CN117460541A - 增强用于细胞疗法的分离的细胞治疗功效的方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及增强分离的细胞的治疗功效的方法,该分离的细胞用于细胞疗法,诸如过继性细胞转移疗法,该方法通过将对细胞疗法的治疗功效有益的低表达的miRNA插入基因的活跃表达的基因座中,该基因是蛋白质编码或非编码的,其通过这种破坏后者的表达同时诱导前者的表达而妨碍细胞疗法的治疗功效。
Description
相关申请的交叉引用
要求于2020年12月1日提交的美国临时专利申请第63/119,708号的权益,其内容以全文通过引用并入。
技术领域
本公开涉及增强分离的细胞的治疗功效的方法,该分离的细胞用于细胞疗法,诸如过继性细胞转移疗法。
背景技术
天然存在的或遗传上重定向的肿瘤反应性T细胞的过继转移已成为晚期血液恶性肿瘤和实体癌患者的最成功的免疫治疗性治疗和一般的细胞疗法中的一种。这种治疗方式可以在对常规治疗难以治愈的大部分转移患者中产生完全和持久的应答。过继性细胞转移(ACT)方法修饰特异性T细胞(自体或同种异体)以增强对肿瘤特异性抗原的靶向,和/或从混合淋巴细胞群中分离肿瘤特异性T细胞。用于癌症免疫疗法的三种ACT类型包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、T细胞受体(TCR)T细胞和嵌合抗原受体(CAR)T细胞(1)。
CAR-T细胞由原代T细胞生成,该原代T细胞在分离和扩展后被工程化以表达合成的CAR–受体,该受体将识别特异性肿瘤相关抗原的细胞外单链抗体结构域(scFv)与来自T细胞受体和共刺激受体的细胞内信号传导结构域组合(2)。就此类修饰而言,CAR-T细胞对肿瘤细胞的识别和清除依赖于CAR分子,并且不依赖于传统T细胞受体(TCR)和人白细胞抗原(HLA)的结合,从而可以克服由肿瘤细胞中HLA的低表达引起的免疫逃逸(3)。目前,大多数CAR细胞是适于靶向血细胞的CAR-T(CD8+)细胞。然而,对实体瘤的试验不太受CAR-T细胞支配,并且采用其它平台诸如NK(天然杀伤)细胞(4)。
尽管CAR-T细胞在血液-肿瘤学领域的临床结果未受到挑战,但是它们的活性与严重的副作用诸如细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性相关。此外,这些疗法从液体瘤到实体瘤的转化受到肿瘤微环境(TME)的物理屏障和免疫抑制作用阻碍,这显著降低了CAR-T细胞活性,至少部分是由于对细胞基因表达的环境影响。随着时间的推移,CAR-T细胞活性降低、T细胞耗竭和无反应性也很常见。因此,仍然需要克服关于CAR-T细胞(特别是在实体瘤中)的安全性和功效以及一般的ACT的实质性挑战(5)。
发明内容
本文描述了基因编辑技术(GET)用于修饰分离的细胞的基因表达的应用,该分离的细胞用于细胞疗法,诸如ACT介导的疗法。
GET诸如CRISPR(成簇的规则间隔的短回文重复序列)、TALEN(转录激活因子样效应物核酸酶),或ZFN(锌指核酸酶)的应用,在RNA编码DNA区的编辑中提供了非常有力的工具,从而产生新的、内在的和高度表达的RNA和/或关闭功能失常的RNA。本公开涉及这些技术在特定ACT环境中,诸如在通过修饰RNA的表达来增强CAR-T细胞功效中的用途,该RNA在与癌症靶标接触和被癌症靶标活化时影响T细胞活性。在具体实施方案中,本文所描述的方法涉及修饰选定的编码蛋白质和非编码RNA诸如miRNA的表达模式。
本文所描述的方法利用GET作为离体增强造血干细胞、其常见淋巴细胞祖细胞、常见骨髓祖细胞和其更发达(即,单能)谱系细胞类型的治疗功效的治疗手段,用于治疗血细胞相关疾病、自身免疫疾病和癌症。可以通过本文所描述的方法修饰的细胞主要是T细胞或CAR T细胞,但也包括B细胞、天然杀伤(NK)细胞、调节性T细胞、巨噬细胞、间充质干细胞及其谱系细胞类型。本文所描述的类似方法修饰实质细胞诸如肝细胞,用于治疗肝脏疾病。应了解,除了所提到的细胞类型外,任何类型的多能细胞可以如本文所描述进行修饰。此外,在具体实施方案中,用于特定受试者的细胞是自体的,而在其它实施方案中,细胞是同种异体的。本文所描述的类似方法可以用于修饰实质细胞或内分泌细胞,诸如例如用于移植的肝细胞或胰腺b细胞。
目前的方法解决了基于T细胞或CAR-T细胞的免疫疗法诸如ACT疗法的主要缺点中的一种。已知在T细胞通过与癌细胞相遇而活化后,基因表达模式,特别是非蛋白质编码RNA诸如miRNA的基因表达模式的改变作为癌细胞抑制T细胞作用的尝试的一部分而发生。结果,“不良”miRNA(对T细胞的治疗效果有害)被上调,并且“良好”miRNA(对T细胞的治疗效果有益)被下调,这导致功能失调的T细胞状态,诸如无反应性、耐受性和耗竭。目前描述的方法描述了这样的新方式,其通过在增加“良好”基因的同时抑制“不良”基因的表达,无论是蛋白质编码的还是蛋白质非编码的,诸如例如miRNA的表达,来利用GET阻断这些对CAR-T细胞活性的抑制作用,并且可以类似地扩展用于细胞疗法所利用的其它类型的细胞。此外,应了解,在具体实施方案中,通过所描述的方法增强细胞是产生用于细胞疗法的细胞的另外步骤的前兆。
在具体实施方案中,GET用于编辑离体细胞诸如T细胞中的遗传基因座,以便同时上调期望的(“良好”)miRNA和关闭或下调不期望的(“不良”)miRNA。
一个实施方案涉及编辑单个miRNA基因座以将“良好”miRNA引入“不良”miRNA的活跃转录位点。该编辑事件导致上调现在在“不良”miRNA调节元件控制下表达的“良好”miRNA,同时关闭该“不良”miRNA。
另一实施方案涉及编辑单个编码基因座以将“良好”miRNA引入“不良”基因的活跃转录位点。该编辑事件导致上调现在在活性“不良”基因调节元件的控制下表达的“良好”miRNA,同时通过例如破坏“不良”基因的开放阅读框来关闭该“不良”基因。
在另一实施方案中,所描述的方法涉及编辑两个基因座以产生编码序列的相互交换。与用良好miRNA替换不良miRNA并行,将不良miRNA引入到良好miRNA的内源基因座以保持不良miRNA的基础活性。在具体实施方案中,所描述的方法涵盖在涉及单对基因–一个“不良”和一个“良好”的单个遗传基因座处,通过编辑事件敲减(knocking down)单个“不良”基因。在其它实施方案中,涵盖多个基因敲减编辑事件,包括在“不良”基因的多个遗传基因座处的两个、三个、四个或更多个,其涉及单个或几个不同“良好”基因的敲入(knocking-in)。
从以下参考附图进行的具体实施方式中,前述和其它目的、特征和优点将变得更加显而易见。
附图说明
图1绘示了所描述的GET介导的方法的实施方案,其中使用单个编辑事件插入“良好”miRNA,该“良好”miRNA通常表达较差或不表达,并且其期望高度表达到“不良”miRNA的转录活性基因座中,该“不良”miRNA的表达将被废除。该编辑事件的结果是“良好”miRNA在两个调节区下的两个基因座中的表达:其表达低到无的原始基因座和“不良”miRNA的高转录活性基因座,其表达高并且遵循“不良”miRNA的典型模式。通过相同的编辑事件,“不良”miRNA表达被关闭。
图2绘示了图1所示的单个编辑事件的替代实施方案,其中要被破坏的“不良”序列具有蛋白质编码基因(在图中例示为免疫检查点基因序列)。该编辑事件的结果是“良好”miRNA在两个调节区下的两个基因座中的表达:定向表达低的原始基因座和定向表达高的“不良”蛋白质编码基因座。“不良”蛋白质表达被关闭。
图3绘示了使用双重编辑事件来转换两个RNA编码序列的位置和转录控制的方式。双重编辑的结果是“良好”miRNA在一个基因座中的表达,该基因座是定向表达高的“不良”miRNA基因座。“不良”miRNA在定向表达低的“良好”miRNA基因座中表达。
图4示出了由PMA或ImmunoCultTM进行的T细胞活化的结果。A.用PMA/离子霉素或ImmunoCultTM活化72小时后细胞活力的流式细胞术测量(SSC-A对FSC-A通道);B.使用通过抗CD25抗体(人),藻红蛋白(PE)进行CD25染色的流式细胞仪分析来评估T细胞活化。CD25是T细胞活化标记物;C.在另一实验中,测量ImmunoCultTM介导的活化后T细胞活化程度的动力学。示出了所有图表的X和Y轴值范围。
图5示出了NALM-6细胞进行的CD19-CAR-T细胞活化。A.通过NGFR染色(NGFR-衍生自神经生长因子受体蛋白质并且融合到CAR的细胞外间隔区)对FSC-A测量的CD19-CAR-携带T细胞百分比。在细胞活化之前进行染色;B.使用通过抗-CD25抗体(人),PE进行CD25染色(T细胞活化标记物)的流式细胞仪分析来评估CAR-T和T细胞活化。通过与NALM-6细胞以1:1的比率共培养[10,000CD19-CAR与10,000NALM-6(CD19+)],活化T细胞24、48和72小时后进行染色,该NALM-6细胞为携带CD19表面蛋白质的B细胞前体白血病细胞系;C.通过在CAR-T或T细胞与靶NALM-6细胞共培养24、48和72小时后测量NALM-6细胞杀伤来评估T细胞功能。通过CD19染色和CD19阳性细胞的FACS定量,进行NALM-6细胞的测量。
图6示出了活化的T细胞中miRNA链(5p和3p)表达的倍数变化。在活化24、48和72小时后,给出每个所指示的miRNA链mir-23a(板块A)、mir-31(板块B)和mir-28(板块C)的相对量。通过ImmunolTM活化T细胞。活化的T细胞的百分比通过CD25染色确定,并且在活化24、48和72小时后分别为61%、67%和87%。数据以2^-ΔΔCt值表示:对内源参考基因(RNU6B)和相对于未处理的(未活化的)对照归一化(normalized)的miR-链表达的倍数变化。
图7示出了用于hsa-mir-31和hsa-mir-23a的CAS9-CRISPR介导的敲除(knockout)的向导RNA(gRNA)设计的方案。呈现了相对于hsa-mir-31和hsa-mir-23a位点的gRNA在基因组DNA上的位置(对应于SEQ ID NO:10,核苷酸93至190;和SEQ ID NO:14,核苷酸97至192)。PAM-原型间隔区邻近基序(紧跟由CRISPR细菌适应性免疫系统中的Cas9核酸酶靶向的DNA序列的2–6-碱基对DNA序列);gRNA-向导RNA(在此和全文中与sgRNA-单个向导RNA可互换使用)–含有与Cas9蛋白质结合所需的支架tracrRNA(支架区)序列融合的定制设计的短crRNA(靶特异性)序列的单个RNA分子。
图8示出了用于优化的mir-31敲除(KO)的gRNA对的评估。A.在pre-mir-31(对应于SEQ ID NO:10的核苷酸85至190)的序列中向导RNA(gRNA)定位的方案。指示了由每个gRNA对引起的缺失的预期长度。箭头定义gRNA位置。前mir序列用下划线描绘,并且PAM基序用不同阴影的字体描绘。B.用由每个gRNA对(1+3、1+4、2+3、2+4)引导的切除位点侧翼的引物进行PCR扩增的结果。CCR5–阴性对照,示出了衍生自从用靶向CCR5的不相关基因组区的gRNA对核转染的细胞提取的DNA的扩增产物。UT(未处理的)-衍生自从非核转染细胞提取的DNA的扩增产物。
图9示出了用于评估mir-31KO效率的T7内切核酸酶1(T7E1)错配检测测定的结果。A.对图5的板块B中描述的PCR扩增产物进行T7E1分析。在T7内切核酸酶1(+T7E1)存在下的结果呈现在左板块中,并且对照反应(-T7E1)呈现在右板块中。所使用的gRNA对指示在每个板块的上方,并且观察到的编辑效率(%)指示在左板块的底部。UT(未处理的)-T7E1处理衍生自非核转染细胞提取的DNA的扩增产物。B.使用gRNA 2+3(SEQ ID NO:41)由mir-31KO生成的编辑过的区域的序列分析。描绘了编辑成功的百分比(100%)
图10示出了用于评估mir-23a KO效率的T7内切核酸酶1(T7E1)错配检测测定的结果。使用所指示的gRNA对(1+2、1+3、4+2、4+3)中的任一对对从针对mir-23a的KO编辑的T细胞提取的DNA进行T7E1错配检测测定(+T7E1)的结果。衍生自从非核转染细胞提取的DNA的扩增产物用作对照(UT-未处理)。A.用由每个gRNA对(1+2、1+3、4+2、4+3)引导的切除位点侧翼的引物进行PCR扩增生成的PCR产物进行T7E1切除(+T7E1)。观察到的编辑效率(%)指示在底部。B.作为对照,与板块A中相同的PCR产物不进行T7E1切除(-T7E1)。观察到的编辑效率(%)指示在底部。C.使用gRNA 1+3对由mir-23a KO生成的编辑区进行序列分析。描绘了编辑成功的百分比(77%)(全部序列对应于SEQ ID NO:42)。D.使用gRNA 4+3对由mir-23aKO生成的编辑区进行序列分析。描绘了编辑成功的百分比(91.9%)(全部序列对应于SEQID NO:43)。
图11示出了mir-31-KO后的T细胞活化。T细胞在收获后立即通过ImmunoCultTM活化(第一次活化)。针对mir-31的KO编辑活化的(扩展的)T细胞,然后通过ImmunoCultTM再活化(第二次活化)。使用抗CD25抗体(人)PE对CD25进行染色的流式细胞仪分析进行T细胞活化的评估。上板块描绘了未编辑过的(UT=未处理的)T细胞的第一次(中间板块)和第二次(右板块)活化程度(CD25染色)。右板块为未染色对照。下板块描述了第一次活化、具有所指示的gRNA引导对中的每一个的mir-31-编辑-介导的KO和再活化后的T细胞的活化(第二次活化)程度。sgRNA-CCR5–用非mir-31-靶向gRNA(靶向CCR5)核转染的T细胞的再活化结果。
图12示出了mir-31和mir-23a在编辑介导的KO(切除)后的表达。mir-31-5p(板块A)链和mir-23a-5p(板块B)链的表达水平在这些mir的编辑-介导的KO和编辑过的细胞的再活化(通过ImmunoCultTM)后,由RT-qPCR在T细胞中测量。数据以2^-ΔΔCt值表示:对内源参考基因(RNU6B)和相对于用非相关gRNA(靶向CCR5)编辑过的对照T细胞的水平归一化的mir-链表达的倍数变化。UT(未处理的)–mir在对照的未编辑过的T细胞中的表达;sgRNA-CCR5–mir-31在用非相关gRNA(靶向CCR5)编辑过的对照T细胞中的表达。
图13示出了mir-28KI进入mir-31KO位点的验证。A.在各种退火温度下通过PCR扩增mir-31上游区和mir-28插入DNA之间的接合位点,并且确定最佳退火温度。将相同的接合引物用于从对照T细胞中提取的模板DNA的PCR,该对照T细胞是mir-23a-KO,但未进行mir-28KI(UT=未处理的)。B.ddPCR在mir-28KI T细胞(KI)或非mir-28-KI T细胞(UT)中进行,其使用接合引物或共同引物(其扩增mir-31位点上游的区域,对于所有DNA模板是共同的)。该图表示当扩增共同区或接合区域时通过ddPCR检测到的每mL的拷贝数(蓝点)。为了计算替换效率,将接合区域的拷贝/mL除以相应样品的共同区的拷贝/mL。获得的百分比(7%)指示替换效率。
图14示出了mir-23a和mir-28在mir-23-KO/mir-28KI T细胞中的表达。mir-23a链和mir-28链的表达通过RT-qPCR在mir-23a KO后(mir-23KO)的T细胞和mir-28进入mir-23aKO位点的mir-23a KO和KI两者后(mir-23KO+mir-28KI)的T细胞中测量。在核转染(编辑)后5天,通过ImmunoCultTM使两种细胞群再活化6小时。数据以2^-ΔΔCt值表示:对内源参考基因(RNU6B)和相对于用靶向AAVSI并且与单链寡脱氧核苷酸(ssODN)修复模板共递送的不相关的sgRNA编辑过的再活化T细胞中的水平归一化的miR链表达的倍数变化。
图15示出了mir-23-KO/mir-28KI T细胞中与T细胞耗竭相关的基因的表达。在编辑过的mir-23a-KO/mir-28-KI T细胞中通过RT-qPCR测量所指示的基因的表达,该编辑过的mir-23a-KO/mir-28-KI T细胞在核转染(编辑)后第5天通过已辐射的PBMC(A)或ImmunoCultTM(B)再活化,并且在再活化48小时后收获。数据以2^-ΔΔCt值表示:对内源参考基因和相对于用靶向AAVSI并且与单链寡脱氧核苷酸(ssODN)修复模板共递送的不相关的sgRNA编辑过的再活化T细胞中的水平归一化的基因表达的倍数变化。mir-23KO/mir-28KI-T细胞,其中mir-23a被mir-28替换;UT-未处理的–用不相关的sgRNA编辑过的对照T细胞。
所描述序列的简要说明
本文提供的核酸和序列使用如37C.F.R.1.822中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写示出。仅示出了每个核酸序列的一条链,但是互补链被理解为通过对所显示链的任何参考而包括在内。序列表作为命名为3287_2_2_seqlist_ST25的ASCII文本文件提交,该文本文件创建于2021年11月30日,约10.8KB,其通过引用并入本文。在序列表中:
SEQ ID NO:1是hsa-mir-181a-1的前mir序列核苷酸序列。
SEQ ID NO:2是hsa-mir-181a-1的基因组区核苷酸序列。
SEQ ID NO:3是hsa-mir-28的前mir序列核苷酸序列。
SEQ ID NO:4是hsa-mir-28的基因组区核苷酸序列。
SEQ ID NO:5是hsa-miR-149的前mir序列核苷酸序列。
SEQ ID NO:6是hsa-miR-149的基因组区核苷酸序列。
SEQ ID NO:7是hsa-miR-146a的前mir序列核苷酸序列。
SEQ ID NO:8是hsa-miR-146a的基因组区核苷酸序列。
SEQ ID NO:9是hsa-miR-31的前mir序列核苷酸序列。
SEQ ID NO:10是hsa-miR-31的基因组区核苷酸序列。
SEQ ID NO:11是hsa-miR-21的前mir序列核苷酸序列。
SEQ ID NO:12是hsa-miR-21的基因组区核苷酸序列。
SEQ ID NO:13是hsa-miR-23a的前mir序列核苷酸序列。
SEQ ID NO:14是hsa-miR-23a的基因组区核苷酸序列。
SEQ ID NO:15至18是靶向mir-31的sgRNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:19至22是靶向mir-23的sgRNA的核苷酸序列。
SEQ ID NO:23是用于将miR-28插入miR-23基因座的单链寡脱氧核苷酸(ssODN)的核苷酸序列。
SEQ ID NO:24是用于将miR-28插入miR-31基因座的单链寡脱氧核苷酸(ssODN)的核苷酸序列。
SEQ ID NO.25和26是T7E1测定中miR-23的正向和反向扩增引物。
SEQ ID NO.27和28是T7E1测定中miR-31的正向和反向扩增引物。
SEQ ID NO.29和30是miR-31(共同区)的正向和反向ddPCR扩增引物。
SEQ ID NO.31和32是miR-31(接合区)的正向和反向ddPCR扩增引物。
SEQ ID NO.33和34是LAG-3的正向和反向RT-qPCR扩增引物。
SEQ ID NO.35和36是TIM3的正向和反向RT-qPCR扩增引物。
SEQ ID NO.37和38是PD1的正向和反向RT-qPCR扩增引物。
SEQ ID NO.39和40是BLIMP-1的正向和反向RT-qPCR扩增引物。
SEQ ID NO:41是来自使用gRNA 2+3由mir-31KO生成的编辑区的测序分析。
SEQ ID NO:42是来自使用gRNA 1+3由mir-23a KO生成的编辑区的测序分析。
SEQ ID NO:43是来自使用gRNA 4+3由mir-23a KO生成的编辑区的测序分析。
具体实施方式
I.术语
除非另有解释,否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。单数术语“一个(a)”、“一个(an)”和“该(the)”包括复数指示物,除非上下文另有明确指示。类似地,词语“或”旨在包括“和”,除非上下文另有明确指示。尽管与本文所描述的方法和材料类似或同等的方法和材料可以用于本公开的实践或测试,但下文描述了合适的方法和材料。术语“包括”意指“包括(含)”。缩写“例如(e.g.)”衍生自拉丁语例如(exempli gratia),并且在本文中用于指示非限制性实例。因此,缩写“例如(e.g.)”与术语“例如(for example)”同义。
倘若有冲突,将以本说明书,包括术语的解释,为准。另外,所有材料、方法和实例仅是说明性的,并且不旨在限制。
异常:偏离正常特性。正常特性可以在对照、群体的标准等中发现。例如,当异常状况是疾病状况,诸如癌症时,正常特性的一些合适来源可以包括未患疾病的个体、非癌性组织样品或者未暴露于疾病微环境诸如肿瘤内或者肿瘤间质内或周围的免疫细胞群或免疫祖细胞群。
过继性细胞转移(ACT):一种治疗方法,其涉及在体外修饰后将具有治疗活性的细胞转移到受试者中。在具体实施方案中,ACT中使用的细胞源自待治疗的受试者,从受试者中取出,离体修饰,扩增,然后返回(施用)至受试者。在具体实施方案中,ACT方法涉及修饰特异性T细胞(自体或同种异体)以增强肿瘤特异性抗原的靶向。用于癌症免疫疗法的三种ACT类型包括肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、T细胞受体(TCR)T细胞和嵌合抗原受体(CAR)T细胞,所有这些都可以根据本文所描述的方法进行修饰。
改变表达:生物分子(例如mRNA、miRNA或蛋白质)在受试者或来自受试者的生物样品中的表达,其偏离相同生物分子在正常或对照受试者中的表达。生物分子的改变表达可以与疾病相关,诸如在肿瘤环境中T细胞中miR-23的改变表达。表达可以以增加或减少的方式改变。RNA或蛋白质表达的定向改变可能与治疗益处有关。在所描述方法的具体实施方案中,在将该miRNA置于T细胞中通常上调的miRNA或蛋白质编码基因的遗传基因座中后,例如在其被肿瘤抗原活化之后(导致抗肿瘤应答降低),在T细胞中通常下调的miRNA的表达增加,例如在其被肿瘤抗原活化之后(也导致抗肿瘤应答降低)。
扩增:当参考核酸使用时,任何增加样品或试样中核酸分子拷贝数的技术。
动物:活的多细胞脊椎动物生物体,种类包括例如哺乳动物和鸟类。术语哺乳动物包括人和非人哺乳动物。类似地,术语受试者包括人受试者和兽医受试者,例如人、非人灵长类、狗、猫、马和牛。用于当前方法的细胞群可以是取自或衍生自取自任何动物的样品的样品。
生物样品:可以直接或间接从生物体获得的任何样品。生物样品包括多种流体,组织,及细胞,包括全血,血浆,血清,泪液,粘液,唾液,尿,胸膜液,脊髓液,胃液,汗液,精液,阴道分泌物,痰液,来自溃疡和/或其它表面喷疹的流体,水疱,脓肿,组织,细胞(诸如成纤维细胞、外周血单核细胞或肌细胞),细胞器(诸如线粒体),器官,和/或组织、细胞(诸如成纤维细胞、外周血单核细胞或肌细胞)、细胞器(诸如线粒体)或器官的提取物。本文所描述的方法可以利用包括肿瘤样品的任何合适的生物样品的细胞或衍生自其的细胞。在具体的实施方案中,本文所描述的方法在衍生自血液样品的细胞诸如外周血单核细胞上实践。在其它实施方案中,本文所描述的方法在衍生自从受试者取出的实体瘤的T细胞上实践。
癌症:瘤形成的产物是赘生物(肿瘤或癌症),它是由过度细胞分裂引起的组织异常生长。不转移的肿瘤被称为“良性的”。侵入周围组织和/或可以转移的肿瘤被称为“恶性的”。瘤形成是增殖性病症的一个实例。“癌细胞”是赘生性细胞,例如分离自肿瘤的细胞或细胞系。本文所描述的方法可以用于增加免疫细胞诸如CAR T细胞抗癌症的治疗(即免疫学)功效,该癌症在具体实施方案中是血液肿瘤,并且在其它实施方案中是实体瘤。
血液肿瘤的实例包括白血病,其包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、急性髓性白血病和成髓细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、粒单核细胞性白血病,单核细胞性白血病和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病(Hodgkin's disease)、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级形式)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulinemia)、重链病,骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤例如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤(Ewing's tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌(诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、肾母细胞瘤(Wilms’tumor)、宫颈癌、睾丸瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(诸如神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤)。
化学治疗剂:在以异常细胞生长或增生为特征的疾病的治疗中具有治疗有用性的药剂。此类疾病包括癌症、自身免疫性疾病以及以增生性生长为特征的疾病诸如牛皮癣。本领域的技术人员可以容易地鉴定化学治疗剂(例如,参见Slapak和Kufe,《癌症治疗原理(Principles of Cancer Therapy)》,第14版《哈里逊内科学原理(Harrison's Principlesof Internal Medicine)》中的第86章;Perry等人,《化学疗法(Chemotherapy)》,在第2版Abeloff的《临床肿瘤学(Clinical Oncology)》中的第17章,2000丘吉尔利文斯通公司(Churchill Livingstone,Inc);Baltzer L,Berkery R(编辑):《肿瘤学化疗袖珍指南(Oncology Pocket Guide to Chemotherapy)》,第2版,圣路易斯莫斯比年鉴(St.Louis,Mosby-Year Book),1995;Fischer DS,Knobf MF,Durivage HJ(编辑):《癌症化疗手册(TheCancer Chemotherapy Handbook)》,第4版,圣路易斯莫斯比年鉴,1993)。化学治疗剂的实例包括ICL诱导剂,诸如美法仑(melphalan)(AlkeranTM)、环磷酰胺(cyclophosphamide)(CytoxanTM)、顺铂(cisplatin)(PlatinolTM)和白消安(busulfan)(BusilvexTM、马勒兰TM(MyleranTM))。如本文所用,化学治疗剂是在癌症治疗中具有治疗有用性的任何药剂,其包括生物药剂,诸如抗体、肽和核酸。在所描述的方法的具体实施方案中,用于细胞疗法的修饰细胞可以用作包括一种或多种化学治疗剂的治疗方案的一部分。此类药剂可以在施用修饰细胞之前、同时或之后施用。
嵌合抗原受体(CAR)T细胞:分离自受试者并且经修饰以表达所期望的靶受体的T细胞。可以设计CAR-T细胞以靶向用于免疫治疗清除的特定细胞,诸如特定的癌症类型。在具体实施方案中,本文所描述的方法修饰CAR-T细胞中miRNA的遗传基因座和相关表达。
成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR):最初在原核生物中鉴定的DNA基因座,其含有多个短的直接重复的碱基序列。原核CRISPR/Cas系统已通过用所需元件转染细胞而适于用作基因编辑技术,该元件包括Cas核酸酶基因和专门设计的向导RNA(gRNA),生物体的基因组可以在任何所期望的位置被切割和修饰。在国际专利公布WO 2013/176772和WO 2014/018423中详细描述了制备用于使用CRISPR/Cas系统的基因组编辑的组合物的方法。
在一些实施方案中,将驱动CRISPR系统的一个或多个元件的表达的一个或多个载体引入靶细胞中,使得CRISPR系统的元件的表达引导在一个或多个靶位点处形成CRISPR复合物。为了使用CRISPR技术靶向特定DNA序列,诸如本文所描述的miRNA,使用者可以将含有靶序列的短DNA片段插入向导RNA表达质粒中。sgRNA表达质粒含有靶序列(约20个核苷酸)、tracrRNA序列的形式(支架)以及合适的启动子和在真核细胞中适当加工的必要元件。此类载体是可商购的。许多系统依赖于定制的互补寡核苷酸,它们经退火以形成双链DNA,然后克隆到sgRNA表达质粒中。来自同一或单独的质粒的sgRNA和合适的Cas酶在转染的细胞中共表达导致在所期望的靶位点处单链或双链断裂(取决于Cas酶的活性)。
对照:适于与样品比较的标准,例如未经历本文所描述的微小RNA编辑过程的细胞或细胞群。
功效:指包括细胞如免疫细胞的药剂引发或提供所期望的治疗效果的能力。功效还指包括本文所描述的修饰细胞的治疗剂的强度或效力。如本文所用,“增强功效”意指增加修饰细胞的治疗作用。例如,当药剂是修饰细胞时,“增强功效”可以意指增加药剂杀死靶细胞诸如肿瘤细胞的能力。增强的功效不需要实际证实靶细胞毒性。相反,如本文所描述的,所描述的修饰细胞的功效由于可以预测增加细胞毒性作用的基因表达模式的改变而增强。
化合物的有效量:足以在所治疗的受试者中实现所期望的作用的化合物的量。化合物的有效量可以是在治疗过程中以例如每日单一剂量或以若干剂量施用。然而,化合物的有效量将取决于所施用的化合物、所治疗的受试者、痛苦的严重程度和类型以及化合物的施用方式。
编码:如果在其天然状态下或当通过本领域的技术人员熟知的方法操作时,多核苷酸可以被转录和/或翻译以产生多肽的mRNA和/或多肽或其片段,则称为多核苷酸“编码”多肽。反义链是此类核酸的补体,并且可以从中推导出编码序列。被翻译以产生蛋白质的mRNA是“编码”RNA。非编码RNA,诸如本文所描述的miRNA,不被翻译成蛋白质,然而此类miRNA的表达或抑制将导致对蛋白质表达的下游效应。
扩展:指细胞培养物中细胞数量或量因细胞分裂而增加的过程。类似地,术语“扩展(expansion)”或“扩展(expanded)”也是指该过程。术语“增殖(proliferate)”、“增殖(proliferation)”或“增殖的(proliferated)”可以与词语“扩展(expand)”、“扩展(expansion)”或“扩展的(expanded)”互换使用。除非另有说明,用于所描述的方法的细胞培养技术是本领域常用的那些。
表达控制序列:调节与其可操作连接的异源核酸序列的表达,例如微小RNA的表达的核酸序列。当表达控制序列控制和调节核酸序列的转录和适当的翻译时,表达控制序列可操作地连接至核酸序列。因此,表达控制序列可以包括合适的启动子、增强子、转录终止子、蛋白质编码基因前面的起始密码子(ATG)、内含子的剪接信号、维持该基因的正确阅读框以允许mRNA的正确翻译和终止密码子。术语“控制序列”旨在最少包括其存在可以影响表达的组分,并且还可以包括其存在是有利的附加组分,例如前导序列和融合配偶体序列。表达控制序列可以包括启动子。启动子是足以引导转录的最小序列。还包括足以使启动子依赖性基因表达对于细胞类型特异性、组织特异性可控或可由外部信号或药剂诱导的那些启动子元件;此类元件可以位于基因的5'或3'区。在具体实施方案中,所描述的方法的miRNA被置于不同于其正常遗传基因座的表达控制序列的转录控制下。在具体实施方案中,miR-28的表达被置于miR-23表达控制序列的控制之下。
基因/基因组/基因组编辑技术(GET):凭借其来缺失、修饰、替换或插入靶核酸序列(即在特定位置)的基因工程方法。本文所描述的方法利用任何GET将特定的miRNA-编码序列插入到非天然遗传基因座中,以便处于该基因座的转录控制下。GET的具体非限制性实例包括CRISPR/Cas相关方法、锌指核酸酶、TALEN和形成三链体的分子诸如形成三链体的寡核苷酸、肽核酸和尾夹肽核酸的使用,所有这些都是本领域已知的。
异源:与第二序列相邻非正常(即,在野生型序列中)发现的一类序列。在一个实施方案中,该序列来自与第二序列不同的遗传来源,诸如病毒或生物体。
免疫应答:免疫系统的细胞诸如B细胞、T细胞或单核细胞对刺激的应答。在一个实施方案中,应答对特定抗原如来自白血病的抗原是特异性的(“抗原特异性应答”)。在一个实施方案中,免疫应答是T细胞应答,诸如CD4+应答或CD8+(细胞毒性)应答。在另一实施方案中,应答是B细胞应答,并且导致特异性抗体的产生。
免疫疗法:一种引发针对或响应于靶抗原的存在的免疫应答的方法,该靶抗原诸如在肿瘤细胞表面上表达。基于细胞介导的免疫应答的免疫疗法涉及对产生特定抗原决定簇的细胞生成或提供细胞介导的应答。ACT免疫疗法,诸如CAT T细胞介导的疗法,也称为免疫肿瘤学。
分离的:“分离的”生物组分(诸如核酸、蛋白质、细胞(或多个细胞/细胞群)、组织或细胞器)已基本上与生物体的其它生物组分分离或从生物体的其它生物组分中纯化出来,其中该组分天然存在于该生物体中,例如其它组织、细胞、其它染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞器。已经“分离的”核酸和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白质。该术语还涵盖通过在宿主细胞中重组表达而制备的核酸和蛋白质以及化学合成的核酸。
基因座:基因或特定DNA序列在染色体或染色体外序列上的遗传位置。可以以更高或更低的精确度描述基因座,使得其可以在一些实施方案中用于描述特定核苷酸序列的位置,并且在其它实施方案中用于描述特定编码(或非编码)序列,以及其相关的表达控制序列。如本文所述,将miRNA编码序列置于新遗传基因座将使其转录处于新基因座的控制之下。
微小RNA(miRNA):18至24个核苷酸长的短单链RNA分子。在细胞中由转录的非编码RNA的较长前体分子内源性产生的miRNA可以抑制翻译,或可以通过与靶核酸互补或接近互补的杂交来引导靶mRNA的切割。
寡核苷酸:通过天然磷酸二酯键连接的多个连接核苷酸,长度在约6和约300个核苷酸之间。寡核苷酸类似物是指功能类似于寡核苷酸但具有非天然存在部分的部分。例如,寡核苷酸类似物可以含有非天然存在的部分,诸如改变的糖部分或糖间连接,诸如硫代磷酸寡脱氧核苷酸。天然存在的多核苷酸的功能性类似物可以结合至RNA或DNA,并且包括肽核酸(PNA)分子。具体的寡核苷酸和寡核苷酸类似物可以包括长度至多约200个核苷酸的线性序列,例如长为至少6个碱基,例如至少8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100或甚至200个碱基,或约6至约50个碱基,例如约10至25个碱基,诸如12、15或20个碱基的序列(诸如DNA或RNA)。
可操作地连接:当第一核酸序列与第二核酸序列处于功能关系时,第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如,如果启动子影响编码序列的转录或表达,则启动子可操作地连接至编码序列。通常,可操作地连接的DNA序列是连续的,并且当需要连接两个蛋白质编码区时,在同一读码框中。在所描述的方法的具体实施方案中,改变miRNA的遗传位置,使得“移动的”miRNA可操作地连接至不同于其原始遗传基因座的表达控制序列。
预防或治疗疾病:预防疾病是指抑制疾病的完全发展,例如抑制患有冠状动脉疾病的人的心肌梗塞的发展或抑制具有赘生物的受试者的肿瘤的进展或转移。治疗是指在疾病或病理状况开始发展后改善其征兆或症状的治疗干预。
转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN):使用编码转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)的一个或多个核酸构建体的GET方法。TALEN具有与ZFN相似的整体架构,主要区别在于DNA结合结构域来自TAL效应蛋白。工程化TAL以与特异性核酸结合的方法描述于Cermak等人,《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》1-11(2011)。美国公开申请号2011/0145940描述了TAL效应子和使用它们修饰DNA的方法,以及TALE结合结构域的一般设计原理。
靶序列:靶序列是ssDNA、dsDNA或RNA的一部分,其可以通过具有足够互补性以允许杂交的寡核苷酸或寡核苷酸类似物(例如吗啉代)杂交。用于所描述的方法的GET方法利用识别特定靶序列的寡核苷酸来引导所描述的编码RNA或非编码miRNA序列的去除和/或插入。
Zn指核酸酶(ZFN):GET技术利用了在DNA中产生双链断裂的细胞机制。在具体实施方案中,GET使用ZFN系统,通过该ZFN系统从编码核酸质粒表达设计的ZFN,并且该ZFN系统能够特异性地靶向期望的序列。用来设计用于基因编辑的ZFN系统的工具可在锌指聚生体(zincfingers.org)在线获得。II.几个实施方案的简要概述
本文描述了通过如下步骤修饰用于细胞疗法的分离的细胞的方法:在培养物中提供多个分离的细胞;以及在多个细胞中,在包括第一RNA编码序列的第一遗传基因座处插入第二RNA编码序列,从而将第二RNA编码序列可操作地连接至第一遗传基因座的转录调节序列,并且破坏第一遗传基因座。在所描述的方法中,在第一遗传基因座处插入第二RNA编码序列,通过破坏或替换该序列(或在去除第一序列的在先步骤之后)而消除第一RNA编码序列的表达,并且其中在足以启动第一遗传基因座处的转录的条件下,诱导第二RNA编码序列在第一遗传基因座处的表达,但是消除第一遗传基因座的表达。在所描述的方法中,所描述的破坏/插入通过基因编辑技术(GET)进行,该基因编辑技术选自可用的GET方法,其包括但不限于应用转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR)–Cas-相关核酸酶和锌指核酸酶(ZFN)或用于修饰遗传序列的任何其它类似技术。
在具体实施方案中,除了将第二RNA编码序列插入第一RNA编码序列的基因座之外,该方法包括在包括第二RNA编码序列的第二遗传基因座处插入第一RNA编码序列,从而将第一RNA编码序列可操作地连接至第二遗传基因座处的转录调节序列,并且其中在足以抑制第二遗传基因座处的转录的条件下,抑制第一RNA编码序列在第二遗传基因座处的表达。
单个编辑实施方案和双重编辑实施方案两者都涉及RNA编码序列的位置的转换,因此在本文中也称为“易位(castling)”方法。
在一些实施方案中,所描述的方法的第一RNA编码序列可以是非蛋白质编码序列,诸如miRNA编码序列。在其它实施方案中,第一RNA编码序列可以是蛋白质编码序列。所描述的方法的第二RNA编码序列可以是非蛋白质编码序列,诸如miRNA编码序列。
在具体实施方案中,分离的细胞是间充质干细胞或其谱系(包括成骨细胞(骨细胞),软骨细胞(chondrocyte)(软骨细胞(cartilage cell)),心肌细胞(肌细胞),脂细胞(产生骨髓脂肪组织的脂肪细胞和肝细胞样细胞),或者多能造血干细胞或其谱系,诸如红细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞或肥大细胞。在又进一步的实施方案中,分离的细胞是天然T细胞、诱导的调节性T细胞、细胞毒性T细胞、天然杀伤(NK)T细胞、辅助性T细胞或嵌合抗原受体(CAR)T细胞。
在具体实施方案中,分离的细胞是实质细胞,诸如肝细胞或内分泌细胞诸如胰腺b细胞。
应了解,除了所提到的细胞类型外,任何类型的多能细胞可以如本文所描述进行修饰。此外,在具体实施方案中,用于特定受试者的细胞是自体的,而在其它实施方案中,细胞是同种异体的。
本文还描述了通过如下步骤来增强用于过继性细胞转移疗法的淋巴细胞或骨髓细胞的治疗功效的方法:在培养物中提供多个分离的淋巴细胞;以及将RNA编码序列插入分离的淋巴细胞中的活跃转录的遗传基因座处,该遗传基因座包括蛋白质编码基因诸如抑制性免疫检查点基因,或编码非蛋白质编码RNA诸如与免疫疗法效率降低相关的miRNA(“不良”基因),该RNA编码序列诸如miRNA编码序列,其高表达预期增加免疫疗法的效率(“良好”基因),从而消除“不良”基因的表达并且增强“良好”基因的表达,其中插入通过选自可用方法的基因编辑技术进行,该可用方法包括转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR)–Cas-相关核酸酶和锌指核酸酶(ZFN)。
在具体实施方案中,该蛋白质编码基因是抑制性免疫检查点基因,诸如但不限于CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白质4);和/或PD-1(程序性细胞死亡蛋白质1);和/或LAG-3(淋巴细胞活化基因3)、TIM3(含有T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域的蛋白质3)等。
III.用于增强细胞疗法的基因编辑技术(GET)介导的RNA工程
本文描述了应用GET介导的基因工程(genomic engineering)来修饰RNA表达,诸如miRNA和/或mRNA表达以优化和增强细胞疗法。
在所描述的方法的一般实施方案中,GET介导的基因工程被用于在分离的细胞中同时修饰两种或更多种靶基因的表达,该分离的细胞用于细胞疗法,诸如但不限于ACT或细胞移植疗法。使用GET,将低表达消极地影响细胞疗法性能的目的非编码RNA(诸如miRNA)编码序列插入与所选序列(“第二RNA编码序列”)不同的转录活性遗传基因座(“第一遗传基因座”),并且其高表达也消极地影响相同类型细胞疗法的性能。此类插入消除了内源基因(编码或非编码)在第一遗传基因座的表达,同时将第二RNA编码序列的表达可操作地连接至第一遗传基因座的转录控制序列。因此,在足以启动第一遗传基因座处的转录的条件下,第二RNA编码序列将被表达。
上述单个编辑实施方案绘示于图1中,其中在第一遗传基因座处活跃表达的miRNA编码序列被标记为“不良”miRNA(作为说明性“不良”基因);并且在第二遗传基因座处的低表达的miRNA编码序列被标记为“良好”miRNA(作为说明性“良好”基因)。如图1所示,GET介导的基因编辑用于在第一遗传基因座处插入“良好”miRNA的拷贝,以破坏或替换“不良”miRNA的编码序列。此类替换导致“良好”miRNA获取“不良”miRNA的表达模式,其表现为在上调“不良”miRNA的条件(例如疾病状态)下上调,并且同时消除“不良”miRNA的表达(其表达限制细胞疗法功能性)。“良好”miRNA也在其表达保持低水平的原始基因座处表达。因此,编辑方式的最终结果将是“不良”miRNA表达的双重消除,同时活化“良好”miRNA表达,两者均导致细胞疗法功效的改善。
在如图3所绘示的所描述的方法的另外的一般实施方案中,进行两个GET介导的编辑过程,使得第二RNA编码序列(图3中的“良好miRNA”)的拷贝在第一遗传基因座的调控下表达,并且第一RNA编码序列(图3中的“不良miRNA”)的拷贝在第二遗传基因座的调控下表达。在特定的环境条件下,在图中称为“疾病状态”,第二RNA编码序列的表达将被诱导或增强,而第一RNA编码序列的表达将被抑制或压抑到基础水平。考虑到miRNA所起的许多不同的和有联系的调节作用,此类将“不良miRNA”维持在基础表达水平可能是有益的(与完全消除其表达相反)。
与图1类似,图2绘示了通过“良好”miRNA对标记为“不良”蛋白质编码基因的第一遗传基因座处的内源基因的GET介导的破坏。此类替换导致“良好”miRNA的表达增加和“不良”蛋白质编码mRNA的表达敲减,两者都赋予更好的细胞疗法功效。“良好”miRNA也在其定向表达保持低水平的原始基因座处表达。在具体的实施方案中,降低例如CAR-T细胞的抗肿瘤功效的“不良”基因可以选自一组抑制性免疫检查点基因,诸如但不限于PD-1或CTLA-4。因此,在图2所描述的编辑过程之后,在T细胞中能够响应于肿瘤环境而上调的活性将降低或甚至消除。
可以用于本文所描述的方法的基因编辑技术选自但不限于转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR)–Cas-相关核酸酶和锌指核酸酶(ZFN)以及本领域已知的任何其它可用的基因编辑方法。
miRNA
微小RNA(miRNA)是一组小的非编码RNA,其经由通过与主要位于靶基因的3'-非翻译区中的部分互补位点结合来控制mRNA降解和/或翻译抑制,从而负调节基因表达。据估计,miRNA调节超过60%的人蛋白质编码基因的翻译,从而参与多种生物过程的调节,这些生物过程包括细胞周期控制、细胞生长和分化、细胞凋亡、胚胎发育等。miRNA是有效的细胞调节物,因为它们能够靶向特定途径内的多个分子或者会聚途径或生物过程中的不同蛋白质。因此,miRNA可以通过累积地或协同地抑制其不同组分而有效地调节生物网络。或者作为选择,它们可以通过靶向正调节组分和负调节组分来微调特定的信号传导途径。这意味着异常的miRNA表达应成比例地影响那些关键的过程,因此导致各种病理的和偶然恶性的结果。事实上,miRNA已被鉴定为人疾病发展、进展和治疗应答中的关键参与者。(6至9)。
例如,在几种人类疾病中报道了某些miRNA的改变的表达(一些上调,一些下调),该人类疾病包括精神分裂症、神经变性疾病如帕金森病和阿尔茨海默病、免疫相关疾病、纤维化疾病和心脏病。然而,在许多已鉴定的miRNA疾病相关中,miRNA在癌症疾病中的参与是最普遍的。已经在淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、乳头状甲状腺癌、成胶质细胞瘤、肝细胞癌、胰腺肿瘤、垂体腺瘤、宫颈癌、脑肿瘤、前列腺癌、肾癌和膀胱癌以及结肠直肠癌中鉴定了肿瘤与正常组织之间miRNA表达的差异。这些观察结果受到以下发现支持:许多miRNA由与癌症连接的基因组区编码,并且加强了miRNA可以充当致癌基因或相反地充当在肿瘤发生中具有关键功能的肿瘤抑制因子的观点(7、8、10至12)。
miRNA基因位于内含子、外显子或非翻译基因组区。一些miRNA聚集在多顺反子转录物中,从而允许对它们的表达进行协同调节,而其它miRNA以组织特异性和发育阶段特异性方式表达(6)。从它们的基因座开始,miRNA初始被RNA聚合酶II转录为长的初级转录物,其被细胞核中的RNAse III酶Drosha加工成大约70个核苷酸前体。然后通过Ran GTP酶和输出蛋白5将前体miRNA输出到细胞质中,并且通过Dicer蛋白质复合物进一步加工成不完整的22-mer miRNA双链体(13)。
控制微小RNA表达的几种机制可以在人类疾病中改变。这些包括表观遗传变化诸如启动子CpG岛过度甲基化、RNA修饰和组蛋白修饰或遗传改变诸如突变、扩增或缺失,其可以影响初级miRNA转录物的产生、它们的生物发生过程和/或与mRNA靶标的相互作用(12)。
鉴于它们在人类疾病中的关键作用,miRNA是治疗干预的有吸引力的靶标。致力于逆转miRNA的表观遗传/遗传沉默的分子方式包括直接施用合成的miRNA模拟物或在表达载体中编码的miRNA,或者通过脱甲基化剂诸如地西他滨(decitabine)或5-氮杂胞苷(5-azacytidine)逆转miRNA的表观遗传沉默。已经采用其它分子方式来阻断miRNA功能,诸如反义miRNA-特异性寡核苷酸(抗miR或拮抗剂(antagomir))、微小抗miR(靶向整个miRNA家族的特异性种子区)、miRNA海绵、blockmir、靶向miRNA的小分子(SMIR)和阻断外来体中的细胞外miRNA(14)。然而,当前基于miRNA的合成寡核苷酸疗法仍然需要克服与合成寡核苷酸药物相关的问题,诸如通过核酸酶降解、肾清除、不能穿过毛细血管内皮、靶细胞的无效胞吞作用、无效的内体释放、配制的基于RNA的药物从血液通过毛细血管内皮释放至靶组织和诱导宿主免疫应答。当通过表达载体递送时,危险和缺点是基因疗法典型的那些:插入沉默基因组区妨碍转基因表达或宿主基因在整合位点附近的破坏/活化,导致潜在的安全后果。
增强细胞疗法
本文所描述的方法利用GET方法来离体修饰细胞以用于细胞疗法,包括ACT疗法,诸如但不限于抗癌T细胞介导的免疫疗法。在具体实施方案中,分离的细胞可以是间充质干细胞。在另一实施方案中,用于所描述的方法的分离的细胞可以是多能造血干细胞,或其具有一些多能性的谱系,或其单能性的另外的谱系。在具体实施方案中,此类造血“谱系细胞”可以是红细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞或肥大细胞。在其它具体实施方案中,T淋巴细胞可以是天然T细胞、诱导的调节性T(Treg)细胞、细胞毒性T细胞、天然杀伤T(NKT)细胞、辅助性T细胞或嵌合抗原受体(CAR)T细胞。
在某些实施方案中,用于所描述的方法的分离的细胞是实质细胞,诸如肝细胞。
在具体实施方案中,所描述的方法用于调整T细胞疗法如使用CAR-T细胞的那些中所选miRNA的表达。活化后,T细胞经历了总体基因和miRNA表达重塑以支持细胞生长、增殖和效应子功能。然而,抗原刺激的性质、持续时间和设置的改变可以导致改变的miRNA和基因表达模式,随后导致功能失调的T细胞状态如无反应性、耐受性和/或耗竭。如下所展示的,使用本文所描述的GET介导的miRNA工程,可以改变miRNA表达模式,并且通过延伸改变由miRNA调节的基因的表达模式,可以克服CAR-T细胞的治疗功效降低。
在基于ACT的疗法中使用miRNA工程的附加靶T细胞是调节性T淋巴细胞(Treg)。Treg细胞对于维持免疫耐受性是至关重要的,因为它们在关闭朝向免疫反应终点的T细胞介导的免疫和抑制自身反应性T细胞中的作用。这些细胞在系统性红斑狼疮(SLE),一种慢性炎性自身免疫病症中以较低频率出现,这导致免疫功能障碍(15)。使用本文所描述的GET介导的miRNA工程,可以扩展分离自SLE患者的Treg并且增强其自身免疫抑制活性。
本文所描述的方法应用GET介导的miRNA工程以同时下调对T细胞功能具有负影响的基因如miRNA,同时上调具有正影响的那些基因。
通过用下调的miRNA的拷贝替换上调的有害miRNA,所描述的易位方法能够同时上调期望的“良好”miRNA和下调不期望的“不良”miRNA,从而确保期望的miRNA的高表达水平并且关闭有害miRNA(参见图1的示范性实施方案)。类似地,为了保持“不良”miRNA的低水平,可以实施相互交换。在此类方法中,与用所期望的miRNA替换有害miRNA并行,用有害miRNA替换所期望的miRNA(参见图3的示范性实施方案)。
在又进一步的实施方案中,通过“敲入”编辑,将期望的“良好”miRNA插入离体T细胞中不期望的“不良”基因(例如,抑制性免疫检查点基因诸如PD-1或CTLA-4)的编码区中,从而同时消除敲减基因的抑制作用并且获得miRNA相关的积极作用。该实施方案绘示于图2中。在miRNA敲入基因编码区的情况下,应确保共同插入适当的信号序列诸如Drosha加工位点和转录终止信号(16、17)。
如所提到的,所描述的方法可以在具体实施方案中用于通过用与增加的或正常的治疗功效相关的一种或多种miRNA编码序列替换与降低的治疗功效相关的一种或多种miRNA编码序列的表达,来增强ACT疗法的功效。这种遗传“转换”,在本文中也称为“易位”,可以在ACT过程的任何离体阶段实施。在具体实施方案中,这样修饰ACT程序,使得如本文所描述[例如,肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)],或在进一步修饰之前(例如,工程化以表达嵌合抗原),或在其它编辑介导的修饰之后(例如,工程化以表达嵌合抗原),对分离的T细胞群进行遗传编辑。在其它实施方案中,将“准备”向需要其的受试者施用的淋巴细胞群根据当前方法进行编辑,再扩展,然后提供给患者。
工程化在T细胞中的miRNA表达
在具体实施方案中,所描述的方法可以用于减轻T细胞耗竭和/或无反应性,扩展它们的持久性,和/或改善它们在实体瘤根除中的效率。
在一个实施方案中,所描述的方法可以与当前使用的策略和与CAR-T细胞的组合如CAR-T细胞疗法与检查点阻断疗法的组合一起采用,已知其能够减少临床前和临床研究中的T细胞耗竭。
目前的检查点阻断方式包括使用针对抑制性免疫检查点靶标的抗体与CAR-T细胞组合,由T细胞自身产生和分泌这些抗体,用免疫检查点基因阻断合成寡核苷酸离体处理CAR-T细胞,或作为选择在CAR-T细胞中使用免疫检查点基因的GET介导的敲减(5)。
所描述的T细胞基因组的GET介导的修饰的方法将上调特异性miRNA的表达,同时抑制其它不期望的miRNA或者其它非编码RNA或蛋白质的表达。
以下部分描述了示范性miRNA,其表达可以使用所描述的方法改变以增加T细胞治疗功效。然而,该列表仅仅是说明性的;并且本领域的技术人员将理解,可以使用被鉴定为类似地影响T细胞功效的任何miRNA。类似地,尽管下面列出的说明性“不良”基因是miRNA,但是编码对T细胞功效有害的编码或非编码RNA的任何核酸可以使用所描述的方法进行破坏或替换。
对T细胞治疗功效具有积极作用的“良好”miRNA
这些miRNA的表达通过编辑介导的插入到活跃转录的“不良”miRNA/编码基因区中而增加。
miR-181a
在具体实施方案中,过继转移的肿瘤特异性T细胞的改善调整了TCR信号传导阈值以增强T细胞活化和功能。已经发现几种miRNA诸如miR-181a通过靶向关键抑制性磷酸酶影响TCR信号传导。
在具体实施方案中,上调miR-181a以同时靶向多种丝氨酸/苏氨酸和酪氨酸磷酸酶。它还可以通过抑制DUSP5(双特异性磷酸酶5)、DUSP6(双特异性磷酸酶5)、PTPN11(蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型11)和PTPN22(蛋白酪氨酸磷酸酶非受体型22),来增强LCK(LCK原癌基因、Src家族酪氨酸激酶)和ERK(MAPK1-促分裂原活化蛋白激酶1)活性。该活性控制中枢和外周T细胞耐受性。此外,T细胞中miR-181a的过表达增加了TCR对同源抗原的敏感性并且增强了TCR触发时的细胞内钙通量,导致更显著的IL-2释放,其在其它活性中促进T细胞分化成效应T细胞和记忆T细胞。因此,经工程化以具有增强的miR-181a表达的T细胞预期具有增加的活化特性(45、46)。
hsa-mir-181a-1序列可如下公开获得。可以在mirbase.org在线找到本文所提到的所有微小RNA序列。
hsa-mir-181a-1(miRbase ID:MI0000289)-前mir序列;人类2013年12月(GRCh38/hg38)组装;chr1:198,859,044至198,859,153(109bp)
5'-
UGAGUUUUGAGGUUGCUUCAGUGAACAUUCAACGCUGUCGGUGAGUUUGGAAUUAAAAUCAAAACCAUCGACCGUUGAUUGUACCCUAUGGCUAACCAUCAUCUACUCCA–3'(SEQ ID NO:1)
粗体序列代表成熟miRNA的5p(左)链和3p(右)链。
hsa-mir181a-1基因组区
基因组的chr1(反向链)(300bp)(chr1:198,859,254至198,858,954)
(SEQ ID NO:2)
小写字母代表前miRNA侧翼基因组序列;大写字母为前miRNA序列;粗体为成熟miRNA的链。
miR-28
在另一实施方案中,T细胞通过GET工程化以具有增加的miR-28表达。据报道,miR-28的表达在从黑素瘤提取的耗竭的PD-1+T细胞中下调大约30%。miR-28通过与其各自的3'UTR结合来抑制免疫检查点分子PD-1、TIM3和BTLA在T细胞中的表达。实验上,miR-28模拟物的添加可以通过恢复白介素-2(IL-2)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的分泌而至少部分地转化PD-1+T细胞的耗竭表型。在癌症患者中,施用TIM-3抗体凭借肿瘤抗原特异性T细胞增加增殖和细胞因子产生。用TIM-3进行的临床前研究示出,它与PD-1一起在肿瘤浸润淋巴细胞上表达,并且靶向这两种蛋白质的组合疗法可以加强T细胞介导的抗肿瘤应答。近年来已经开发了多种抗PD-1剂和抗PD-L1剂,并且它们可以与所描述的工程化T细胞一起用于癌症免疫疗法中。例如,派姆单抗(pembrolizumab)是FDA在2014年批准用于治疗黑素瘤的第一种PD-1抑制剂。同样,阿特珠单抗(atezolizumab)是FDA在2016年批准用于治疗尿路上皮癌和非小细胞肺癌的完全人源化的抗PD-L1的IgG1抗体。此外,阿维单抗(avelumab)和德瓦鲁单抗(durvalumab)是FDA批准用于治疗梅克尔细胞癌、尿道上皮癌和非小细胞肺癌的完全人源化的IgG1抗体(18)。总之,miR-28可能在将T细胞的末端状态逆转为记忆细胞和恢复T细胞分泌促炎性细胞因子的能力中起重要作用(19)。以上所提到的活性剂均可用于所描述的组合疗法。
hsa-mir-28序列可如下公开获得:
hsa-mir-28(MirBase ID:MI0000086)-前mir序列;人类2013年12月(GRCh38/hg38)组装;chr3:188688781至188688866(85bp)
5'–GGUCCUUGCCCUCAAGGAGCUCACAGUCUAUUGAGUUACCUUUCUGACUUUCCCACUAGAUUGUGAGCUCCUGGAGGGCAGGCACU–3'
(SEQ ID NO:3)
粗体序列代表成熟miRNA的5p(左)链和3p(右)链。
hsa-mir-28基因组区
基因组chr3(正链):188688680至188688966(286bp)
小写字母代表前miRNA侧翼基因组序列;大写字母为前miRNA序列;粗体为成熟miRNA的链。
miR-149-3p
在进一步的实施方案中,将T细胞工程化以具有增强的miR-149-3p表达。已经示出miR-149-3p通过在乳腺癌细胞存在下减少抑制性受体和促进细胞因子分泌来逆转CD8+T细胞耗竭。用miR-149-3p模拟物处理CD8+T细胞减少细胞凋亡,减弱T细胞耗竭的mRNA标记物的变化并下调编码PD-1、TIM-3、BTLA和Foxp1的mRNA。同时,miR-149-3p模拟处理后,T细胞增殖和指示增加的T细胞活化的效应细胞因子(IL-2、TNF-α、IFN-γ)的分泌上调。此外,用miR-149-3p模拟物治疗促进CD8+T细胞杀死靶向的4T1小鼠乳腺肿瘤细胞的能力。总之,这些数据示出miR-149-3p可以逆转CD8+T细胞耗竭,并且揭示它是乳腺癌中潜在的抗肿瘤免疫治疗剂(20)。hsa-miR-149序列可如下公开获得:
hsa-mir-149(MirBase ID:MI0000478)–前mir序列;人类2013年12月(GRCh38/hg38)组装;chr2:240456001至240456089(88bp)
5’-GCCGGCGCCCGAGCUCUGGCUCCGUGUCUUCACUCCCGUGCUUGUCCGAGGAGGGAGGGAGGGACGGGGGCUGUGCUGGGGCAGCUGGA–3'(SEQ ID NO:5)
粗体序列代表成熟miRNA的5p(左)链和3p(右)链。
hsa-mir-149基因组区
基因组chr2:(正链):240455900至240456190(289bp)
小写字母代表前miRNA侧翼基因组序列;大写字母为前miRNA序列;粗体为成熟miRNA的链。
对T细胞治疗功效具有负作用的“不良”miRNA
拮抗活跃表达的负调节T细胞免疫应答的miRNA是增加T细胞适应性和抗肿瘤功能的替代方式。因此,此类miRNA在T细胞中的基因组基因座是经由插入“良好”miRNA而被GET介导的敲减的靶标。
miR-146a
在一个实施方案中,mir146a的表达可以被消除或抑制。miR146a是NF-B信号传导的主要抑制因子,并且响应于T细胞活化而上调以抑制效应子应答。已经示出mir146a敲除(KO)小鼠丧失了它们的免疫耐受性。拮抗T细胞中的miR146a预期加强过继转移细胞中的NF-B活性并且潜在地增强其抗肿瘤应答的效力(21)。因此,在一些实施方案中,T细胞中miR146a的GET介导的缺失或抑制将增强T细胞的功效。
hsa-mir-146a序列可如下公开获得:
hsa-mir-146a(miRbase ID:MI0000477)–前mir序列,人类2013年12月(GRCh38/hg38)组装,chr 5:160485352至160485450
5'-CCGAUGUGUAUCCUCAGCUUUGAGAACUGAAUUCCAUGGGUUGUGUCAGUGUCAGACCUCUGAAAUUCAGUUCUUCAGCUGGGAUAUCUCUGUC AUCGU–3'(SEQ ID NO:7)
粗体序列代表成熟miRNA的5p(左)链和3p(右)链。
mir146a基因组区:(待替换的前mir区)
基因组的chr5:160485251至160485550(299bp)
小写字母代表前miRNA侧翼基因组序列;大写字母为前miRNA序列;粗体为成熟miRNA的链。
miR-31
在另一实施方案中,将T细胞工程化以具有降低的或关闭的miR-31表达。已经证明miR-31的产生可能是免疫耗竭表型表达中的关键事件,该免疫耗竭表型是T细胞系统不能控制某些癌症和慢性感染的原因。在小鼠中敲除miR-31排除了耗竭表型的发展。响应于LCMV的慢性感染,miR-31缺陷的CD8+T细胞表达耗竭标记物的水平降低并且保留效应细胞的特性,包括细胞毒素和细胞因子的产生。仅在T细胞中缺乏miR-31表达的小鼠被保护免于与慢性感染相关的消耗并且具有较低的病毒滴度。过表达miR-31的细胞具有增加的参与干扰素信号传导的Ifna2、Irf3和Irf7的表达。此外,相同的细胞具有降低的68个miR-31靶基因的表达,其包括Ppp6c,即下调干扰素信号传导作用的介质(22至24)。总之,这些发现指示抵消miR-31活性是检查点抑制疗法的替代方式。
hsa-mir-31序列可如下公开获得:
hsa-mir-31(miRbase ID:MI0000089)–前mir序列,人类2013年12月(GRCh38/hg38)组装,chr9:21512115至21512185
5'-GGAGAGGAGGCAAGAUGCUGGCAUAGCUGUUGAACUGGGAACCUGCUAUGCCAACAUAUUGCCAUCUUUCC-3'(SEQ ID NO:9)
粗体序列代表成熟miRNA的5p(左)链和3p(右)链。
mir31基因组区:(待替换的前mir区)
基因组chr 9:(反向链):21512286至21512015(271bp)
小写字母代表前miRNA侧翼基因组序列;大写字母为前miRNA序列;粗体为成熟miRNA的链。
miR-21
在另一实施方案中,GET用于工程化具有降低的miR-21表达的T细胞。Carissimi等人示出与原初T淋巴细胞相比,记忆T淋巴细胞表达更高水平的miR-21,并且在原初T细胞的TCR接合后诱导miR-21表达。miR-21活化诱导的上调使分化T细胞的转录组偏离记忆T细胞并且偏向炎性效应T细胞。此类转录组偏向也是具有增加的miR-21表达的年长个体中的T细胞应答的特性,并且通过拮抗miR-21而逆转。
在过表达miR-21的Jurkat细胞中鉴定了miR-21靶标,并且发现其包括参与信号转导的基因。Jurkat细胞中miR-21过表达后抑制TCR信号传导,导致ERK磷酸化、AP-1活化和CD69(在增殖中起作用)表达降低。另一方面,如通过CD69、OX40、CD25和CD127表达分析所评估的,其中miR-21活性受损的原代人淋巴细胞显示IFN-g产生增强和响应于TCR接合的更强活化。通过对原代T淋巴细胞中的内源蛋白质进行细胞内染色,证实了淋巴细胞活化的三种关键调节物(PLEKHA1、CXCR4、GNAQ)作为新的miR-21靶标。这些结果点明miR-21作为T淋巴细胞中信号转导的负调节物(25)。总之,数据表明抑制T细胞中的miR-21上调或活性可以改善其产生有效细胞毒性应答的能力(26)。
hsa-mir-21序列可如下公开获得:
hsa-mir-21(miRbase ID:MI0000077)–前mir序列,人类2013年12月(GRCh38/hg38)组装,chr17:59841266至59841337(72bp)
5'-UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA-3'(SEQ ID NO:11)
粗体序列代表成熟miRNA的5p(左)链和3p(右)链。
mir-21基因组区:(待替换的前mir区)
基因组chr17:59841165至59841437(172bp)
小写字母代表前miRNA侧翼基因组序列;大写字母为前miRNA序列;粗体为成熟miRNA的链。
miR-23a
T细胞中有效的记忆生成需要清除病原体或肿瘤。持续的抗原暴露诱导CD8+T细胞“耗竭”,其特征在于包括PD-1(程序性细胞死亡1)、LAG-3和CTLA-4的抑制性受体的上调,伴随着增殖能力、效应子功能和细胞存活的降低。明显的是,逆转T细胞耗竭可以释放现有的肿瘤特异性细胞毒性T细胞以攻击和杀死癌细胞。miR-23a被鉴定为转录因子BLIMP-1的强功能性阻抑物,其促进CTL(CD8+细胞毒性T淋巴细胞)细胞毒性和效应细胞分化。在一批晚期肺癌患者中,miR-23a在肿瘤浸润的CTL中上调,并且其表达与患者CTL受损的抗肿瘤潜力相关。证明肿瘤衍生的TGF-β通过升高miR-23a和下调BLIMP-1直接抑制CTL免疫功能。在人CTL中miR-23a的功能性阻断增强了粒酶B表达,并且在具有已建立的肿瘤的小鼠中,用其中miR-23a被抑制的少量肿瘤特异性CTL进行的免疫疗法有力地阻碍了肿瘤进展。总之,这些发现指示停止miR-23a表达预期防止在过继性细胞转移肿瘤免疫疗法期间经常观察到的CTL的免疫抑制(22、27)。
hsa-mir-23a序列可如下公开获得:
has-mir-23a(miRbase ID:MI0000079)–前mir序列,人类2013年12月(GRCh38/hg38)组装,chr19:13,836,587至13,836,659(73bp)。
5'-GGCCGGCUGGGGUUCCUGGGGAUGGGAUUUGCUUCCUGUCACAAAUCACAUUGCCAGGGAUUUCCAACCGACC–3'(SEQ ID NO:13)
粗体序列代表成熟miRNA的5p(左)链和3p(右)链。
mir23a基因组区:(待替换的前mir区):
基因组chr19(反向链):13836760至13836490(270bp)
小写字母代表前miRNA侧翼基因组序列;大写字母为前miRNA序列;粗体为成熟miRNA的链
对T细胞治疗功效有负作用的“不良”基因
抑制性免疫检查点基因
将T细胞暴露于与感染和癌症相关的持续性抗原和/或炎性信号。例如,在实体瘤的情况下,它们的微环境对于有效T细胞活性是特别不利的,该有效T细胞活性给它们的渗透带来障碍,具有减少CAR-T细胞寿命(1)和降低它们的效应子功能的内在抑制机制和外在抑制机制。总之,这些条件导致称为T细胞“耗竭”的状态(28)。为了扩展CAR-T细胞性能和持久性,先前已经采用了几种方式,其中一些目的在于抑制免疫检查点靶标(ICT),诸如PD-1、CTLA-4、LAG-3或它们对应的配体。例如,存在表达抗PD-L1或PD-1(29)的分泌抗体(Fab区)的CAR-T细胞,或者其中编码PD-1/CTLA-4抑制性受体的基因被破坏的CAR-T细胞。另一方式由以下组成:通过嵌合开关-受体(CSR)将PD-1/CTLA-4抑制性信号转化为活化信号,该嵌合开关-受体(CSR)具有截短形式的PD-1受体作为与CD28共刺激分子的细胞质信号传导结构域融合的细胞外结构域(5)。
在所描述的方法的具体实施方案中,GET介导的基因编辑用于将RNA编码序列如miRNA编码序列插入蛋白质编码序列如ICT的编码序列中。在具体实施方案中,所描述的方法涉及通过积极影响T细胞功能的miRNA(例如miR-181a、miR-28或miR-149-3p)的GET介导的敲入来敲减PD-1、CTLA-4或LAG-3。
用于治疗系统性红斑狼疮(SLE)的Treg细胞中的miR-146a上调和miR-17下调
对系统性红斑狼疮(SLE)患者的外周血白细胞中156个miRNA进行的分析揭示了包括miR-146a的多种微小RNA的差异表达,该miR-146a是先天性免疫的负调节物。进一步分析示出在SLE患者中miR-146a的低表达与临床疾病活性和干扰素(IFN)评分负相关。值得注意的是,miR-146a的过表达降低,而对内源miR-146a的抑制增加在外周血单核细胞(PBMC)中I型IFN的诱导。此外,miR-146a直接抑制I型IFN下游的反式活化,并且更重要的是,将miR-146a引入患者的PBMC缓解了I型IFN途径的协同活化(30)。在分子水平上,miR-146a示出通过抑制dectin-1/酪氨酸蛋白激酶SYK/NF-κB信号传导途径来抑制IL-6和TNF-α的β-葡聚糖诱导的产生(31)。还证明miR-146a直接靶向IRAK1基因(白介素1受体相关激酶1)。IRAK1部分负责转录因子NF-κB的IL1-诱导的上调。因此,推断出miR-146a可以下调IRAK1表达,从而抑制炎性信号的活化和促炎性细胞因子的分泌。此外,表明miR-146a的下调可以消除其对促炎性细胞因子分泌的负作用,导致IL-6和TNF-α水平的增加,从而可以促进SLE的发展(32)。
鉴于miR-146a在狼疮患者中作为IFN途径的负调节物的关键作用,所描述的方法的进一步的实施方案包括GET介导的基因编辑,用于SLE患者中的治疗干预。miR-146a表达由NF-κB以负反馈模式调节。在相对于转录开始的核苷酸位置-481至+21处的miR-146a启动子的3'段中鉴定出两个NF-κB结合位点(33)。因此,在具体实施方案中,可以编辑miR-146a的映射启动子以增强其在SLE患者的造血干细胞中的活性,或者作为选择可以在不同启动子的调节下引入miR-146a的附加拷贝。
在类似实施方案中,提供Treg细胞作为用于基因编辑的靶细胞。Lu及其同事报道了miR-146a是在Treg细胞中普遍表达的miRNA之一,并且示出它对于Treg功能是关键的。实际上,miR-146a的缺乏导致Treg细胞的数目增加但功能受损,因此,免疫耐受性破坏,伴有大量淋巴细胞活化,以及在若干器官中的组织浸润(34)。相反,miR-17在体外和体内的过表达导致Treg细胞抑制活性减弱,此外,miR-17的异位表达经由效应细胞因子基因的去抑制赋予Treg细胞以效应T细胞样特性。miR-17的阻断导致增强的T-reg抑制活性。在IL-6(在SLE患者中高度表达的促炎性细胞因子)的存在下,Treg细胞中miR-17表达增加,并且其表达负调节Eo的表达,该Eo是与Treg细胞转录因子Foxp3协同工作以确定Treg细胞的转录特征和特征性抑制表型的共调节分子。因此,miR-17通过靶向Eo和可能的附加Foxp3共调节物提供了Treg细胞控制的有效层(35)。
存在两种可以用于本方法的扩展Treg的机制,一种涉及利用抗CD3或CD28抗体进行离体扩展的使用,另一种涉及通过单独使用转化生长因子-β或者与全反式视黄酸、雷帕霉素组合使用转化生长因子-β或者单独使用雷帕霉素,将常规T细胞转化为Treg(36)。一旦扩展,可以通过将Treg的拷贝插入mir-17的基因座从而破坏其表达,来遗传操作Treg(使用GET)以过表达miR-146a。然后,此类遗传操作的Treg可以作为单一疗法或与其它疗法诸如例如低剂量IL-2疗法组合用于治疗SLE。观察到白介素-2(IL-2)的获得性缺乏和调节性T细胞(Treg)内稳态的相关紊乱在SLE的发病机制中起重要作用。低剂量IL-2疗法示出恢复活性SLE患者的Treg内稳态,并且当前在临床试验中评价其临床功效(37)。
在使用所描述的方法治疗SLE的附加实施方案中,B细胞是通过GET介导的基因编辑修饰的细胞的靶标。B细胞已经呈现肿瘤学领域发展的疗法如嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法的有吸引力的靶标,嵌合抗原受体(CAR)-T细胞疗法已经证明在靶向B细胞方面是有益的。鼠模型指向CAR-T细胞作为SLE的潜在治疗,结果示出靶器官的延长的存活和保留。因此,使用表达嵌合免疫受体诸如CAR和B细胞抗原受体的Treg,可以在与特异性T细胞缀合物结合后导致对正常细胞的直接保护。因此,此类CAR-Treg还可以包括过表达的miR-146a/下调的mir-17以增强它们的免疫抑制功能。
肝细胞中GET介导的miRNA工程
在其它实施方案中,基于GET介导的miRNA的疗法在以下情况下用于治疗衰弱性慢性疾病:(a)存在将靶细胞分离、扩展和再引入回相关器官的能力,以允许离体应用GET介导的基因编辑;及(b)存在靶向编码分泌蛋白的基因的能力,以具有期望的作用,尽管仅替换部分器官细胞。
在具体实施方案中,可以用于此类治疗的细胞是实质细胞,诸如肝细胞。肝细胞移植是治疗肝脏疾病患者的替代方法,并且超过20年的临床应用和临床研究证明了其功效和安全性。此外,正在测试附加的细胞来源,诸如干细胞衍生的肝细胞(38、39)。
在一个实施方案中,通过GET介导的编辑实现PCSK9(前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型)的靶向。PCSK9是主要在肝脏中产生的分泌蛋白,并且在LDL-C(低密度脂蛋白胆固醇)内稳态的调节中起重要作用。PCSK9结合至低密度脂蛋白颗粒(LDL)的受体,其通常在细胞外液中运输3,000至6,000个脂肪分子(包括胆固醇)/颗粒。肝脏和其它细胞膜上的LDL受体(LDLR)与细胞外液中的LDL颗粒结合并且开始使其摄入细胞,从而降低LDL颗粒浓度。如果PCSK9被阻断,则更多的LDLR被再循环并且存在于细胞表面上以从细胞外液中去除LDL颗粒。因此,阻断PCSK9可以降低血液LDL颗粒浓度(40、41)。
在一个实施方案中,增加miR-222、miR-191和/或miR-224的表达可以直接与PCSK93'-UTR相互作用并且下调其表达。这些miRNA在HepG2细胞系中过表达后,PCSK9 mRNA水平显著降低,指示miR-191、miR-222和miR-224可以通过靶向在LDLR降解和细胞LDL摄取中具有关键作用的PCSK9,而在脂质和胆固醇代谢中起重要作用并且参与疾病状况诸如高胆固醇血症和CVD(心血管疾病)的发展。因此,miR-191、miR-222和/或miR-224可以用于肝细胞中GET编辑介导的上调。然而,miR-191似乎与多种疾病和癌症类型的发病机制密切相关,并且还可能涉及先天免疫反应。此外,最近的研究证明其抑制导致癌症表型的逆转(42)。在肝细胞癌(HCC)患者中观察到miR-224具有高血浆水平,因此miR-224可能被怀疑为肿瘤进展的效应子。另一方面,当与对照组相比时,HCC组中miR-222血浆水平显著较低(43)。此外,mir-222被鉴定为体外调节PMH(原代小鼠肝细胞)增殖的关键因子,因此,mir-222似乎是植入的肝细胞中上调的合理候选物(44)。
在另一实施方案中,GET介导的编辑可以用于抑制mir-27表达。mir-27a诱导PCSK9水平增加3倍,并且使肝LDL受体水平直接降低40%。miR-27a的抑制使LDL受体水平增加70%。miR-27a靶向LDLR途径中的关键参与者,LRP6和LDLRAP1基因。因此,在具体实施方案中,miR-27a的抑制用于治疗高胆固醇血症,并且可以是他汀类药物的替代。在另一实施方案中,它通过用miR-222替换miR-27a来实现,这可以导致LDLR水平增加以及PCSK9水平降低,因此会是高胆固醇血症的更有效治疗。
提供以下实施例以说明某些特定特征和/或实施方案。这些实施例不应被解释为将本公开限于所描述的特定特征或实施方案。
实施例
实施例1:一般方法
T细胞活化
解冻4小时后,使用ImmunoCultTM人CD3/CD28/CD2 478T细胞活化剂(5uL/1×106;干细胞技术公司(STEMCELL Technologies))和IL-2(100U/uL;Immunotools)活化PBMC,并且使其保持在2×106细胞/mL的浓度。
CD19-CAR T细胞活化
为了驱动CD19-CAR T细胞活化,将CD19-CAR T细胞与NALM-6(CD19+)细胞一起共培养。由于CD19-CAR T细胞在实验之前未被预分类,而是被用作大量群体(作为CD19-CAR T细胞和未转导的T细胞的混合物),所以通过对与CD19-CAR构建体串联存在的LNGFR(CD271-(LNGFR)-APC克隆REA658,美天旎公司(Miltenyi))染色来间接评估CD19-CAR+T细胞的百分比。对于该实验,将10,000个CD19-CAR T细胞与10,000个CD19-CAR T细胞共培养。
T细胞核转染
活化后3天,用4D-核转染系统(龙沙公司(Lonza)),使用P3原代细胞4D核转染试剂盒(龙沙公司)和E0115程序电穿孔1×106PBMC。对于切除实验,在室温下将靶向所选基因(miR-31或miR-23)的每个sgRNA(112.5pmol,Synthego)与Cas9蛋白质(30pmol,IDT)分别孵育10分钟,以形成各自单独的核糖核蛋白(RNP)复合物。在孵育时间结束时,合并两个单独的反应。紧靠在将整个混合物添加到核转染前的细胞之前,添加核转染溶液。对于替换实验,遵循相同的程序,但在这种情况下,就在核转染溶液之前,将100pmol的ssODN(IDT)添加到RNP混合物中。电穿孔后,使用补充有IL-2(1000U/mL;Immunotools)的完全RPMI培养基来恢复细胞,然后在96孔U形底板(Falcon)中对它们进行培养。5天后,在两个孔中分开细胞。立即收获一个孔,使用组织gDNA提取试剂盒(Machery Nagel),按照制造商的程序进行基因组DNA提取。将所得DNA重悬于40uL无核酸酶的水中。使用ImmunoCult再活化第二孔中的细胞,并且在活化后6小时或3天收获miRNA以检查miRNA-23或miRNA-31表达水平。活化后6小时收获的样品用于评价/>的效率,而活化后3天收获的样品用于评价miRNA敲除的程度。使用miRVana/>(美国Thermoscientific)提取miRNA。收获细胞并且在300G下沉淀5分钟。使用1mL PBS洗涤沉淀物(pellet)两次。小心地去除PBS后,按照制造商的说明书通过在最终体积为50uL的无RNAse的水中洗脱,获得总miRNA提取物。用于基因编辑的寡核苷酸的靶向子序列如下:
*sgRNA ID RNA序列5'→3'
mir-31#1 CCUGUAACUUGGAACUGGAG(SEQ ID NO:15)
mir-31#2 CUGGAGAGGAGGCAAGAUGC(SEQ ID NO:16)
mir-31#3 CUGCUGUCAGACAGGAAAGA(SEQ ID NO:17)
mir-31#4 UUCCUGUCUGACAGCAGCCA(SEQ ID NO:18)
mir-23#1 CCAGGAACCCCAGCCGGCCG(SEQ ID NO:19)
mir-23#2 GACCCUGAGCUCUGCCACCG(SEQ ID NO:20)
mir-23#3 UCGGUGGCAGAGCUCAGGGU(SEQ ID NO:21)
mir-23#4 CCAUCCCCAGGAACCCCAGC(SEQ ID NO:22)
斜体序列是与每种靶标组合使用时表现最好的sgRNA。这些序列用于进一步的优化步骤。
sgRNA包括用于稳定性目的的标准Synthego修饰。这些是:前三个核苷酸和后三个核苷酸处的2'-O-甲基;以及前三个核苷酸与后两个核苷酸之间的3'-硫代磷酸酯键。
将miR-28敲入miR-23基因座
ssODN(单链寡脱氧核苷酸)序列
TCCCCTCCAGGTGCCAGCCTCTGGCCCCGCCCGGTGCCCCCCTCACCCCTGTGCCACGGTCCTTGCCCTCAAGGAGCTCACAGTCTATTGAGTTACCTTTCTGACTTTCCCACTAGATTGTGAGCTCCTGGAGGGCAGGCACTCTGAGCTCTGCCACCGAGGATGCTGCCCGGGGACGGGGTGGCAGAGAGGCCCCGAAG(SEQ ID NO:23)
将miR-28敲入miR-31基因座
ssODN(单链寡脱氧核苷酸)序列
AAATTTTGGAAAAGTAAAACACTGAAGAGTCATAGTATTCTCCTGTAACTTGGAACTGGTCCTTGCCCTCAAGGAGCTCACAGTCTATTGAGTTACCTTTCTGACTTTCCCACTAGATTGTGAGCTCCTGGAGGGCAGGCACTTGTCTGACAGCAGCCATGGCCACCTGCATGCCAGTCCTTCGTGTATTGCTGTGTATGT(SEQ ID NO:24)
在以上ssODN序列中:
斜体:同源臂,左和右
非斜体:miR-28序列
miRNA的逆转录(RT)和qPCR
使用应用生物系统公司微小RNA逆转录试剂盒将miRNA靶标逆转录为cDNA,并且通过遵循应用生物系统公司的TaqMan微小RNA测定(目录号:4427975)程序进行RT-qPCR。
总信使RNA提取、RT和RT-qPCR
为了测量PDCD1、TIM3、LAG3和BLIMP-1基因的表达水平,使用RNAeasy微试剂盒(凯杰公司(QIAGEN)),按照制造商的提取,提取来自第二次活化(使用Immunocult或通过与已辐射的PBMC共培养)后48小时收获的细胞的总mRNA。使用Quantitech RT-试剂盒(凯杰公司)将总mRNA逆转录为cDNA。按照制造商的程序,使用专用引物(参见表1)和通用qPCR主混合物(NEB),将总cDNA用作RT-qPCR的输入。
基因编辑测定(T7E1、DECODR、ddPCR)
为了评估在靶位点处使用的核酸酶的切割效率,根据制造商的建议,使用T7内切核酸酶1(T7E1,NEB)测定。基因组DNA分离后(见上文),使用所指示的引物(参见表1)和Hi-Fi热启动Q5聚合酶(NEB),经由PCR扩增目的基因座。通过琼脂糖凝胶电泳分析2.5uL的PCR反应,以确认正确的扩增大小,并且使用PCR纯化试剂盒(凯杰公司)纯化PCR反应的剩余部分。将所得扩增子在27uL的无核酸酶的水中洗脱。然后,将3uL的NEB2缓冲液(10×)与纯化的反应物混合,并且将整个混合物加热至95℃持续10分钟,并且缓慢冷却至室温以使链再退火。用Nanodrop 2000装置(赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific))确定浓度,并且在使用无核酸酶的水的总体积为12μl、最终浓度为1×NEBuffer 2中,利用1μl的T7E1消化100ng的DNA。然后将反应物在37℃水浴中孵育30分钟。通过添加1.2μl凝胶负载染料(NEB)终止反应,并且在2%琼脂糖凝胶上分析反应以评估分割效率。为了定量,使用ImageJ软件计算切割带的强度。指示核酸酶切割的indel突变的百分比使用切割带的强度与未切割带和切割带的强度总和之间的比率来计算。
为了证实精确切除,使用用于T7E1测定的相同PCR引物(对于mir23为ID#6219和ID#6220,并且对于mir31为ID#6215和ID#6216)来扩增对应的靶区。使用桑格法(Sangermethod)对所得扩增子进行测序。将获得的测序文件(.ab1)上传到能够鉴定PCR扩增子内高达500bp的插入和缺失突变的在线工具“DECODR”(可在decodr.org在线获得)。
为了研究替换(即“易位”)效率,设计了基于微滴数字PCR(ddPCR)的测定。在测定中,一对引物结合在编辑区(称为共同区)之外,并且第二对引物仅在发生替换时才结合。使用表1中所指示的引物(ID#6217和ID#6412)扩增miRNA-31的共同区。按照制造商的建议,使用QX200TMddPCRTMEvaGreenSupermix#1864034(Biorad)进行ddPCR,并且将Tm设置为58.7℃。
表1:扩增引物
实施例2:用于miRNA替换的CAR-T细胞的建立和表征
该实施例描述了用于证明miRNA“易位”的CAR-T细胞的建立。
使用不同刺激活化外周血单核细胞(PBMC)并且评估T细胞扩展/活化
将冷冻的PBMC解冻4小时,然后使用乙酸肉豆蔻酸佛波醇酯(PMA)/离子霉素[PMA(10ng/ml)和离子霉素(250ng/ml)]或ImmunoCultTM(干细胞技术公司;ImmunoCultTM人CD3/CD28 T细胞活化剂)活化72小时。活化后,使用流式细胞术分析细胞的T细胞CD25活化标记物。如图4所示,用PMA/离子霉素的活化导致更高的活化程度(93%的活细胞是CD25+),而ImmunoCultTM诱导79%的细胞活化(图4,板块B)。然而,PMA/离子霉素处理导致大量细胞死亡(30%活细胞),而用ImmunoCultTM处理后63%的细胞是能存活的(图4,板块A)。根据这些结果,在后续实验中选择ImmunoCultTM处理作为T细胞活化方法。
在活化后24、48和72小时,通过对CD25活化标记物染色来评价ImmunoCultTM介导的T细胞活化的动力学,并且示出其从24小时后61%的活化程度增加到72小时后的87%的峰(图4,板块C)。
嵌合抗原受体(CAR)-T细胞的活化
CD19-CAR-T细胞在Dr.Claudio Mussolino的实验室(弗赖堡大学(FreigurgUniv.))中生成。CD19-CAR经由慢病毒转导与PGK启动子驱动的表达整合。通过NGFR染色(融合到CAR并且衍生自神经生长因子受体蛋白的细胞外间隔区),测量细胞群中CD19-CAR-T细胞的百分比并且确定为45%(图5,板块A)。然后通过以1:1的比率[10,000CD19-CAR与10,000NALM-6(CD19+)]与靶NALM-6细胞,携带CD19表面蛋白质的B细胞前体白血病细胞系共培养,来活化CAR-T细胞。将CAR-T细胞中NALM-6细胞诱导的活化程度与非CAR T细胞的活化进行比较,并且通过对CD25染色来测量。如图5,板块B所示,与非CAR T细胞群(在共培养24、48和72小时后分别有33%、33%和20%的细胞活化)相比,NALM-6细胞将CD19-CAR-T细胞活化至更高的程度(在共培养24、48和72小时后分别有73%、62%和51%的细胞活化)。CAR-T细胞活化的峰值处于与NALM-6靶细胞共培养后24小时,并且在稍后的时间点观察到活化水平降低。
活化的CD19-CAR-T细胞针对共培养的NALM-6细胞的细胞毒性功能通过对作为靶NALM-6细胞的表面标记物的CD19抗原进行染色来测量。在共培养后24、48和72小时,存活的NALM-6细胞的量分别为初始计数的27%、21%和30%。NALM-6细胞与原初非CD19-CAR T细胞的共培养导致细胞计数适度减少,在24和48小时后分别为51%和54%,而在72小时后没有观察到减少(图5,板块C)。这些结果证明了CD19-CAR-T细胞的靶向特异性及其在控制NALM-6细胞扩展中的效力。
在T细胞活化期间选择的miRNA表达水平的动力学
使用经设计以分离小RNA的mirVanaTMmiRNA分离试剂盒(赛默飞世尔科技公司的InvitrogenTM),从活化的T细胞(通过ImmunoCultTM)纯化RNA。使用链特异性TaqManTM微小RNA试剂盒(赛默飞世尔科技公司的应用生物系统公司TM),通过逆转录-qPCR(RT-qPCR),定量以上列出的miRNA链的每一种的相对量。
使用ΔΔCt方法计算miRNA链的表达水平:将测量的每个miRNA链的表达水平归一化为内源参考基因RNU6B的表达水平。计算活化的细胞中的归一化表达值相对于未活化的细胞(未处理的对照)中的归一化表达值之间的比率(倍数变化),并且其表示miRNA表达的倍数变化(2^-ΔΔCt值)。
在所有三种miRNA(miR-31、miR-23a和miR-28)中,与5p链水平的倍数变化相比,3p链的倍数变化较低,这可能是由于它们在将5p链装载到RISC复合物中后快速降解。在所有测量的时间点,与未活化的T细胞中的mir-23a-5p链和mir-31-5p链的水平相比,活化的T细胞中的mir-23a-5p链和mir-31-5p链的水平分别升高大约8和17倍(图6,板块A、B上板块),而mir-28-5p在T细胞活化的24小时略微升高(×4),但在72小时降低至基线水平,这是T细胞活化的峰值(图3-C,上板块)。这些结果强化了mir-23a和mir-31两者皆在T细胞活化时上调的观点,而两种mir-28链的水平在T细胞活化的峰值的基线水平。这些表达模式使得这些miR适于基因编辑介导的易位。
实施例3:CRISPR介导的miRNA敲除
本实施例示出了用于敲除前mir31和前mir23a的基因编辑系统的建立,这两者的表达示出了与降低的T细胞抗癌功效相关。
用于pre-mir31和pre-mir23a的编辑介导的敲除的向导RNA(gRNA)的设计和选择
设计四种gRNA用于优化miRNA mir-31和mir-23a的编辑介导的敲除(KO)(图7)。使用四对sgRNA中的每一对测试T细胞中每种miRNA的KO(参见下表2,序列描述于实施例1中),如下:PBMC用ImmunoCultTM活化72小时,并且等分成1×106个细胞用于每个KO实验。用一对sgRNA(每种0.75pmol)和3ug的Cas9蛋白质对每个细胞等分试样进行核转染(基于电穿孔的转染方法,其能够通过施加特定电压和试剂将核酸诸如DNA和RNA转移到细胞中)。核转染后5天,收获一半的细胞进行基因组DNA提取和序列分析,并且剩余一半的细胞保留在培养物中,7天后再进一步活化。
表2-mir-23a和mir-31KO实验设计
*样品 | sgRNA量 | Cas9蛋白质(IDT) | GFP mRNA |
sgRNA1+3 | 0.75pmol(每种) | 3ug | |
sgRNA1+4 | 0.75pmol(每种) | 3ug | |
sgRNA2+3 | 0.75pmol(每种) | 3ug | |
sgRNA2+4 | 0.75pmol(每种) | 3ug | |
sgRNAG399(CCR5) | 0.75pmol(每种) | 3ug | |
GFPmRNA | 500ng | ||
UT | / | / | / |
*每个KO实验含有一对gRNA(每种0.75pmol)和3ug CAS9蛋白质。作为对照,将GFPmRNA转染到细胞中。另一对照包括靶向CCR5的不相关gRNA对。sgRNA-单向导RNA-含有与支架tracrRNA(支架区)序列融合的定制设计的短crRNA(靶特异性)序列的单RNA分子。
使用侧翼于由每个gRNA对引导的切除位点的引物,对从编辑的T细胞中提取的DNA进行PCR扩增。如图8所示,用每个gRNA对获得预期缺失大小。
从编辑的细胞提取的DNA的进一步分析采用T7内切核酸酶1(T7E1)错配检测测定,其是用于评价位点特异性核酸酶的活性的广泛使用的方法,诸如成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR)-Cas9系统。该测定的原理包括使用缺失位点侧翼的引物对靶区进行PCR扩增,然后对PCR产物进行变性和再退火。该过程导致形成包括未缺失的片段和缺失的片段的混合物的双链体及其中一条链缺失并且另一条链不缺失的双链体。后一种双链体含有不成对核苷酸的区域,称为凸起。当添加内切核酸酶T7E1时,其切割该凸起,从而检测出缺失的分子。
T7内切核酸酶1(T7E1)错配检测测定的结果(图6-A)证明了所有4个gRNA对,尤其是2+3对的高mir-31编辑效率。对由用gRNA 2+3核转染的细胞获得的PCR产物进行序列分析,并且证实了52个核苷酸的预期缺失(图9,板块B)。
以类似的方式,评估了4个gRNA对的mir-23a的编辑介导的KO。所有测试的sgRNA对都导致生成预期缺失大小,并且证明了miRNA-23KO的高编辑效率(图10,板块A和B)。对由用gRNA 1+3和4+3核转染的细胞获得的PCR产物进行序列分析验证,并且分别确认71个和65个核苷酸的预期缺失大小(图10,板块C和D)。
实施例4:编辑的KO-T细胞的表征
本实施例示出了已经敲除miRNA-23和miRNA-31的T细胞的表征,如实施例3所示。
编辑的T细胞的再活化能力的评估
评估了在mir-31-KO后,通过用每个gRNA对进行核转染对T细胞的再活化的能力。如上所述用ImmunoCultTM活化编辑的细胞,并且在72小时后用T细胞CD25活化标记物染色,通过流式细胞术确定活化程度。如图11所示,编辑的细胞可以被再活化高达80%。
编辑介导的KO后miRNA表达的评估
分别使用CAS9和gRNA 2+3和2+4,在mir-31和mir-23a的编辑介导的KO后,如上所述通过RT-qPCR在T细胞中测量mir-31-5p链和mir-23a-5p链的表达。在核转染后5天,用ImmunoCultTM再活化细胞,并且在再活化后72小时,从细胞中提取RNA并且对RNA进行mir链的RT-qPCR定量。如图12所示,mir-31-5p链和mir 23a-5p链两者的表达在KO T细胞中未检测到,而在未编辑的T细胞(未处理的=UT)和用靶向CCR5的不相关gRNA编辑的T细胞的阴性对照中,两条5p mir链的表达是明显的。
实施例5:易位–微小RNA的敲入到微小RNA KO的位点
本实施例证明了易位概念的论证,依据该概念,不期望的微小RNA编码序列在遗传基因座被期望的微小RNA的编码序列替换。
mir-28DNA段的敲入(KI)到mir-31KO位点
携带前mir-28序列的单链DNA寡核苷酸(86个核苷酸长)用作mir-28的KI到mir-31-KO T细胞中mir-31的位点的供体。利用mir-31上游区和mir-28插入之间的接合位点的PCR扩增,来验证mir-28序列的KI到mir-31KO位点(图13,板块A)。为了确定mir-28KI效率,进行微滴数字PCR(ddPCR)分析。ddPCR是基于水-油乳液微滴技术进行数字PCR的方法。将样品分级分离成20,000个微滴,并且在每个单独的微滴中进行模板分子的PCR扩增。然后对正微滴计数以获得精确的绝对目标定量。使用上述相同的接合引物(代表KI阳性事件)进行ddPCR。作为对照,扩增mir-31位点上游的区域,其是KI和KO两个模板的共同区,以提供对所有DNA样品的测量(图13,板块B)。所计算的Mir-28 KI到mir-31KO位点的效率为7%。
mir-28DNA段的敲入(KI)到mir-23a KO位点
进行mir-28的编辑介导的KI到mir-23a KO位点,并且在核转染后5天用Immunocult再活化核转染的T细胞。活化后6小时,从细胞中提取RNA,并且通过RT-qPCR测量两条mir链的表达水平以验证编辑介导的miR替换。如图14所示,两条mir-23a链的表达在两种细胞群中几乎未检测到,指示mir-23a KO的高效率。在活化的mir-23a KO细胞中未检测到mir-28链的表达,而在活化的mir23a-KO/mir-28-KI T细胞中,它们的表达升高,证实mir-23a被mir-28成功地编辑介导替换(图14)。
为了评估T细胞中编辑介导的miR替换(易位)的功能性,在由ImmunoCultTM或已辐射的PBMC(已辐射的PBMC理想地与抗CD3抗体组合用作抗原呈递细胞以刺激T细胞活化和增殖)对编辑的细胞进行再活化(核转染后5天)后48小时,通过RT-qPCR测量与T细胞耗竭相关并且受编辑的miR(mir-23-a和mir-28)调节的基因的表达。如图15所示,与未编辑的活化的T细胞中的免疫检查点基因PD1、TIM-3和LAG-3的水平相比,活化的mir-23a-KO/mir28-KI T细胞中由mir-28调节的免疫检查点基因PD1、TIM-3和LAG-3的水平低约50%。另一方面,与未编辑的活化的T细胞中的BLIMP-1的水平相比,活化的mir-23a-KO/mir28-KI T细胞中由mir-23a调节的BLIMP-1水平上调(×1.5至2.5)。已知转录阻抑物BLIMP-1促进T细胞终末分化为短寿细胞毒性T淋巴细胞(CTL),而不是长寿中央记忆(CM)T细胞。因此,BLIMP-1的上调指示KO/KI T细胞与正常T细胞相比会具有增加的免疫活性的更大可能性。
总的来说,本文提供的结果证明,通过用具有有益作用的miRNA替换对T细胞功能具有有害作用的miR,可以影响T细胞中免疫检查点基因(作为说明性蛋白质编码序列)的表达。
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鉴于可以应用所公开的本发明的原理的许多可能的实施方案,应认识到,所举例说明的实施方案仅仅是本发明的优选实施例,并且不应被视为限制本发明的范围。相反,本发明的范围由以下权利要求书限定。因此,我们要求保护落入这些权利要求的范围和精神内的我们所有发明。
序列表
<110> 莱普顿制药有限公司
<120> 增强用于细胞疗法的分离的细胞治疗功效的方法
<130> 3287/2.2
<150> US 63/119,708
<151> 2020-12-01
<160> 43
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 110
<212> RNA
<213> 智人
<400> 1
ugaguuuuga gguugcuuca gugaacauuc aacgcugucg gugaguuugg aauuaaaauc 60
aaaaccaucg accguugauu guacccuaug gcuaaccauc aucuacucca 110
<210> 2
<211> 300
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
aatggcataa aaatgcataa aatatatgac taaaggtact gttgtttctg tctcccatcc 60
ccttcagata cttacagata ctgtaaagtg agtagaattc tgagttttga ggttgcttca 120
gtgaacattc aacgctgtcg gtgagtttgg aattaaaatc aaaaccatcg accgttgatt 180
gtaccctatg gctaaccatc atctactcca tggtgctcag aattcgctga agacaggaaa 240
ccaaaggtgg acacaccagg actttctctt ccctgtgcag agattatttt ttaaaaggtc 300
<210> 3
<211> 86
<212> RNA
<213> 智人
<400> 3
gguccuugcc cucaaggagc ucacagucua uugaguuacc uuucugacuu ucccacuaga 60
uugugagcuc cuggagggca ggcacu 86
<210> 4
<211> 286
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
catctaaata tggcttgtct attcagcaag cacttattaa gtgccttttg catggtagac 60
aacatgcttg atgctgaaga tacaagaaaa aatttaaaat ggtccttgcc ctcaaggagc 120
tcacagtcta ttgagttacc tttctgactt tcccactaga ttgtgagctc ctggagggca 180
ggcactttcg ttcatctgaa aaagagctta aatttcagtg ttaatcctag attacaatcc 240
cgcctctatt attttaactt tgttcacatc tgttaactgc tctgaa 286
<210> 5
<211> 89
<212> RNA
<213> 智人
<400> 5
gccggcgccc gagcucuggc uccgugucuu cacucccgug cuuguccgag gagggaggga 60
gggacggggg cugugcuggg gcagcugga 89
<210> 6
<211> 289
<212> DNA
<213> 智人
<400> 6
gtccagcctg cagcgggcct cagggggccg cctcgatcca gcctgcccga ggctcccagg 60
ccttcgcccg ccttgcgtcc agcctgccgg gggctcccag gccggcgccc gagctctggc 120
tccgtgtctt cactcccgtg cttgtccgag gagggaggga gggacggggg ctgtgctggg 180
gcagctggaa caacgcaggt cgccgggccg gctgggcgag ttggccgggc ggggctgagg 240
ggtcggcggg ggaggctgag gcgcgggggc cggtgcgcgg ccgtgaggg 289
<210> 7
<211> 99
<212> RNA
<213> 智人
<400> 7
ccgaugugua uccucagcuu ugagaacuga auuccauggg uugugucagu gucagaccuc 60
ugaaauucag uucuucagcu gggauaucuc ugucaucgu 99
<210> 8
<211> 299
<212> DNA
<213> 智人
<400> 8
agcagctgca ttggatttac caggcttttc actcttgtat tttacagggc tgggacaggc 60
ctggactgca aggaggggtc tttgcaccat ctctgaaaag ccgatgtgta tcctcagctt 120
tgagaactga attccatggg ttgtgtcagt gtcagacctc tgaaattcag ttcttcagct 180
gggatatctc tgtcatcgtg ggcttgagga cctggagaga gtagatcctg aagaactttt 240
tcagtctgct gaagagcttg gaagactgga gacagaaggc agagtctcag gctctgaag 299
<210> 9
<211> 71
<212> RNA
<213> 智人
<400> 9
ggagaggagg caagaugcug gcauagcugu ugaacuggga accugcuaug ccaacauauu 60
gccaucuuuc c 71
<210> 10
<211> 271
<212> DNA
<213> 智人
<400> 10
tttcaattaa tgagtgtgtt ttccctccct caggtgaaag gaaaaatttt ggaaaagtaa 60
aacactgaag agtcatagta ttctcctgta acttggaact ggagaggagg caagatgctg 120
gcatagctgt tgaactggga acctgctatg ccaacatatt gccatctttc ctgtctgaca 180
gcagccatgg ccacctgcat gccagtcctt cgtgtattgc tgtgtatgtg cgcccttcct 240
tggatgtgga tttccatgac atggcctttc t 271
<210> 11
<211> 72
<212> RNA
<213> 智人
<400> 11
ugucggguag cuuaucagac ugauguugac uguugaaucu cauggcaaca ccagucgaug 60
ggcugucuga ca 72
<210> 12
<211> 272
<212> DNA
<213> 智人
<400> 12
gtttttttgg tttgtttttg tttttgtttt tttatcaaat cctgcctgac tgtctgcttg 60
ttttgcctac catcgtgaca tctccatggc tgtaccacct tgtcgggtag cttatcagac 120
tgatgttgac tgttgaatct catggcaaca ccagtcgatg ggctgtctga cattttggta 180
tctttcatct gaccatccat atccaatgtt ctcatttaaa cattacccag catcattgtt 240
tataatcaga aactctggtc cttctgtctg gt 272
<210> 13
<211> 73
<212> RNA
<213> 智人
<400> 13
ggccggcugg gguuccuggg gaugggauuu gcuuccuguc acaaaucaca uugccaggga 60
uuuccaaccg acc 73
<210> 14
<211> 270
<212> DNA
<213> 智人
<400> 14
gtgtccccaa atctcattac ctcctttgct ctctctctct ttctcccctc caggtgccag 60
cctctggccc cgcccggtgc ccccctcacc cctgtgccac ggccggctgg ggttcctggg 120
gatgggattt gcttcctgtc acaaatcaca ttgccaggga tttccaaccg accctgagct 180
ctgccaccga ggatgctgcc cggggacggg gtggcagaga ggccccgaag cctgtgcctg 240
gcctgaggag cagggcttag ctgcttgtga 270
<210> 15
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 15
ccuguaacuu ggaacuggag 20
<210> 16
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 16
cuggagagga ggcaagaugc 20
<210> 17
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 17
cugcugucag acaggaaaga 20
<210> 18
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 18
uuccugucug acagcagcca 20
<210> 19
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 19
ccaggaaccc cagccggccg 20
<210> 20
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 20
gacccugagc ucugccaccg 20
<210> 21
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 21
ucgguggcag agcucagggu 20
<210> 22
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 22
ccauccccag gaaccccagc 20
<210> 23
<211> 200
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 23
tcccctccag gtgccagcct ctggccccgc ccggtgcccc cctcacccct gtgccacggt 60
ccttgccctc aaggagctca cagtctattg agttaccttt ctgactttcc cactagattg 120
tgagctcctg gagggcaggc actctgagct ctgccaccga ggatgctgcc cggggacggg 180
gtggcagaga ggccccgaag 200
<210> 24
<211> 201
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 24
aaattttgga aaagtaaaac actgaagagt catagtattc tcctgtaact tggaactggt 60
ccttgccctc aaggagctca cagtctattg agttaccttt ctgactttcc cactagattg 120
tgagctcctg gagggcaggc acttgtctga cagcagccat ggccacctgc atgccagtcc 180
ttcgtgtatt gctgtgtatg t 201
<210> 25
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 25
tctaggtatc tctgcctc 18
<210> 26
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 26
cttagccact gtgaacac 18
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 27
ggaactaccc acaaacctcc tg 22
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 28
acaggccaat gtggctag 18
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 29
gtcacaattt catccctgtg 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 30
gatgtagtta ggcacaggag 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 31
gcggacactc taaggaagac 20
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 32
ctccttgagg gcaaggacc 19
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 33
gcctccgact gggtcatttt 20
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 34
ctttccgcta agtggtgatg g 21
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 35
ctgctgctac tacttacaag gtc 23
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 36
gcagggcaga taggcattct 20
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 37
ccaggatggt tcttagactc cc 22
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 38
tttagcacga agctctccga t 21
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 39
gtattgtcgg gactttgcag 20
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成寡核苷酸
<400> 40
ctcagtgctc ggttgcttta g 21
<210> 41
<211> 33
<212> DNA
<213> 智人
<400> 41
gaactggaga ggaggcaaga tgctggcata gct 33
<210> 42
<211> 38
<212> DNA
<213> 智人
<400> 42
ccctgtgcca cggccggctg gggttcctgg ggatggga 38
<210> 43
<211> 50
<212> DNA
<213> 智人
<400> 43
gccacggccg gctggggttc ctggggatgg gatttgcttc ctgtcacaaa 50
Claims (18)
1.一种修饰用于细胞疗法的分离的细胞的方法,其包括:
在培养物中提供多个分离的细胞;以及
在所述多个分离的细胞中,在包括其表达对细胞疗法功效有害的第一RNA编码序列的第一活跃转录遗传基因座处插入其表达对细胞疗法功效有益的第二RNA编码序列,从而将所述第二RNA编码序列可操作地连接至所述第一遗传基因座处的转录调节序列,
其中在所述第一遗传基因座处插入所述第二RNA编码序列消除所述第一RNA编码序列的表达并且破坏或替换所述第一RNA编码序列,或者其中在插入所述第二RNA编码序列之前切除所述第一RNA编码序列,
其中所述第二RNA编码序列是miRNA编码序列,
其中插入所述第二RNA编码序列和任选地切除所述第一RNA编码序列是通过基因编辑技术进行的,所述基因编辑技术选自转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR)–Cas-相关核酸酶和锌指核酸酶(ZFN),并且
其中在足以启动所述第一遗传基因座处的转录的条件下,诱导所述第二RNA编码序列在所述第一遗传基因座处的表达。
2.根据权利要求1所述的方法,其进一步包括在包括所述第二RNA编码序列的第二遗传基因座处插入所述第一RNA编码序列,从而将所述第一RNA编码序列可操作地连接至所述第二遗传基因座处的转录调节序列,
其中在足以抑制所述第二遗传基因座处的转录的条件下,抑制所述第一RNA编码序列在所述第二遗传基因座处的表达。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述第一RNA编码序列是miRNA编码序列或蛋白质编码序列。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述分离的细胞是多能造血干细胞或其谱系,或者间充质干细胞或其谱系。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述分离的细胞是巨噬细胞、天然杀伤细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞或肥大细胞。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述T淋巴细胞是天然T细胞、诱导的调节性T细胞、细胞毒性T细胞、天然杀伤(NK)T细胞、辅助性T细胞或嵌合抗原受体(CAR)T细胞。
7.根据权利要求3所述的方法,其中所述分离的细胞是实质细胞。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述实质细胞是肝细胞。
9.根据权利要求6所述的方法,其中第二miRNA选自由以下组成的组:miR-181a、miR-28和/或miR-149-3p。
10.根据权利要求6所述的方法,其中第一miRNA选自由以下组成的组:miR-146a、miR-31、miR-21和/或miR-23a。
11.根据权利要求6所述的方法,其中所述分离的细胞是调节性T细胞,并且其中所述第二miRNA是miR-146a,且所述第一miRNA是miR-17。
12.根据权利要求8所述的方法,其中所述第二RNA是miR-222、miR-191和/或miR-224。
13.根据权利要求8所述的方法,其中所述第一RNA是miR-27a。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述第二RNA是miR-222、miR-191或miR-224。
15.一种增强用于过继性细胞转移的淋巴细胞的治疗功效的方法,其包括:
在培养物中提供多个分离的淋巴细胞;以及
在包括蛋白质编码基因或第一miRNA编码序列的遗传基因座处将第二miRNA编码序列插入所述分离的淋巴细胞,从而破坏所述蛋白质编码基因或miRNA编码序列的表达,
其中所述插入是通过基因编辑技术进行的,所述基因编辑技术选自转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、成簇的规则间隔的短回文重复(CRISPR)–Cas-相关核酸酶和锌指核酸酶(ZFN),并且
其中所述第二miRNA编码序列的插入消除所述蛋白质编码基因的表达或消除所述第一miRNA编码序列的表达。
16.根据权利要求15所述的方法,其中所述蛋白质编码基因是抑制性免疫检查点基因。
17.根据权利要求15所述的方法,其中所述第二miRNA编码序列是miR-181a、miR-28或miR-149-3p。
18.根据权利要求15所述的方法,其中在插入所述第二miRNA编码序列之前,通过基因编辑技术切除所述第一miRNA编码序列。
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