刺激的CGS-21680抑制。最后，我们证明了在体外癌细胞杀伤试验中，靶向ADORA2A和FAM105A的T细胞对CGS-21680抑制具有抗性(图12E)。因此，我们鉴定了可以经修饰以产生对腺苷抑制具有抗性的T细胞的胞外和胞内靶标。总之，这些发现表明，SLICE能够鉴定原代细胞对特定胞外信号反应所需途径的已知和新颖组件。这例证了将该平台用于发现可以增强特定T细胞功能的基因靶标的潜力。SLICE体内汇集筛选以揭示T细胞肿瘤浸润的调节剂
分离来自2个供体的原代人CD8+T细胞，并用抗CD3/CD28珠刺激。然后用编码NY-ESO1-反应性α95:LY TCR的浓缩冷冻慢病毒以及包含先前所述CROPseq质粒文库的慢病毒转导细胞(实验程序)。转导后48小时，如先前所述电穿孔细胞(实验过程)。电穿孔后48小时，将细胞暴露于2.5ug/ml嘌呤霉素，以选择用CROPseq文库转导的细胞(20个基因靶标(各基因2个向导)和8个非靶向对照向导，对于总计共48个向导)。然后，细胞在IL-2为50U/mL的Xvivo培养基中扩增，以1E6个细胞/ml，分离后持续总计14天。最初分离T细胞后7天，通过在一侧腹皮下注射100万个A375人黑素瘤细胞，8-12周龄NOD/SCID/IL-2Rγ-空(NSG)雄性小鼠(杰克逊实验室公司(Jackson Laboratory))接种了肿瘤。肿瘤接种后第7天，在各个供体两只小鼠中，将上述NY-ESO特异性CROPseq文库转导的T细胞(现在为第14天)以100万细胞重悬于100μl无血清RPMI中并经眼眶后注入小鼠中。T细胞转移后7天，由4只小鼠每只中收集肿瘤和脾脏，并通过FACS分离T细胞。基因组DNA分离自这些细胞，并如先前所述进行PCR扩增和条形码化(实验程序)。然后将样品在HiSeq 4000(亿明达公司(Illumina))上进行测序，并对各只小鼠和各供体的肿瘤和脾脏之间的向导频率进行比较。在使用有限数量的小鼠进行的这项前期研究中，我们发现相较于两个供体的脾脏，靶向ARID1A的向导在肿瘤中大量富集。我们进一步发现靶向CD5的向导还显示出相对于脾脏在肿瘤中富集的趋势。在证明了该实验的技术可行性之后，我们扩大了文库的大小，并计划在2位供体中各供体5只小鼠中进行体内汇集筛选。
表1-4列出了由我们的SLICE筛选平台鉴定的基因靶标。
讨论
SLICE提供了用于原代人T细胞中全基因组CRISPR功能丧失筛选的新平台，该细胞类型促成了癌症免疫疗法的革命。SLICE筛选可以在来自多个人供体的原代细胞中大规模常规进行，确保生物学上可重复的发现。在这里，我们选择了增强刺激反应性T细胞增殖的遗传搅动。增殖是受复杂遗传学调控的广谱(broad)表型。使用Cas9 RNP进行的阵列编辑使我们能够使用通过流式细胞仪测量的多重蛋白质组学进一步表征单个扰动的影响。最终，将SLICE与单细胞转录组学结合使用能够从全基因组筛选更全面地评估扰动命中的功能性后果。整合这些基于CRISPR的功能性遗传研究快速确定了人T细胞中的基因，这些基因可以被靶向以增强刺激依赖性增殖，激活反应，效应子程序和体外癌细胞杀伤。
在接受针对慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的CAR T细胞疗法的患者中偶然地证明了人原代T细胞功能丧失筛选的潜在能力(Fraietta等，2018)。非靶向整合编码CAR构建体的慢病毒前病毒可以破坏内源性基因。破坏患者T细胞中TET2的慢病毒整合在反应峰值时表现出优选且接近克隆的大规模扩增，并且可能有助于患者的完全缓解。该患者恰好在TET2的第二个等位基因中存在预先存在的亚型突变。SLICE现在提供了更系统地搜索增强过继性T细胞疗法的细胞扩增和效应子功能的遗传扰动的机会。
我们发现消融人T细胞中的至少四个靶标(SOCS1、TCEB2、RASA2和CBLB)增强了增殖和抗癌功能。其中，已经在小鼠模型中研究了CBLB，作为可以被靶向以增强CD8 T细胞对肿瘤的控制的胞内检查点。我们的数据表明，RASA2和SOCS1/TCEB2复合物成员还可能是用于过继T细胞癌免疫疗法中调节的有效靶标。这些研究证明了SLICE作为人原代CD8 T细胞中这样工具的潜力，所述工具将迅速发现并验证用于开发新型免疫疗法的相关候选靶标。展望未来，SLICE汇集筛选可以适用于选择对人T细胞赋予更加复杂表型的扰动，包括与T细胞疗法相关的体内功能。
SLICE汇集筛选方法是灵活多样的，因为其可以适用于探查调节原代T细胞生物学的多种遗传程序。可以用各种胞外选择性压力和/或基于FACS的表型选择进行原代T细胞筛选。我们关注CD8+T细胞，但表明SLICE也可以用于CD4+T细胞，并且可以推广到许多其他原代细胞。我们证明了可以向筛选添加抑制压力，在我们的情况下是腺苷激动剂，以鉴定赋予抗性的基因扰动。未来的筛选可以设计成克服肿瘤微环境中的其他关键抑制力，如抑制性细胞因子，代谢产物，营养耗竭或抑制性细胞类型，包括调节性T细胞或骨髓来源的抑制性细胞。总而言之，我们开发了新型汇集CRISPR筛选技术，其具有对人原代细胞未知生物学进行几乎无限探索的潜力。
实验方案：实施例中采用的方法
分离和培养人CD8 T细胞
所有实验的原代人T细胞均来自以下两个来源之一：(1)Trima Apheresis(太平洋血液中心)后的白细胞减少(leukoreduction)腔室的残留物，或者(2)根据UCSF人类研究委员会(CHR#13-11950)批准的方案采集的新鲜全血样品。使用SepMate管(干细胞公司(STEMCELL)，目录号#85460)通过Lymphoprep离心(干细胞公司，目录号07861)从样品中分离出外周血单核细胞(PBMC)。使用EasySep人CD8+T细胞分离试剂盒(干细胞公司，目录号17953)通过磁性负选择由PBMC中分离CD8 T细胞，并直接使用。当使用冷冻细胞(IncuCyte实验)时，将在Bambanker冷冻培养基(Bulldog Bio公司，目录号BB01)中冷冻的先前分离的PBMC解冻，使用先前所述EasySep分离试剂盒分离CD8 T细胞，并在刺激前将细胞静置于未经刺激的培养基中持续一天。将细胞在X-Vivo培养基中培养(隆萨公司(Lonza)，目录号04-418Q)，该培养基由具有5％胎牛血清，50mM 2-巯基乙醇和10mM N-乙酰基团L-半胱氨酸的X-Vivo15培养基组成。分离后，使用平板结合的10μg/mL抗人CD3(目录号40-0038，克隆UCHT1)和5μg/mL的CD28(克隆CD28.2)(Tonbo公司，目录号40-0289)或使用ImmunoCult人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂(干细胞公司，目录号10970)，以及使用50U/mL的IL-2，以1e6个细胞/ml刺激细胞。平板结合(plateboud)刺激用于第一次T细胞刺激，而ImmunoCult用于第二次T细胞刺激。Immunocult以生产商建议剂量的1/16、1/8和1/2，即25μL/mL的细胞使用。
慢病毒产生
在转染前16小时，将HEK 293T细胞以1800万个细胞接种于15cm聚-L-赖氨酸涂覆的培养皿中，并在DMEM+5％FBS+1％pen/strep中培养。按照生产商的方案(目录号L3000001)使用lipofectamine 3000转染试剂，使用sgRNA转移质粒和第二代慢病毒包装质粒pMD2.G(艾德基因公司(Addgene)，目录号12259)和psPAX2(艾德基因公司，目录号12260)转染细胞。第二天，按照生产商的方案(Alstem公司目录号VB100)，通过添加500x病毒促进试剂来更换培养基。转染后48小时收集病毒上清液并以300g离心10分钟以去除细胞碎片。为了浓缩慢病毒颗粒，添加Alstem沉淀溶液(Alstem公司目录号VC100)，混合，并在4℃下冷冻4小时。然后，通过在4℃下以1500g离心30分钟来浓缩病毒。最后，将慢病毒沉淀以原始体积的100倍重悬于冷PBS中并于-80℃下储存待用。
慢病毒转导和Cas9电穿孔
刺激后24小时，将慢病毒以1:300v/v的比例直接添加到培养的T细胞中，并通过倾斜轻轻混合。24小时后，将细胞收集，沉淀并将其以20e6个细胞/100μl重悬于隆萨电穿孔缓冲液P3(隆萨公司，目录号V4XP-3032)中。然后，将Cas9蛋白(MacroLab公司，伯克利，40μM储液)以1:10v/v的比例添加到细胞悬液中。使用脉冲代码EH115(隆萨公司，目录号VVPA-1002)以各比色皿20e6个细胞对细胞进行电穿孔。根据需要缩放用于电穿孔的细胞总数。电穿孔后立即将1mL预热的培养基添加到各比色皿中，并将比色皿在37度下放置20分钟。然后，将细胞转移至培养容器中，于含50U/ml IL-2的X-Vivo培养基中，以1e6个细胞/ml，在适当的组织培养容器中。每两天扩增一次细胞，添加具有50U/ml IL-2的新鲜培养基，并将细胞密度维持在1e6个细胞/ml。
CFSE染色
收集培养的细胞，旋转，用PBS洗涤，然后以100万-1000万细胞/ml重悬于PBS中。根据生产商的方案制备CFSE(白乐津公司(Biolegend)，目录号423801)，以在DMSO中制备5mM的储液。将该储液在PBS中1:1000稀释，得到5μM工作溶液，然后以1:1v/v的比例添加到细胞悬液中。混合后，将细胞在室温下黑暗中孵育5分钟。然后用至少5倍染色体积的培养基(例如2ml+10ml)淬灭染色，并在室温下于黑暗中孵育1分钟。然后将细胞离心并重悬于培养基中，然后进行再刺激。
筛选流水线(Pipeline)
由TRIMA残留物分离多个人健康人类供体的PBMC(参见方法)。TRIMA残留物购自太平洋血液中心(Blood Centers of the Pacific)。如上所述CD8 T细胞分离后(第0天)，将细胞在X-Vivo培养基中静置过夜，然后在第二天(第1天)用平板结合的抗人CD3/CD28和IL-2(50U/mL)进行刺激。刺激后24小时(第2天)，用编码汇集sgRNA文库的浓缩慢病毒转导细胞(参见方法)。转导后48小时(第3天)，用CAS9蛋白电穿孔细胞(方法)。然后将细胞在具有50U/mL IL-2的培养基中培养并扩增，保持培养基目标密度为1e6细胞/ml。在第14天，细胞经CFSE染色(参见方法)，分成筛选的相关部分，然后用immunocult再刺激(方法)。4天后，根据CFSE水平对细胞进行FACS分选。具体而言，我们将非增殖细胞定义为具有最高CFSE峰的细胞，并且将高增殖细胞定义为在第3高CFSE峰以及以下的细胞。基因组DNA分离自分选的细胞沉淀物，然后针对下一代测序进行准备。在HiSeq4000上对条码化的扩增的PCR产物进行测序。使用MAGeCK软件流水线分析数据。
阵列化Cas9核糖核苷酸蛋白(RNP)制备和电穿孔
将冻干的crRNA和tracrRNA(达马可公司(Dharmacon))以160μM的储液浓度重悬于具有150mM KCl的10mM Tris-HCL(7.4pH)中，并储存在-80℃直至使用。为了制备Cas9-RNP，首先将crRNA和tracrRNA解冻，以1:1v/v的比例混合，并在37℃下孵育30分钟以形成复合的gRNA。Cas9蛋白(储液为40μM)以1:1v/v比例添加并在37℃孵育下15分钟。将组装好的RNP以3μL/孔分配到96W V型底板中。将细胞离心分离，以1e6个细胞/20μL重悬于隆萨P3缓冲液中，并添加到具有RNP的V型底板中。将细胞和RNP混合物转移到96孔电穿孔比色皿板(隆萨公司，目录号VVPA-1002)中，用于使用脉冲代码EH115进行核转染。电穿孔后立即将80uL预热的培养基添加到各孔中，并在37℃下孵育20分钟。然后，将细胞转移至含50U/ml IL-2的培养容器中，以1e6个细胞/ml，在适当的组织培养容器中。
阵列化CFSE染色
为了对用RNP编辑的阵列化细胞进行CFSE染色，由多个重复平板收集细胞并合并到96孔深孔板中。在深孔板中离心细胞，倾析培养基后，使用手动多通道移液器将细胞重悬于每孔1mL PBS中。按照上述生产商的方案，准备CFSE以在PBS中制备5uM的工作溶液。然后，使用多通道移液器以1:1v/v的比例向各孔的细胞添加1mL的5μM CFSE。混合后，将细胞在室温下黑暗中孵育5分钟。然后使用多通道移液器用2ml的X-Vivo培养基淬灭染色，并在室温下于黑暗中孵育1分钟。然后将细胞在深孔板中离心，倾析CFSE，然后将细胞重悬于X-Vivo培养基中，然后进行再刺激。
汇集sgRNA文库构建
对于细胞表面亚库的克隆，我们遵循如Joung等(Joung等,2016)描述的定制sgRNA文库克隆方案。我们利用了pgRNA人源化骨架(艾德基因公司，质粒#44248)。为了优化该质粒用于克隆文库，首先，我们用源自lentiGuide-Puro质粒的1.9kb填充序列(艾德基因公司，质粒#52963)替换了sgRNA。使用BfuAI限制酶切下该填充序列，并对骨架进行凝胶纯化。我们选择细胞表面文库，其包括1211个基因靶标(各基因4个向导)，以及总共5000个向导，其包括非靶向对照。向导源自Brunello sgRNA文库，汇集的寡核苷酸文库购自TwistBioscience公司。PCR扩增寡核苷酸并通过如Joung等(Joung等,2016)所述的Gibson组装克隆到pgRNA人源化骨架中。对于全基因组筛选，lentiGuide-Puro骨架中的Brunello质粒文库(艾德基因公司，目录号73178)购自艾德基因公司。按照生产商的方案(Endura公司，目录号60242-1)使用Endura ElectroCompetent细胞扩增文库。
制备gDNA用于下一代测序
在细胞分选和收集之后，使用基因组DNA分离试剂盒(Machery-Nagel公司，目录号740954.20)由细胞沉淀物分离基因组DNA。如Gilbert等(Gilbert等，2014)所述，对细胞表面亚文库进行sgRNA的扩增和条码化。对于全基因组筛选，分离gDNA后，使用两步PCR方案扩增sgRNA并进行条码化。首先将各个样品分为多个100uL反应，其中各反应具有4μg的gDNA。各个反应这样组成：50uL的NEBNext 2x高保真PCR主混物(NEB，目录号M0541L)，4μg的gDNA，各自为2.5μL的10μM read1-stagger-u6和tracer-read2引物，并加水至100μL总体积。PCR循环条件为：在98℃下3分钟，然后98℃下10秒、62℃下10秒、72℃下25秒，进行20个循环；最后在72℃下延伸2分钟。PCR后，将各样品的所有反应合并，然后使用Agencourt AMPure XPSPRI珠(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，目录号A63880)按照生产商的方案纯化。然后，从各纯化的PCR产物中提取5μL以进行第二次PCR，用于进行标引。各个反应包括：5μL的PCR产物，25μL的NEBNext 2x主混物(NEB，目录号M0541L),各自为1.25μL的10μM p5-i5-read1和read2-i7-p7标引引物，并加水至各反应50μL总体积。对于标引PCR的PCR循环条件为：在98℃下3分钟，然后98℃下10秒、62℃下10秒、72℃下25秒，进行10个循环；最后在72℃下延伸2分钟。PCR后，将样品进行SPRI纯化，使用Qubit ssDNA高灵敏度测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)，目录号Q32854)进行定量，然后在2100生物分析仪上进行分析。然后在HiSeq 4000(亿明达公司)上对样品进行测序。
A375和T细胞体外共培养试验
用慢病毒转导A375黑素瘤细胞，以建立RFP-核标签(IncuCyte公司，目录号4478)，用于在IncuCyte细胞成像系统上进行最佳成像。刺激后一天，用含有NY-ESO1反应性α95:LYTCR构建体的病毒转导来自健康供体的CD8 T细胞。转导后五天，使用HLA-A2+限制性NY-ESO-1肽(SLLMWITQC)葡聚糖-PE(Immundex公司，目录号WB2696)针对表达构建体的纯细胞群对细胞进行FACS分选。然后，在初始刺激后，细胞在含有50U/ml的IL-2的X-Vivo培养基中扩增共14天。共培养的前一天，将A375细胞以5,000个细胞/孔接种到96W平板中的100μL完全RPMI培养基中。完全RPMI培养基包括：RPMI(吉布可公司(Gibco)，目录号11875093)，10％胎牛血清，1％L-谷氨酰胺，1％NEAA，1％HEPES，1％pen/strep，50mM 2-巯基乙醇和10mM N-乙酰基L-半胱氨酸。次日，将14天龄NY-ESO-1特异性T细胞添加到各孔5,000个A375细胞的上部，以指示的T细胞与癌细胞比：1:2、1:4和1:8。将T细胞添加50μL完全RPMI中，其中IL-2为150U/ml，并且葡萄糖为6g/dL。然后使用IncuCyte活细胞成像系统对平板进行成像，其中随时间对A375 RFP阳性核的数量进行计数。为了对该系统进行初始优化，A375细胞以24,000个细胞/孔接种，并且添加来自经NY-ESO特异性TCR转导的两个供体的T细胞，以下述T细胞与肿瘤细胞比(8:1、4:1、2:1、1:1)。根据生产商的说明，将IncuCyte胱天蛋白酶-3/7红色细胞凋亡试剂(IncuCyte公司，目录号4704)添加到各个孔中，然后每4个小时在IncuCyte活细胞成像系统上进行成像。平行地，将具有RFP核标签的A375细胞以4,000个细胞/孔接种，并且添加来自经NY-ESO特异性TCR转导的两个供体的相同T细胞，以与上述半胱天冬酶实验相同的比例，并对它们进行平行地成像。
CROPseq文库产生
用于克隆CROPseq文库的骨架质粒是购自艾德基因公司的CROPseq-Guide-Puro(艾德基因公司，质粒#86708)。该文库包含20个基因靶标(各基因2个向导，选自Brunello文库(Doench等，2016))和8个非靶向对照向导，总共48个向导。这些文库向导的寡核苷酸购自整合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies，IDT)，并使用Datlinger等所述的方法克隆到CROPseq-Guide-Puro质粒骨架，用于将汇集的gRNA文库无扩增地克隆到CROPseq-Guide-Puro质粒中。如前所述，慢病毒产生自该汇集的质粒文库，并将其用于转导来自两个健康供体的CD8 T细胞。转导后48小时，将细胞用1uM嘌呤霉素处理3天，然后使用Ghost Dye710(Tonbo生物科学公司，目录号13-0871)分选活细胞。然后收集细胞，计数，并上样至具有v2化学(chemistry)的10X Chromium单细胞测序系统中。
CROPseq向导再扩增
对于向导再扩增，使用两步PCR方案扩增样品和对样品进行条码化。首先将各个样品分为8个PCR反应，其各自具有.1ng的cDNA模板。各25uL的反应如下组成：1.25uL P5正向引物1.25uL Nextera Read 2反向引物，引发U6启动子以富集向导，12.5uL NEBNext UltraII Q5主混物(NEB，目录号M0544L)、.1ng模板并加水至25uL。PCR循环条件为：在98℃下3分钟，然后98℃下10秒、62℃下10秒、72℃下25秒，进行10个循环；最后在72℃下延伸2分钟。PCR后，将各样品的所有反应合并，根据生产商的方案使用Agencourt AMPure XP SPR珠纯化。然后，从各纯化的PCR产物中提取1uL以进行第二次PCR，用于进行标引。各反应包括：1uLPCR产物，12.5uL NEBNext Ultra II Q5主混物(NEB，目录号M0544L)，1.25uL P5正向引物，1.25uL亿明达i7引物，并加水至25uL。PCR循环条件为：在98℃下3分钟，然后98℃下10秒、62℃下10秒、72℃下25秒，进行10个循环，最后在72℃下延伸2分钟。PCR后，使用Qubit dsDNA高灵敏度测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司，目录号Q32854)对所有反应进行SPRI纯化和定量，并在凝胶上运行以确认大小。然后在MiniSeq(亿明达公司)上对样品进行测序。
阵列化验证的流式细胞术
所有基于阵列的验证研究均在96孔圆底板上进行，并在具有96孔板读数器的Attune NxT流式细胞仪上进行读取。对于针对来自全基因组筛选排名靠前的靶标的基于RNP的增殖验证试验，在再刺激前，细胞以96孔格式进行CFSE染色，如上述方法所述。为了评估阵列化RNP编辑的细胞的上激活标志物水平，使用了下述抗体：CD69(白乐津公司，目录号310904)、CD154(白乐津公司，目录号310806)、PD-1(白乐津公司，目录号329908)、TIM-3(白乐津公司，目录号345005)、LAG-3(白乐津公司，目录号369308)和CD8a(白乐津公司，目录号01038)。
定量和统计学分析
汇集CRISPR筛选的分析
为了在我们的筛选中鉴定阴性和阳性命中，我们使用了MAGeCK软件来定量和测试向导富集(Li等,2014)。首先，通过对原始fastq文件使用MAGeCK“计数”模块来确定向导的丰度。对于全基因组的Brunello文库，通过使用参数“-trim-5 23,24,25,26,28,29,30”，将5'修整(trim)长度设置为消除由文库制备引入的交错偏移。对于靶向的文库，通过MAGeCK自动检测到恒定的5'修整。在超过80％的样品中，我们去除了绝对计数低于50的向导。为了测试稳健向导和基因水平的富集，以默认参数使用MAGeCK“测试”模块。该步骤包括中值比标准化，以说明变化的读取深度。我们使用非靶向对照向导来估算用于标准化的大小因数，并使用均值方差模型来进行用于发现显著向导富集的零分布。将各筛选中的所有供体重复进行分组，用于分析生物噪声。MAGeCK产生各方向(即正向和负向)上的向导水平富集评分，然后将其用于α-稳健排名聚集(alpha-robust rank aggregation)以获得基因水平评分。各基因的p值由置换检验确定，将向导分配随机化，并通过Benjamini-Hochberg方法针对错误发现率进行调整。计算各基因的Log2倍数变化(LFC)，在全文中定义为各基因靶标所有向导的LFC中值。在指示的地方，将LFC标准化以具有平均值为0和标准偏差为1，以获得LFC Z评分。
筛选命中的基因集富集分析
为了在筛选点击中找到富集的注释，我们使用了基因集富集分析(Gene SetEnrichment Analysis)，如在fgsea R软件包中所实现的。富集的输入由筛选中测试的所有基因的LFC值组成。我们将KEGG途径数据集用作参比基因注释数据库，仅包括具有15个以上成员和500个以下成员的基因集。对于图2E中所示体内免疫疗法的外部基因集，我们使用了Zhou等确定的43个基因，其具有3个或更多的具有4倍以上富集的shRNA向导。标准化的富集评分和p值通过置换检验确定，其具有10,000次迭代，其具有相同大小随机化的基因集并通过FDR方法进行调整。
拟合CFSE分布以用于阵列化验证筛选
我们使用FlowFit R软件包由所有样品的CFSE概况中提取定量参数。因为阵列的CFSE染色是针对经编辑的细胞的各个群体进行的，所以亲本群体的信号峰可能会在各孔之间略有偏移。因此，对于各个孔，将经刺激的孔与相同的未经刺激的孔进行比较，预期在试验结束时具有单个峰。FlowFit软件包实现了Levenberg-Marquadt算法，以估算亲本群峰的大小和位置。然后，我们使用来自未经刺激孔的拟合参数来拟合相应经刺激细胞的CFSE概况。这些CFSE概况被建模为高斯分布，具有因细胞分裂和CFSE稀释而导致的log2距离峰。对拟合的模型进行视检，调整拟合参数以使与原始CFSE信号的偏差最小化。将拟合的模型用于计算增殖指数，定义为实验结束时的细胞总数除以计算的亲本细胞起始数量。该参数对于起始CFSE染色强度的变化稳健。分析与单细胞RNA-Seq配对的SLICE
使用CellRanger软件2.1版对产生自10X Genomics V2文库的亿明达测序结果进行预处理。该流水线为各个样品产生了稀疏数值矩阵，并具有针对通过默认质量控制指标的所有单细胞鉴定的独特的分子标识物(UMI)的基因水平计数。如其他地方所述(https://satijalab.org/seurat/pbmc3k_tutorial.html)，使用Seurat R软件包处理了这些基因表达矩阵。仅将具有超过500个鉴定的基因的细胞用于下游分析。使用Seurat，对计数进行log标准化，回归出(regressing out)各细胞的总UMI计数和各细胞检测到的线粒体基因的百分比，并进行缩放以获得基因水平的z评分。然后，我们使用细胞中1,000个最易变基因进行主成分分析(PCA)。如图4A所示，前30个PCA成分被用于构建统一流形近似和投影(UMAP)，以二维图像显示单细胞。如图4B所示的单细胞的基因表达计算为log10(UMI计数+1)并进行缩放。图4C中的聚类是通过Louvain算法在共享的最近邻图进行的，通过Seurat R软件包中的FindClusters命令所实现。对于图S4B中的合成大量差异基因表达，对于各样品中具有非靶向对照向导的所有细胞，将各基因的UMI计数相加，并使用DESeq2 R软件包确定差异表达的基因。
为了将向导与鉴定的细胞条码相关联，我们处理了来自10X文库和来自再扩增PCR的fastq文件。使用如R ShortRead软件包中实现的matchPattern，将read2文件与向导文库进行匹配。使用的模式是向导序列前的U6启动子序列，其附加到20bp文库向导序列(例如，TGGAAAGGACGAAACACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNN，其中N表示向导序列)，总共允许4个错配。带有匹配向导读数的配对Read1对用于确定细胞条码和UMI分配。我们过滤掉了出现次数少于两次的读数以及分配了一个以上向导的细胞。将卡方检验用于确定在细胞状态驱动的簇中具有相同基因靶标的向导下细胞的过量表达。将卡方检验的标准化残差缩放并用于生成图4E和10F。
数据和软件可用性
在PENDING处可获得用于进行的所有筛选的原始测序文件。单细胞RNA-Seq实验的原始文件保存至GEO PENDING。可根据要求提供所有用于分析数据和产生图形的代码。
简介及实施例中按作者和年份排列的引用的参考文献
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应理解，本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的，本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变，且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用其所被引用的内容纳入本文。
表1：GW筛选的阳性命中
Figure BDA0002966026280000681
表2：来自体外和体内分析的命中
体外肿瘤杀伤
Figure BDA0002966026280000691
体内肿瘤浸润
基因 sgRNA序列
ARID1A CAGCAGAACTCTCACGACCA
SOCS1 CGGCGTGCGAACGGAATGTG
表3：腺苷抗性
Figure BDA0002966026280000692
表4：阴性命中——GW筛选
Figure BDA0002966026280000693
Figure BDA0002966026280000701
Figure BDA0002966026280000711
Figure BDA0002966026280000721
Figure BDA0002966026280000731
Figure BDA0002966026280000741
Figure BDA0002966026280000751
Figure BDA0002966026280000761

Claims (32)

1.一种遗传修饰的造血细胞，其包含对T细胞抑制性基因的遗传修饰，其抑制由所述T细胞抑制性基因编码的多肽产物的表达或活性，其中相较于对照野生型造血细胞，所述多肽产物的表达或活性被抑制至少60％。
2.如权利要求1所述的遗传修饰的造血细胞，其中，所述对T细胞抑制性基因的遗传修饰使该基因失活。
3.如权利要求1或2所述的遗传修饰的造血细胞，其中，所述遗传修饰的造血细胞是T细胞。
4.如权利要求3所述的遗传修饰的细胞，其中，所述T细胞是CD8+T细胞或CD4+T细胞。
5.如权利要求1、2、3或4中任一项所述的遗传修饰的造血细胞，其中，使用成簇规律间隔性短回文重复序列(CRISPR)系统抑制所述T细胞抑制性基因。
6.如权利要求1、2、3或4中任一项所述的遗传修饰的造血细胞，其中，使用转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)系统抑制所述T细胞抑制性基因。
7.如权利要求1、2、3或4中任一项所述的遗传修饰的造血细胞，其中，使用锌指核酸酶系统抑制所述T细胞抑制性基因。
8.如权利要求1、2、3或4中任一项所述的遗传修饰的造血细胞，其中，使用大范围核酸酶系统抑制所述T细胞抑制性基因。
9.如权利要求1、2、3或4中任一项所述的遗传修饰的造血细胞，其中，使用抑制性RNA抑制所述T细胞抑制性基因。
10.如权利要求1、2、3或4中任一项所述的遗传修饰的造血细胞，其中，使用shRNA、siRNA、微小RNA或反义RNA抑制所述T细胞抑制性基因。
11.如权利要求1所述的遗传修饰的细胞，其中，所述T细胞抑制性基因是FAM105A、ARID1A、RASA2、TCEB2、SOCS1、CBLB或TMEM222。
12.如权利要求2-10中任一项所述的遗传修饰的细胞，其中，所述T细胞抑制性基因是FAM105A、ARID1A、RASA2、TCEB2、SOCS1、CBLB或TMEM222。
13.如权利要求12所述的遗传修饰的细胞，其中，所述T细胞抑制性基因是RASA2、TCEB2、SOCS1、CBLB或TMEM222。
14.如权利要求12所述的遗传修饰的细胞，其中，所述T细胞抑制性基因是FAM105A。
15.如权利要求12所述的遗传修饰的细胞，其中，所述T细胞抑制性基因是ARID1A。
16.如权利要求12所述的遗传修饰的细胞，其中，所述T细胞抑制性基因是CD5、TNFAIP3、DGKZ或UBASH3A。
17.如权利要求1-10中任一项所述的遗传修饰的细胞，其中，所述T细胞抑制性基因是AGO1、ARIH2、CD8A、CDKN1B、DGKA、FIBP、GNA13、MEF2D或SMARCB1。
18.一种细胞群，其包含权利要求1-17中任一项所述的遗传修饰的T细胞。
19.一种治疗癌症的方法，其包括给予患有癌症的对象包含权利要求1-17中任一项所述的遗传修饰的造血细胞的细胞群。
20.一种遗传修饰的T细胞，其具有相较于对照野生型T细胞而言经调节的免疫功能，并且包含遗传修饰，以抑制由T基因编码的多肽的表达，其中相较于所述对照野生型T细胞，所述多肽的表达被抑制至少60％；并且该基因选自下组：CYP2R1、LCP2、RPP21、VAV1、EIF2B3、RPP21、EXOSC6、RPN1、VARS、CD3D、GRAP2、TRMT112、ALG8、VAV1、EXOSC6、SH2D1A、HSPA8、ZAP70、DDX54、CD247、ALDOA、ZNF131、WDR36、AK2、LCP2、CD247、VHL、EIF2B2、PRELID1、GRPEL1、NAA10、ALDOA、ALG2、MARS、C4orf45、RAC2、LCK、SUPT4H1、SLC25A3、LUC7L3、C3orf17、RPP21、HARS、ZNRD1、CCNH、MYC、CCDC25、EEF1G、CCND2、GCLC、TAF2、EIF6、SEC63、EXOSC6、RPS19BP1、SEC61B、VHL、DAD1、BEND6、FBL、VARS、EIF2B4、RAC2、PAGR1、MYC、CD3E、LCP2、MYC、ENOSF1、POLR3H、NOP14、CLNS1A、POLR2L、ZPR1、CARD11、SLC35B1、TRMT112、FARSA、PRELID1、LARS、NOP16、POLR2L、HSPA8、CD247、GEMIN8、TTC27、PMPCA、PWP2、TAF1C、DDOST、ZNF654、FAU、EIF2B3、YARS、DDX20、DDX56、DDX49、UTP20、EPRS、RSL1D1、ATP1B3、EXOSC4、ARMC7、EIF2B4、AUP1、VAV1、PAK1IP1、EIF6、FAM157A、HSPE1-MOB4、LAT、DCAF13、PPP1R10、EXOSC2、SRP9、POLR3K、TAF6、EIF3H、ABCF1、FLJ44635、PTP4A2、EIF3CL、ABCB7、GTF2H4、MARS、TAF4、RPL5、FTSJ3、CD28、ALG13、CARD11、EIF4G1、UTP3、GARS、CACNB4、HSPA8、POP7、ERCC3、GDPD2、SUPT5H、POLR3D、RPP30、C12orf45、DPH3、EIF3B、LACTBL1、THAP11、IMP4、EXOSC7、NOB1、EIF4E、PLCG1、HUWE1、RBM19、GATA3、CCND2、TTI2、THG1L、TAF1C、URI1、TRMT112、EIF3H、CCND2、GCLM、RBSN、QARS、POP7、TAF4、HUWE1、CARS、PTP4A2、PES1、ZNF785、WDR26、PRR20D、STK11、PIK3CD、YARS、STRAP、WDR77、NANS、TARS、HSPA8、TMEM127、FAM35A、ZBTB8OS、BPTF、INO80D、NOP14、KARS、SH2D1A、RHOH、DIMT1、CMPK1、TAF6、QTRT1、LCK、NOL10、MYBBP1A、NHP2、DDX54、LAT、TAF2、MBTPS1、GNL3、DEF6、BCL10、NFKBIA、PHB、CD3G、CD3D、QARS、EIF3C、GRPEL1、MBTPS2、ORAOV1、SLC4A2、GATA3、ODF3、SLC7A6OS、ORAOV1、ALG13和TAF1B。
21.如权利要求20所述的遗传修饰的T胞，其中，所述基因是下述任一种：HSPA8、RPP21、EXOSC6、LCP2、MYC、CD247、NOP14、VAV1、RHOH、TAF1C、TRMT112、CCND2、SH2D1A、MARS、CD3D、NELFCD LCK、LUC7L3、EIF2B4、ORAOV1.VARS、NOL10、ZBTB8OS、SLC35B1、NAA10、EIF2B3、DHX37、LAT、EMG1、ALDOA、GRPEL1、ARMC7、POLR2L、NOP56、PSENEN、RELA、SUPT4H1、VHL、GFER、BPTF、RAC2、TSR2、TAF6、PMPCA、EIF6、STT3B、POP7、GMPPB、TP53RK、CCNH、TEX10、DHX33、QARS、EID2、IRF4、TAF2、IARS、GTF3A、NOP2、IMP3、RPL28、UTP3.EIF4G1、GPN1、UTP6、DAD1、ALG2、CDK6、MED19、RASGRP1、PHB2、NFS1、POLR2E、CDIPT、POLR3H、HARS、SEH1L、EIF2B5、TTC27、RRP12、JUNB、HSPE1、GMPS、EIF2S3、SRP14、FAM96B、RPL8、RRP36、MED11、ISG20L2、ROMO1、ATP6V1B2、RPN2或WASH1。
22.如权利要求20或21所述的遗传修饰的T胞，其中，所述基因是失活的。
23.如权利要求22所述的遗传修饰的T细胞，其中，所述T细胞是CD8+或CD4+T细胞。
24.如权利要求20-23中任一项所述的遗传修饰的T细胞，其中，使用CRISPR系统、TALEN系统、锌指核酸酶系统、大范围核酸酶系统、siRNA、反义RNA、微小RNA或发夹RNA抑制所述基因。
25.一种细胞培养物，其包含权利要求20-24中任一项所述的遗传修饰的T细胞。
26.一种治疗自体免疫疾病或治疗或预防移植物排斥的方法，所述方法包括给予患有自体免疫疾病或正在进行组织移植的对象权利要求20-24中任一项所述的T细胞群。
27.一种生成用于治疗患有癌症的对象的遗传修饰的细胞群的方法，所述方法包括：
由患者获得造血细胞；
抑制选自下组的T细胞抑制性基因的表达：FAM105A、ARID1A、RASA2、TCEB2、SOCS1、CBLB和TMEM222；
选择其中所述T细胞抑制性基因被抑制的造血细胞，
离体扩增选择的造血细胞群。
28.一种生成用于治疗患有癌症的对象的遗传修饰的细胞群的方法，所述方法包括：
由患者获得造血细胞；
抑制选自下组的T细胞抑制性基因的表达：CD5、TNFAIP3、DGKZ和UBASH3A；
选择其中所述T细胞抑制性基因被抑制的造血细胞，
离体扩增选择的造血细胞群。
29.如权利要求27或28所述的方法，其中，所述造血细胞是造血干细胞。
30.如权利要求27或28所述的方法，其中，所述造血细胞是T细胞。
31.如权利要求27或28所述的方法，其中，所述造血细胞是CD8+或CD4+T细胞。
32.如权利要求27、28、29、30或31中任一项所述的方法，其中，使用CRISPR系统、TALEN系统、锌指核酸酶系统、大范围核酸酶系统、siRNA、反义RNA、微小RNA或发夹RNA抑制所述T细胞抑制性基因。
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